高活性纤维素酶的制造方法 本发明属于微生物生产制造领域。
纤维素酶用于轻纺、饲料及酿造和发酵行业。目前纤维素酶生产采用固体和液体两种发酵工艺，前者一次性投资较后者小，但工艺要求占地面积巨大，易污染杂菌，且生产稳定性差，技术不易掌握，难以进行工业化生产，辽宁沈阳绵洲纤维素酶厂即用此工艺。液体发酵尽管具有生产稳定性高，技术易掌握，可以大规模工业化生产等特点，但因纤维素酶的诱导物质——天然纤维素类物质(玉米桔、高梁桔、麦桔、稻草等)中的纤维素与木质素及纤维素之间结合紧密而难以分解利用，故制造工艺需采用昂贵的进口纤维素粉为原料，因此纤维素酶的生产成本颇高，影响了该技术的推广应用，目前国内尚无成熟的液体发酵生产工艺。
本发明旨在克服已有技术的不足，利用天然纤维素类物质为原料通过液体深层发酵工艺制造生产高活性纤维素酶。
本发明是以如下方式来实现的，选用天然纤维素类物质如玉米桔、麦桔、稻草、高梁桔等作原料，用粉碎机粉碎至20目制成碎料，碎料加50％的水拌匀，装入高压蒸汽喷爆机内加压至1.2-1.5兆帕，保持5-15分钟，突然降至正常气压，使碎料喷爆成膨松粉状，以此作为纤维素酶的诱导物质——碳源；使用青霉属斜卧青霉菌(Penicillium decumbens AS3.524)[北京中国科学院微生物所保藏菌种]作菌种，经试管斜面菌种，再经三角瓶摇瓶培养出液体种子。
培养基：碳源 2.5-5％
辅料：豆饼粉或麸皮 0.5-0.8％ KH2PO4 0.35％
(MH4)2SO 0.2％ CaCO3 0.5％
将以上培养基调浆装入三个通用发酵罐内，装料系数70％，调PH值为5.0-6.0.分别作为一级种子罐、二级种子罐和发酵罐，经灭菌后在一级种子罐内按10％的接种量接入三角瓶内的种子液，在28℃-31℃下通风量为1∶0.8-1.0，液体深层培养36小时后的发酵液再以10％的接种量被接入灭菌处理后的二级种子罐内，在和一级种子罐相同的条件下液体深层培养48小时，生成的培养液以10％的接种量再接入到灭菌处理后的发酵罐内，在相同的条件下液体深层发酵56小时完成发酵，经板框过滤或离心机分离除去残渣以制作饲料，滤液收集后浓缩至原来体积的1/10，然后将浓缩液经喷雾干燥制成纤维素酶粉。
纤维素酶活性的测定方法：用20mg新华滤纸为底物，加PH4.8、0.1M的醋酸缓冲液0.9ml，再加适当稀释的酶液0.1ml，在50℃反应60分钟，用3.5-二硝基水杨酸法(DNS法)测定生成的还原糖，以葡萄糖为标准糖，即每分钟产生1ug葡萄糖为一个酶活力单位。
本发明方法由于采用高压蒸汽喷爆工序对天然纤维素类物质如玉料桔、麦桔、稻草等进行处理，使得此类物质内地纤维素与木质素及纤维素之间的紧密结构遭到破坏，从而有利于微生物的分解利用，可诱导大量的纤维素酶合成，天然纤维素类物质的利用取代造价昂贵的纤维素粉作原料，可大幅降低纤维素酶的生产成本，该工艺采用青霉属斜卧青霉菌AS3.524(Penicillium decumbens AS3.524)液体深层发酵，生产稳定性高，不污染杂菌，便于大规模工业化生产，发酵过程滤除的残渣又可用来生产饲料，克服了由此带来的环境污染。利用此工艺生产的酶粉经活性化验为8000U/g，比国内固体发酵的酶活高出20％，与丹麦NOVO公司所产酶粉酶活相近。
图1是本发明的工艺流程图，其中1是天然纤维素类物质，2是粉碎，3是高压蒸汽喷爆，4是斜面菌种，5是摇瓶菌种，6是辅料，7是一级种子罐，8是二级种子罐，9是发酵罐，10是过滤器，11是滤渣，12是滤液，13是浓缩液，14是喷雾干燥，15是纤维素酶粉。
由图知，天然纤维素类物质1经粉碎2工序加工成20目的碎料被送入高压蒸汽喷爆机内，经高压蒸汽喷爆3工序处理成粉状物作为碳源，和辅料6组成培养基分别加入一级种子罐7、二级种子罐8和发酵罐9内进行灭菌处理，将斜卧青霉AS3.524菌种进行试管斜面菌种4和三角瓶摇瓶菌种5培养出液体种子，接入一级种子罐7内进行深层发酵培养，将培养液接入二级种子罐8内进行深层发酵培养，然后取出培养液再接入发酵罐9内进行深层发酵，发酵完毕后经过滤器10过滤除去滤渣11被加工成饲料，滤液12被浓缩成浓缩液13，再经喷雾干燥14工序制成纤维素酶粉15。
本发明实施例如下：
1、高压喷爆(玉米桔碎料)：汽压1.2兆帕，时间15分钟。培养基：碳源 5％
辅料：豆饼粉 0.5％ KH2PO4 0.35％
(NH4)2SO4 0.2％ CaCO3 0.5％
装罐后调PH值为5.0，28℃，通风量1∶0.8，灭菌处理后逐级接种发酵，发酵时间：
一级种子罐 36小时
二级种子罐 48/小时
发酵罐 56小时发酵完成后经过滤、浓缩、喷雾干燥等工序制成纤维酶粉。
2、高压喷爆(稻草桔碎料)：汽压1.4兆帕，时间9分种。
培养基：碳源4％，麸皮0.6％，加其他辅料同实施例1，装罐后调PH值5.5，30℃，通风量1∶0.9，其他工艺过程同实施例1。
3、高压喷爆(高梁桔碎料)：汽压1.5兆帕，时间5分钟。
培养基：碳源 5％ 麸皮 0.8％
其他辅料同实施例1。装罐调PH值为6.0，31℃，通风量1∶1 其他过程同实施例1。