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1、(10)申请公布号 CN 103641631 A (43)申请公布日 2014.03.19 CN 103641631 A (21)申请号 201310691470.2 (22)申请日 2013.12.17 C05G 3/00(2006.01) (71)申请人 湛江师范学院 地址 524000 广东省湛江市赤坎区寸金路 29 号湛江师范学院 (72)发明人 罗富英 李典 (74)专利代理机构 广州市南锋专利事务所有限 公司 44228 代理人 刘广生 (54) 发明名称 一种广谱抗菌生物肥 (57) 摘要 本发明公开了一种广谱抗菌生物肥， 是由 免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌液 0.5-2kg 。
2、和 / 或免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液 0.5-2kg、 细胞分裂素 1-3kg、 植物激素 1-5kg、 质 量浓度 0.1% 的硼酸 300-700g、 硫酸锰 300-700g， 质量浓度0.5%的碳酸氢钠溶液0.2-1.0kg和清水 300-1000kg。 本发明生物肥产品可按1 ： 8001000 倍液对 30 余种农作物根施或喷施， 可预防暴发青 枯病和枯萎病 ； 防病外， 还可获得增产 10%60% ； 该产品具有较强的抗菌作用及高效、 广谱的抗菌 优势 ； 本方法技术路线简便， 产品稳定， 生产成本 低廉， 产率可控度高， 无污染、 成果容易转化、 便于 产业化生产。 (。
3、51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 (10)申请公布号 CN 103641631 A CN 103641631 A 1/2 页 2 1. 一种广谱抗菌生物肥， 其特征在于 ： 是由免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌液和 / 或免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液、 细胞分裂素、 植物激素、 质量浓度 0.1% 的硼酸、 硫酸锰、 质量浓度 0.5% 的碳酸氢钠溶液和清水组成 ； 各组成原料的用量为 ： 免疫生物活性 蛋白非致病性青枯菌液0.5-2kg和/或免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液0。
4、.5-2kg、 细 胞分裂素 1-3kg、 植物激素 1-3kg、 质量浓度 0.1% 的硼酸 0.3-0.7kg、 硫酸锰 0.3-0.7kg、 质 量浓度 0.5% 的碳酸氢钠溶液 0.2-1.0kg 和清水 300-1000kg。 2. 一种广谱抗菌生物肥， 其特征在于 ： 按如下步骤制备 ： 合并免疫生物活性蛋白非致 病性青枯菌液和免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液， 得混合菌液 ； 在高剪切反应釜中 依加入清水 500kg、 五龄蚕幼虫组织粉碎液 50kg、 免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌液和 免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液各 1kg、 细胞分裂素 2kg、 植物激素 2kg、 。
5、质量浓度 0.1% 的硼酸 .0.5kg、 硫酸锰 0.5kg、 质量浓度 0.5% 的碳酸氢钠溶液 0.5kg， 在常温下生物扩 增 72 小时， 然后以 2001000rp/min 的转速进行搅拌培养 96 小时， 培养结束， 升温至 50， 恒温 2 小时， 制得广谱抗菌生物肥成品。 3. 一种广谱抗菌生物肥， 其特征在于 ： 按以下步骤制备成一种预防青枯病的广谱抗菌 生物肥 ： 取免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌菌液 1kg、 清水 1000kg、 细胞分裂素 1kg、 植物 激素 0.5kg， 在温度 3638条件下， 以 20500rp/min 转速搅拌， 进行生物扩增 1015 天。
6、， 制 得预防 “青枯病” 的广谱抗菌生物肥。 4. 一种广谱抗菌生物肥， 其特征在于 ： 按以下步骤制备成一种预防香蕉枯萎病的广谱 抗菌生物肥 ： 取免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液 1kg、 清水 1000kg、 细胞分裂素 1kg、 植物激素 1kg， 在常温下以 20500rp/min 转速搅拌， 生物扩增 8-12 天， 制得预防 “香蕉枯萎 病” 的广谱抗菌生物肥。 5. 根据权利要求 1 至 4 中任意一项所述的广谱抗菌生物肥， 其特征在于 ： 所述免疫生 物活性蛋白非致病性青枯菌液的制备方法如下 ： 常温下， 接种箱内湿度 7580%， 取消毒后 五龄蚕活体， 以皮试针经蚕活。
7、体的尾部皮下注射接种 0.01ml 青枯病原菌， 蚕活体抗菌培养 24小时， 然后经组织粉碎机粉碎， 粉碎后在转速为20500rp/min搅拌条件下遮光培养72小 时， 培养结束， 升温至 50， 恒温 2 小时， 过滤、 减毒， 即得到免疫生物活性蛋白非致病性青 枯菌液。 6. 根据权利要求 5 所述的广谱抗菌生物肥， 其特征在于 ： 所述青枯病原菌为茄科劳尔 氏菌 Ralstoniasolanacearum 青枯病原菌， 其制备方法如下 ： 将从番茄、 辣椒、 茄子病症严 重植株茎获得的体液以转速 15002000rp/min 离心， 取上清液， 按每 50mL 上清液接种米饭 培养基 5。
8、0g 的比例， 冬天 38， 夏天常温下， 在湿度 8090% 条件下， 以转速 100500rpm/ min 在黑暗中振荡培养至显微观测成对数生长期， OD560 值为 0.81 时， 取菌液以转速 20000rpm/min 离心， 取离心后的上清液， 保存。 7. 根据权利要求 1 至 4 中任意一项所述的广谱抗菌生物肥， 其特征在于 ： 所述免疫生 物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液的制备方法如下 ： 常温下， 室内湿度 78%， 取消毒后五龄蚕 活体， 以皮试针经蚕体尾部皮下注射接种 0.01ml 的尖镰孢菌液， 蚕活体抗菌培养 48 小时， 然后经组织粉碎机粉碎， 粉碎后在转速为20500。
9、rp/min搅拌培养120小时， 培养结束， 升温 至 50， 恒温 2 小时， 过滤、 减毒， 即得到免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液。 8. 根据权利要求 7 所述的广谱抗菌生物肥， 其特征在于 ： 所述尖镰孢菌液是从香蕉、 米 权 利 要 求 书 CN 103641631 A 2 2/2 页 3 蕉 “香蕉枯萎病” 病症严重植株的假茎维管束挤压岀的菌腐液体， 为古巴尖镰孢菌 Fusarium oxysporumf.sp.cubense(E.F.Sm ith)Snyder&Hansen. 古巴专化型 1 号生理小种和 4 号 生理小种未分离纯化混合菌 ； 所述尖镰孢菌液的获得方法是 ： 。
10、将菌腐液体以转速 20000rp/ min离心， 提取病原菌上清液， 每50mL上清液接种米饭培养基500g， 在冬天3238， 夏天常 温下， 湿度 8090% 下， 静置遮光培养至米饭表面覆盖白色长毛状尖镰孢菌丝， 菌丝对数生 长期 OD560=0.81， 菌核直径达 0.54mm 时， 再以转速 20000rpm/min 离心， 取离心后的上清 液， 保存。 9. 根据权利要求 1 至 4 中任意一项所述的广谱抗菌生物肥， 其特征在于 ： 所述细胞分 裂素为 6- 苄氨基腺嘌呤， 植物激素为赤霉素。 权 利 要 求 书 CN 103641631 A 3 1/6 页 4 一种广谱抗菌生物肥。
11、 技术领域 0001 本发明涉及一种生物肥料， 具体是一种广谱抗菌生物肥， 属于农业生产技术领域。 背景技术 0002 狭义的生物肥料， 是通过微生物生命活动， 使农作物得到特定的肥料效应的制品， 也被称之为接种剂或菌肥， 它本身不含营养元素， 不能代替化肥。 广义地生物肥料是既含有 作物所需的营养元素， 又含有微生物的制品， 是生物、 有机、 无机的结合体它可以代替化肥， 提供农作物生长发育所需的各类营养元素。 由于化肥和农药的大量使用会对人类及环境带 来一定的影响， 因此， 在发展 “生态农业” 、“绿色农业” 的今天， 生物肥料得到了越来越多的 关注。 0003 有效生物抗性药物是当今世。
12、界研究的重点和热点， 由青枯病病原菌引起的番茄和 辣椒青枯病 (Bacterial Wilt)、 由枯萎镰刀菌引起的香蕉枯萎病 (Fusarium wilt) 等世界 性细菌毁灭性土传病害已经有许多研究报道。抗菌肽对革兰氏阳性和阴性细菌约 40 余种、 绿脓杆菌和副伤寒菌等耐药性菌株均有较强的杀灭作用。 利用广谱抗菌生物肥， 通过拌土、 施灌、 植株浸根、 拌种等方法可对以上病害进行有效地预防， 尤其在我国沿海地区温暖潮湿 的环境减少发病率可达 8090% 以上。通过广谱抗菌生物肥的广泛应用， 可有效地防止、 减 轻农业病虫害， 减少农药的施用量， 降低农业生产投入， 确保农产品食用安全， 实。
13、现农业增 产增收， 从而起到事半功倍、 绿色环保的作用。 0004 本申请的发明人及其所在课题组从 2004 年广东省重点引导项目立项资助以来， 十年时间对蚕的再生资源进行了深入系统的研究。 试验证明家蚕具有超强的免疫蛋白合成 能力， 一条蚕， 在不到一个月的生长期中， 食用 3040g 的桑叶可合成并分泌可利用鲜丝腺 35g或吐岀0.51.5g的蚕丝蛋白。 试验证明蚕抗菌肽(antibacterial peptides)又称肽 抗生素 (peptide antibiotics) 或抗微生物 (antimicrobialpeptide)， 是蚕生物免疫系统 产生的一类抵抗外界生物感染源的活性多。
14、肽， 用于植物、 动物及人体它除有非特异性的抗 细菌、 真菌感染作用外， 还有抗细胞变异、 抗肿瘤细胞的作用， 且不损害人体正常细胞， 尤其 对多重耐药菌株仍有效。 0005 现已有家蚕抗菌肽的相关研究报道。如中国专利 ZL200910116463.3 公开了 一种诱导家蚕产生抗菌肽的方法， 所述该方法是采用病毒或细菌注射， 或者可以采用使 家蚕饥饿的方法 ； 采用病毒或细菌注射时， 给家蚕注射微量的细菌或病毒， 采用使家蚕 饥饿的方法时， 对家蚕不喂桑叶， 让其饥饿 48 小时， 再正常饲养 24 小时， 该专利所述诱 导方法简单易行， 能有效诱导出较多的抗菌肽， 使抗菌肽提取效率大为提高 。
15、； 中国专利 ZL200910193620.0 则公开了一种家蚕抗菌肽 BmcecE 及其 cDNA 序列与应用， 该发明的家蚕 抗菌肽对革兰氏阳性菌(苏云金芽孢杆菌)、 以及革兰氏阴性菌(大肠杆菌、 绿脓杆菌、 灵菌 败血病菌或青枯菌 ) 均具有抗菌活性、 抗菌谱广， 家蚕抗菌肽 BmcecE 可用于人、 畜、 禽的药 物研发、 预防和治疗由苏云金芽孢杆菌、 大肠杆菌、 绿脓杆菌、 灵菌败血病菌或青枯菌感染 引起人、 畜、 禽的致病， 还可以用于生物产品添加剂的制备， 防止由苏云金芽孢杆菌、 大肠杆 说 明 书 CN 103641631 A 4 2/6 页 5 菌、 绿脓杆菌、 灵菌败血病菌。
16、或青枯菌引起的生物产品的腐败变质。 0006 现有技术中未有关于利用五龄蚕幼虫活体诱导抗生物质， 并结合利用细胞分裂素 调节病原体导致其丧失致病能力的详细的实施方法的报道。 本申请是在本申请的发明人及 其所在课题组提出的将五龄蚕幼虫活体用于农业抗生预防的基础上进行深入的进一步研 究得到， 所得到的技术更加具体、 更具有实用性， 特别是在用于预防青枯病、 枯萎病具有显 著效果。 发明内容 0007 本发明目的在于克服现代农用肥的单一性缺点或不足， 提供一种广谱抗菌生物 肥， 该广谱抗菌生物肥是利用蚕体具有的免疫蛋白合成能力进行制备， 其制备方法简便、 快 捷， 生产过程对人畜安全， 成本低廉， 。
17、对环境无污染 ； 使用该广谱抗菌生物肥可减轻有毒害 性农药使用量， 降低农业生产成本， 逐步修复土壤生态 ； 使农业合理、 安全、 高效、 高产的良 性循环。 0008 为解决上述问题， 本发明所采用的技术方案是 ： 一种广谱抗菌生物肥， 是由免疫 生物活性蛋白非致病性青枯菌液和 / 或免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液、 细胞分裂 素、 植物激素、 质量浓度 0.1% 的硼酸、 硫酸锰、 质量浓度 0.5% 的碳酸氢钠溶液和清水组成 ； 各组成原料的用量为 ： 免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌液 0.5-2kg 和 / 或免疫生物活 性蛋白非致病性尖镰孢菌液 0.5-2kg、 细胞分裂素 1-。
18、3kg、 植物激素 1-3kg、 质量浓度 0.1% 的硼酸 0.3-0.7kg、 硫酸锰 0.3-0.7kg、 质量浓度 0.5% 的碳酸氢钠溶液 0.2-1.0kg 和清水 300-1000kg。 0009 一种广谱抗菌生物肥， 按如下步骤制备 ： 合并免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌 液和免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液， 得混合菌液 ； 在高剪切反应釜中依加入清 水 500kg、 五龄蚕幼虫组织粉碎液 50kg、 免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌液和免疫生物 活性蛋白非致病性尖镰孢菌液各 1kg、 细胞分裂素 2kg、 植物激素 2kg、 质量浓度 0.1% 的硼 酸 .0.5kg、 硫。
19、酸锰 0.5kg、 质量浓度 0.5% 的碳酸氢钠溶液 0.5kg， 在常温下生物扩增 72 小 时， 然后以2001000rp/min的转速进行搅拌培养96小时， 培养结束， 升温至50， 恒温2小 时， 制得广谱抗菌生物肥成品。 0010 一种广谱抗菌生物肥， 在应用于预防青枯病时， 按以下步骤制备成一种预防青枯 病的广谱抗菌生物肥 ： 取免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌菌液 1kg、 清水 1000kg、 细胞分 裂素 1kg、 植物激素 0.5kg， 在温度 3638条件下， 以 20500rp/min 转速搅拌， 进行生物扩 增 1015 天， 制得预防 “青枯病” 的广谱抗菌生物肥。。
20、 0011 一种广谱抗菌生物肥， 在应用于预防香蕉枯萎病时， 按以下步骤制备成一种预 防香蕉枯萎病的广谱抗菌生物肥 ： 取免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液 1kg、 清水 1000kg、 细胞分裂素1kg、 植物激素1kg， 在常温下以20500rp/min转速搅拌， 生物扩增8-12 天， 制得预防 “香蕉枯萎病” 的广谱抗菌生物肥。 0012 所述免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌液的制备方法如下 ： 常温下， 接种箱内湿 度 7580%， 取消毒后五龄蚕活体， 以皮试针经蚕活体的尾部皮下注射接种 0.01ml 青枯病原 菌， 蚕活体抗菌培养 24 小时， 然后经组织粉碎机粉碎， 粉碎后在转。
21、速为 20500rp/min 搅拌 条件下遮光培养 72 小时， 培养结束， 升温至 50， 恒温 2 小时， 过滤、 减毒， 即得到免疫生物 说 明 书 CN 103641631 A 5 3/6 页 6 活性蛋白非致病性青枯菌液。 0013 所述青枯病原菌为茄科劳尔氏菌 Ralstoniasolanacearum 青枯病原菌， 其制备 方法如下 ： 将从番茄、 辣椒、 茄子病症严重植株茎获得的体液以转速 15002000rp/min 离 心， 取上清液， 按每 50mL 上清液接种米饭培养基 50g 的比例， 冬天 38， 夏天常温下， 在湿 度 8090% 条件下， 以转速 100500r。
22、pm/min 在黑暗中振荡培养至显微观测成对数生长期， OD560 值为 0.81 时， 取菌液以转速 20000rpm/min 离心， 取离心后的上清液， 保存。 0014 所述免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液的制备方法如下 ： 常温下， 室内湿度 78%， 取消毒后五龄蚕活体， 以皮试针经蚕体尾部皮下注射接种 0.01ml 的尖镰孢菌液， 蚕活 体抗菌培养 48 小时， 然后经组织粉碎机粉碎， 粉碎后在转速为 20500rp/min 搅拌培养 120 小时， 培养结束， 升温至 50， 恒温 2 小时， 过滤、 减毒， 即得到免疫生物活性蛋白非致病性 尖镰孢菌液。 0015 所述尖镰孢菌。
23、液是从香蕉、 米蕉 “香蕉枯萎病”病症严重植株的假茎维管束 挤压岀的菌腐液体， 为古巴尖镰孢菌 Fusarium oxysporumf.sp.cubense(E.F.Sm ith) Snyder&Hansen. 古巴专化型 1 号生理小种和 4 号生理小种未分离纯化混合菌 ； 所述尖镰孢 菌液的获得方法是 ： 将菌腐液体以转速 20000rp/min 离心， 提取病原菌上清液， 每 50mL 上 清液接种米饭培养基 500g， 在冬天 3238， 夏天常温下， 湿度 8090% 下， 静置遮光培养至 米饭表面覆盖白色长毛状尖镰孢菌丝， 菌丝对数生长期 OD560=0.81， 菌核直径达 0.5。
24、4mm 时， 再以转速 20000rpm/min 离心， 取离心后的上清液， 保存。 0016 所述细胞分裂素为 6- 苄氨基腺嘌呤， 植物激素为赤霉素。 0017 本发明所采用的五龄蚕幼虫活体材料， 选用的家蚕不限品种， 蚕桑种类不限， 家蚕 常规传统饲养管理， 蚕卵从蚁蚕起完成四次蜕皮大约 2025 天， 每条蚕大约进食 2640g 桑 叶合成并分泌可利用鲜丝腺 35g 或集存了吐岀 0.51.5g 干物质的蚕丝蛋白， 均能达到丝 腺成熟的五龄蚕要求。取此丝腺成熟的五龄蚕， 用试剂高猛酸钾配成体积分数 1/10000 的 高锰酸钾溶液， 手持喷雾器喷于五龄蚕活体上， 蚕体药液自然风干即可，。
25、 待蚕体药液自然风 干后获得。 0018 本发明所述的五龄蚕幼虫组织粉碎液是将上述消毒后并风干的五龄蚕活体经组 织机粉碎获得。 0019 本发明相对于现有技术的有益效果是 ： 本发明是利用蚕体具有超强的免疫蛋白合 成能力， 研制得到的具有特殊抗病害性又能提高产量的生物肥产品， 产品可按 1 ： 8001000 倍液对 30 余种农作物根施或喷施， 可预防暴发青枯病和枯萎病 ； 蔬菜类除了防病外， 增产 40%60% ； 粮食作物除了防病外， 增产 10%20% 左右 ； 对香蕉、 米蕉根部和喷幼果预防枯萎病 菌发病率达 90%95%， 增产 2040% 以上 ； 该产品具有较强的抗菌作用及高效。
26、、 广谱的抗菌优 势。 经过中试， 本方法技术路线简便， 产品稳定， 生产成本低廉， 产率可控度高， 无污染、 成果 容易转化、 便于产业化生产。 具体实施方式 0020 下面通过实施例对本发明做进一步详细说明， 这些实施例仅用来说明本发明， 并 不限制本发明的范围。 0021 在以下的实施例中， 所涉及到的五龄蚕幼虫活体的准备采用如下方法 ： 选用的 说 明 书 CN 103641631 A 6 4/6 页 7 家蚕不限品种， 蚕桑种类不限， 家蚕常规传统饲养管理， 蚕卵从蚁蚕起完成四次蜕皮大 约 2025 天， 每条蚕大约进食 2640g 桑叶合成并分泌可利用鲜丝腺 35g 或集存了吐岀 。
27、0.51.5g干物质的蚕丝蛋白， 均能达到丝腺成熟的五龄蚕要求。 取此丝腺成熟的五龄蚕， 用 试剂高猛酸钾配成体积分数 1/10000 的高锰酸钾溶液， 手持喷雾器喷于五龄蚕活体上， 蚕 体药液自然风干即可， 待蚕体药液自然风干后获得。 0022 实施例 1 采用以下步骤制备一种广谱抗菌生物肥， 用于预防青枯病 ： （1） 免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌菌液的制备 ： a 青枯病原菌提取和培养 ： 取番茄、 辣椒、 茄子病症严重植株茎体液， 以转速 15002000rp/min 离心， 取上清液， 按每 50mL 上清液接种米饭培养基 50g 的比例， 夏天常温 下， 在湿度 8090% 条件。
28、下， 以转速 500rpm/min 在黑暗中振荡培养至显微观测成对数生长 期， OD560 值为 0.81 时， 取菌液以转速 20000rpm/min 离心， 取离心后的上清液， 保存， 待 用 ； b. 常温下， 接种箱内湿度 7580%， 取消毒后五龄蚕活体， 以皮试针经蚕活体的尾部皮 下注射接种 0.01ml 青枯病原菌， 蚕活体抗菌培养 24 小时， 然后经组织粉碎机粉碎， 粉碎后 在转速为 200rp/min 搅拌条件下遮光培养 72 小时， 培养结束， 升温至 50， 恒温 2 小时， 过 滤、 减毒， 即得到免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌液 ； （2） 取免疫生物活性蛋白非致病。
29、性青枯菌菌液 1kg、 清水 1000kg、 细胞分裂素 ： 6- 苄氨 基腺嘌呤 1kg、 植物激素赤霉素 0.5kg， 在温度 3638条件下， 以 20rp/min 转速搅拌， 进行 生物扩增 10 天， 制得预防 “青枯病” 的广谱抗菌生物肥， 按 200mL， 500mL， 1000mL 三个规格 分装。 0023 应用时取本实施例制备得到的广谱抗菌生物肥 1 份， 与占其质量 1000 倍的请水， 搅拌均匀， 在作物进行移栽时浸根， 成活后喷施 1 次， 在花期、 幼果期 12 次， 每次间隔 15 天， 连续高温3638超过7天时， 进行根施1次。 经试验证明， 本实施例制得的广。
30、谱抗菌生 物肥对茄科植物 “番茄青枯病” 、“辣椒青枯病” 、“茄子青枯病” “烟草青枯病” 有 90% 以上预 防作用 ； 对 “玉米青枯病” 、“花生青枯病” 具有 95% 以上预防作用， 且增产 40-50%。 0024 实施例 2 采用以下步骤制备一种广谱抗菌生物肥， 用于预防香蕉枯萎病 ： （1） 免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液制备 ： a 从香蕉、 米蕉 “香蕉枯萎病” 病症严重植株的假茎维管束挤压岀的菌腐液体， 经验证为 古巴尖镰孢菌 Fusarium oxysporumf.sp.cubense(E.F.Sm ith)Snyder&Hansen. 古巴专化 型1号生理小种和4。
31、号生理小种未分离纯化混合菌 ； 将菌腐液体以转速20000rp/min离心， 提取病原菌上清液， 每 50mL 上清液接种米饭培养基 500g， 在冬天 3238， 湿度 8090% 下， 静置遮光培养至米饭表面覆盖白色长毛状尖镰孢菌丝， 菌丝对数生长期 OD560=0.81， 菌核 直径达 0.54mm 时， 再以转速 20000rpm/min 离心， 取离心后的上清液， 保存 ； b 常温下， 室内湿度 78%， 取消毒后五龄蚕活体， 以皮试针经蚕体尾部皮下注射接种 0.01ml 的尖镰孢菌液， 蚕活体抗菌培养 48 小时， 然后经组织粉碎机粉碎， 粉碎后在转速为 20rp/min 搅拌培。
32、养 120 小时， 培养结束， 升温至 50， 恒温 2 小时， 过滤、 减毒， 即得到免疫 生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液 ； （2） 取免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液 1kg、 清水 1000kg、 细胞分裂素 ： 6- 苄氨 基腺嘌呤 1kg、 植物激素 1kg， 在常温下以 500rp/min 转速搅拌， 生物扩增 12 天， 制得预防 说 明 书 CN 103641631 A 7 5/6 页 8 “香蕉枯萎病” 的广谱抗菌生物肥， 按 100mL， 200mL， 500mL 三个规格分装。 0025 应用时取实施例制备得到的广谱抗菌生物肥 1 份， 与其质量 800 倍的水， 搅。
33、拌均 匀， 在香蕉移栽时浸根， 在花期、 幼果期根施 12 次， 每次间隔 15 天。经试验证明， 本实施例 制得的广谱抗菌生物肥对香蕉因枯萎病菌引发病有 90% 以上的预防作用， 对米蕉枯萎病有 95% 以上预防作用， 获得增产 40-50%。 0026 实施例 3 和 4 中涉及的免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌液的制备 ： （1）青枯病原菌为茄科劳尔氏菌 Ralstoniasolanacearum 青枯病原菌， 其制备方法 如下 ： 从番茄、 辣椒、 茄子病症严重植株茎体液中， 离心 15002000rp/min， 取上清液， 按每 50mL上清液接种米饭培养基50g的比例， 冬天38， 。
34、在湿度8090%条件下， 以转速100rpm/ min 在黑暗中振荡培养至显微观测成对数生长期， OD560 值为 0.81 时， 取菌液以转速 20000rpm/min 离心， 取离心后的上清液， 保存， 待用 ； （2） 常温下， 接种箱内湿度 7580%， 取消毒后五龄蚕活体， 以皮试针经蚕活体的尾部皮 下注射接种 0.01ml 青枯病原菌， 蚕活体抗菌培养 24 小时， 然后经组织粉碎机粉碎， 粉碎后 在转速为 500rp/min 搅拌条件下遮光培养 72 小时， 培养结束， 升温至 50， 恒温 2 小时， 过 滤、 减毒， 即得到免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌液。 0027 实施例。
35、 3 和 4 中涉及的免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液的制备 ： （1） 尖镰孢菌液是从香蕉、 米蕉 “香蕉枯萎病” 病症严重植株的假茎维管束挤压岀的菌 腐液体， 为古巴尖镰孢菌 Fusarium oxysporumf.sp.cubense(E.F.Sm ith)Snyder&Hansen. 古巴专化型 1 号生理小种和 4 号生理小种未分离纯化混合菌 ； 所述尖镰孢菌液的获得方法 是 ： 将菌腐液体以转速20000rp/min离心， 提取病原菌上清液， 每50mL上清液接种米饭培养 基 500g， 夏天常温下， 湿度 8090% 下， 静置遮光培养至米饭表面覆盖白色长毛状尖镰孢菌 丝， 菌。
36、丝对数生长期OD560=0.81， 菌核直径达0.54mm时， 再以转速20000rpm/min离心， 取 离心后的上清液， 保存 ； （2） 常温下， 室内湿度 78%， 取消毒后五龄蚕活体， 以皮试针经蚕体尾部皮下注射接种 0.01ml 的尖镰孢菌液， 蚕活体抗菌培养 48 小时， 然后经组织粉碎机粉碎， 粉碎后在转速为 500rp/min 搅拌培养 120 小时， 培养结束， 升温至 50， 恒温 2 小时， 过滤、 减毒， 即得到免疫 生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液。 0028 实施例 3 本实施例采用以下原料制备一种广谱抗菌生物肥 ： 一种广谱抗菌生物 肥， 其特征在于 ： 按如下步。
37、骤制备 ： 合并 1kg 免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌液和 1kg 免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液， 得混合菌液 ； 在高剪切反应釜中依次加入清水 500kg、 经组织粉碎机粉碎的五龄蚕活体组织粉碎液 50kg、 混合菌液、 细胞分裂素 ： 6- 苄氨 基腺嘌呤 2kg、 赤霉素 2kg， 质量浓度 0.1% 的硼酸 0.5kg、 硫酸锰 0.5kg， 质量浓度 0.5% 的碳 酸氢钠溶液 0.5kg， 在常温下生物扩增 72 小时， 然后以 2001000rp/min 的转速进行搅拌培 养 96 小时， 培养结束， 升温至 50， 恒温 2 小时， 制得广谱抗菌生物肥成品。 0029 。
38、实施例 4 本实施例采用以下原料制备一种广谱抗菌生物肥 ： 各组成原料的用量 为 ： 免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌液 2kg、 免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液 1kg、 细胞分裂素 3kg、 植物激素 3kg、 质量浓度 0.1% 的硼酸 0.7g、 硫酸锰 0.7g、 质量浓度 0.5% 的碳酸氢钠溶液 1kg 和清水 1000kg。 0030 实施例 5 本实施例采用以下原料制备一种广谱抗菌生物肥 ： 各组成原料的用量 说 明 书 CN 103641631 A 8 6/6 页 9 为 ： 免疫生物活性蛋白非致病性青枯菌液 0.5kg 和免疫生物活性蛋白非致病性尖镰孢菌液 0.5kg、 细胞分裂素 1kg、 植物激素 1kg、 质量浓度 0.1% 的硼酸 300g、 硫酸锰 300g、 质量浓度 0.5% 的碳酸氢钠溶液 0.2kg 和清水 300kg。 说 明 书 CN 103641631 A 9 。