用于产生有旋光力的化合物的方法 本发明涉及用于产生(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的方法和用于产生可以由前体(S)-4-羟基-2-酮戊二酸形成的化合物(例如，(2S,4S)-4-羟基-L-谷氨酸和(2S,4S)-4-羟基-L-脯氨酸等化合物)的方法。(2S,4S)-4-羟基-L-脯氨酸具有包括抗癌细胞活性[癌症研究48.,2483(1988)]和抗肥大细胞活性(日本未审查专利出版物,No.63-218621)在内的生物学活性。(S)-4-羟基-2-酮戊二酸和(2S,4S)-4-羟基-L-谷氨酸对于产生(2S,4S)-4-羟基-L-脯氨酸是有用的。
人们知道许多产生(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的常规方法，包括苏型-4-羟基-L-脯氨酸的化学脱氨作用[酶学方法,17部分B,275]。
本发明的发明人以前曾报导过产生(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的方法(日本未审查专利出版物No.7-289284)，该方法包括使(例如，提供)生物催化剂(其具有由丙酮酸产生(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的活性)作用于水合乙醛酸和丙酮酸或通过生物催化剂作用能转变为丙酮酸的化合物。与已知的常规方法比较，该方法更有工业产生优势，但该方法的劣势在于，如果用廉价的葡萄糖作为底物则(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的积累较少，而必须用昂贵的丙酮酸作为底物才能使(S)-4-羟基-2-酮戊二酸地积累水平高于20mM。
下列产生(2S,4S)-4-羟基-L-谷氨酸的方法是已知的；一种是包括使谷氨酸脱氢酶在氨和NADPH存在时作用于化学合成的DL-4-羟基-2-酮戊二酸，并用离子交换层析分离最终的4(R)-和4S-4-羟基-谷氨酸的方法。一种是从植物中提取(2S,4S)-4-羟基-L-谷氨酸(Phlox decussata)[酶学方法，17部分B,277]的方法；和一种允许转氨酶同时作用于L-4-羟基-2-酮戊二酸和半胱氨酸亚磺酸[四面体通讯，28,1277(1987)]的方法。
本发明的发明人以前曾报道过产生(2S,4S)-4-羟基-L-谷氨酸的方法，该方法使(例如，提供)生物催化剂(其具有在氨基供体存在时由丙酮酸和水合乙醛酸产生(2S,4S)-4-羟基-L-谷氨酸的活性)作用于水合乙醛酸和丙酮酸或能转化为丙酮酸的化合物(日本未审查专利出版物No.8-80198)。该方法仅在产生4(S)形式时有工业优势；然而，该方法费力和劣势在于其需要进一步将(S)-4-羟基-L-酮基谷氨酸转变为(2S,4S)-4-羟基-L-谷氨酸，其通过在合成(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的步骤后向(S)-4-羟基-2-酮戊二酸中加入另一种细菌，以便由此方法产生大量(2S,4S)-4-羟基-L-谷氨酸。
下列方法是已知的产生(2S,4S)-4-羟基-L-脯氨酸的常规方法；一种是通过培养卷角霉属或顶柱霉属的微生物以从培养菌中提取脯氨酸的方法(日本未审查专利出版物No.5-111388)；和一种使(例如，提供)微生物(其具有将4-羟基-2-酮戊二酸转变为4-羟基-L-脯氨酸的活性)作用于4-羟基-2-酮戊二酸的方法(日本未审查专利出版物No.3-266996)；及其类似方法。然而，这些方法的工业应用是困难的，因为前一种方法的产率低而后一种方法需要分离和纯化同时产生的4(S)和4(R)形式的耗费劳动的工序。
本发明的目的是提供一种有利于工业上产生(S)-4-羟基-2-酮戊二酸和由前体(S)-4-羟基-2-酮戊二酸制得的化合物的方法，所说的化合物例如(2S,4S)-4-羟基-L-谷氨酸和(2S,4S)-4-羟基-L-脯氨酸。
本发明涉及产生有旋光力的化合物的方法，该方法使(例如，提供)重组微生物(其携带包括编码(S)-4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶DNA片段(以下简写为＂KAL基因＂)的重组DNA)，在液体培养基中具有或缺乏氨基供体时作用于糖和水合乙醛酸，并收集在液体培养基中产生的有光学活性的(S)-4-羟基-2-酮戊二酸或由前体(S)-4-羟基-2-酮戊二酸产生的化合物(以下简写为＂4(S)KHG＂)。
图.1描述了质粒pKSR101及其限制性酶切图；
图.2描述了质粒pKSR601及其限制性酶切图；
图.3描述了质粒pKSR125的构建过程及该质粒的限制性酶切图；和
图.4描述了质粒pKSR50及其限制性酶切图。
本发明涉及产生(S)-4-羟基-2-酮戊二酸(4(S)KHG)的方法或产生可由前体4(S)KHG形成的化合物的方法。
所说的化合物(其可由前体(S)-4-羟基-2-酮戊二酸产生)包括(2S,4S)-4-羟基-L-谷氨酸〔以下简写为“4(S)HG”〕,(2S,4S)-4-羟基-L-脯氨酸[以下简写为＂4(S)HYP＂],(S)-4-羟基-L-谷氨酰胺，(S)-4-羟基-L-精氨酸，(S)-4-羟基-L-鸟氨酸及其类似物。(S)-4-羟基-L-谷氨酰胺，(S)-4-羟基-L-精氨酸，(S)-4-羟基-L-鸟氨酸可用作动物的饲料添加剂。
根据本发明，通过利用携带含有KAL基因的重组DNA的微生物，可直接(即前体4(S)KHG不必作为中间体形成)形成所说的化合物。或者，可将微生物用作生物催化剂把前体4(S)KHG转化成为化合物。此处提到来自前体4(S)KHG的化合物时，指的是形成该化合物的任一种技术。
使用携带含有KAL基因的重组DNA的微生物产生4(S)KHG，4(S)HG和4(S)HYP的方法描述如下。
KAL基因包括来源于埃希氏菌属、假单胞菌属、副球菌属、普罗威登斯菌属、根瘤菌属或摩根氏菌属微生物的这种基因；KAL基因优选地是来源于埃希氏菌属的基因。例如，从埃希氏菌属回收KAL基因的方法是现在具体描述的。
从具有4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶活性的微生物(例如大肠杆菌菌株W3110(ATCC14948))，其染色体DNA由常规方法产生[生物化学生物物理学报，72,619(1963)]。根据在参考文献中公布的核苷酸序列[R.V.Patil和E.E.Dekker，细菌学杂志174,102(1992)]合成寡核苷酸引物。其后，将所得染色体DNA为模板进行聚合酶链反应(在下文简称＂PCR＂)[R.F.Saiki等，科学230,1350(1985)]以获得上述基因。
为向宿主(例如大肠杆菌)中导入KAL基因，可以利用任何载体包括噬菌体载体，质粒载体和类似物，只要载体可以自动复制或向宿主微生物的染色体中掺入基因。适合于大肠杆菌宿主的载体包括携带trp启动子的pBR322,pUC119,pACY184和pTrS33(日本未审查专利出版物No.2-227075)。适合于棒杆菌属的微生物宿主的载体包括pCG1载体。
来自KAL基因和载体DNA的重组DNA可以与各种重组体混合物一起产生，通过在体外用具有相同限制酶切位点的限制酶消化两个DNA并用DNA连接酶与酶切产物进行连接反应。利用所得的重组体混合物，转化宿主微生物并筛选出能催化由丙酮酸和水合乙醛酸产生4(S)KHG反应的转化体菌株(重组DNA可由该菌株获得)。该重组DNA具体地包括pKSR101，pKSR125和pKSR601。根据已知方法进行转化，例如，按分子克隆(T.Maniatis等，冷泉港实验室，1982)一书中描述的分子克隆方法。
产生携带含有KAL基因的重组DNA的重组微生物，通过掺入带有遗传信息的DNA片段到载体DNA中产生重组DNA，其后用所得的重组DNA转化宿主微生物。任何微生物均可以用作这样的宿主微生物，只要该微生物可以结合重组DNA并能在遗传信息基础上表达酶活性以催化由丙酮酸和水合乙醛酸产生4(S)KHG的反应。这样的微生物包括，例如，埃希氏菌属或棒杆菌属的微生物。更具体地说，这样的微生物包括例如大肠杆菌K-12的ATCC33625菌株，谷氨酸棒杆菌ATCC13032，和嗜乙酰乙酸棒杆菌FERM P-4962。
通过携带含有KAL基因重组DNA的重组微生物产生4(S)KHG，4(S)HG或4(S)HYP，至少具有硫辛酸要求或苹果酸合酶活性减弱或缺乏一种特性的微生物可作为优选地宿主微生物。
任何能结合重组DNA并能在遗传信息基础上表达酶活性以催化由丙酮酸和水合乙醛酸产生4(S)KHG反应的微生物可用作为所需的微生物，包括例如属埃希氏菌属或棒杆菌属的微生物。更具体地说，这样的微生物包括如大肠杆菌K-12的ATCC33625菌株，谷氨酸棒杆菌ATCC13032，以及嗜乙酰乙酸棒杆菌FERM P-4962。
更具体地说，可以运用大肠杆菌K-12的亚菌株NHK40[硫辛酸需要(lip),4KAL缺失(eda)]。NHK40菌株于1997年4月16日按照布达佩斯条约存放在日本生物科学与人类技术国家研究所的工业科学和技术机构，作为FERM BP-5919。
去除烯醇丙酮酸磷酸羧化酶活性的微生物作为优选的宿主微生物，用来产生4(S)HG。
任何能结合重组DNA并能在遗传信息基础上表达酶活性以催化由丙酮酸和水合乙醛酸产生4(S)KHG反应的微生物可用作为所需的微生物，包括例如埃希氏菌属或棒杆菌属的微生物。更具体地说，这样的微生物包括如大肠杆菌K-12的ATCC33625菌株，谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株，以及嗜乙酰乙酸棒杆菌FERM P-4962。
更具体地说，可以运用大肠杆菌K-12的亚菌株NHK46[lip,eda,缺乏苹果酸合酶(glc)，缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧化酶(ppc)]。大肠杆菌K-12NHK46于1997年4月16日按照布达佩斯条约保藏在日本生物科学与人类技术国家研究所的工业科学和技术机构，作为FERM BP-5920。
为了产生4(S)HYP，更优选的是使用具有硫辛酸需要，苹果酸合酶活性减弱或缺乏及缺乏烯醇丙酮酸磷酸羧化酶活性和对脯氨酸类似物具有抗性中至少一种特性的微生物。该脯氨酸类似物包括铃兰氨酸，3,4-脱氢脯氨酸和硫代脯氨酸。
任何能结合重组DNA并能在遗传信息基础上表达酶活性以催化由丙酮酸和水合乙醛酸产生4(S)KHG反应的微生物都可用作为所需的微生物，包括例如埃希氏菌属或棒杆菌属的微生物。更具体地说，这样的微生物包括如大肠杆菌K-12的ATCC33625菌株，谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株，以及嗜乙酰乙酸棒杆菌FERM P-4962。
更具体地说，论及的是大肠杆菌K-12的亚菌株NHK47[具有lip,eda,glc,ppc,以及具有抗铃兰氨酸抗性]。大肠杆菌菌株NHK47于1997年4月16日按照布达佩斯条约保藏在日本生物科学与人类技术国家研究所的工业科学和技术机构，作为FERM BP-5921。
以上提到的各种缺失菌株或抗性菌株可以是具有上述特性的野生型菌株，或通过将其不具有此特性的亲本菌株经常规突变过程而获得的菌株，该常规突变过程诸如用诱变剂，例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)，紫外光照射或者γ辐射处理，将所得菌株涂到合适的琼脂平板培养基上，收获在平板上生长的突变菌株，并筛选带有缺失的菌株或与亲本菌株相比较酶活性相对减弱的菌株或收获比亲本菌株类似物更具抗性的菌株。从具有客观缺失或抗性突变的菌株转导缺失突变(转导)到所需的菌株中(运用噬菌体P1)，使可以回收大肠杆菌K-12菌株[J.H.Miller，分子遗传实验，冷泉港实验室(1972)]的各种缺失突变和抗性突变菌株。
根据本发明所要用到的微生物可以通过常规培养程序培养。进行培养所用的培养基可以是任何天然培养基或合成培养基，只要该培养基中含有碳源、氮源、无机盐及类似物等所用微生物能同化的物质，由此可以有效地培养微生物。所用的微生物能够同化的任何碳源都是可用的，其包括糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、淀粉水解产物以及糖蜜；有机酸如醋酸、乳酸以及葡糖酸；或者醇如乙醇和丙醇。所用的微生物能够同化的任何氮源都是可用的，其包括无机盐如氨、硫酸铵、氯化铵、以及磷酸铵；有机酸的铵盐、蛋白胨、酪蛋白水解物、肉膏、酵母提取物、玉米浆、大豆麸、大豆麸水解物、各种发酵细菌及细菌的消化产物。所用的微生物能够同化的任何无机盐都是可用的，其包括磷酸钾、硫酸铵、氯化铵、氯化钠、硫酸镁、硫酸亚铁和硫酸锰。另外，还可加入钙、锌、硼、铜、钴和钼盐作为痕量元素。如果需要，培养基中还可含有维生素诸如维生素B1和生物素、氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸、以及与核酸有关的物质如腺嘌呤和鸟嘌呤。通过振荡培养或浸没通气振荡培养方法，在有氧条件下进行培养。培养优选地在pH5.0至9.0和20至45℃下进行10至96小时。用无机酸或有机酸、碱性溶液、尿素、碳酸钙及氨调节pH值。由此产生的培养物可用于客观反应；在可供选择的方法中，可以处理培养物，并将所得处理产物用于后续反应。处理产物包括各种形式培养物的凝聚和干燥产物，冻干产物，表面活性剂处理产物，有机溶剂处理产物，热处理产物，酶处理产物，超声处理产物和机械破碎产物；以及细菌的固定产物或细菌的处理产物。
用于本发明的液体培养基的例子包括水；缓冲液如磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、硼酸盐，柠檬酸盐和Tris；及含有包括醇类如甲醇和乙醇；酯类如乙酸乙酯；酮类如丙酮；和酰胺如乙酰胺有机溶剂的水溶液。此外，如果必要，可以将表面活性剂诸如Triton X-100(Nacalai Tesque,Inc.)和Nonion HS204(NOF公司)，以及有机溶剂如甲苯和二甲苯等以每升约0.1～20克的浓度加入培养基中。
根据本发明所用的氨基供体包括氨；无机铵盐如硫酸铵、氯化铵、以及尿素；还有各种氨基酸如谷氨酸。氨基供体的浓度是每升0.1至100克，优选浓度为每升1至50克。
通过使携带含有KAL基因的重组DNA的重组微生物作用于糖和水合乙醛酸产生的4(S)KHG的浓度一般是每升5至100克。糖和水合乙醛酸的浓度都是每升1至200克，优选浓度为每升20至200克。任何糖(其能被重组菌株同化)都可以使用，这些糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、淀粉水解产物以及糖蜜。该反应在15至80℃(优选温度为25至60℃)，和pH3至11(优选pH5至9)条件下进行1至96小时。
在上述过程中，按上述提及的浓度在携带含有KAL基因的重组DNA的微生物的培养起点或培养过程中通过加入水合乙醛酸来产生4(S)KHG。糖可提前作为培养底物加入或与水合乙醛酸一同加入。
可以按照有机酸的常规纯化方法分离和纯化所得的4(S)KHG。例如用离心机去除反应中的固体物质而得到反应上清液，并借助于离子交换树脂和薄膜法结合分离和纯化4(S)KHG。
在液体培养基中存在氨基供体条件下，通过使携带含有KAL基因的重组DNA的重组微生物作用于糖和水合乙醛酸产生4(S)HG或4(S)HYP，其中所用的糖可以是任何重组菌株能同化的糖，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、淀粉水解产物、以及糖蜜。进行反应的细菌浓度一般是每升5至100克。糖和水合乙醛酸的浓度都是每升1至200克，优选浓度为每升10至200克。反应在15至80℃(优选温度为25至60℃)，和pH3至11(优选pH5至9)条件下进行1至96小时。在此过程中，可以按上述浓度在携带含有KAL基因的重组DNA的微生物的培养起点或培养过程中加入水合乙醛酸产生4(S)HG或4(S)HYP。
另外，通过向液体培养基中加入具有把4(S)KHG转化为4(S)HYP活性的生物催化剂，在氨基供体存在条件下用4(S)KHG也能产生4(S)HYP。
运用4(S)KHG产生4(S)HYP的例子包括分离和纯化的4(S)KHG，其中不合有4(R)KHG或4(R)HG的粗样品，和包含4(S)KHG的反应溶液，可通过生物催化剂的反应形成。4(S)KHG的浓度是每升1至200克，其优选浓度为每升20至200克。
在氨基供体存在的条件下具有把4(S)KHG转化成为4(S)HYP活性的生物催化剂的例子包括具有把4(S)KHG转化成为4(S)HYP活性的微生物细胞，培养物，和加工的细胞。这样的微生物包括埃希氏菌属和棒杆菌属的微生物。更具体而言，包括大肠杆菌K-12之ATCC33625菌株的微生物，其通过修饰编码在大肠杆菌中合成脯氨酸的酶的proBA基因(编码proB和proA)产生，并产生质粒pKSR25,其携带所得的突变proBA基因，具减弱的反馈抑制作用，接着，把质粒导入大肠杆菌菌株。论及的需要谷氨酸的突变菌株是更优选的。可以通过常规诱变技术(例如，N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)，紫外辐射或γ辐射)从其亲本菌株产生该突变菌株，将所得菌株涂在适当的琼脂平板培养基上，收获在平板上生长的突变菌株，并筛选需谷氨酸才能生长的菌株。此外，在大肠杆菌K-12微生物例中，缺失突变菌株也可以由转导产生。这样的微生物包括NHK3/pKSR25菌株，其产生通过，首先获得大肠杆菌K-12之ATCC33625菌株的异柠檬酸脱氢酶缺失突变(icd)菌株以获得NHK3菌株，然后，把pKSR25导入菌株NHK3；这样的微生物也包括(NHK3/pKSR25+pKSR50)的菌株，pKSR50质粒还含有谷氨酸脱氢酶和导入其中的6-磷酸葡萄糖脱氢酶，需谷氨酸的和具铃兰氨酸及脯氨酸类似物如3,4-脱氢脯氨酸和硫代脯氨酸抗性的宿主微生物被更有利地利用。通过对其亲本菌株进行诱变和转导可获得该微生物；另外，可通过将具有脯氨酸类似物抗性的质粒导入亲本菌株而获得此微生物。更具体地说，我们将论及大肠杆菌菌株NHK23/pKSR25+pKSR50。大肠杆菌NHK23/pKSR25+pKSR50菌株和大肠杆菌NHK3/pKSR25+pKSR50菌株于1997年4月16日按照布达佩斯条约保藏在日本生物科学与人类技术国家研究所的工业科学和技术机构，分别作为FERM BP-5922和FERMBP-5923。
用于反应的生物催化剂的浓度一般是每升5至100克。反应在15至80℃(优选温度25至60℃)，pH3至11(优选pH5至9)条件下进行1至96小时。在氨基供体存在时向具有将4(S)KHG转化成为4(S)HYP活性的微生物中于培养起点或培养过程中加入4(S)KH-G产生4(S)HYP。
由此产生的4(S)HG或4(S)HYP可通过氨基酸的常规纯化方法分离。例如，通过离子交换树脂和薄膜法结合，可从通过离心预先去除固体物的反应上清液中分离4(S)HG或4(S)HYP。
实施例
本发明将在下列实施例中更详细地描述。除非特别指出，关于重组DNA的一般过程根据在分子克隆(实验室手册，T.Maniatis等，冷泉港实验室，1982)中描述的方法。
实施例1 含有KAL基因的质粒的产生
将一铂环的大肠杆菌K-12之菌株W3110(ATCC14948)接种到10毫升LB液体培养基中[每升水中含细菌用胰蛋白胨(10克；由Difco公司制造)，酵母提取物(5克；由Difco公司制造)和NaCl(5克)，并调节至pH7.2]，并在30℃培养1小时。用已知方法从培养的微生物中分离染色体DNA[H.Saito & K.I.Miura，生物化学生物物理学报，72,619(1963)]。
根据所报告的KAL基因的核苷酸序列[R.V.Patil和E.E.Dekker,J.Bacteriol.174,102(1992)],基因产物N末端相应序列No.1的DNA序列的寡核苷酸和KAL基因C末端相应序列No.2的DNA序列的寡核苷酸用常规方法分别合成。用这些寡核苷酸作为引物，通过PCR扩增KAL基因[R.F.Saiki等，科学230,1350(1985)]。用大肠杆菌W3110(ATCC 14948)分离的染色体DNA作为模板，扩增用基因AmpTM试剂盒(Perkin Elmer制造，日本)和用同一家公司生产的DNA热循环器进行，共30个循环，每个循环是94℃30秒，52℃30秒及72℃一分钟，反应末一步为72℃5分钟。反应结束后，用氯仿提取约630bps的扩增DNA片段并通过乙醇沉淀纯化。DNA片段(2μg)和携带trp启动子的载体质粒pTrS33(1μg)(日本未审查专利出版物No.2-227075)用HindⅢ和BamHⅠ以双重方式独立消化，并接着用琼脂糖凝胶电泳纯化。先用乙醇沉淀，并混合纯化的两个片段，将所得的混合物溶解在蒸馏水(5μl)中，接着进行连接，以产生重组DNA。
通过Maniatis等的方法用所获得的重组DNA转化大肠杆菌ATCC33625[分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室(1982)]，将所得菌株涂于含100μg/ml氨苄青霉素LB琼脂培养基上，于37℃培育24小时。检验所得的八个抗氨苄青霉素的转化体菌落由丙酮酸和水合乙醛酸合成4-羟基-2-酮戊二酸的活性。更具体地说，将每一转化体菌株在含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基(3ml)中于30℃培养20小时，其后向培养液中加入二甲苯(30μl)、2M丙酮酸钠(150μl)和2M水合乙醛酸溶液(150μl；用NaOH调节至pH6.4),在37℃摇动30分钟。用高效液相色谱(HPLC)检验反应溶液离心后的上清液，测量4(R)-和4(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的产率。HPLC测定条件
柱；SUMICHIRAL OA-5000柱，Sumitomo化学测定中心公司制造。
流动相；一对1mM硫酸铜(Ⅱ)和0.1mM乙酸铵水溶液(pH4.5)和异丙醇按85∶15的比例依此顺序混合的混合物溶液。
流速；1ml/分钟
温度；40℃
检测；在210nm紫外光下的吸收度
结果是，在任何转化体中观察到活跃合成4(S)KHG的能力。另外，这些菌株加入LB液体培养基(3ml)(含100μg/ml氨苄青霉素)中，预先离心后于37℃搅拌培养16小时，根据已知方法[分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室(1982)]从所得的微生物中分离质粒，并用各种限制酶消化以确定结构。发现所有这些质粒具有相同的结构。由此产生的质粒定义为pKSR101。pKSR101的限制性酶切图在图1中显示。关于pKSR101，携带pKSR101的大肠杆菌NHK46/pKSR101于1998年6月2日按照布达佩斯条约保藏在日本生物科学与人类技术国家研究所的工业科学和技术机构，作为FERM BP-6382。
为将4(S)KAL基因导入棒杆菌属的微生物，将pKSR101连接到可自动复制的载体质粒pCS116(日本未审查专利出版物No.6-277082)上。pCS116(1μg)和pKSR101(1μg)溶解于H缓冲液(45μl；Takara Brewery制造)中，并加入10个单位的BglⅡ于37℃消化3小时，其后用酚抽提和乙醇沉淀。所得物质在蒸馏水(5μL)中溶解以连接，产生重组DNA。用Maniatis等的方法[分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室(1982)]运用重组DNA转化大肠杆菌ATCC33625。将所得菌株涂在含100μg/ml氨苄青霉素和100μg/ml壮观霉素的LB琼脂培养基上于37℃培育24小时。从所得抗氨苄青霉素和壮观霉素的菌落中，以上述相同的方式分离质粒，用已知方法(日本未审查专利出版物No.6-277082)用质粒转化谷氨酸棒杆菌ATCC13032。然后将转化体涂在含100μg/ml谷氨酸的BY琼脂培养基上培养[培养基每升水含肉汤(20g；Kyokuto公司制造)和酵母提取物(5g；Kyokuto公司制造)，并预先调节至pH7.2，并用2％的琼脂固化]在30℃培育48小时。用已知方法(日本未审查专利出版物No.57-183799)，从所得的八个抗壮观霉素的菌落中分离质粒以确定结构。结果是发现所有这些质粒具有相同的结构。产生的该质粒定义为pKSR601。pKSR601的限制性酶切图在图.2中显示。
实施例2 用大肠杆菌突变菌株产生4(S)KHG
通过Pi噬菌体从大肠杆菌K-12菌株的具有ppc突变的菌株DV21A05[细菌学杂志。132,832(1977)]转导，得到大肠杆菌K-12菌株WA802[J.Mol.Biol.16,118(1966)]的ppc突变。进一步借助于P1噬菌体，通过转导过程，得到菌株的lip突变和其后的eda突变，来产生具有ppc、lip和eda三重缺失突变的菌株NHK42。从菌株NHK42，诱导出具有减弱苹果酸合酶活性的菌株。NHK42菌株的微生物在含2g/l谷氨酸与100μg/l硫辛酸的LB培养基中培养至对数生长期，离心并收获，再在0.05M Tris-马来酸盐缓冲液(pH6.0)中冲洗，并悬浮在缓冲液中达终细菌浓度每升109个细胞。向悬浮液中加入NTG至终浓度为600mg/l，将所得混合物在室温保持20分钟进行诱变。在诱变后，将微生物涂在M9基本琼脂培养基上(加入0.5％葡萄糖，0.05g/l谷氨酸，100μg/l硫辛酸，以及30mM水合乙醛酸[分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室(1982)])。在37℃温育两天后，收集产生菌落中的小菌落到另加2g/l谷氨酸和100μg/l硫辛酸的LB琼脂培养基中。将所收集的突变菌株在加入0.5％的葡萄糖，0.5g/l谷氨酸，100μg/l硫辛酸的M9基本琼脂培养基中，和在加入0.5％的葡萄糖，100μg/l硫辛酸和30mM水合乙醛酸的M9基本琼脂培养基中复制。接着，筛选在前一培养基中生长而不在后一培养基中生长的菌株。所选的菌株在MS培养基中于37℃搅拌培养[该培养基每升水含3g葡萄糖，4gKH2PO4,10g(NH4)2SO4,1g MgSO4,100μg维生素B1盐酸盐，1g酵母提取物，1g蛋白胨，50μg硫辛酸，20g CaCO3，以及2g谷氨酸，并调节至pH7.2]。在对数生长后期，收获微生物并在50mM Tris-盐酸的缓冲液(pH7.0)中冲洗，该微生物用超声破碎机破碎并在离心机中以15,000rpm离心45分钟，获得上清液(定义其为细胞抽提物溶液)。利用细胞抽提物溶液，根据已知参考文献[酶学方法5,633(1962)]测定苹果酸合酶活性。检测的不具有活性的NHK46菌株被选作对照突变菌株。
运用P1噬菌体通过转导过程，将lip+基因从大肠杆菌W3110(ATCC14948)引入NHK46菌株，以产生不需要硫辛酸的NHK48菌株。
利用Maniatis等方法[分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室(1982)]，将pKSR101导入到菌株NHK42,NHK46和NHK48(只要在培养基中加入100μg/l硫辛酸和2g/l谷氨酸后进行培养)，利用氨苄青霉素抗性作为标记来获得转化体。
将每个转化体在包含1％葡萄糖，2％碳酸钙，100μg/l硫辛酸，以及2g/l谷氨酸的LB培养基中，28℃搅拌培养16小时。将每一培养肉汤加至5ml灭菌T培养基[该培养基每升水中包含50g葡萄糖，4g KH2PO4，10g(NH4)2SO4,1g MgSO4,10μg硫胺素盐酸盐，0.2g酵母提取物，3g KCl,50μg硫辛酸，250mg色氨酸，20g CaCO3，以及2g谷氨酸，并且调整其pH为7.2]，30℃培养24小时，接着在另一个37℃24小时搅拌培养之前，加入0.25ml 2M水合乙醛酸溶液(用NaOH调整pH为6.4)。将所获得的培养肉汤进行离心分离，通过HPLC分析产生的培养上清液以便测定4(R)KHG和4(S)KHG的产量。结果如表1显示。4(S)KHG产量明显表明，硫辛酸需要性的突变和苹果酸合成酶活性减弱的突变有助于4(S)KHG的产量。
表1 宿主 质粒4(R)KHG(mM)4(S)KHG(mM)大肠杆菌NHK42 pKSR101 0.8 7.5大肠杆菌NHK46 pKSR101 3.1 28.1大肠杆菌NHK48 pKSR101 0.0 0.0
实施例3 用谷氨酸棒杆菌产生4(S)KHG
将导入了pKSR601的谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13032在LB培养基中搅拌培养16小时。加该培养肉汤(0.5ml)至灭菌的TC培养基(5ml)[该培养基每升水中包含10g葡萄糖，0.5g KH2PO4，0.5g K2HPO4,20g(NH4)2SO4,0.25g MgSO4,3g尿素，100μg生物素，5g玉米浆，10mg FeSO4·7aq,5mg MnSO4·4-6aq,20g CaCO3，并且调整pH为7.2]中，30℃搅拌培养24小时。然后，往那里加入2M水合乙醛酸溶液(0.25ml；用NaOH调整pH为6.4)，将混合物在37℃进一步搅拌培养24小时。用HPLC以与实施例2中相同的方式分析培养上清液。4(S)KHG的产量为34.7mM，没有产生4(R)KHG。
实施例4 扩大产生4(S)KHG
在实施例2结果的基础上，将pKSR101如实施例2导入到菌株NHK40(该菌株在大肠杆菌K-12的这些菌株中具lip和eda双缺失突变)，来产生菌株以产生4(S)KHG。将该转化体在包含1％葡萄糖，2％碳酸钙以及100μg/l硫辛酸的LB培养基中，28℃下搅拌培养13小时。加入该培养肉汤(10ml)至灭菌的1升锥形瓶中的200ml相同培养基中，28℃搅拌培养13小时。将全部的培养肉汤加至灭菌的5升广口瓶中的这些组成(如表2所示)的J1培养基中，在33℃、2升/分钟的通气下以500rpm进行搅拌培养，同时用氨水使该培养基的pH保持在6.8。二十小时后，将二甲苯(20ml)和2M水合乙醛酸溶液(用NaOH调整pH为6.4)加至广口瓶中，37℃进一步培养12小时。用HPLC分析该培养上清液，并观察到4(S)KHG的产量是305mM。
表2 J1培养基的组成(每一升；调整pH为6.8)
葡萄糖 30g
KH2PO4 2g
K2HPO4 2g
(NH4)2SO4 10g
MgSO4 1g
FeSO4·7aq 10mg
MnSO4·4-6aq 10mg
CoCl2 1.5mg
CaCl2 15mg
NiCl2 1.5mg
钼酸铵 1.5mg
硫胺素盐酸盐 100μg
酵母提取物 0.5g
KCl 3g
硫辛酸 75μg
色氨酸 250mg
实施例5 用各种菌株产生4(S)KHG
通过使用P1噬菌体的转导过程[J.H.Miller，分子遗传学实验，冷泉港实验室，(1972)]，将ppc+基因从大肠杆菌W3110(ATCC14948)导入到菌株NHK42中，以产生不需要谷氨酸的菌株NHK45。以与实施例2中相同的方式将pKSR101导入到该菌株中。
将这些菌株NHK42,NHK46，NHK48和NHK45(所有这些菌株以pKSR101进行了导入)以与实施例2中以相同的方式进行培养，并用HPLC测定结果产生的培养上清液以便测量4(R)HG和4(S)HG的产量。HPLC测定条件柱；Lichrospher(C18)柱，Merck，公司制造流动相；包含10mM柠檬酸钠，10mM无水硫酸钠(pH2.2)，0.4％正丙醇，以及0.03％SDS的溶液。流速；0.8ml/分钟温度；40℃检测；通过柱标记检测经邻苯二甲醛处理的洗脱液。Ex=350nm,Em=448nm。
结果如表3显示。根据每种菌株的4(S)HG的产量，这些是明显的，即硫辛酸需要性的突变，苹果酸合酶活性减弱的突变，以及烯醇丙酮酸磷酸羧化酶缺失的突变可有助于4(S)HG的产生。
将导入了pKSR601的谷氨酸棒杆菌ATCC13032在LB培养基中搅拌培养16小时。加该培养肉汤(0.5ml)至灭菌的TC培养基(5ml)中[该培养基每升水中包含100g葡萄糖，0.5g KH2PO4,0.5g K2HPO4,20g(NH4)2SO4,0.25g MgSO4,3g尿素，100μg生物素，5g玉米浆，10mg FeSO4·7aq,5mg MnSO4·4-6aq,20g CaCO3,并且调整pH为7.2],30℃搅拌培养24小时。然后，加入2M水合乙醛酸溶液(0.25ml；用NaOH调整pH为6.4)，将混合物在37℃进一步搅拌培养24小时。用HPLC以与上述相同的方式分析培养上清液以测定4(R)HG和4(S)HG的产量。
结果如表3显示。
表3 宿 主 质粒4(R)HG(mM)4(S)HG(mM)大肠杆菌NHK42 pKSR101 0.1 14.0大肠杆菌NHK46 pKSR101 0.1 21.9大肠杆菌NHK48 pKSR101 0.0 1.5大肠杆菌NHK45 pKSR101 0.1 3.7谷氨酸棒杆菌ATCC13032 pKSR601 0.0 9.8
实施例6 扩大产生4(S)HG
将导入了pKSR101的大肠杆菌NHK46菌株在包含1％葡萄糖，2％碳酸钙，100μg/l硫辛酸以及2g/l谷氨酸的LB培养基中，28℃下搅拌培养13小时。加入该培养肉汤(10ml)至灭菌的l升锥形瓶中的200ml相同培养基中，28℃搅拌培养13小时。将全部培养肉汤加至灭菌的5升广口瓶中的这些组成(如表4所示)的J2培养基中，在33℃、2升/分钟的通气下以500rpm进行搅拌培养，同时用氨水使该培养基的pH保持在6.8。14小时后，将2M水合乙醛酸溶液(350ml；用NaOH调整pH为6.4)加至广口瓶中，37℃进一步培养60小时并适当地增加葡萄糖。用HPLC以与实施例5相同的方式分析该培养上清液，并观察到4(S)HG的产量为141.7mM及4(R)HG的产量为6mM。
表4 J2培养基的组成(每一升；调整pH为6.8)
葡萄糖 30g
KH2PO4 2g
K2HPO4 2g
(NH4)2SO4 10g
MgSO4 1g
FeSO4·7aq 10mg
MnSO4·4-6aq 10mg
CoCl2 1.5mg
CaCl2 15mg
NiCl2 1.5mg
钼酸铵 1.5mg
硫胺素盐酸盐 100μg
酵母提取物 0.5g
KCl 3g
硫辛酸 75μg
色氨酸 250mg
谷氨酸 12g
异亮氨酸 20mg
甲硫氨酸 10mg
实施例7 纯化4(S)HG
利用离心，从培养肉汤(一升)中分离出这些如实施例6获得的，包含4(S)HG和4(R)HG的微生物，同时使所产生的培养上清液流过装有阳离子交换树脂SK1B(500ml)的柱(H+类型，Mitsubishi化学公司制造)。在以水冲洗之后，使1N氨水流过该柱以分馏HG洗脱物组分。通过活性炭使该分馏溶液进行脱色过程，并将此产生的溶液的一半流过装有阴离子交换树脂PA316(400ml)柱(OH类型，Mitsubishi化学公司制造)。在以水冲洗之后，使0.5N盐酸流过柱以分馏HG洗脱物组分。通过蒸发，使盐酸从分馏溶液中分离出，并将所产生的溶液浓缩至50ml，然后在4℃处放置2天。将液体中所产生的晶体过滤以回收4(S)HG(7g)。通过NMR分析，质谱以及旋光性测定，证实出该晶体为4(S)HG，没有4(R)HG的存在。因此，利用菌株NHK46，可以从没有4(R)HG污染的一步反应中收集4(S)HG。
实施例8 将脯氨酸合酶基因连接到KAL基因上
首先，以下列方式，通过修饰proBA(编码proB和proA)基因(该基因编码脯氨酸生物合成酶)产生对脯氨酸反馈抑制作用不敏感的突变体proBA基因。
将来源于大肠杆菌，含proBA基因的质粒pPRO-1(日本未审查专利出版物No.3-266995)以EcoRV来进行消化，然后将所消化的产物在琼脂糖凝胶上电泳，并利用prep-A-Gene DNA纯化系统(Bio-Rad公司制造)分离和纯化包含部分proB基因的DNA片段。将该片段连接到通过以SmaⅠ消化pUS119(Takara Brewery公司制造)所获得的消化产物上。将所产生的连接产物用来转化大肠杆菌ATCC33625以产生抗氨苄青霉素的转化体。用限制性分析的常规方法从这些转化体之一提取质粒。鉴定出，该质粒在pUC119的SmaⅠ位点处插入了包含部分proB基因的约1 kb的DNA片段。定义该质粒为pBAB51。
在已知脱敏感proB酶基因(proB74突变)[A.M.Dandekar和S.L.Uratsu，J.Bacteriol.170,5943(1988)]的核苷酸序列基础上，用常规方法合成产生No.3序列的序列的寡核苷酸A1和No.4序列的序列的寡核苷酸A2。通过其后分别利用一对寡核苷酸A1和M13引物M3(TakaraBrewery公司制造)作为引物，一对寡核苷酸A2和M13引物RV(TakaraBrewery公司制造)作为另一个引物，按与实施例1相同的方式，由PCR利用pBAB51作为模板扩增突变体proB基因的部分的序列。将所扩增的DNA在琼脂糖凝胶上进行电泳，并利用Prep-A-Gene DNA纯化系统(Bio-Rad，公司)纯化。以纯化后这两个DNA片段的混合物作为模板，利用M13引物M3与M13引物RV作为引物再一次进行PCR，扩增包含突变体proB基因序列的约1 kb的DNA片段。在以Eco0651和SacⅡ消化后，将该DNA片段连接到约6.8kb的DNA片段上(其通过以Eco0651和SacⅡ将pPRO-1消化后，接着利用Prep-A-Gene DNA纯化系统(Bio-Rad公司)进行琼脂糖凝胶电泳、分离和纯化来回收)。利用该连接产物，转化大肠杆菌ATCC33625以产生抗四环素的转化体。将这些转化体和携带pPRO-1的大肠杆菌ATCC33625中的几个在加入了3,4-脱氢脯氨酸(100mg)的M9基本琼脂培养基上进行复制。所有转化体均能生长，但是携带pPRO-1的大肠杆菌ATCC33625不能生长。这证实了已构建出使其中pPRO-1的proB基因修饰成脱敏感类型的质粒。利用常规方法，从这些转化体提取出这些质粒来进行限制酶切分析，这表明所有该质粒有相同的结构。该质粒被定义为pKSR24。
将这样产生的pKSR24以PstⅠ和BglⅡ进行酶切，并利用DNA平端化试剂盒(Takara Brewery，公司制造)使其平端化。利用琼脂糖凝胶电泳和Prep-A-Gene DNA纯化系统(Bio-Rad公司)，分离出并纯化包含突变体proBA基因约2.9kb的DNA片段。将具图3中所显示的高温诱导类型启动子和限制酶切位点的pPAC1质粒的ClaⅠ酶切物，在借助于DNA平端化试剂盒使该片段平末端化后，连接到该DNA片段上。利用连接产物，转化大肠杆菌ATCC33625，从这些转化体中提取质粒以回收pKSR25，其中pKSR25具有突变体proBA插入在pPAC1的高温诱导类型启动子的下游的结构，因此该突变体的转录方向可能是一种有顺序的方向。
将实施例1中所产生的pKSR101以EcoRⅠ和BdlⅡ消化，并用DNA平端化试剂盒使其平端化，通过利用琼脂糖凝胶电泳和Prep-A-Gene DNA纯化系统(Bio-Rad公司制造)分离并纯化包含约1.2 kb KAL基因的DNA片段。将约1.2kb的该DNA片段与通过以XhoⅠ消化pKSR25，并用DNA平端化试剂盒使所消化的产物平端化而回收的DNA片段相连接。利用连接产物，转化大肠杆菌ATCC33625，从这些转化体中回收抗氨苄青霉素的转化体。对几个转化体进行3,4-脱氢脯氨酸抗性和KAL活性测定。证实所有转化体均有3,4-脱氢脯氨酸抗性和KAL活性。用常规方法，从八个这样的转化体中提取质粒以作限制酶切分析，这表明所有这些质粒有相同的结构。该质粒被定义为pKSR125。在图3中显示了质粒构建过程和pKSR125的限制酶图谱。
实施例9 通过加入水合乙醛酸的培养法产生4(S)HYP
在实施例2中所产生的菌株NHK46中，如下诱导具抗脯氨酸类似物铃兰氨酸的突变菌株。将通过与实施例2相同的方式培养的菌株NHK46，以与实施例2中相同的方式进行诱变，然后涂布在M9基本琼脂培养基上(该培养基中加入了0.5％葡萄糖，0.5g/l谷氨酸，100μg/l硫辛酸，100mg/l铃兰氨酸)，37℃下培育2天。在所产生的菌落中，收获较大的菌落，以获得抗铃兰氨酸突变菌株NHK47。
将实施例8中所产生的pKSRl25导入菌株NHK46与NHK47，利用氨苄青霉素抗性作为标记来获得转化体。将这些转化体的个体和携带pKSR101的菌株NHK46(如实施例2中产生)以与实施例2中相同的方式进行培养，并用HPLC测定这些培养上清液以检测4(S)HYP。HPLC测定条件柱；Shiseido CapcellPak-C18(4.6×150mm)流动相；A；10mM柠檬酸钠(pH4),B；相等体积的A和甲醇的混合溶液流速；1.5ml/分钟温度；50℃流动相的梯度时间表时间(分钟 B(体积％)0-10 0-810-20 8-8020-21 80-10021-23 10023-24 0检测；在Ex=470nm和Em=530nm时的荧光检测
表5中显示该结果。
表5宿主 质粒4(R)HYP(mM)4(S)HYP(mM)大肠杆菌NHK46 pKSR101 0.0 0.0大肠杆菌NHK46 pKSR125 0.0 2.1大肠杆菌NHK47 pKSR125 0.0 10.3
实施例10 通过两步反应产生4(S)HYP
通过Pl噬菌体的转导方法，将异柠檬酸脱氢酶缺失突变(icd)从具异柠檬酸脱氢酶缺失的大肠杆菌突变菌株EB106[由美国Ct.,New Haven，耶鲁大学，大肠杆菌基因储备中心提供]导入到大肠杆菌ATCC33625中，以产生菌株NHK3。由于icd突变，该突变菌株表达谷氨酸需要性。
利用实施例8中产生的pKSR25，个别地转化大肠杆菌ATCC33625和NHK3，以氨苄青霉素抗性作为标记来获得个别的转化体。此外，利用来源于pACYC177的质粒pKSR50(图.4)[该质粒携有一个携带插入在PstⅠ和ClaⅠ两位点之间的大肠杆菌谷氨酸脱氢酶基因(gdh)的4.2-kbDNA片段]和约3-kb DNA片段[该片段携带插入在BamHⅠ和SphⅠ两位点之间的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(zwf)]，转化携带pKSR25的大肠杆菌NHK3(NHK3/pKSR25菌株)，并利用对氨苄青霉素和氯霉素的抗性作为标记来获得携带pKSR50和pKSR25的菌株NHK3(NHK3/pKSR50+pKSR25)。同样将pKSR50和pKSR25导入到大肠杆菌K-12菌株突变类型(icd,sucA,putA,eda)的突变菌株NHK23中，以获得菌株NHK23/pKSR50+pKSR25。
按如实施例2中相同的方式，将所有上述所产生的大肠杆菌ATCC33625,NHK3,ATCC33625/pKSR25,NHK3/pKSR25,NHK3/pKSR50+pKSR25和NHK23/pKSR50+pKSR25，在T培养基中30℃同样地培养24小时。将实施例4中产生的包含4(S)KHG的培养上清液在通过微孔滤膜过滤和灭菌之后，加至该培养物中直到4(S)KHG的终浓度为40mM，然后将该混合物在37℃进一步搅拌培养24小时。用下列方法测定培养肉汤中的4(S)HYP。在80μl该培养上清液中加入甲醇溶液(100μl)[其包含硼酸盐缓冲液(pH9.6；20μl)和6mg/ml NBD-Cl(7-氯-4-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑氯化物)]以用于60℃、黑暗下反应20分钟，其后加入1N HCl(50μl)至反应溶液中以终止反应。使该混合物通过微孔滤膜过滤，滤液由HPLC以实施例9中相同的方式测定以检测4(S)HYP。表6中显示该结果。
另外，将谷氨酸棒杆菌KY10912在LB培养基中搅拌培养16小时。然后把该培养肉汤加入到5ml灭菌的TC培养基中，30℃搅拌培养24小时。将实施例4中产生的包含4(S)KHG的培养上清液在通过微孔滤膜过滤和灭菌之后，加至该培养物中直到4(S)KHG的终浓度为40mM，然后将该混合物在37℃进一步搅拌培养24小时。如同实施例9中由HPLC分析培养上清液以检测4(S)HYP。表6中显示该结果。
表6 宿 主 质 粒4(S)HYP(mM)大肠杆菌ATCC33625无 0.0大肠杆菌ATCC33625pKSR25 0.4大肠杆菌NHK3无 0.0大肠杆菌NHK3 pKSR25 0.9大肠杆菌NHK3 pKSR50+pKSR25 1.6大肠杆菌NHK23 pKSR50+pKSR25 5.8谷氨酸棒杆菌KY10912无 1.0
依据本发明，(S)-4-羟基-2-酮戊二酸和来自前体(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的化合物，例如(2S,4S)-4-羟基-L-谷氨酸以及(2S,4S)-4-羟基-L-脯氨酸，可以以工业上有利的方式来产生。(2S,4S)-4-羟基-L-脯氨酸具有包括抗肿瘤细胞活性[癌症研究48,2483(1988)]和抗肥大细胞活性(日本未审查专利出版物No.63-218621)的生物学作用。(S)-4-羟基-2-酮戊二酸和(2S,4S)-4-羟基-L-谷氨酸是用作为合成脯氨酸有用的原材料。
可以构成本发明的许多不同实施方案而不背离本发明的精神与范围。人们知道，本发明不限于本说明书所描述的特定的实施方案。相反，本发明旨在覆盖权利要求的精神与范围内所包括的各种改进和等同的方案。
序列表序列号：1序列长度：26序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸，合成DNA序列描述：CAAAAGCTTA TGAAAAACTG GAAAAC序列号：2序列长度：24序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸，合成DNA序列描述：TTTGGATCCT TACAGCTTAG CGCC序列号：3序列长度：22序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸，合成DNA序列描述：GACCCGTGCT AATATGGAAG AC序列号：4序列长度：22序列类型：核酸链型：单链拓扑结构：线型分子类型：其它核酸，合成DNA序列描述：GTCTTCCATA TTAGCACGGG TC