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1、(10)申请公布号 CN 103352044 A (43)申请公布日 2013.10.16 CN 103352044 A *CN103352044A* (21)申请号 201310282227.5 (22)申请日 2013.07.05 C12N 15/53(2006.01) C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 安徽农业大学 地址 230036 安徽省合肥市长江西路 130 号 (72)发明人 林毅 刘鑫 王艳玲 姜家生 蔡永萍 (74)专利代理机构 安徽汇朴律师事务所 34116 代理人 胡敏 (54) 发明名称 一种 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因片段的 构建获。
2、得方法 (57) 摘要 本发明公开了一种 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢 酶基因片段的构建获得方法， 步骤包括 ： 提取棉 花雄性不育系与可育系的花药总 DNA， 设计并合 成如 SEQ ID NO:1 所示的上游引物和如 SEQ ID NO:2 所示的下游引物， 以花药总 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 分离出编码棉花 Spot-9-UDP- 葡萄糖 脱氢酶的基因。本发明的突出优势是设计并合成 了 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因片段特异性引 物， 同时提供了该基因 PCR 扩增的最佳反应条件， 首次在棉花雄性不育系中克隆了该基因片段 ； 通 过比较该基因在不育系与可育系植株。
3、中表达的差 异性， 为进一步探讨该基因与棉花不育性状之间 的关系奠定了基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 序列表2页 (10)申请公布号 CN 103352044 A CN 103352044 A *CN103352044A* 1/1 页 2 1. 一种 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法， 其特征在于， 包括以 下步骤 ： 提取棉花雄性不育系与可育系的花药总 DNA， 设计如 SEQ ID NO:1 所示的上游引 物和如 SEQ ID。
4、 NO:2 所示的下游引物， 以花药总 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 分离出棉花 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因。 2. 根据权利要求 1 所述的一种 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法， 其特征在于， 所述上游引物和下游引物与基因非扩增区域无同源性， 无发夹结构， 且其内部 链无二级结构， 长度均为 24bp。 3. 根据权利要求 1 所述的一种 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法， 其特征在于， 所述 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因具有 SEQ ID NO:3 所示的多核苷酸序列 以及它的突变形式， 所述突变形式包括。
5、 ： 缺失、 无义、 插入、 错义。 4. 根据权利要求 1 所述的一种 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法， 其特征在于， 所述 PCR 扩增的反应条件为 ： 94预变性 3 5min， 94变性 30s， 65退火 30s， 72延伸 2min， 30 35 个循环， 循环结束后， 再进行 72延伸 7 10min。 5. 根据权利要求 1 所述的一种 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法， 其特征在于， 所述棉花雄性不育系与可育系的花药选自 6 个时期， 包括 ： 幼花药发育期， 花 粉母细胞发育期， 花粉母细胞减数分裂期， 花粉粒发育期， 。
6、纤维层发育期和成熟花粉期。 权 利 要 求 书 CN 103352044 A 2 1/3 页 3 一种 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法 技术领域 0001 本发明涉及基因工程技术领域， 具体地说， 是一种 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基 因片段的构建获得方法。 背景技术 0002 目前， 植物雄性不育的分子生物学研究在逐步开展， 对于花粉发育的研究已有相 当多的理论支持。马小定等应用 cDNA-AFLP 分析棉花双隐性核不育系 ms5ms6 的不育株和 可育株花粉进行对比， 得到 17 个差异条带， 这些基因的表达在时间和空间上也均存在着差 异， 经过BLA。
7、ST比对找到有14个同源性较高的基因， 分别是与细胞壁发育， 基因表达和能量 代谢相关的基因， 将这些基因在 NCBI 中比对， 找到同源性最高的 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢 酶基因 cDNA 序列。 0003 尿苷二磷酸葡糖脱氢酶 （UDPGDH） 主要参与 4 种代谢途径， 包括 ： 戊糖和葡萄糖醛 酸之间的转化、 抗坏血酸和醛糖二酸的代谢、 淀粉和蔗糖之间的转化以及核苷酸糖的代谢 过程， 它参与的反应如下 ： 0004 0005 UDP- 葡糖醛酸是合成细胞壁和多种糖的前体物质， 是核糖代谢途径的重要的中间 产物， 许多糖类是由 UDP- 葡萄糖醛酸衍生出来的， 在有机体中扮演着。
8、重要角色。UDPGDH 在 多糖合成中的作用为 ： UDPGDH 催化 UDPG 生成 UDP- 葡萄糖醛酸， 可能是生成纤维素果胶途 径的关键酶。纤维素果胶是合成初生壁的重要前体， 所以 UDPGDH 在细胞壁发育过程中起着 一定的作用。而不育的发生与小孢子壁的发育有关， 因此 UDPGDH 基因可能在败育过程中起 作用。 0006 本研究以一种UDPGDH基因Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因为研究对象， 通过分析 其在可育株与不育株 DNA 序列的差异性， 研究其对基因表达的影响， 进而分析该基因对植 株育性的调控。 发明内容 0007 本发明的目的是针对现有技术的不足， 提供一种 。
9、Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因 片段的构建获得方法。 0008 为实现上述目的， 本发明采取的技术方案是 ： 0009 一种 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因片段的构建获得方法， 包括以下步骤 ： 0010 提取棉花雄性不育系与可育系的花药总 DNA， 设计如 SEQ ID NO:1 所示的上游引 物和如 SEQ ID NO:2 所示的下游引物， 以花药总 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 分离出编码棉花 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因。 0011 所述上游引物和下游引物与基因非扩增区域无同源性， 无发夹结构， 且其内部链 无二级结构， 长度均为 24bp。 说 。
10、明 书 CN 103352044 A 3 2/3 页 4 0012 所述Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因具有SEQ ID NO:3所示的多核苷酸序列以及 它的突变形式， 所述突变形式包括 ： 缺失、 无义、 插入、 错义。 0013 所述 PCR 扩增的反应条件为 ： 94预变性 3 5min， 94变性 30s， 65退火 30s， 72延伸 2min， 30 35 个循环， 循环结束后， 再进行 72延伸 7 10min。 0014 所述棉花雄性不育系与可育系的花药选自 6 个时期， 包括 ： 幼花药发育期 （现蕾 1 5 天， 直径 1 3mm） ， 花粉母细胞发育期 （现蕾 6 。
11、7 天， 直径 3 4mm） ， 花粉母细胞减 数分裂期 （现蕾 8 9 天， 直径 4 5mm） ， 花粉粒发育期 （现蕾 10 11 天， 直径 5 6mm） ， 纤维层发育期 （现蕾 12 15 天， 直径 6 7mm） 和成熟花粉期 （现蕾 16 20 天， 直径 7 8mm） 。 0015 本发明的有益效果在于 ： 设计了 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因片段特异性引 物， 同时提供了Spot-9-UDP-葡萄糖脱氢酶基因PCR扩增的最佳反应条件， 首次在棉花雄性 不育系中克隆了 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因片段 ； 通过对该基因在不育系与可育系植 株中表达差异性。
12、的比较， 为进一步探讨该基因与棉花不育性状之间的关系奠定了基础。 具体实施方式 0016 下面根据实施例对本发明做进一步详细说明， 其目的在于让熟悉此领域技术的人 士能够了解本发明技术构思以及内容并加以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围， 凡 根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围内。 0017 1、 材料的选取 ： 0018 取棉花雄性不育系 ms5ms6 与可育系的花蕾 （取样时间为上午 6:00） ， 选取 6 个时 期的花药， 包括 ： 幼花药发育期 （现蕾 1 天， 直径 2mm） ， 花粉母细胞发育期 （现蕾 6 天， 直径 3mm） ， 花粉母细。
13、胞减数分裂期 （现蕾 8 天， 直径 4mm） ， 花粉粒发育期 （现蕾 10 天， 直径 5mm） ， 纤维层发育期 （现蕾 12 天， 直径 6mm） 和成熟花粉期 （现蕾 16 天， 直径 7mm） ， 保存于 -70冰 箱备用。 0019 2、 花药总 DNA 的提取 ： 0020 （1） 取上述各时期的棉花核雄性不育系和可育系花药各 0.5g， 加入等量的 PVP， 加 液氮充分研磨至粉末状， 转移至离心管中， 加入 1mL 的 65预热的 CTAB 缓冲液， 混匀， 65 温浴 30min ； 0021 （2） 4下 12000rpm 离心 10min， 取上清 ； 0022 （3。
14、） 上清中加入 1/2 体积的 pH 为 8.0 的酚， 再加入与混合液等体积的氯仿与异戊 醇混合液， 氯仿与异戊醇混合液的体积比为 24 ： 1， 混匀， 4下 12000rpm 离心 15min， 取上 清 ； 0023 （4） 再加入等体积的上述氯仿与异戊醇混合液， 4下 12000rpm 离心 15min， 取上 清 ； 0024 （5） 上清中加入 1/10 体积的醋酸钠， 再加入混合液 2 倍体积的无水乙醇， 混匀， 静 置 30min， 4下 12000rpm 离心 10min， 弃上清 ； 0025 （6） 加入 1mL 的体积分数为 75的乙醇， 洗涤沉淀， 4下 12000。
15、rpm 离心 5min， 弃 上清 ； 0026 （7） 重复步骤 （6） ， 室温风干， 加入 20L 的 TE 缓冲液 （购于上海生物工程有限公 说 明 书 CN 103352044 A 4 3/3 页 5 司） 充分溶解， 于 -20保存备用。 0027 3、 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因特异性引物的设计 ： 0028 根据 GenBank 里棉花 Spot-9-UDPGDH 基因全长 cDNA 序列 （序列如 SEQ ID NO:3 所 示， GenBank 登录号为 FJ415166.1） 设计引物， 并委托上海生物工程有限公司合成， 引物序 列如 SEQ ID NO:1。
16、 和 SEQ ID NO:2 所示。 0029 4、 Spot-9-UDP- 葡萄糖脱氢酶基因片段的 PCR 扩增 ： 0030 （1） PCR 反应体系 ： 0031 在 PCR 管中依次加入 ： 10PCR Buffer2.5L， dNTP2L， 上游引物和下游引物各 1L， DNA 模板 1L， ddH2O17L， Taq 酶 0.5L（购于大连宝生物工程有限公司） 。 0032 （2） PCR 反应条件 ： 0033 94预热 3min， 94变性 30s， 65退火 30s， 72延伸 2min， 30 个循环， 72延伸 10min， PCR 产物于 4保存。 说 明 书 CN 103352044 A 5 1/2 页 6 0001 0002 序 列 表 CN 103352044 A 6 2/2 页 7 序 列 表 CN 103352044 A 7 。