发酵产生L-谷氨酸的方法 本发明提供了基于改善属于埃希氏杆菌属的微生物产生L-谷氨酸的能力，以较低的成本有效地产生L-谷氨酸的方法，该方法包括在液体培养基中培养属于埃希氏杆菌属的微生物，在培养基中积累L-谷氨酸，以及收集该产物，其中所说的微生物具有对天冬氨酸抗代谢物的抗性，并且具有缺失的或降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性。
本发明涉及用于经发酵产生L-谷氨酸的微生物，以及用该微生物经发酵产生L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一种作为调味品和医药成分的重要的氨基酸。
迄今主要用属于短杆菌属、棒杆菌属或微杆菌属的所谓的谷氨酸产生微生物或者它们地突变体经发酵产生L-谷氨酸(氨基酸发酵，GakkaiShuppan Center，pp.195-215，1986)。就利用其它菌株产生L-谷氨酸的方法而言，已知用属于芽孢杆菌属、链霉菌属、青霉属或者类似的微生物的方法(美国专利3,220,929)和用属于假单胞菌属、节杆菌属、沙雷氏菌属、假丝酵母属或者类似的微生物的方法(美国专利356,387)。用常规方法L-谷氨酸的产率已得到很大的提高。然而，为了满足未来增加的需要，需要开发以较低的成本更有效地产生L-谷氨酸的方法。
因为大肠杆菌具有高的生长速率，并且其遗传学分析已取得非凡的进展，因此，在将来这种微生物有可能用作良好的产L-谷氨酸微生物。可是，按照过去的报道，大肠杆菌所积累的L-谷氨酸的量低至2.3克/升(生物化学杂志，vol.50pp.164-165，1961)。然而，最近报道一种突变体表现出谷氨酸产生能力的高水平，所说的突变体具有缺失的或降低的α-酮戊二酸脱氢酶(此后有时称作“α-KGDH”)活性(法国专利公开号2,680,278)。
本发明的一个目的是提供基于改善属于埃希氏杆菌属的微生物产生L-谷氨酸的能力，以较低的成本更有效地产生L-谷氨酸的方法。
本发明发明人对用属于埃希氏杆菌属的微生物产生L-谷氨酸的方法进行了刻苦的研究，结果发现属于埃希氏杆菌属并具有L-谷氨酸产生能力之微生物(其被赋予天冬氨酸抗代谢物抗性)的L-谷氨酸产生能力得到改善。这一发现使得完成了本发明。
1.一种属于埃希氏杆菌属的微生物，该微生物具有对天冬氨酸抗代谢物的抗性并且具有产生L-谷氨酸的能力。
2.以上1的微生物，其属于埃希氏杆菌属，具有对天冬氨酸抗代谢物的抗性，并且具有缺失的或降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性。
3.以上1或2的微生物，其中所说的天冬氨酸抗代谢物是天冬氨酸β-异羟肟酸盐(hydroxamate)。
4.一种经发酵产生L-谷氨酸的方法，该方法包括在液体培养基中培养以上1至3的微生物，在培养基中积累L-谷氨酸，以及收集该产物。
取得用于本发明的属于埃希氏杆菌属的微生物，例如，大肠杆菌。这些菌株的特定的例子如下：
大肠杆菌K-12(ATCC10798)
大肠杆菌W3110(ATCC27325)
大肠杆菌B(ATCC11303)
大肠杆菌W(ATCC9637)
用于本发明的天冬氨酸抗代谢物是这样一种物质，其抑制埃希氏杆菌属的微生物的生长，这种生长抑制作用由添加L-天冬氨酸解除。而且，它是这样一种物质，其抑制参与L-天冬氨酸生物合成的酶的表达或者抑制所述酶的活性，这种抑制作用由添加L-天冬氨酸解除。
天冬氨酸抗代谢物的例子包括天冬氨酸β-异羟肟酸盐(hydroxamte)、α-甲基天冬氨酸、β-甲基天冬氨酸、半胱氨酸亚磺酸、二氟琥珀酸和N-羟-N-甲酰甘氨酸(hadacin)。作为天冬氨酸抗代谢物，可以获得市售产品。
本发明的微生物属于埃希氏杆菌属，具有对天冬氨酸抗代谢物的抗性，并且具有产生L-谷氨酸的能力。
只要具有提到的性质，具有其它营养需要和对其它抗代谢物抗性的微生物也可以用于本发明。
可以通过用以下方法获得具有对天冬氨酸抗性的菌株：用紫外线照射或者用诱变剂[例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(此后缩写为“NG”)和甲磺酸甲酯]处理亲本菌株，收集在含有一定浓度(该浓度下亲本菌株不能生长)的天冬氨酸抗代谢物的琼脂培养基上可以生长的菌株。
具有对天冬氨酸抗代谢物抗性的菌株指对天冬氨酸抗代谢物的抗性比亲本菌株更强的菌株。
就属于埃希氏杆菌属并且具有L-谷氨酸产生能力的微生物而言，以具有缺失的或降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的微生物作为例子。
日本公开专利申请(Kokai)244,970/1993和203,980/1995描述了属于埃希氏杆菌属具有缺失的或降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性和该活性的breeding atrategies的微生物，这一特定微生物的例子如下：
大肠杆菌W3110sucA∷Kmr
大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)
大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)
大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)
大肠杆菌W3110sucA：：Kmr是通过破坏大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱羧酶基因(此后缩写为″sucA基因″)获得的，其是α-KGDH-完全-缺失菌株。
W3110sucA∷Kmr以以下方式获得。
基于已报道的sucA基因的核苷酸序列合成引物(Eur.生物化学杂志vol.141，pp.351-359，1984)，用大肠杆菌W3110的染色体DNA为模板经PCR扩增sucA基因。将药物抗性基因(本发明的卡那霉素抗性基因)插入到扩增的sucA基因编码区，以构建丧失其自身功能的sucA基因。其后，通过同源重组，用已插入药物抗性基因并已丧失其自身功能的sucA基因(sucA∷Kmr)
替换W3110染色体上的sucA基因。
也可以用常规的突变方法而不是上述基因工程方法分离α-KGDH-缺失菌株。例如，用X光或紫外线照射或者用诱变剂(例如NG等)处理菌株，并且可以基于以下性质选择α-KGDH-缺失菌株。
具有缺失的或降低的α-KGDH活性的突变体在包含葡萄糖的基本培养基中不能生长或者在需氧条件下仅能以显著降低的速率生长。然而，当琥珀酸或赖氨酸和甲硫氨酸添加到基本培养基中时，在相同的条件下正常生长是可能的。另一方面，厌氧条件使得突变体可以在包含葡萄糖的基本培养基中正常生长(Molec.Gen.Genetics，vol.105，pp.182-190，1969)。
大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)是具有降低的α-KGDH活性并且具有降低的降解L-谷氨酸能力的突变体。
大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)是具有降低的α-KGDH活性并且具有降低的降解L-谷氨酸能力以及组成型表达ace操纵子的突变体。
大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)是通过把包含磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和谷氨酸脱氢酶基因的质粒引入到大肠杆菌W3110 sucA∷Kmr获得的菌株。
上述突变体(其具有缺失的或降低的α-KGDH活性并且具有降低的降解L-谷氨酸能力以及组成型表达苹果酸合酶(aceB)，异柠檬酸裂合酶(aceA)和异柠檬酸脱氢酶磷酸酶(aceK)操纵子和/或其磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脱氢酶的活性被增强)是优选的，因为其具有较高水平的产生L-谷氨酸的能力。
本发明的微生物属于大肠杆菌，并且具有对天冬氨酸抗代谢物的抗性和具有产生L-谷氨酸的能力。例如，下列微生物被论及。
大肠杆菌AJ13199(FERMP-15573/FERM BP-5807)
大肠杆菌AJ13199是通过将得自非致病性野生菌株大肠杆菌W3110的大肠杆菌W3110 sucA∷Kmr进行常规诱变获得的，其是具有天冬氨酸β-异羟肟酸盐抗性。
本发明的产生L-谷氨酸的培养基是包含碳源，氮源，无机盐的标准培养基，必要时，包含有机微量营养物，如氨基酸，维生素等。可以使用合成培养基和完全培养基两者。只要待培养的微生物在其中可以生长，任何碳源和氮源都可用于所述的培养基中。
碳源的例子可以是葡萄糖，甘油，果糖，蔗糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，淀粉水解物和morasses；有机酸(如醋酸和柠檬酸)。这些可以单独使用或者与其它碳源结合使用。
氮源的例子包括氨；铵盐(如硫酸铵，碳酸铵，氯化铵，磷酸铵和乙酸铵)；和硝酸盐。
有机微量营养物的例子包括氨基酸，维生素，脂肪酸，核酸，包含它们胨，酪蛋白氨基酸，酵母抽提物和大豆水解物。当培养需要供其生长的氨基酸等的营养缺陷型时，补充所需的营养物是必要的。
无机盐的例子包括磷酸盐，镁盐，钙盐，铁盐和锰盐。
于pH值5至9时在20-45℃的发酵温度下进行通气培养。培养期间控制pH值时，通过添加碳酸钙或碱(如氨气等)进行中和。当培养进行10小时到4天时，培养基中积累大量的L-谷氨酸。
培养完成后，可以用已知方法从培养基收集L-谷氨酸。例如，可以通过从培养基除去细胞，然后浓缩和结晶剩余物或通过离子-交换色谱收集L-谷氨酸。
实施例
参照下列实施例更具体地说明本发明。
实施例1构建α-KGDH-缺失菌株
(1)克隆大肠杆菌W3110 sucA基因和脱氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶基因
已知大肠杆菌K12的sucA基因和脱氢硫辛酰胺琥珀酰转移酶基因(此后缩写为“sucB基因”)的核苷酸序列(Eur.生物化学杂志，vol.141，pp.351-374 1984)。基于报道的核苷酸序列，合成序列表中1-4号序列所代表的引物，用大肠杆菌W3110的染色体DNA为模板经PCR扩增sucA基因和sucB基因。
在所合成的引物中，序列表中1和2号序列代表用于扩增sucA基因的引物。序列表中的1号序列相应于Eur.生物化学杂志，vol.141，pp.354，1984中描述的sucA基因的核苷酸序列中的45-65位残基的序列，序列表中的2号序列相应于Eur.生物化学杂志，vol.141，pp.364，1984中描述的sucB基因的核苷酸序列中的3173-3193位残基的序列。
序列表中3和4号序列代表用于扩增sucB基因的所述引物。序列表中的3号序列相应于以上提及的文献354页上描述的sucA基因的核苷酸序列图中的2179-2198位残基的序列，序列表中的4号序列相应于以上提及的文献364页上描述的sucB基因的核苷酸序列图中4566-4591位残基的序列。顺便指出，已澄清sucA基因和sucB基因形成一个操纵子。
用标准方法(生物工程实验报告，日本发酵和生物工程学会编pp.97-98，Baifukan，1992)从大肠杆菌W3110制备用作经PCR扩增sucA基因和sucB基因之模板的染色体DNA。
在PCR技术(Henry Ehrlich编，Stockton出版社，1989)中所描述的标准条件下进行PCR。
用T4 DNA聚合酶使所形成的PCR产物成为平端，克隆到载体pBR322的EcoRV位点。其中已克隆扩增的sucA基因的pBR322指定为pBR-sucA，其中已克隆扩增的sucB基因的pBR322指定为pBR-sucB。其后，基于采用这些质粒，用CaCl2方法转化大肠杆菌JM109(生物工程实验报告，日本发酵和生物工程学会编pp.139，Baifukan，1992)。从转化体制备质粒，构建克隆的DNA片段的限制图。已证实克隆的基因具有与以前报道的sucA基因和sucB基因相同的限制图。
随后，用KpnI和EcoRI消化pBR-sucB以制备包含sucB基因的KpnI-EcoRI片段。同时，同样地用KpnI和EcoRI消化pBR-sucA以制备较大的DNA片段。用T4 DNA连接酶连接这两种片段以制备图1中所示的pBR-sucAB。
(2)大肠杆菌W3110染色体DNA上sucA基因的破坏
破坏大肠杆菌W3110染色体DNA上sucA基因的流程图示于图2中。
首先，pBR-sucAB以KpnI消化，用T4 DNA聚合酶使其两个末端成为平端。同时，用PstI消化pUC4K(从Pharmacia购得)以制备包含卡那霉素抗性基因的DNA片段。随后，用T4 DNA聚合酶使其两个末端成为平端。用T4 DNA连接酶连接这些片段以构建pBR-sucA∷Kmr。从这一质粒，制备包含卡那霉素抗性基因的HindIII-EcoRI DNA片段。用60微克这一线性DNA片段经CaCl2方法(生物工程实验报告，日本发酵和生物工程学会编pp.139，Baifukan，1992)转化从大肠杆菌遗传材料中心(耶鲁大学，美国)获得的大肠杆菌JC7623菌株。在L-琼脂培养基(10克/升细菌培养用胰蛋白胨(bacto trypton)，5克/升细菌培养用酵母膏，5克/升NaCl(pH7.2)和15克/升包含25毫克/升卡那霉素的琼脂)上选择其中JC7623菌株染色体DNA上的sucA基因由具有插入其中的卡那霉素抗性基因(sucA∷Kmr)的sucA基因替换的菌株。因为大肠杆菌JC7623菌株包含突变体如recB-，recC-，sbcB-，所以，用一种线性DNA可以高频率地获得同源重组。获得十二种卡那霉素抗性菌株，从这十二种菌株制备染色体DNA。用KpnI消化每一DNA，用包含sucA基因的DNA片段作为探针进行Southern杂交。结果鉴别出在这十二种菌株中，其sucA基因经同源重组被具有插入其中的卡那霉素抗性基因的sucA基因替换。这一重组可以从下列结果证实。用包含pBR-sucA上的sucA基因的2.6kb EcoRI-HindIII片段作为探针进行Southern杂交。当JC7623菌株的染色体DNA以KpnI消化并与2.6kb片段杂交时，检测到5.2kb和6.2kb的两个带，因为在sucA基因中存在KpnI位点。另一方面，在由具有插入其中的卡那霉素抗性基因的sucA基因替换sucA基因的菌株中，当将卡那霉素抗性基因(1.2kb)插入到sucA基因时，KpnI位点被破坏。因此，当这种染色体DNA被KpnI-消化的片段与12.6kb片段杂交时仅检测到12.6kb的一个带。
用P1噬菌体感染如此获得的卡那霉素抗性大肠杆菌JC7623菌株以制备相(phase)溶胞产物，将sucA∷Kmr转导进大肠杆菌W3110菌株。用标准方法(生物工程实验报告，日本发酵和生物工程学会编pp.75-76，Baifukan，1992)进行采用P1噬菌体的转导。作为卡那霉素抗性菌株被选择的代表性菌株指定为sucA∷Kmr。
用Reed等的方法(酶学方法，vol.13，p.55，1969)测定W3110sucA∷Kmr和W3110菌株的α-KGDH活性。结果在表1中示出。在W3110 sucA∷Kmr菌株中未检测到α-KGDH活性，同时证实W3110sucA∷Kmr菌株是α-KGDH-缺失菌株。
表1 W3110 W3110 sucA∷Kmr α-KGDH活性 3.70 未检测到
(单位：μmoles/毫克蛋白质/分钟)
实施例2具有DL-天冬氨酸β-异羟肟酸盐抗性的菌株的选择
于37℃下在包含16克/升细菌培养用胰蛋白胨(bacto trypton)，10克/升细菌培养用酵母膏和5克/升NaCl(pH7.2)的2YT液体培养基中培养大肠杆菌W3110 sucA∷Kmr菌株。将W3110 sucA∷Kmr(0.1ml)的过夜培养物接种到5毫升2YT液体培养基中，于37℃培养3小时，以便在对数生长期收集细胞。把细胞悬浮在50mM磷酸钾缓冲液(pH值6.0)中，离心悬液，再收集细胞。重复相同的过程。接着，将细胞悬浮在包含200毫克/升NG的50-mM磷酸钾缓冲液中，使悬液静置30分钟。然后，离心悬液并收集细胞。将这些细胞悬浮在50-mM磷酸盐缓冲液中，离心悬液并收集细胞，重复这一过程两次，洗涤细胞。此后，将细胞散布在包含0.25克/升DL-天冬氨酸β-异羟肟酸盐的M9基本培养基(葡萄糖5克/升，磷酸氢二钠-12水合物17.1克/升，磷酸二氢钾3.0克/升，氯化铵1.0克/升，氯化钠0.5克/升，硫酸镁-7水合物0.25克/升，盐酸硫胺素1毫克/升和琼脂15克/升)上，于37℃培养5至8天。
挑取在包含0.25克/升DL-天冬氨酸β-异羟肟酸盐的M9基本培养基上形成的菌落。经单菌落分离方法在M9基本培养基上纯化单个菌落。具有对DL-天冬氨酸β-异羟肟酸盐抗性的代表性菌株被指定为AJ13199。当W3110 sucA∷Kmr被散布到包含0.25克/升DL-天冬氨酸β-异羟肟酸盐的M9基本培养基上时，它完全不能生长，没有观察到菌落的形成。
实施例3L-谷氨酸-产生菌株的培养和L-谷氨酸的产生
将已在L-琼脂培养基上培养的具有DL-天冬氨酸β-异羟肟酸盐抗性的AJ13199和其亲本菌株W3110 sucA∷Kmr分离进500毫升Sakaguchi培养瓶中，所述培养瓶包含具有下列组成的20毫升培养基。于37℃培养直到培养基中的糖完全消耗。结果在表2中示出。
L-谷氨酸产生培养基
组分 浓度(克/升)
葡萄糖(已单独灭菌) 40
(NH4)2SO4 20
KH2PO4 1
MgSO47H2O(已单独灭菌) 1
FeSO47H2O 0.01
MnSO45H2O 0.01
酵母膏 2
盐酸硫胺素 0.01
CaCO3(干燥-灭菌的) 50
pH值7.0(在高压灭菌前用氢氧化钾调节于120℃下高压灭菌10分钟)
表2 菌 株 OD*累积的L-谷氨酸的量 (克/升) 培养时间 (小时)W3110 sucA∷Kmr 0.45 19.2 25 AJ13199 0.76 19.8 12
*：OD562(26-倍稀释)
在具有DL-天冬氨酸β-异羟肟酸盐抗性的AJ13199中，与其亲本菌株比较，累积的谷氨酸的量不变，但生长率增加，细胞的量也增加，培养时间大大缩短，单位时间的谷氨酸产率大大提高。
分离到许多具有DL-天冬氨酸β-异羟肟酸盐抗性的菌株而不是AJ13199，按实施例3所描述的方法评价，在许多这样的菌株中，与AJ13199一样，生长率增加，细胞的量增加，培养时间大大缩短。
本发明的方法可以增加埃希氏杆菌属突变体产生L-谷氨酸的能力，并且以低的成本有效产生L-谷氨酸。
大肠杆菌AJ12624于1991年7月24日被列于日本工业科学和技术机构国立生物科学和人体技术研究所保藏目录中(No.3，1-ban，Higashi1-chome，Tsukuba city，Ibaraki prefecture，日本，邮区代码305)，给出的保藏号为FERM P-12379。这一菌株按照布达佩斯条约于1992年5月15日转为国际保藏，给出的保藏号为FERM BP-3853。
大肠杆菌AJ12628于1991年7月24日被列于日本工业科学和技术机构国立生物科学和人体技术研究所保藏目录中(No.3，1-ban，Higashi1-chome，Tsukuba city，Ibaraki prefecture，日本，邮区代码305)，给出的保藏号为FERM P-12380。这一菌株按照布达佩斯条约于1992年5月15日转为国际保藏，给出的保藏号为FERM BP-3854。
大肠杆菌AJ12949于1993年12月28日被列于日本工业科学和技术机构国立生物科学和人体技术研究所保藏目录中(No.3，1-ban，Higashi1-chome，Tsukuba city，Ibaraki prefecture，日本，邮区代码305)，给出的保藏号为FERM P-14039。这一菌株按照布达佩斯条约于1994年11月11日转为国际保藏，给出的保藏号为FERM BP-4881。
大肠杆菌AJ13199于1996年4月18日被列于日本工业科学和技术机构国立生物科学和人体技术研究所保藏目录中(No.3，1-ban，Higashi1-chome，Tsukuba city，Ibaraki prefecture，日本，邮区代码305)，给出的保藏号为FERMP-15573。这一菌株按照布达佩斯条约于1997年2月3日转为国际保藏，给出的保藏号为FERM BP-5807。
【序列表】
1号序列
序列长度： 21
序列类型： 核酸
链型： 单链
拓扑结构： 线性
序列类型： 合成DNA
序列特征： 扩增大肠杆菌sucA基因的引物
序列：
ACGCGCAAGC GTCGCATCAG G21
2号序列
序列长度： 21
序列类型： 核酸
链型： 单链
拓扑结构： 线性
序列类型： 合成DNA
序列特征： 扩增大肠杆菌sucA基因的引物
序列：
ATCGGCTACG AATTCAGGCA G21
3号序列
序列长度： 20
序列类型： 核酸
链型： 单链
拓扑结构： 线性
序列类型： 合成DNA
序列特征： 扩增大肠杆菌sucB基因的引物
序列：
CCGGTCGCGG TACCTTCTTC20
4号序列
序列长度： 26
序列类型： 核酸
链型： 单链
拓扑结构： 线性
序列类型： 合成DNA
序列的特征：扩增大肠杆菌sucB基因的引物
序列：
CGTAGACCGA ATTCTTCGTA TCGCTT 26
附图简要描述
图1是显示构建pBR-sucAB的图。
图2是大肠杆菌W3110染色体DNA上的sucA基因由具有插入其中的卡那霉素抗性基因的sucA基因(sucA∷Kmr)替换的流程图。