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1、(10)申请公布号 CN 103361433 A (43)申请公布日 2013.10.23 CN 103361433 A *CN103361433A* (21)申请号 201310316741.6 (22)申请日 2013.07.26 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 天津市秀鹏生物技术开发有限公司 地址 300384 天津市华苑产业区海泰发展六 道 6 号海泰绿色产业基地 F 座 3 门 601 室 (72)发明人 赵卫军 (54) 发明名称 用 于 检 测 人 类 细 胞 色 素 P450 酶 系 3A5(CYP3A5) 基因分型。
2、的引物组及试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种用于检测 CYP3A5 基因分 型的引物组及试剂盒。 用于检测CYP3A5基因分型 的引物组包括 CY3A5*1 引物对、 CY3A5*2 引物对、 CY3A5*3 引物对、 CY3A5*4 引物对、 CY3A5*5 引物 对、 CY3A5*6 引物对和内参引物对， 本发明的试剂 盒的应用实现了对 CYP3A5 基因的良好分型， 在器 官移植临床应用中， 对实现个体化使用免疫抑制 剂和安全使用免疫抑制剂具有很好的指导作用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 序列表 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产。
3、权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 序列表5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103361433 A CN 103361433 A *CN103361433A* 1/2 页 2 1. 一种用于检测人类细胞色素 P450 酶系 3A5(CYP3A5) 基因分型的引物组， 其特征包 括 CY3A5*1 引物对、 CY3A5*2 引物对、 CY3A5*3 引物对、 CY3A5*4 引物对、 CY3A5*5 引物对、 CY3A5*6 引物对及内参引物对。( 下述引物的位置来源于美国 GENBANK 网站的 CYP3A5 的参 考序列， Homo sapiens cytochr。
4、ome P450， family3， subfamily A， polypeptide5(CYP3A5)， RefSeqGene on chromosome7， NCBI Reference Sequence ： NG_007938.1) 所述 CY3A5*1 包括 5 对引物对 ： 第 1 对的上、 下游引物位于 CYP3A5 的 DNA 参考序列的 32013-32034 与 32390-32413 位 置， 上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.1、 SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列 ； 第 2 对的上、 下游引物位于 CYP3A5 的 DNA 参考序列的 11696。
5、-11717 与 12092-12111 位 置， 上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.6 所示的核苷酸序列 ； 第 3 对的上、 下游引物位于 CYP3A5 的 DNA 参考序列的 9158-9178 与 9768-9789 位置， 上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.7、 SEQ ID NO.9 所示的核苷酸序列 ； 第 4 对的上、 下游引物位于 CYP3A5 的 DNA 参考序列的 8029-8049 与 8344-8363 位置， 上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.10、 SEQ ID NO.12 所示的核苷酸序列。
6、 ； 第 5 对的上、 下游引物位于 CYP3A5 的 DNA 参考序列的 19765-19787 与 20321-20343 位 置， 上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.13、 SEQ ID NO.15 所示的核苷酸序列 ； 所 述 CY3A5*2 的 上、 下 游 引 物 位 于 CYP3A5 的 DNA 参 考 序 列 的 32013-32034 与 32390-32413 位置， 上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3 所示的核苷酸 序列 ； 所 述 CY3A5*3 的 上、 下 游 引 物 位 于 CYP3A5 的 DNA 参 。
7、考 序 列 的 11696-11717 与 12092-12111 位置， 上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6 所示的核苷酸 序列 ； 所述 CY3A5*4 的上、 下游引物位于 CYP3A5 的 DNA 参考序列的 9158-9178 与 9768-9789 位置， 上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.8、 SEQ ID NO.9 所示的核苷酸序列 ； 所述 CY3A5*5 的上、 下游引物位于 CYP3A5 的 DNA 参考序列的 8029-8049 与 8344-8363 位置， 上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.。
8、11、 SEQ ID NO.12 所示的核苷酸序列 ； 所 述 CY3A5*6 的 上、 下 游 引 物 位 于 CYP3A5 的 DNA 参 考 序 列 的 19765-19787 与 20321-20343 位置， 上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.14、 SEQ ID NO.15 所示的核苷 酸序列 ； 2. 根据权利 2 所述的一种用于检测人类细胞色素 P450 酶系 3A5(CYP3A5*1、 CY3A5*2、 CYP3A5*3、 CY3A5*4、 CYP3A5*5、 CY3A5*6) 基因分型的试剂盒， 其特征是包被有 CY3A5*1 引物 对、 CY3A5*2 引。
9、物对、 CYP3A5*3 引物对、 CY3A5*4 引物对、 CYP3A5*5 引物对、 CY3A5*6 引物对 及内参引物对的引物板和浓缩 dNTP-Buffer。 所述 CY3A5*1 共包括 5 对引物对 ： 第 1 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.1 与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列 ； 第2对的上、 下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.4与 SEQ ID NO.6 所示的核苷酸序列 ； 第 3 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.7 与 SEQ ID NO.9 所示的核苷酸序列 ； 第 4 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ。
10、 ID NO.10 与 SEQ ID NO.12 所示的核苷酸序列 ； 第 5 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.13 与 SEQ ID NO.15 所示的核苷酸序列 ； 权 利 要 求 书 CN 103361433 A 2 2/2 页 3 所述 CY3A5*2 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3 所示 的核苷酸序列 ； 所述 CY3A5*3 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6 所示 的核苷酸序列 ； 所述 CY3A5*4 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ I。
11、D NO.8、 SEQ ID NO.9 所示 的核苷酸序列 ； 所述 CY3A5*5 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.11、 SEQ ID NO.12 所 示的核苷酸序列 ； 所述 CY3A5*6 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.14、 SEQ ID NO.15 所 示的核苷酸序列。 权 利 要 求 书 CN 103361433 A 3 1/5 页 4 用于检测人类细胞色素P450酶系3A5(CYP3A5)基因分型的 引物组及试剂盒 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 特别涉及一种用于检测 CYP3A5 基因分型的试剂盒。 背景技术。
12、 0002 CYP3A5 基因位于人类 7 号染色体 q21.1-22.1 区域， 基因全长 31.8kb， 包含 13 个 外显子， 编码 502 个氨基酸。目前在中国人群中的分布主要以 CYP3A5*3 为主。CYP3A5*3 等位基因的 6986 位点存在 A G 的变化， 从而在第 3 内含子中创造了一个隐含的受体剪接 位点， 该位点促使基因内类外显子序列 ( 假外显子 ) 插入成熟的 mRNA 并包括随后外显子的 缺失 ( 或 ) 其基因序列的插入。这些异常的剪接导致若干框内提前终止密码子的出现。突 变型 CYP3A5 的 mRNA 比野生型更迅速、 更不稳定， 这种机制成为无义密码。
13、子介导的 mRNA 降 解， 促使含 PTC 的 mRNA 降解， 是集体细胞的一种保护性措施。因此， 突变纯合型携带者的总 mRNA 水平比另两种携带者显著减少， 最终导致 CYP3A5 蛋白的不表达， 使 CYP3A5 酶活性明 显降低甚至消失。 他克莫司作为基础免疫抑制剂， 具有治疗窗窄， 个体间药物代谢动力学差 异大的特点， 主要由胞色素氧化酶 P450(CYP) 酶系中的 CYP3A4 和 CYP3A5 代谢， 大量研究表 明， CYP3A5*1/*1 携带者与 CYP3A5*3/*3 携带者相比， 要达到相同的他克莫司血药浓度， 需 要的他克莫司剂量更高。 0003 我国每年大概要。
14、有 150 万名患者要进行器官移植， 而他克莫司是在器官移植后使 用的预防排斥反应的主要免疫抑制剂类药物之一。他克莫司作为一种强有效的免疫抑制 剂， 其治疗指数很窄， 个体差异较大， 故临床不良反应比较明显， 其中最主要的是肾毒害和 神经中毒， 所有根据患者的具体情况制定合理的个体化、 安全化治疗方案来降低不良反应 的发生具有很大的必要性。 研究表明， CYP3A5是他克莫司代谢的主要酶， 其对他克莫司的代 谢程度直接影响他克莫司在患者体内的血药浓度， 从而影响治疗的效果， 而 CYP3A5 的基因 多态性影响 CYP3A5 酶活性的表达。目前， 参考文献报道在中国人群内仅发现 CYP3A5*。
15、3 突 变型， 但是频率高达75。 因此在临床中检测CYP3A5基因分型对实现个体化用药和安全用 药具有很好的指导作用。当今， 关于 CYP3A5 基因分型的检测多采用测序和 PCR-RFLP 方法， 但这两种方法均存在一定的局限性。 0004 基于CYP3A5基因在中国人群分布的特点以及目前CYP3A5基因分型研究方法的局 限性， 开发建立了 【CYP3A5 基因测定试剂盒 (PCR-SSP)】 主要用于检测 CYP3A5 基因分型， 为 实现个体化用药和安全用药具有很好的指导作用。 发明内容 0005 本发明的目的是克服现有技术中的不足， 提供一种用于检测 CYP3A5 基因分型的 引物组。
16、。 0006 本发明的第二个目的是 ： 提供一种用于灵敏、 特异、 经济、 简便、 快速的特点的用于 检测 CYP3A5 基因分型的试剂盒。 说 明 书 CN 103361433 A 4 2/5 页 5 0007 一种用于检测人类细胞色素P450酶系3A5(CYP3A5)基因分型的引物组， 其特征包 括 CY3A5*1 引物对、 CY3A5*2 引物对、 CY3A5*3 引物对、 CY3A5*4 引物对、 CY3A5*5 引物对、 CY3A5*6 引物对及内参引物对。 0008 所述 CY3A5*1 共包括 5 对引物对 ： 第 1 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.1 与。
17、 SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列 ； 第 2 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.4 与 SEQ ID NO.6 所示的核苷酸序列 ； 第 3 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.7 与 SEQ ID NO.9 所示的核苷酸序列 ； 第 4 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.10 与 SEQ ID NO.12 所示的核苷酸序列 ； 第 5 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.13 与 SEQ ID NO.15 所示的核苷酸序列 ； 0009 所述 CY3A5*2 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ I。
18、D NO.2、 SEQ ID NO.3 所示的核苷酸序列 ； 0010 所述 CY3A5*3 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6 所示的核苷酸序列 ； 0011 所述 CY3A5*4 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.8、 SEQ ID NO.9 所示的核苷酸序列 ； 0012 所述CY3A5*5引物对的上、 下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.11、 SEQ ID NO.12 所示的核苷酸序列 ； 0013 所述CY3A5*6引物对的上、 下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.14、 SEQ ID NO.1。
19、5 所示的核苷酸序列。 0014 一种用于检测人类细胞色素 P450 酶系 3A5(CYP3A5*1、 CY3A5*2、 CYP3A5*3、 CY3A5*4、 CYP3A5*5、 CY3A5*6) 基因分型的试剂盒， 其特征是包被有 CY3A5*1 引物对、 CY3A5*2 引物对、 CYP3A5*3 引物组、 CY3A5*4 引物对、 CYP3A5*5 引物组、 CY3A5*6 引物对及内 参引物对的引物板和浓缩 dNTP-Buffer。 0015 所述 CY3A5*1 共包括 5 对引物对 ： 第 1 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.1 与 SEQ ID NO.3 所。
20、示的核苷酸序列 ； 第 2 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.4 与 SEQ ID NO.6 所示的核苷酸序列 ； 第 3 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.7 与 SEQ ID NO.9 所示的核苷酸序列 ； 第 4 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.10 与 SEQ ID NO.12 所示的核苷酸序列 ； 第 5 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.13 与 SEQ ID NO.15 所示的核苷酸序列 ； 0016 所述 CY3A5*2 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.2、 SEQ ID。
21、 NO.3 所示的核苷酸序列 ； 0017 所述 CY3A5*3 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6 所示的核苷酸序列 ； 0018 所述 CY3A5*4 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.8、 SEQ ID NO.9 所示的核苷酸序列 ； 0019 所述CY3A5*5引物对的上、 下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.11、 SEQ ID NO.12 所示的核苷酸序列 ； 0020 所述CY3A5*6引物对的上、 下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.14、 SEQ ID NO.15 所示的核苷酸序列。 说 。
22、明 书 CN 103361433 A 5 3/5 页 6 附图说明 0021 图 1 为 CYP3A5 基因特异引物孔位图 0022 图 2 为实验结果阴阳性判读图 0023 图 3 为 CYP3A5 实验结果阳性基因分型读板纸 0024 图 4 为 CYP3A5*1/*1 型电泳结果胶图 0025 图 5 为 CYP3A5*1/*3 型电泳结果胶图 0026 图 6 为 CYP3A5*3/*3 型电泳结果胶图 具体实施方式 0027 下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。 0028 实施例 1 0029 依据美国国立生物技术信息中心基因库 (NCBI Gene Bank) 公开的 CYP。
23、3A5 等位 基因序列， 设计出用于检测 CYP3A5 基因分型的引物组， 该引物组包括 CY3A5*1 引物对、 CY3A5*2 引物对、 CY3A5*3 引物对、 CY3A5*4 引物对、 CY3A5*5 引物对、 CY3A5*6 引物对、 及内 参引物对。 0030 实施例 2 0031 用于检测 CYP3A5 基因分型的试剂盒的制备方法是 ： 0032 (1) 依据 CYP3A5 基因特异引物孔位图 ( 见图 1)， 分别将 CY3A5*1 引物对、 CY3A5*2 引物对、 CY3A5*3 引物对、 CY3A5*4 引物对、 CY3A5*5 引物对、 CY3A5*6 引物对和内参引物。
24、对 包被至引物板的相应位置上， 干燥处理 ； 0033 (2) 依据配 220mM dNTP、 3.5mM Mg2+、 500mM KCL、 100mM Tris-HCL、 1 TritonX-100 制备出 440l 浓缩 dNTP-Buffer ； 0034 (3) 将包被有引物对的引物板每人份检测包括 10 孔特异性引物孔， 浓缩 dNTP-Buffer 组成一种用于人类 CYP3A5 基因分型检测的试剂盒。 0035 实施例 3 0036 使用操作流程 0037 一、 2.5琼脂糖凝胶的准备 ： 0038 1. 将加入 2.5g 琼脂糖加入 100ml1TBE 溶液 (Tris- 硼酸。
25、盐 -EDTA 溶液 )， 加热 直到形成均匀的凝胶溶液。再加入适量电泳染色剂， 混合均匀。 0039 2.将凝胶槽置于水平位置， 向凝胶槽中加入适量凝胶溶液， 插入电泳梳。 前后水平 移动凝胶槽， 确保凝胶溶液覆盖均匀。 0040 3. 待凝胶完全凝固后， 竖直拔出电泳梳。 0041 二、 PCR 循环参数见表 1 ： 0042 196 /2min1cycle 296 /20sec， 68 /60sec5cycles 说 明 书 CN 103361433 A 6 4/5 页 7 396 /20sec， 65 /50sec， 72 /45sec10cycles 496 /20sec， 63 /。
26、50sec， 72 /45sec15cycles 572 /5min1cycle 64保存 0043 表 1 扩增参数特征表 0044 三、 必须满足的试验条件 ： 0045 1. 从冷冻室取出 Taq 聚合酶， 放置冰上备用。 0046 2. 根据实验所需数量， 将包被引物的干燥冷冻保存的引物板取出， 放置室温解冻， 备用。 0047 3.根据实验所需数量， 将冷冻的DNA样本、 浓缩dNTP-Buffer取出， 彻底融化， 混匀 离心。 0048 四、 实验过程中的注意事项 ： 0049 1.PCR 扩增前后使用的加样器具要分开， 不得混用。 0050 2. 所有血液制品均应按照潜在的传染。
27、物处理。 0051 3. 当观察和拍摄胶凝体时， 要戴防紫外光的保护镜， 不要直视紫外光源。 0052 4. 试剂和样本应加样到微孔板的底部。 0053 5. 为避免交叉污染， 在不同样本和试剂之间要更换加样枪头。 0054 6. 在检测前应准备好所有试剂和样本， 一旦开始试验， 为确保得到可靠结果不可 中断操作。 0055 7.Taq 聚合酶粘性很大， 在分装过程中必须小心操作确保准确。 0056 8. 严格按照指定的顺序操作。 0057 五、 操作步骤 ： 选用实施例 2 制备的一种人类 CYP3A5 基因分型检测试剂盒 0058 配制 dNTP-Buffer 工作液 ： 0059 440。
28、l 浓缩 dNTP-Buffer+560l 无菌水 1000l dNTP-Buffer 工作液 0060 1.配制Buffer-酶混合液 ： 每人份用量 ： 100l dNTP-Buffer工作液+0.8l Taq 酶 (5units/l)+12l DNA 112.8l 0061 2. 漩涡混匀 Buffer- 酶混合液， 并瞬时离心， ， 使液体位于管底。 0062 3. 分别向每个引物孔 (1-10) 加入 10l 上述混合液。 0063 4. 每孔再分别加入 15-20l 石蜡油， 用密封膜封好 PCR 反应板 ( 引物板 )。 0064 5. 将引物板放入设置好循环参数的 PCR 仪内。
29、， 配合使用适当的板架适配器。PCR 循环参数见上文。 0065 6. 反应板顶部置 PCR 密封压力垫， 以防止液体蒸发， 关上 PCR 仪， 启动程序直至循 环结束。 0066 7. 启动 PCR 程序， 直到循环结束。 0067 8. 取出引物板， 轻轻地撕掉密封膜， 防止样品溅出。或者如果不立即电泳， 置于 4可保存 48 小时。 说 明 书 CN 103361433 A 7 5/5 页 8 0068 9. 按照照引物孔位图的顺序， 将每个 PCR 反应产物 (5-10l) 转移到 2.5琼脂 糖凝胶孔中。 0069 10.140-150V 电泳 15-20 分钟， 内参带和阳性带清晰。
30、分开即可停止电泳。 0070 11. 紫外光下观察结果并拍摄成像。 0071 12. 根据提供的读板纸解释分型结果。 0072 六、 质量控制程序 ： 0073 内参质控带(缓慢迁移的)作为成功扩增的质控手段， 在阴性孔应该总是可见的 ； 阳性孔的内参质控带可能会很弱或者不存在， 这是因为特异性引物扩增过程中与内参引物 竞争 Taq 酶等反应原料的结果。 0074 七、 实验结果的判读 ： 0075 检测CYP3A5电泳结果胶图(见图4、 图5、 图6)， 实验结果阴阳性判读图(见图2)， 实验结果阳性基因分型读板纸 ( 见图 3)。 0076 预期结果 ： 0077 阳性孔 ： 有两条带， 。
31、一条是内参带， 另一条是特异性扩增带 0078 阴性孔 ： 只有一条带， 是内参带， 无特异性扩增带 0079 产物大小和孔位 ： 见 CYP3A5 基因特异引物孔位图 ( 见图 1) 0080 根据 CYP3A5 基因特异引物孔位图 ( 见图 1) 或该试剂配套软件进行分型结果的判 定。 0081 该实验为定性试验， 特异性扩增带强弱将不影响结果判读 ； 扩增产物大小请参见 CYP3A5 基因特异引物孔位图 ( 见图 1) ； 并符合人类基因座位规则。 0082 以上实施例所涉及的引物对如下 ： 0083 CY3A5*1 共包括 5 对引物对 ： 第 1 对的上、 下游引物分别是序列表中 S。
32、EQ ID NO.1 与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列 ； 第2对的上、 下游引物分别是序列表中SEQ ID NO.4与 SEQ ID NO.6 所示的核苷酸序列 ； 第 3 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.7 与 SEQ ID NO.9 所示的核苷酸序列 ； 第 4 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.10 与 SEQ ID NO.12 所示的核苷酸序列 ； 第 5 对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.13 与 SEQ ID NO.15 所示的核苷酸序列 ； 0084 CY3A5*2 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SE。
33、Q ID NO.2、 SEQ ID NO.3 所示 的核苷酸序列 ； 0085 CY3A5*3 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.5、 SEQ ID NO.6 所示 的核苷酸序列 ； 0086 CY3A5*4 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.8、 SEQ ID NO.9 所示 的核苷酸序列 ； 0087 CY3A5*5 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.11、 SEQ ID NO.12 所 示的核苷酸序列 ； 0088 CY3A5*6 引物对的上、 下游引物分别是序列表中 SEQ ID NO.14、 SEQ ID NO.。
34、15 所 示的核苷酸序列。 说 明 书 CN 103361433 A 8 1/5 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 103361433 A 9 2/5 页 10 0003 序 列 表 CN 103361433 A 10 3/5 页 11 0004 序 列 表 CN 103361433 A 11 4/5 页 12 0005 序 列 表 CN 103361433 A 12 5/5 页 13 序 列 表 CN 103361433 A 13 1/3 页 14 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103361433 A 14 2/3 页 15 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103361433 A 15 3/3 页 16 图 6 说 明 书 附 图 CN 103361433 A 16 。