核酸的检测方法.pdf

本发明提供能够有效地排除检测目的以外的核酸的非特异检测、进一步提高目的核酸的检测特异性的核酸的检测方法等。本发明的核酸的检测方法是包含下述工序的方法：(a)使固定化有探针的凝胶与反应溶液接触的工序，该反应溶液包含核酸、核酸扩增用引物组、核苷酸单体和DNA延长酶，其中所述核酸作为核酸扩增的模板；(b)对上述凝胶和反应溶液实施用于进行核酸扩增反应的热循环处理的工序；(c)筛选扩增后的核酸片段中特定碱基长度的核酸片段的工序；以及(d)对所筛选的核酸片段进行检测的工序。

权利要求书
1.  一种核酸的检测方法，其包含下述工序：
(a)使固定化有探针的凝胶与反应溶液接触的工序，所述反应溶液包含核酸、核酸扩增用引物组、核苷酸单体和DNA延长酶，其中所述核酸作为核酸扩增的模板；
(b)对上述凝胶和反应溶液实施用于进行核酸扩增反应的热循环处理的工序；
(c)筛选扩增后的核酸片段中特定碱基长度的核酸片段的工序；以及
(d)对所筛选的核酸片段进行检测的工序。

2.  根据权利要求1所述的方法，其中，作为固定化有探针的凝胶，使用凝胶浓度不同的多种凝胶。

3.  根据权利要求1或2所述的方法，其中，相对于固定化有探针的凝胶与反应溶液的接触表面积(S(μm2))，该凝胶的体积(V(μm3))的比率(V/S)为50以上。

4.  根据权利要求1～3中任1项所述的方法，其中，固定化有探针的凝胶保持于基板中的凹坑或贯通孔中。

5.  根据权利要求1～4中任1项所述的方法，其中，固定化有探针的凝胶包含取代（甲基）丙烯酰胺衍生物和/或琼脂糖衍生物。

6.  根据权利要求1～5中任1项所述的方法，其中，固定化有探针的凝胶的凝胶浓度为大于2质量%且小于5质量%。

7.  一种生物芯片，其负载有凝胶浓度不同的多种凝胶，并且该凝胶是固定化有探针的凝胶。

8.  权利要求7所述的生物芯片的制造方法，其包含下述工序：
(a)通过以中空纤维的各纤维轴为相同方向的方式3维排列多根中空纤维并用树脂将该排列固定，从而制作中空纤维束的工序；
(b)将包含探针的、单体浓度不同的多种凝胶前体溶液导入中空纤维束的各中空纤维的中空部的工序；
(c)使导入所述中空部的凝胶前体溶液反应，将包含探针的凝胶状物保持在 中空纤维的中空部的工序；以及
(d)在与纤维的纵向交叉的方向上切断中空纤维束，进行薄片化的工序。

说明书核酸的检测方法
技术领域
本发明涉及使用DNA生物芯片的核酸的检测方法等。详细而言，涉及通过利用了应用点凝胶的分子筛效果的凝胶保持型DNA生物芯片的在芯片上的（on-chip）PCR反应进行的核酸的特异性检测方法等。
背景技术
DNA生物芯片是以固定化的DNA为探针与待检测核酸进行杂交反应的工具。
近年来，使用这样的DNA生物芯片进行待检测核酸中的特定的碱基序列的检测，在疾病相关基因的探索、临床诊断等领域中的实用化正在推进。
作为DNA生物芯片，已知例如利用光刻（Photolithography）在2维表面上逐次合成探针的DNA生物芯片（参照专利文献1）、以预先合成的探针在2维表面上进行点样的DNA生物芯片（参照专利文献2）、在树脂板等基板上形成多个槽或贯通孔，在这些槽或孔的内部保持包含DNA的凝胶的DNA生物芯片（参照专利文献3）、在平面基盘上配置包含DNA等的凝胶的点的DNA生物芯片（参照专利文献4）等。本发明人中的一部分也开发了通过下述方法得到的DNA生物芯片：制作在中空纤维的中空部保持有凝胶的中空纤维排列体，在与该排列体的纤维轴交叉的方向上切断（专利文献5参照）。
在以往的DNA生物芯片的使用方法中，由于存在于待检测物中的目标核酸通常为微量，因此需要预先通过T7扩增法、PCR法等对目标核酸进行扩增。此外，对于杂交反应，有时会花费一个晚上。因此，认为有必要使从反应至检测更简化。
为了缩短检测到目标核酸的时间，公开了多种在DNA生物芯片上进行PCR反应的技术。例如，在非专利文献1中公开了下述技术：利用在用规定的氨基硅烷试剂修饰后的玻璃基板的表面上共价结合有成为引物的DNA链的DNA生物芯片，通过固相PCR（Polymerase Chain Reaction）进行DNA扩增。
此外，在非专利文献2中，代替玻璃基板，使用聚（甲基丙烯酸甲酯），使用表面上固定化有DNA片段的DNA生物芯片来评价与规定的DNA链的杂交特性和在PCR样环境下的热稳定性。
作为进一步具体的应用的例子，正在尝试开发非专利文献3～4所示那样的迅速的微生物鉴定方法、单核苷酸多态性的检测方法。
然而，这些方法中仍然存在一些问题。特别是作为在基板上固定化有核酸的DNA生物芯片上的PCR反应的代表性的问题，可以列举下述1）～3）几点等。
1）热循环处理时（PCR反应时），固定化的引物会发生偏移。
2）如果在基板表面上进行PCR反应，则核酸的延伸反应效率低。
3）在PCR反应时，会发生非特异性的检测。
针对这些问题，正在考虑一些解决方案，但需要对基板上进行特殊的化学修饰，不能使用通常的核苷酸（使用取代核苷酸）等，实用性低（参照专利文献6～9）。
还有，除此以外，还公开了不将核酸固定化在基板表面上而是利用凝胶垫（gel pad）的DNA生物芯片技术。已知可以在DNA生物芯片上的凝胶垫内通过扩增反应和个别碱基的延伸进行检测反应（参照非专利文献5）。
使用凝胶的DNA生物芯片（参照专利文献3～5）与在2维表面上固定有探针的DNA生物芯片相比，一个区划所能固定化的探针量增加。因此，可以说是杂交效率（与探针结合的核酸相对于用于杂交的核酸的比例）优异的DNA生物芯片。
上述利用凝胶的DNA生物芯片能够通过作为检测对象的样品（以下，待检测物）在凝胶的多孔质结构中充分扩散并与凝胶中的探针进行反应，获得高杂交效率。然而，在迄今为止已知的凝胶DNA生物芯片中，有时不能使待检测物在凝胶的多孔质结构中充分扩散，仅能用于检测凝胶表面。
为了增大凝胶的多孔质结构的有效细孔径、提高待检测物的扩散等目的，正在进行构成凝胶的单体的种类、单体浓度的研究（参照专利文献10和非专利文献6～9）。例如，在非专利文献6中记载了使用8质量%的丙烯酰胺凝胶的方法，在非专利文献7和8中记载了通过使用5质量%的甲基丙烯酰胺凝胶， 能够使最大500碱基长度的DNA杂交。此外，在专利文献10中，通过使用含有2～7质量%的N,N-二甲基丙烯酰胺的凝胶作为在DNA生物芯片中使用的合适的凝胶，能够获得高杂交效率。进一步还已知有利用像N-异丙基丙烯酰胺那样的温度敏感性凝胶的方法（参照非专利文献9）。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利第5405783号说明书
专利文献2：美国专利第5601980号说明书
专利文献3：日本特开2000-60554号公报
专利文献4：美国专利第6682893号说明书
专利文献5：日本特开2000-270877号公报
专利文献6：日本特开2006-230335号公报
专利文献7：日本特开2007-330104号公报
专利文献8：日本特开2007-222010号公报
专利文献9：日本特开2009-219358号公报
专利文献10：专利第3654894号公报
非专利文献
非专利文献1：Adessi,Celine et al.,“Solid phase DNA amplification:Characterisation of primer attachment and amplification mechanisms”,Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）,2000,Vol.20,No.20,e87
非专利文献2：Fixe,F.et al.,“Functionalization of poly(methyl methacrylate)(PMMA)as a substrate for DNA microarrays”,Nucleic Acids Res.（《核酸研究》）,Jan.2004
非专利文献3：Georg,M.et al.,“Microarray-Based Identification of Bacteria in Clinical Samples by Solid-Phase PCR Amplification of 23S Ribosomal DNA Sequences”,JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY（《临床微生物学杂志》）,Mar.2004,p.1048-1057
非专利文献4：Martin H.et al.,“Detection of Single Base Alterations in Genomic DNA by Solid Phase Polymerase Chain Reaction on Oligonucleotide  Microarrays”,Analytical Biochemistry（《分析生物化学》）,299,24-30,2001
非专利文献5：Svetlana D.et al.,“Polymorphism analysis and gene detection by minisequencing on an array of gel-immobilized primers”,Nucleic Acides Res.（《核酸研究》）,1999,Vol.27,No.18,e19
非专利文献6：Gennady Yershov et al.,“DNA analysis and diagnostics on oligonucleotide microchips”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国科学院院刊》）,Vol.93,pp.4913-4918,May 1996
非专利文献7：A.Yu.Rubina et al.,“Hydrogel drop microchips with immobilized DNA:properties and methods for large-scale production”,Analytical Biochemistry（《分析生物化学》）,Vol.325,pp.92-106,2004
非专利文献8：Dmitry A.Khodakov et al.,”An oligonucleotide microarray for multiplex realtime PCR identification of HIV-1,HBV,and HCV”,BioTechniques（《生物技术》）,Vol.44,No.2,pp.241-248,2008
非专利文献9：迫原修治等，化学工学会第69年会I316：“DNA芯片構築のための感温性多孔質ゲルの応用”（“用于DNA芯片构建的温度敏感性多孔质凝胶的应用”）
发明内容
发明所要解决的课题
与在基板上固定化有探针的DNA生物芯片相比较，增大凝胶的多孔质结构的有效细孔径从而提高了待检测物扩散的利用凝胶的DNA生物芯片灵敏度高、热稳定性也高（探针不会由于热而从固定化的部位解离）。作为基因表达分析用DNA生物芯片是特别有用的。
然而，在基因表达分析中，只要使预先扩增、纯化了的RNA与DNA生物芯片上的探针杂交即可，但在实施DNA生物芯片上的PCR反应的情况下，实际上，在浸渍微阵列的液相、微阵列表面、微阵列内部等之中会发生预想不到的反应，在特异性方面产生与在基板上固定化有探针的DNA生物芯片同样的问题。特别是为了在微阵列上同时进行PCR反应与杂交反应，需要使用特异性高于迄今为止的微阵列的DNA生物芯片。
用于解决课题的方法
本发明人等深入研究，结果发现，通过使用利用凝胶的分子筛效果与探针的特异性两者的DNA生物芯片，能够进行特异性更高的核酸检测。
即，发现通过在凝胶利用型DNA生物芯片上同时进行利用PCR等核酸扩增方法进行的核酸扩增反应与杂交反应，目的核酸检测的特异性提高，从而完成了本发明。
即，本发明为如下所述。
（1）包含下述工序的核酸的检测方法。
（a）使固定化有探针的凝胶与反应溶液接触的工序，该反应溶液包含核酸、核酸扩增用引物组、核苷酸单体和DNA延长酶，其中所述核酸作为核酸扩增的模板；
（b）对上述凝胶和反应溶液实施用于进行核酸扩增反应的热循环处理的工序；
（c）筛选扩增后的核酸片段中特定碱基长度的核酸片段的工序；以及
（d）对所筛选的核酸片段进行检测的工序。
在该检测方法之中，固定化有探针的凝胶可以使用例如凝胶浓度不同的多种凝胶。此外，该凝胶也可以是例如保持于基板中的凹坑或贯通孔中的凝胶，还可以是包含取代（甲基）丙烯酰胺衍生物和/或琼脂糖衍生物的凝胶。进一步，该凝胶优选为根据作为检测对象的核酸的大小（碱基长度）而适当设定的凝胶浓度，可以列举例如凝胶浓度超过2质量%、小于5质量%的凝胶。
另外，该检测方法之中，例如，可以使该凝胶的体积（V(μm3)）相对于固定化有探针的凝胶与反应溶液的接触表面积（S(μm2)）的比率（即，使V的值除以S的值的值（V/S））为50以上。
（2）一种生物芯片，其负载有凝胶浓度不同的多种凝胶，并且该凝胶为固定化有探针的凝胶。
（3）权利要求7所述的生物芯片的制造方法，其包含下述工序。
（a）通过以中空纤维的各纤维轴为相同方向的方式3维排列多根中空纤维并用树脂将该排列固定，从而制作中空纤维束的工序；
（b）将包含探针的、单体浓度不同的多种凝胶前体溶液导入中空纤维束的各中空纤维的中空部的工序；
（c）使导入所述中空部的凝胶前体溶液反应（共聚反应），将包含探针的凝胶状物（探针固定化凝胶）保持在中空纤维的中空部的工序；以及
（d）在与纤维纵向交叉的方向上切断中空纤维束，进行薄片化的工序。
发明效果
根据本发明，可以提供下述核酸的检测方法以及该检测方法所用的生物芯片：所述核酸的检测方法在利用凝胶的DNA生物芯片上的核酸扩增反应（PCR等）中有效地排除检测目的以外的核酸的非特异检测，从而能够进一步提高目的核酸的检测特异性（特别是能够减少假阳性）。该检测方法之中，通过根据所扩增的目的核酸（检测对象的核酸）的大小（碱基长度）来适当设定凝胶浓度（凝胶的多孔质结构），能够提高凝胶的分子筛效果，可以提供特异性更高的检测方法。本发明的检测方法等是适合于对大量待检测物进行处理的用途的方法，实用性、有用性优异。
附图说明
图1是表示饱和环状聚烯烃制薄型96孔板所负载的贯通孔型DNA生物芯片的图。
图2是表示将饱和环状聚烯烃制薄型96孔板置于市售的热循环仪（Life Technologies公司制、GeneAmp 9700）时的状态的图。
图3是在反应凹坑内（反应液内）的检测对象DNA的扩增反应（扩增反应初期）的模式图。
图4是表示扩增产物向贯通孔型微阵列点凝胶内的选择性扩散的模式图。
图5是点凝胶内的PCR反应的模式图。
图6是表示制造中空纤维束（中空纤维排列体）所用的排列固定夹具的示意图。
图7是表示DNA生物芯片的各点的凝胶浓度与探针负载位置的示意图。
图8是表示大小不同的扩增产物的电泳图与这些扩增产物可以与探针杂交的位置的模式图。
图9是表示对于123bp的扩增产物检查分子筛效果的结果的图。
图10是表示对于413bp的扩增产物检查分子筛效果的结果的图。
图11是表示对于827bp的扩增产物与1191bp的扩增产物的混合物检查分 子筛效果的结果的图。
图12是表示扩增产物向比较例1所使用的平板状微阵列上的点的非选择性扩散的模式图。
具体实施方式
以下对本发明详细地进行说明。本发明的范围不局限于这些说明，除了关于以下的例示以外，在不损害本发明的宗旨的范围内，能够进行适当的变更而实施。其中，本说明书包含作为本申请优先权主张的基础的日本特愿2011-027588号说明书（2011年2月10日申请）的全部内容。此外，本说明书中所引用的全部出版物，例如现有技术文献以及公开公报、专利公报及其他专利文献，均作为参照加入本说明书中。
本发明涉及利用了点凝胶的特性（分子筛效果）与探针的特异性的协同效应的DNA生物芯片、以及通过在该DNA生物芯片上同时进行核酸扩增反应（PCR等）与杂交反应而进行的核酸的特异性检测方法。点凝胶是使包含1种以上的取代（甲基）丙烯酰胺衍生物、琼脂糖衍生物、交联剂和规定的探针的凝胶前体共聚而得到的凝胶。
这里，在说明书中，提及“DNA生物芯片”时，并非仅指固定化有DNA（脱氧核糖核酸）的生物芯片，而是指固定化有“探针”的生物芯片。此外，提及“生物芯片上的反应”时，是指“包含生物芯片与反应溶液的反应体系整体中的反应”，并不特别意味着利用了凝胶的微阵列中的仅在凝胶表面、凝胶内部的反应。
以下，对本发明所用的DNA生物芯片的制造方法的一个实施方式进行说明。
1.利用凝胶的DNA生物芯片的制造方法
＜固定化于凝胶的探针＞
本发明之中，所谓“探针”，表示脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、肽核酸（PNA）等核酸类，根据情况包含蛋白质、脂质等。这些探针能够从合成市售品或活细胞等获得。例如，从活细胞提取DNA可以按照Blin等的方法（Nucleic Acids Res.3.2303(1976)）等来实施，此外，RNA的提取可以按照Favaloro等的方法（Methods.Enzymol.65.718(1980)）等来实施。特别是在本发 明中，在DNA生物芯片的凝胶表面和凝胶内部发生核酸的延伸反应，因此，“探针”同时具有作为引物的功能。
此外，作为探针而使用的核酸是链状和环状中任一种形状均可，没有限定，可以列举例如质粒DNA或染色体DNA、RNA（其为病毒的情况下等）等。此外，还可以使用限制酶或化学性修饰后的或者切断后的DNA片段、在试管内利用酶等合成的DNA或者化学合成的寡核苷酸等。
如后所述，探针通过与取代（甲基）丙烯酰胺衍生物、琼脂糖衍生物和交联剂的共聚反应而固定于凝胶的网络结构。因此，优选在探针中导入有能够共聚反应的不饱和官能团（以下称为修饰探针）。作为不饱和官能团，可以列举例如（甲基）丙烯酰胺基、缩水甘油基等。在不损害探针·引物的功能的范围内，不饱和官能团可以在任意部位导入。例如，探针为核酸的情况下，不饱和官能团导入至核酸的末端和链中均可，但优选导入至核酸的链的末端。修饰探针可以用公知的方法来制造，例如，可以按照国际公开第02/062817号所记载的方法制造。
＜DNA生物芯片所保持的凝胶＞
在使用DNA生物芯片时，在反应体系整体实施用于进行核酸扩增反应（PCR等）的热循环处理。因此，凝胶只要是不会由于热而发生化学的、物理的变化从而探针向液相反应液溶出、熔解，不会在检测时形状变化而不能检测，就没有问题。具体而言，在实施PCR反应时，反应体系整体达到94℃左右的温度，但只要此时不发生凝胶本身的熔解、凝胶中固定的探针的溶出就没有问题。
凝胶的制作所用的单体（monomer）可以使用例如“取代（甲基）丙烯酰胺衍生物”。该衍生物是指下述通式（I）所表示的化合物。
[化1]

［通式（I）中，R1和R2相互独立地表示氢原子或饱和烷基。］
作为通式（I）所表示的取代（甲基）丙烯酰胺衍生物，没有限定，可以列举例如甲基丙烯酰胺（metacrylamide）、N-甲基丙烯酰胺（N-methlylacrylamide）、N,N-二甲基丙烯酰胺（N,N-dimethylacrylamide）、N-乙基丙烯酰胺（N-Ethylacrylamide）、N-环丙基丙烯酰胺（N-Cyclopropylacrylamide）、N-异丙基丙烯酰胺（N-isopropylacrylamide）、N,N-二乙基丙烯酰胺（N,N-Diethylacrylamide）、N-甲基-N-乙基丙烯酰胺（N-Methyl-N-Ethylacrylamide）、N-甲基-N-异丙基丙烯酰胺（N-Methyl-N-Isopropylacrylamide）、N-甲基-N-正丙基丙烯酰胺（N-Methyl-N-n-propylacrylamide）等。
凝胶的组成没有特殊限定，例如，除了上述取代（甲基）丙烯酰胺衍生物，也可以使用N-丙烯酰基氨基乙氧基乙醇、N-丙烯酰基氨基丙醇、N-羟甲基丙烯酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酸羟乙酯、（甲基）丙烯酸、烯丙基糊精等单体，进一步还可以使用使1种或者2种以上的取代（甲基）丙烯酰胺衍生物与亚甲基双（甲基）丙烯酰胺、聚乙二醇二（甲基）丙烯酸酯等多官能性单体共聚后的凝胶。此外，可以使用例如含有琼脂糖、海藻酸、葡聚糖、聚乙烯醇和聚乙二醇、以及它们的衍生物等的凝胶、或者用交联剂使它们交联后的凝胶。
所谓交联剂，是具有2个以上乙烯性不饱和键的多官能性单体。例如为N,N’-甲叉双丙烯酰胺、N,N’-二烯丙基（1,2-羟基亚乙基）-双丙烯酰胺、N,N’-胱胺-双丙烯酰胺、N-丙烯酰基三（羟甲基）氨基甲烷、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯等。可以优选使用N,N’-甲叉双丙烯酰胺。
下面，对共聚反应进行说明。
相对于凝胶的制作中所用的单体的合计摩尔数，共聚反应时所使用的修饰探针优选以1/10以下的摩尔数进行使用，但只要是在能够清除前述热循环处理时的耐性的条件的范围内就没有特殊限制。
相对于凝胶的制作中所用的单体（取代（甲基）丙烯酰胺衍生物等）的合计，共聚反应所使用的交联剂的量优选以摩尔比（单体：交联剂）计为8:2～500:1的范围。如果该摩尔比变得比8:2大，则凝胶网络不均匀化而容易产生白色浑浊，如果摩尔比变为500:1以下，则有可能变得不能保持作为凝胶的结 构。
聚合引发剂只要是在聚合反应时不发生探针的显著分解即可，没有限定，但优选聚合引发剂为2,2’-偶氮二〔2-（2-咪唑啉-2-基）丙烷〕二盐酸盐、APS（过硫酸铵）、KPS（过硫酸钾）等。另外，使用APS或者KPS作为聚合引发剂的情况下，还可以使用TEMED（四甲基乙二胺）作为聚合促进剂。
聚合反应时的反应温度没有限定，但使用偶氮系的聚合引发剂的情况下，优选为40℃以上。另外，单独使用APS、KPS时，优选为50℃以上。在APS、KPS中使用TEMED的情况下，优选室温～30℃的范围。
＜凝胶浓度的设定＞
通过上述共聚反应所形成的凝胶中的聚合物浓度（凝胶浓度）可以对应于凝胶的组成、所要检测的核酸的大小（碱基长度）而适当进行调整和设定。本发明中，还可以在同一微阵列上设置多个凝胶的区划（点），这种情况下，可以在同一微阵列上负载凝胶浓度不同的多种点凝胶。
具体的凝胶浓度没有特殊限定，优选为超过2质量%且小于5质量%，更优选为2.5～4.5质量%，进一步优选为2.5～4质量%，特别优选为2.8～3.8质量%。凝胶浓度在该范围内时，在特异性检测50碱基以上且小于3000碱基的碱基长度的核酸的情况下优选，更优选为50～2000碱基，进一步优选为100～2000碱基，更进一步优选为100～1500碱基，特别优选为100～1200碱基，尤其优选为100～1000碱基。此外，在构成凝胶的单体中包含例如N,N-二甲基丙烯酰胺的情况下，上述凝胶浓度的范围特别合适。
＜负载有探针固定化凝胶的基材的制作＞
本发明的核酸检测方法所用的探针固定化凝胶，只要能够与包含模板核酸等的反应溶液接触而进行核酸扩增反应（PCR等），则可以是任何形态，并无限定，基本上，优选为负载于某些基材上的形态。
例如，还能够通过将凝胶填充在管状体的中空部来制作凝胶保持管状体。例如，正如在日本特开平3-47097号公报中所记载的，该管状体能够作为基因突变的检测等的工具来使用。凝胶向管状体的中空部的保持可以以制作毛细管凝胶电泳所使用的毛细管柱的要领来实施。
此外，还可以制作负载有凝胶浓度不同的多种凝胶（探针固定化凝胶）的 生物芯片。例如，通过在平面基板上将聚合前或刚开始聚合的包含探针的单体溶液（单体浓度不同的多种凝胶前体溶液）在预定的区划内点样，能够制造DNA生物芯片（参照日本特表平6-507486号公报、美国专利第5,770,721号说明书）。上述基板之中，各区划由槽（包括凹坑）或贯通孔形成的情况下，通过在这些槽或贯通孔中添加聚合前或刚开始聚合的包含探针的单体溶液而在区划内实施聚合反应，能够制造在上述基板中的槽或贯通孔中保持有（负载有）探针固定化凝胶的DNA生物芯片（参照日本特开2000-60554号公报）。
进一步，可以通过反复进行下述操作来制作DNA生物芯片：将多根保持有探针固定化凝胶的管状体集束并在与管状体的纵向交叉的方向上切断该集束物而薄片化（参照国际公开第00/53736号）。另一方面，也可以先使多根管状体集束后，在该集束物的各中空部中保持凝胶后进行上述切断和薄片化。这种情况下，可以通过依次进行下述（1）～（4）的工序来制造DNA生物芯片。
（1）使多根管状体以其纵向一致的方式集束的工序。
（2）在集束物的各管状体的中空部中填充包含制作凝胶所用的单体、交联剂和探针的溶液的工序。
（3）在中空部内进行共聚反应的工序。
（4）在与集束物的纵向交叉的方向上进行切断的工序。
作为管状体，能够例示玻璃管、不锈钢管、中空纤维等。考虑到加工性、操作的容易性，特别优选使用中空纤维。此处，作为使用中空纤维作为管状体的情况下的生物芯片的制造方法，具体而言，能够例示依次进行下述（a）～（d）的工序的方法。
（a）通过以中空纤维的各纤维轴为相同方向的方式3维排列多根中空纤维并用树脂将该排列固定，从而制作中空纤维束的工序；
（b）将包含探针的、单体浓度不同的多种凝胶前体溶液导入中空纤维束的各中空纤维的中空部的工序；
（c）使导入所述中空部的凝胶前体溶液反应（共聚反应），将包含探针的凝胶状物（探针固定化凝胶）保持在中空纤维的中空部的工序；以及
（d）在与纤维纵向交叉的方向上切断中空纤维束，进行薄片化的工序。
如上所述进行，就能够制作在排列有多根中空纤维的中空部中保持有固定 化有探针（探针核酸等）的凝胶的DNA生物芯片。
＜DNA生物芯片的使用方法＞
以下接着对前述的DNA生物芯片的使用方法进行说明。
制作完DNA生物芯片后，可以按照以下（a）～（d）的步骤进行核酸的检测。
（a）使前述的探针固定化凝胶与反应溶液接触的工序，该反应溶液包含待检测物（作为核酸扩增的模板的核酸）以及核酸扩增用引物组、核苷酸单体和DNA延长酶。在该工序中，探针固定化凝胶可以是保持于DNA生物芯片等的基材上的状态，也可以是不保持于该基材等的状态。
（b）对上述凝胶和反应溶液实施用于进行核酸扩增反应（PCR等）的规定的热循环处理的工序。在该工序中，上述凝胶为保持于DNA生物芯片等的基材上的状态中的凝胶时，实施热循环处理的对象通常为与反应溶液接触了的DNA生物芯片等的整体（进而为整个反应体系）。
（c）筛选扩增后的核酸片段中特定碱基长度的核酸片段的工序。该工序中所谓特定碱基长度的核酸片段的筛选，是指通过依赖于凝胶浓度的探针固定化凝胶的分子筛效果进行的核酸片段的筛选。因此，该筛选是在核酸扩增反应后根据探针固定化凝胶的特性进行的工序。
（d）对所筛选的核酸片段进行检测的工序。
以下，对上述核酸检测的方法详细地进行说明。
＜作为核酸扩增的模板的核酸（待检测物）＞
反应溶液所包含的作为核酸扩增的模板的核酸，具体而言，是作为待检测物而使用的物质。
首先，准备含有核酸的液体。只要该溶液在热循环处理时不阻碍反应，已纯化或未纯化都没关系。纯化时，采取生物样品等并提取核酸。作为从活体成分提取核酸的方法，例如除了酚抽提、乙醇沉淀，还可以使用任意的提取方法。在提取mRNA时，还可以使用寡聚dT柱。如果有需要，可进一步对DNA或RNA进行分离纯化。更具体而言，包括例如某特定生物的基因组DNA、或者转录产物（mRNA）或将其逆转录后的cDNA、1种以上生物的基因组DNA混合物、转录产物（mRNA）的混合物等。进一步还包括对它们进行了酶处理、 进行了化学物质的作用的核酸。
以这些核酸为模板，通过核酸扩增反应，能够进行下述操作：扩增某区域的核酸片段，或者扩增仅在某特定生物中含有的核酸片段，或对特定基因的表达量（mRNA）进行定量等。作为核酸的扩增方法，有PCR法、LAMP法、ICAN法、TRC法、NASBA法、PALSAR法等各种方法，其中，优选PCR法，但只要在核酸的检测上不会产生特殊问题，就可以在核酸扩增反应中使用任一种方法。
＜核酸扩增用引物组＞
通常，拟检测的核酸序列（核酸片段）已预先决定。即，此时已决定拟检测的核酸的链长和区域，也已决定该链长的核酸能够通过的凝胶的组成·浓度。核酸扩增用引物组可以混合于液相的反应液中，也可以与探针一起固定于DNA生物芯片的点中。作为探针（也作为引物发挥作用）的寡核苷酸的碱基序列，以包含于扩增的序列（引物组所夹区域）的内部的方式决定引物组。引物通常设定为20～50核苷酸左右的长度，针对1个所扩增的基因区域，通常需要正向引物（Forward primer）和反向引物（Reverse primer）两种（1组）、或其以上（1组以上）的引物。
为了实施本发明，需要混有该1组以上的引物，固定化有1种以上具有与其扩增产物杂交的特异性碱基序列的探针。
此处，如果选择对于1组引物，能够扩增多个基因区域那样的序列，反应体系就变得更简单。具体而言，可以列举例如，对多个生物的16S rRNA的序列进行比较而在共有的区域内设计引物（1组），对每个物种在该引物所夹的内部设计用于检测各物种的探针的情况等。
进一步，以后续检测变得容易的方式，所使用的引物组可以预先用荧光物质（cy3、cy5等）、生物素等将其末端预先标记。标记方法没有特殊限定，只要在扩增反应中未见反应被显著阻碍等现象，任何方法均可。
＜核苷酸单体＞
核苷酸单体可以列举通常的扩增反应所用的三磷酸脱氧核苷酸等。它们与引物组同样，也可以使用使后续检测变得容易的衍生物，优选使用不阻碍扩增反应的物质。
＜DNA延长酶、其他＞
DNA延长酶与通常的PCR法所用的酶同样地，能够使用作为来自耐热性细菌的DNA聚合酶（DNA polymerase）的Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等。
作为可以使用的具体的酶、试剂盒，可以列举Hot StarTaq DNA Polymerase （凯杰公司制）、PrimeStarMax DNA聚合酶（宝生物工程株式会社）、Speed STAR HS DNA聚合酶（宝生物工程株式会社）、KOD-Plus-Neo（东洋纺公司）、KAPA2G FastHotStartPCR试剂盒（日本Genetics（株）公司）等。
＜热循环处理＞
使包含待检测物（待检测核酸）的反应溶液接触DNA生物芯片等所保持的探针固定化凝胶后，对包含该DNA生物芯片等的反应体系整体施加用于进行PCR等核酸扩增反应的规定的热循环处理。此处，关于使反应溶液接触探针固定化凝胶，可以将探针固定化凝胶（即保持有该凝胶的DNA生物芯片等）在反应溶液中浸渍，也可以对探针固定化凝胶（或者保持有该凝胶的DNA生物芯片等）供给反应溶液，并无限定。
此处，在本发明中，各区划的探针固定化凝胶中的、该凝胶与反应溶液的接触表面积（接触于反应溶液的该凝胶的表面积）（S(μm2)）优选相对于该凝胶的体积（V(μm3））不过大，过大的情况下，有可能不能充分发挥凝胶的分子筛效果（凝胶本身对核酸分子的大小进行筛选的效果）。例如，前述非专利文献6（Gennady Yershov et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国科学院院刊》）,Vol.93,pp.4913-4918,May1996）、非专利文献7（A.Yu.Rubina et al.,Analytical Biochemistry（《分析生物化学》）,Vol.325,pp.92-106,2004）所记载的技术之中，虽然已经做出通过使凝胶的形状更为扁平来提高扩散效率（尽可能增加对反应溶液的接触面积，使凝胶的网络结构大），这样就能够缩短杂交所需要的时间，但杂交的核酸分子在凝胶中会在短时间内达到饱和，因此，凝胶的分子筛效果几乎不能发挥。对此，本发明该凝胶的体积（V(μm3））相对于凝胶与反应溶液的接触表面积（S(μm2)）的比率（即，使V的值除以S的值的值（V/S））虽然没有限定，但为例如50以上，优选为75以上，更优选为100以上，进一步优选为125以上。通过以V/S的值为该范围内的方式设计探针固定化凝胶的 形状，特别是设计向基板的保持形态（负载形态），能够充分发挥凝胶的分子筛效果，进而能够使目的碱基长度的核酸的检测特异性更高。
这里，作为放入DNA生物芯片等与反应溶液两者的容器，考虑到能够一次性处理多个样品、具有放入DNA生物芯片等程度的大小的凹坑等，优选例如为96孔板形状且其尺寸符合SBS基准的容器。96孔板的各凹坑为方形、圆形中的哪一种均可。
此外，孔板的底面维持了导热性，因此，优选与散热片相接触的下面的高度差无限接近0，厚度薄。此外，关于耐热性，只要在103℃以上不发生变形就没有特别的问题。满足这样的条件的孔板的底部的厚度没有限定，但优选为0.05mm～0.5mm，更优选为0.1mm～0.4mm，进一步优选为0.15mm～0.35mm。如果该厚度超过上限值，则有可能导热性变差，如果小于下限值，则有可能在底部孔板中产生扭曲。
考虑到反应后通过光学方法进行检测，孔板优选底面透明性较高。另一方面，为了使上面密封，优选使用盖或密封膜。盖或密封膜的材质只要是不会对反应体系产生不利影响的材质即可。此外，只要是具有在适用的反应时施加的温度下不发生变形、杂质溶出等程度的耐热性和耐化学药品性等的物质即可。从上面用光学测定器测定时，可以使用例如，针对实时PCR用而出售的粘接密封膜等。
作为孔板的材质，优选热塑性树脂，可以使用荧光产生量少的物质。通过使用荧光产生量少的树脂，能够降低检测时的背景，因此，能够进一步提高检测灵敏度。作为荧光产生量少的热塑性树脂，可以使用例如聚乙烯、聚丙烯等直链状聚烯烃；环状聚烯烃；含氟树脂等。其中，饱和环状聚烯烃耐热性、耐化学药品性、低荧光性、透明性和成型性特别优异，因此，可以作为孔板的材质优选使用。作为市售的96孔板，可以使用例如Aurora Biotechnologies公司的96-IQ板等。
对于本检测方法所进行的热循环处理的温度控制的方法进行说明。该温度控制可以通过，例如使孔板的底面接触调节至任意温度的热板（热块）来对反应溶液的温度进行控制。作为其他方式，也可以通过将多个热板（热块）预先控制在各自规定的温度状态，使孔板在其上依次进行移动的方法，从而明显更 快地进行反应溶液的温度调整。此外，通过热板（热块）不仅与孔板的下方、还从上方接触，能够以更短时间进行反应溶液的温度调节·温度控制。
本检测方法的热循环处理所用的温度控制装置可以使用市售的热循环仪，但优选能够直接放置孔板的装置。例如，可以使用GeneAmp 9600、GeneAmp 9700（Life Technologies公司）、T Professional系列（Biometra公司）等，只要关于导热性、盖的形状不发生问题，为哪一种形式的装置均可。此外，加入有DNA生物芯片、反应液的孔板为不能放入热循环仪的深度（厚度）时，也可以使用将上面部分切削而使深度变浅，从而使厚度变薄了的孔板。
＜扩增产物的检测方法＞
作为扩增产物（扩增并且通过凝胶的分子筛效果筛选的核酸片段）的检测方法，可以使用例如使用荧光物质、发光物质作为标记基质，通过显色测定、荧光强度测定而进行检测的方法，或者通过目测而进行检测的方法。具体而言，可以使用荧光成像分析仪、CCD相机等进行扩增产物的有无判断和定量。此外，优选使用近年来广泛使用的PCR反应实时定量装置（Real Time PCR装置）等，通过逐点经时检测荧光量，能够进行可靠性更高的核酸的定量。进一步，也可以使用利用或不利用酶反应的显色试剂等在凝胶上进行显色。这种情况下，可以通过目测对DNA生物芯片上的检测点的位置进行判定、通过光学扫描仪进行扫描。
将本发明中的DNA生物芯片的使用方法的一个实施方式示于图1和图2。图1左上为7mm见方的DNA生物芯片、图1右为方形96孔板中容纳有96块7mm见方的DNA生物芯片的图。另外，图2为将其放置于热循环仪中的图。用热循环仪进行热循环处理后，取出孔板，可以立即用CCD相机从其上面或者下面进行检测。
接下来，对本发明的核酸的检测方法的原理进行说明。将利用凝胶的DNA生物芯片放入孔板的孔中，之后，在孔内中加入反应溶液，使DNA生物芯片接触或者浸渍于反应溶液，然后，可以通过进行热循环处理，实施PCR等核酸扩增反应。
该反应通过如下方式进行：将DNA生物芯片和反应液整体以预先优化了的各温度，通过“变性→复性→复制”的3阶段或者“变性→复性·复制”的 2阶段热循环处理，重复反应。
如图3所示，在热循环处理的初期阶段，液相（反应溶液中）中主要发生核酸扩增反应（PCR）。与此同时，一部分扩增产物（作为目标的核酸片段）与点凝胶所固定化的探针DNA进行杂交。在这种情况下，像基因组DNA那样大尺寸的核酸、非特异性扩增的核酸中不能扩散至凝胶内部那样大尺寸的核酸被排除，不能进入后续阶段（图4）。此外，如前所述，点的凝胶浓度是考虑对应于检测目的核酸的大小（碱基长度）、即要扩散至凝胶的内部的核酸的大小而设定的。
然后，通过反应溶液中所包含的DNA聚合酶，以目的DNA为模板，发生探针DNA的延伸反应。通过该延伸反应，形成液相中的引物DNA能够进行杂交的区域（图5右上和右下）。
之后，通过加热，在双链DNA解离的同时，来自液相中的引物在延伸后的探针（引物）末端退火，进行反向链的扩增反应。反向链仅至探针序列的3’末端部分具有模板，因此，合成以不完整的长度结束，但通过其后的加热，一部分向液相中扩散，能够发挥作为核酸扩增反应（PCR）的模板、引物的作用（图5下）。
通过反复进行这样的步骤，DNA扩增和固定化于凝胶的探针DNA的延伸、扩增产物（扩增核酸片段）的杂交、液相中的核酸扩增反应（PCR）同时进行。
如果最初加入液相中的引物末端以荧光物质等进行了标记，则能够通过在检测时对该标记的有无进行检测或者进行定量，进行目的DNA的检测、定量。
特别在本发明之中，如图4所示，即使在核酸扩增反应（PCR）时产生了意料之外的扩增产物，通过凝胶的分子筛效果，目的大小以上的核酸也难以扩散至凝胶内部、难以杂交，因此，实现了背景的降低和特异性的提高。本发明的DNA生物芯片具有在判断核酸的有无时容易获得明确的检测结果的特点。
以上内容中，作为一个实施方式，特别列举PCR法为例进行说明，但只要是更适于SNP检测用的反应体系的核酸扩增方法，则可以不限于PCR法而适用。
本发明的核酸的检测方法，可以列举如下应用，例如向单核苷酸基因多态性（SNP）分析、微卫星分析、染色体异常分析(CGH：Comparative Genomic  Hybridization)、功能未知（nc）的RNA探索等基因分析用基本工具的适用；向使用这些工具的器官·疾病特异性基因表达分析芯片、诱变试验试剂盒（环境激素）、转基因食品检测试剂盒、线粒体基因序列分析试剂盒、用于亲子鉴定·刑事调查的分析试剂盒、先天性疾病分析试剂盒、染色体·基因异常分析试剂盒、基因诊断（着床前·出生前）试剂盒、药物反应相关基因多型分析试剂盒、脂质代谢相关基因多型分析试剂盒、耳鼻科·眼科领域基因多型分析试剂盒等用途特异性定制芯片的适用；向癌症预后预测芯片、药品开发（临床·药品开发）用芯片、保健食品开发用芯片等诊断·临床用定制芯片的适用；向微生物限度检查、食品饮用水中的微生物检测等药品·食品制造工序、和龋齿·牙周病相关菌的检测、机会性感染菌的检测等牙科领域的临床检测、和食品工厂·厨房设施环境检测、饮料·公共浴场、井水等的水质检测中的环境检测、和传染病·食物中毒的预防、公司从业人员的卫生管理等保健卫生、以及包括抗性菌的一般细菌鉴定、肝炎病毒、幽门螺杆菌、肝炎衣原体菌、艾滋病毒、SARS病毒、西尼罗病毒、诺沃克病毒（来自生牡蛎的食物中毒）、流感病毒、真菌·霉菌等的临床检测等微生物鉴定检测试剂盒的适用等。
以下列举实施例对本发明具体地进行说明，但本发明并不受其限定。
实施例1
1.凝胶保持DNA生物芯片的制作（具有多个凝胶浓度不同的点的DNA生物芯片的制作）
通过以下方式来制造DNA生物芯片。
1-1.探针的调制
首先，调制作为探针的序列号1记载的寡核苷酸。此时，调制在寡核苷酸的5’末端导入有氨基己基的寡核苷酸。接着，使甲基丙烯酸酐与该寡核苷酸进行反应，进一步通过用HPLC进行纯化、分部收集，获得具有下述序列号1所表示的碱基序列的5’末端乙烯化寡核苷酸（探针（也作为引物发挥功能））。
5’-AGGAKGTTGGCTTAGAAGCAGCCA-3’（序列号1）
（简并符号K表示鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶盐(T)。）
该寡核苷酸能够与蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）的23S核糖体DNA序列（编码23S核糖体RNA的基因组DNA序列）的一部分进行杂交。
1-2.中空纤维束薄片板（DNA生物芯片）的制造
利用图6所示的排列固定器具来制造中空纤维束。这里，图6中的x、y、z为正交的3维轴，x轴与纤维的纵向一致。
参照图6，准备2块厚度0.1mm的多孔板21，每块所述多孔板上设置有合计108个直径0.32mm的孔11，该孔以孔的中心间距离设为0.42mm、以纵12列横各9列的方式设置。将这些多孔板重合，使其全部的孔内各由1根聚碳酸酯中空纤维31（三菱工程塑料公司制、添加1质量%炭黑）通过。
在x轴方向上，在各纤维上施加有0.1N的张力的状态下，移动2块多孔板的位置，从而固定于距中空纤维的一个端部20mm的位置和100mm的位置2处。即，将2块多孔板的间隔设为80mm。
接着，用板状物41包围多孔板间的空间的周围3面。通过这种方式，得到仅上部为开口状态的容器。
接着，从该容器的上部在容器内注入树脂原料。作为树脂，使用相对于聚氨酯树脂粘接剂（日本聚氨酯工业（株）制、NIPPORAN4276、CORONATE4403）的总重量添加有2.5质量%的炭黑的树脂。在25℃静置1周，使树脂固化。接着，拆除多孔板和板状物，得到中空纤维束。
调制以下述表1所示的质量%、浓度混合的溶液，作为凝胶前体聚合性溶液。使用1种前述序列号1所表示的寡核苷酸作为核酸探针，调制5种凝胶前体聚合性溶液。对于未负载探针处，使用水来代替核酸探针。将各点以及凝胶浓度、探针配置图示于图7。图7中，以浅色至深色划分颜色的区划表示凝胶浓度的差异。另外，“P”所表示的处所固定有核酸探针，“B”所表示的处所仅有凝胶而不含核酸探针。
[表1]

然后，将包含核酸探针的凝胶前体聚合性溶液设置于干燥器内。使干燥器内成为减压状态后，将中空纤维束的纤维束未固定的一个端部在该溶液中浸渍。在干燥器内封入氮气，在中空纤维的中空部导入包含核酸探针的凝胶前体聚合性溶液。接着，将容器内设为50℃，用3小时进行聚合反应。
通过这种方式，得到核酸探针通过凝胶状物保持于中空纤维的中空部的中空纤维束。
然后，将得到的中空纤维束用薄片切片机在与纤维的纵向正交的方向上以适当的片数进行切片，得到300片厚度0.25mm的薄片板（DNA生物芯片）（参照图1左上）。
在本实施例中如图1左下所示，各区划的探针固定化凝胶中的、该凝胶的体积（V(μm3））相对于凝胶与反应溶液的接触表面积（S(μm2)）的比率（即，使V的值除以S的值的值（V/S））为125。
2.利用了凝胶分子筛效果的特异性提高的确认
2-1.链长大小不同的模板DNA的制作
利用Summit Pharmaceuticals International株式会社的ATCC分销服务，购入蜡状芽孢杆菌的基因组DNA（保藏号：ATCC 14579)，用作PCR反应的模板。
设计针对上述模板的4组引物，以得到内部包含生物芯片所负载的探针序列（即，5’-AGGAKGTTGGCTTAGAAGCAGCCA-3’（序列号1））与来自蜡状芽孢杆菌的23S核糖体DNA序列（编码23S核糖体RNA的基因组DNA序列）的碱基序列的、4种碱基长度的核酸片段。
以下，列示设计的4组引物组（正向(F)引物和反向(R)引物）。
“用于获得123bp的PCR产物的引物”
·F引物(i)
PrimerFP123bp_cereus：5’-GTATTAAGTGGAAAAGGATGTGGAGTTGC-3’（序列号2）
·R引物(i)
PrimerRP123bp_cereus：5’-CCGGTACATTTTCGGCGCAGAGTC-3’（序列号3）
“用于获得413bp的PCR产物的引物”
·F引物(ii)
PrimerFP413bp_cereus:5’-AACTCCGAATGCCAATGACTTATCCTTAG-3’（序列号4）
·R引物(ii)
PrimerRP413bp_cereus:5’-AGCCTTCCTCAGGAAACCTTAGGCA-3’（序列号5）
“用于获得827bp的PCR产物的引物”
·F引物(iii)
PrimerFP827bp_cereus:5’-AACTCCGAATGCCAATGACTTATCCTTAG-3’（序列号6）
·R引物(iii)
PrimerRP827bp_cereus:5’-TTCACTGCGGCTTTCCGTTAAGAAAGCA-3’（序列号7）
“用于获得1191bp的PCR产物的引物”
·F引物(iv)
PrimerFP1191bp_cereus:5’-AACTCCGAATGCCAATGACTTATCCTTAG-3’（序列号8）
·R引物(iv)
PrimerRP1191bp_cereus:5’-CCGCCTATCCTGTACAAACTGTACCAA-3’（序列号9）
蜡状芽孢杆菌的23S核糖体DNA序列（编码23S核糖体RNA的基因组DNA序列）利用由美国生物技术信息中心（NCBI：National Center for Biotechnology Information）提供的GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中以Accession No.:AJ310099.1登录的物质。以下，列示蜡状芽孢杆菌的23S核糖体DNA序列（编码23S核糖体RNA的基因组DNA序列；序列号10）的碱基序列。该碱基序列中，附有下划线的碱基序列为可以与探针（序列号1）杂交的序列（由于为双链，杂交反向链（互补链））。
“Bacillus cereus AJ310099.123S rRNA gene”（序列号10）：
CACGGTGGATGCCTTGACACTAGGAGTCGATGAAGGACGGGACTAACGCCGATATGCTTCGGGGAGCTGTAAGTAAGCTTTGATCCGAAGATTTCCGAATGGGGAAACCCACTATACGTAATGGTATGGTATCCTTACCTGAATACATAGGGTATGGAAGACAGACCCAGGGAACTGAAACATCTAAGTACCTGGAGGAAGAGAAAGCAAATGCGATTTCCTGAGTAGCGGCGAGCGAAACGGAATCTAGCCCAAACCAAGAGGCTTGCCTCTTGGGGTTGTAGGACATTCTATACGGAGTTACAAAGGAACGAGGTAGACGAAGCGACCTGGAAAGGTCCGTCGTAGAGGGTAACAACCCCGTAGTCGAAACTTCGTTCTCTCTTGAATGTATCCTGAGTACGGCGGAACACGTGAAATTCCGTCGGAATCTGGGAGGACCATCTCCCAAGGCTAAATACTCCCTAGTGATCGATAGTGAACCAGTACCGTGAGGGAAAGGTGAAAAGCACCCCGGAAGGGGAGTGAAAGAGATCCTGAAACCGTGTGCCTACAAATAGTCAGAGCCCGTTAATGGGTGATGGCGTGCCTTTTGTAGAATGAACCGGCGAGTTACGATCCCGTGCAAGGTTAAGTTGAAGAGACGGAGCCGCAGCGAAAGCGAGTCTGAATAGGGCGTTTAGTACGTGGTCGTAGACCCGAAACCAGGTGATCTACCCATGTCCAGGGTGAAGTTCAGGTAACACTGAATGGAGGCCCGAACCCACGCACGTTGAAAAGTGCGGGGATGAGGTGTGGGTAGCGGAGAAATTCCAATCGAACCTGGAGATAGCTGGTTCTCCCCGAAATAGCTTTAGGGCTAGCCTTAAGTGTAAGAGTCTTGGAGGTAGAGCACTGATTGAACTAGGGGTCCTCATCGGATTACCGAATTCAGTCAAACTCCGAATGCCAATGACTTATCCTTAGGAGTCAGACTGCGAGTGATAAGATCCGTAGTCAAGAGGGAAACAGCCCAGATCGCCAGCTAAGGTCCCAAAGTGTGTATTAAGTGGAAAAGGATGTGGAGTTGCTTAGACAACTAGGATGTTGGCTTAGAAGCAGCCACCATTTAAAGAGTGCGTAATAGCTCACTAGTCGAGTGACTCTGCGCCGAAAATGTACCGGGGCTAAATACACCACCGAAGCTGCGAATTGATACCAATGGTATCAGTGGTAGGGGAGCGTTCTAAGTGCAGTGAAGTCAGACCGGAAGGACTGGTGGAGCGCTTAGAAGTGAGAATGCCGGTATGAGTAGCGAAAGACGGGTGAGAATCCCGTCCACCGAATGCCTAAGGTTTCCTGAGGAAGGCTCGTCCGCTCAGGGTTAGTCAGGAC CTAAGCCGAGGCCGACAGGCGTAGGCGATGGACAACAGGTTGATATTCCTGTACCACCTCTTTATCGTTTGAGCAATGGAGGGACGCAGAAGGATAGAAGAAGCGTGCGATTGGTTGTGCACGTCCAAGCAGTTAGGCTGATAAGTAGGCAAATCCGCTTATCGTGAAGGCTGAGCTGTGATGGGGAAGCTCCTTATGGAGCGAAGTCTTTGATTCCCCGCTGCCAAGAAAAGCTTCTAGCGAGATAAAAGGTGCCTGTACCGCAAACCGACACAGGTAGGCGAGGAGAGAATCCTAAGGTGTGCGAGAGAACTCTGGTTAAGGAACTCGGCAAAATGACCCCGTAACTTCGGGAGAAGGGGTGCTTTCTTAACGGAAAGCCGCAGTGAATAGGCCCAAGCGACTGTTTAGCAAAAACACAGGTCTCTGCGAAGCCGTAAGGCGAAGTATAGGGGCTGACACCTGCCCGGTGCTGGAAGGTTAAGGAGAGGGGTTAGCGTAAGCGAAGCTCTGAACTGAAGCCCCAGTAAACGGCGGCCGTAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGAAATTCCTTGTCGGGTAAGTTCCGACCCGCACGAAAGGTGTAACGATTTGGGCACTGTCTCAACCAGAGACTCGGTGAAATTATAGTACCTGTGAAGATGCAGGTTACCCGCGACAGGACGGAAAGACCCCGTGGAGCTTTACTGTAGCCTGATATTGAATTTTGGTACAGTTTGTACAGGATAGGCGGGAGCCATTGAAACCGGAGCGCTAGCTTCGGTGGAGGCGCTGGTGGGATACCGCCCTGACTGTATTGAAATTCTAACCTACGGGTCTTATCGACCCGGGAGACAGTGTCAGGTGGGCAGTTTGACTGGGGCGGTCGCCTCCTAAAGTGTAACGGAGGCGCCCAAAGGTTCCCTCAGAATGGTTGGAAATCATTCGTAGAGTGCAAAGGCATAAGGGAGCTTGACTGCGAGACCTACAAGTCGAGCAGGGACGAAAGTCGGGCTTAGTGATCCGGTGGTTCCGCATGGAAGGGCCATCGCTCAACGGATAAAAGCTACCCCGGGGATAACAGGCTTATCTCCCCCAAGAGTCCACATCGACGGGGAGGTTTGGCACCTCGATGTCGGCTCATCGCATCCTGGGGCTGTAGTCGGTCCCAAGGGTTGGGCTGTTCGCCCATTAAAGCGGTACGCGAGCTGGGTTCAGAACGTCGTGAGACAGTTCGGTCCCTATCCGTCGTGGGCGTAGGAAATTTGAGAGGAGCTGTCCTTAGTACGAGAGGACCGGGATGGACGCACCGCTGGTGTACCAGTTGTTCTGCCAAGGGCATAGCTGGGTAGCTATGTGCGGAAGGGATAAGTGCTGAAAGCATCTAAGCATGAAG
＜PCR反应＞
以50ng/μL蜡状芽孢杆菌基因组DNA为模板，分别用前述4组引物组进行PCR反应。PCR反应中使用AmpDirect试剂盒（岛津制作所）。
＜PCR反应液组成＞

PCR反应中使用GeneAmp9600热循环仪。温度条件如下所示。
＜PCR反应温度条件＞
95℃ 10分钟
（94℃ 30秒、64℃ 1分钟、72℃ 30秒）×35循环
72℃ 1分钟
反应结束后保持4℃
反应后，用凯杰（Qiagen）公司的MinElute PCR纯化试剂盒进行纯化，用14μL洗脱。之后，用安捷伦公司的生物分析仪实施电泳，结果确认到目的大小的PCR产物。图8中表示电泳结果以及各产物内部的对应于探针序列的位置的模式图。图8中，泳道L为大小标记物（size marker），泳道1～4依次分别为123bp、413bp、827bp和1191bp的PCR产物。
测定得到的PCR产物的吸光度，计算浓度，将浓度全部调整至5fmol/μL。
2-2.在保持有凝胶的DNA生物芯片上的PCR反应
将利用中空纤维的凝胶保持DNA生物芯片（也参照图1左）放入通过切削加工使厚度为8mm的Aurora Biotechnologies公司的96-IQ板的1个孔中，进一步加入以下组成的PCR反应液100μL。
＜PCR反应液组成＞

加入反应液后，用实时PCR用的粘接密封膜（ABI PRISM Optical Adhesive Covers、ABI公司#4311971）将上部密封，使反应液不会泄露。
接下来，将96孔板放置于热循环仪GeneAmp9700（0.2mL块）中。放置时，放置与该孔板的底面相同大小（11.5×7.5cm）的0.8mm厚铝板，在其上放置该孔板。进一步，放置Microseal‘P+’密封垫（Bio-Rad公司制），以位置无偏移的方式慢慢地滑动盖子，降低杠杆，维持从上方按压的状态。
热循环仪的程序以如下温度设定进行设定，对反应体系整体进行热循环处理。实施合计40循环的热循环程序。
＜热循环处理＞
94℃ 7分钟
（92℃ 30秒、60℃ 1分钟、72℃ 1分钟）×20循环
（92℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒）×20循环
反应结束后保持4℃
PCR反应结束后，从装置取出孔板，通过移液操作除去全部PCR反应液，用凯杰公司的MinElute PCR纯化试剂盒进行纯化，用14μL洗脱。测定浓度，结果为156nmol/μL。
DNA生物芯片通过用200μL TN缓冲液2次移液操作吹吸后，粘接密封并在50℃放置20分钟。之后，通过移液操作除去全部200μL TN缓冲液，通过用200μL TN缓冲液2次移液操作吹吸后，全部除去，加入100μL TN缓冲液，继续检测操作。
检测操作使用了冷却CCD相机方式的DNA生物芯片自动检测装置。从凹坑上部以曝光时间1秒钟对DNA生物芯片进行拍摄，检测各点中的cy5的 荧光信号。将其检测结果示于图9。
将点的荧光强度设为点内的荧光强度的中位数而定量化时，显示了依赖于凝胶浓度的荧光强度。图9的图表中，右端的B-Med为空白点的荧光强度。将空白点的荧光强度＋空白点的标准差的2倍设为临界值，判定是否能够检测。其结果判断为对于123bp，勉强在全部凝胶浓度的点能够检测。可是在2质量%凝胶中，由于从点的脱落、凝胶的形状不良，观察到荧光强度发生大的偏差。
根据该结果，利用凝胶的分子筛效果，通过配置设定为与所要检测的核酸的大小相对应的凝胶浓度的点，观察到荧光强度依赖于凝胶浓度而降低从而根据大小进行的选择。
可知，通过利用探针的核酸的筛选、依赖于凝胶浓度的核酸大小的筛选这样的双重作用，能够提供与平板状的微阵列相比较可以进行更特异性的检测的DNA生物芯片。
实施例2
除了将实施例1的2-2.项（在保持有凝胶的DNA生物芯片上的PCR反应）之中PCR反应液组成变更为以下的组成以外，实施与实施例1同样的操作。
＜PCR反应液组成＞

与实施例1同样地，PCR反应结束后，从装置取出孔板，通过移液操作除去全部PCR反应液，用凯杰公司的MinElute PCR纯化试剂盒进行纯化，用14μL洗脱。测定浓度，结果为401nmol/μL。
与实施例1同样地，检测各点中的cy5的荧光信号，将检测结果示于图10。
将点的荧光强度设为点内的荧光强度的中位数而定量化时，显示了依赖于凝胶浓度的荧光强度。与实施例1同样，将空白点的荧光强度＋空白点的标准 差的2倍设为临界值，判定是否能够检测。其结果显示，对于413bp，在10质量%凝胶浓度的点中判断为不能检测，但在2.8质量%和3.8质量%的凝胶点中能够良好地检测。此外，在2质量%凝胶中由于从点的脱落、凝胶的形状不良，观察到荧光强度发生大的偏差。
根据该结果，利用凝胶的分子筛效果，通过配置设定为与所要检测的核酸的大小相对应的凝胶浓度的点，观察到荧光强度依赖于凝胶浓度而降低从而根据大小进行的选择。
可知，通过利用探针的核酸的筛选、依赖于凝胶浓度的核酸大小的筛选这样双重作用，能够提供与平板状的微阵列相比较可以进行更特异性的检测的DNA生物芯片。
实施例3
除了将实施例1的2-2.项（在保持有凝胶的DNA生物芯片上的PCR反应）之中PCR反应液组成变更为以下的组成以外，实施与实施例1同样的操作。
＜PCR反应液组成＞

与实施例1同样地，PCR反应结束后，从装置取出孔板，通过移液操作除去全部PCR反应液，使用凯杰公司的MinElute PCR纯化试剂盒进行纯化，用14μL洗脱。测定浓度，结果为827bp的产物为147.7nmol/μL、1191bp的产物为70.6nmol/μL（从电泳的条带换算）。
与实施例1同样地，检测各点中的cy5的荧光信号，将检测结果示于图11。
将点的荧光强度设为点内的荧光强度的中位数而定量化时，显示了依赖于凝胶浓度的荧光强度。与实施例1同样，将空白点的荧光强度+空白点的标准差的2倍设为临界值，判定是否能够检测。其结果显示，对于827bp和1191bp的混合物，在3.8质量％～10质量％凝胶浓度的点中判断为不能检测，但在2.8质量％凝胶中能够良好地检测。在2质量％凝胶中，与实施例l和2同样，观察到从点的脱落。此外，观察到荧光强度发生偏差。
根据该结果，利用凝胶的分子筛效果，通过配置设定为与所要检测的核酸的大小相对应的凝胶浓度的点，观察到荧光强度依赖于凝胶浓度而降低从而根据大小进行的选择。
可知，通过利用探针的核酸的筛选、依赖于凝胶浓度的核酸大小的筛选这样的双重作用，能够提供与平板状的微阵列相比较可以进行更特异性的检测的DNA生物芯片。
[比较例1]
将市售的水凝胶涂层片(Hydrogel coating slide)(CodeLink(注册商标)Activated Microarray Slides(Surmodics，Inc.#DN01-0025))切成7mm见方，将寡聚DNA点于其上，制作平板状的DNA微阵列(图12)。微阵列的制作方法是按照日本特开2006-174788号公报的实施例1的方法来制作。
与实施例1同样地将制作的微阵列放入方形96孔板的孔内，浸渍于100μLPCR反应液中，实施PCR反应。
通过与实施例1和2同样的方法，分别实施各个大小(123、413、827、1191bp)的PCR反应实验，检测各点中的cy5的荧光信号。将其检测结果(点内的荧光强度的中位数)示于下述表2。
[表2]
模板所用的PCR产物的大小荧光强度的中位数1 2 3 b p123044 1 3 b p112458 2 7 b p110251 1 9 1 b p12031
基板表面上固定有探针(也作为引物发挥功能)的微阵列中，没有分子筛 效果，因此，无论用怎样大小的模板均检测到同等程度的信号强度。即，可以认为，在暂时生成、混入有基因组DNA、尺寸大的非特异的扩增产物的情况下，处于容易受到它们的非特异性杂交的影响的状态。
产业可利用性
本发明的核酸的检测方法和该检测方法所用的DNA生物芯片等，例如，适用于对大量待检测物进行处理的用途，实用性和有用性优异。
符号说明
11  孔
21  多孔板
31  中空纤维
41  板状物
保藏号
保藏号：ATCC 14579
序列表自由文字
序列号1：合成DNA
序列号2：合成DNA
序列号3：合成DNA
序列号5：合成DNA
序列号6：合成DNA
序列号8：合成DNA
序列号9：合成DNA