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1、(10)申请公布号 CN 103319571 A (43)申请公布日 2013.09.25 CN 103319571 A *CN103319571A* (21)申请号 201310210531.9 (22)申请日 2013.05.30 C07K 7/08(2006.01) C07K 16/06(2006.01) G01N 33/68(2006.01) (71)申请人 北京正旦国际科技有限责任公司 地址 102206 北京市昌平区科学园路 33 号 申请人 中山大学肿瘤防治中心 (72)发明人 魏开华 夏云飞 侯利平 陶亚岚 傅海媛 杨保安 黄亚娟 宋纯艳 郑俊杰 甄蓓 张拓 韩志国 (74)专。
2、利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 (54) 发明名称 一种鼻咽癌放疗敏感性多肽标志物 SPG03 及 其 ELISA 试剂盒 (57) 摘要 本发明涉及一种鼻咽癌放疗敏感性多肽标志 物 SPG03 及其 ELISA 试剂盒。所述鼻咽癌放疗 敏感性多肽标志物 SPG03 全长氨基酸序列如 SEQ ID No.1 所示。本发明所提供的针对多肽标志物 SPG03 的多抗特异性强， 检测特异度达到 100%， 灵 敏度为80%， 针对多肽标志物SPG03的检测方法操 作步骤简便可控， 利于临床检测 ； 可结合酶联检 测仪进行高通量、 低成本的临床检测。 (51)I。
3、nt.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103319571 A CN 103319571 A *CN103319571A* 1/1 页 2 1.一种鼻咽癌放疗敏感性多肽标志物SPG03， 其全长氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。 2.一种以权利要求1所述多肽标志物SPG03为抗原、 与该多肽发生特异性结合的抗体。 3. 根据权利要求 2 所述的抗体， 其特征在于， 所述抗体为多克隆抗体， 其按照如下步骤 制备 ： 。
4、1） 采用固相合成法制备合成肽 SPG03 ； 2） 采用碳二亚胺偶联法将合成肽 SPG03 与载体蛋白牛血清白蛋白偶联制备免疫原 SPG03-BSA ； 3） 将免疫原 SPG03-BSA 进行动物免疫， 获得免疫血清， 通过纯化， 获得浓度 2.9mg/mL、 滴度 1:510000 的抗合成肽 SPG03 多克隆抗体。 4. 一种 ELISA 试剂盒， 其特征在于， 包括权利要求 2 或 3 所述的抗体。 5. 根据权利要求 4 所述的 ELISA 试剂盒， 其特征在于， 进一步包括包被液、 2%OVA、 HRP 酶标二抗、 TMB 显色液、 2M 硫酸和 96 孔酶联板中的一种或多种。。
5、 6. 根据权利要求 5 的试剂盒， 其特征在于， 所述抗体为兔源多克隆抗体， 所述 HRP 酶标 二抗为 HRP- 羊抗兔。 7. 权利要求 1 所述的多肽标志物 SPG03、 权利要求 2 或 3 所述的抗体在制备用于检测 鼻咽癌放疗敏感性试剂中的应用。 8. 根据权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 利用权利要求 2 或 3 所述抗体制备 ELISA 试剂盒。 9. 根据权利要求 8 所述的应用， 其特征在于， 所述 ELISA 试剂盒进一步包括包被液、 2%OVA、 HRP 酶标二抗、 TMB 显色液、 2M 硫酸和 96 孔酶联板中的一种或多种。 10. 根据权利要求 9 所述的。
6、应用， 其特征在于， 具体方法按照如下步骤操作 ： 在 96 孔 酶联板中， 将检测血清与包被液包被过夜， 清洗， 用 20%OVA 溶液封闭， 清洗， 加入抗合成肽 SPG03 多克隆抗体， 适宜温度孵育后， 清洗， 加入 HRP 酶标二抗， 清洗， 用 TMB 显色液显色， 再 用 2M 硫酸终止， 450nm 检测 OD 值。 权 利 要 求 书 CN 103319571 A 2 1/6 页 3 一种鼻咽癌放疗敏感性多肽标志物 SPG03 及其 ELISA 试剂 盒 技术领域 0001 本发明涉及生物技术检测领域， 具体地说， 涉及一种鼻咽癌放疗敏感性多肽标志 物 SPG03 及其 EL。
7、ISA 试剂盒。 背景技术 0002 鼻咽癌 （Nasopharyngeal carcinoma,NPC） 是中国南方常见的恶性肿瘤之一， 尤 其集中在中国广东省， 故又称为 “广东瘤 （Canton tumor） ” 。虽然在世界范围内鼻咽癌属罕 见肿瘤， 在大多数国家的发病率或死亡率均低于 1/100000， 但在华南地区和东南亚地区的 鼻咽癌年发病率高达 15 50/100000， 且病理组织学常诊断为 WHO 规定的期或期 （参 见 Feng XP 等 . 经蛋白组学预测鼻咽癌放疗反应性的生物标记的鉴别 (Identification of biomarkers for predict。
8、ing nasopharyngeal carcinoma response to radiotherapy by proteomics), 癌症研究 (Cancer Res.),2010,70(9):3450-62） 。仅中山大学肿瘤防 治中心在广州地区确诊的鼻咽癌新发病例就多达 2400-2500 例 / 年。鼻咽癌的肿瘤位置 深处颅底、 颈部和咬肌间隙， 十分隐蔽， 无法采用常规外科手术对病灶区肿块进行切除。 目前， 放射治疗已经作为鼻咽癌的首选治疗方案 （参见敖帆， 廖瑜露 .P53、 Ki-67、 Bcl-2、 EGFR 与鼻咽癌放射敏感性的相关性研究 J. 实用中西医结合临床 ,20。
9、10,10(4):4-5） ， 尤其对于无远处转移的早期鼻咽癌有良好控制作用， 同步放化疗也逐渐成为局部晚期 鼻咽癌的标准治疗方式 （马俊 , 鼻咽癌治疗的研究进展 J. 中山大学学报 ( 医学科学 版 ),2010,31(2):179-185） 。 0003 临床治疗发现， 即使鼻咽癌患者属于同一分期， 采用同样的放射治疗技术和相同 的放射治疗剂量， 仍然有20%-40%的患者在5年内出现了射野内复发， 深入研究发现这主要 是因为不同个体肿瘤细胞的放射治疗内在敏感性不同， 表现为放射敏感或者放射抗拒 （参 见叶伟军 , 闵华庆 , 曹新平 , 等 .P53 蛋白、 血管内皮生长因子等生物分子。
10、指标与鼻咽癌放 射敏感性的关系.癌症,2006,25(9):1168-1172） 。 导致鼻咽癌治疗失败的主因是远处转移 和放射抗拒， 对鼻咽癌患者进行单纯的放射治疗， 其 5 年生存率约为 50%， 治疗率不高的原 因之一即放射抗拒 （参见夏云飞 , 钱剑扬 , 张恩熹 , 实用鼻咽癌放射治疗学 . 北京大学医 学出版社 , 北京 ,2003,211-214） 。因此， 发掘出特异性好、 灵敏度高的生物标志物， 并开发 出快速、 准确、 灵敏的相关诊断方法， 在鼻咽癌患者接收治疗前对其放疗敏感性进行评价， 辅助实施鼻咽癌个体化治疗， 已成为研究热点， 对提高鼻咽癌放射治疗针对性和有效性， 同。
11、 时减轻患者不必要的痛苦和经济负担， 具有重要意义。 0004 目前对于鼻咽癌放疗敏感性的诊断， 尚无权威的诊断技术或者统一的评价指标 （金标准） 。 相关文献报道了多种蛋白标志物与鼻咽癌的放疗敏感性相关。 如PCNA （增殖细胞 核抗原） 的高表达鼻咽癌放疗敏感性呈正相关， 预测鼻咽癌放疗敏感性时的灵敏度为 94%， 但特异性不足 32%（参见黄东海 , 田勇泉 , 邱元正 , 等 . 应用 PCNA 和 survivin 预测鼻咽 癌放疗敏感性的研究 J. 同济大学学报 ( 医学版 ),2006,27(5):39-42） ， 且存在不同报道 说 明 书 CN 103319571 A 3 2。
12、/6 页 4 对不同蛋白候选标志物的结论不一致的现象。 蛋白标志物的联合检测在鼻咽癌放疗敏感性 中的研究在近些年得到很大的重视， 如研究发现 14-3-3 和 maspin（乳腺丝抑蛋白） 的下 调， 以及GRP78(78KDa葡萄糖调节蛋白)和Mn-SOD(锰超氧化物歧化酶)的上调对鼻咽癌放 射抗拒显著相关 （参见 Feng XP 等 , 经蛋白组学预测鼻咽癌放疗反应性的生物标记的鉴别 (Identification of biomarkers for predicting nasopharyngeal carcinoma response to radiotherapy by proteo。
13、mics). 癌症研究 (Cancer Res.)2010,70(9):3450-62） ， 具有 良好的特异性和灵敏度， 但是这四种蛋白标志物的联合检测仍需要依靠免疫组化技术 （参 见 Cho WC 等 . 经血清蛋白组学分析鉴定血清淀粉样蛋白作为一种潜在的有用的监测鼻咽 癌复发的生物标志物 (Identification of serum amyloid a protein as a potentially useful biomarker to monitor relapse of nasopharyngeal cancer by serum proteomic profiling).临。
14、床癌症研究(Clin Cancer Res.)2004,10(1):43-52） ， 采取病人组织进行检 测， 检测成本较高， 周期较长， 很难广泛应用于临床鼻咽癌放疗敏感性的辅助诊断。 0005 血清中富含有丰富的多肽成分， 传统中被人们认为是 “生物垃圾” 的血清多肽已变 身为 “诊断黄金” ， 血清多肽类标志物所揭示的生物信息对于肿瘤的防治已引起研究人员的 极大关注。基于血清多肽， 并结合目前常用的临床检测方式对肿瘤早诊和个体化治疗辅助 诊断， 获得了不错的检测效果。 Villanueva等利用血清多肽研究了前列腺癌、 乳腺癌以及膀 胱癌， 寻找到了几十个可作为肿瘤标志物的多肽片段， 对。
15、样本的预测准确率达到 100%。 0006 目前的血清多肽主要用于前列腺癌、 乳腺癌以及膀胱癌等的分析， 分析主要采用 基于抗体亲和分离技术 （免疫磁珠、 抗体偶联固相载体等） 的免疫质谱法， 这些体系均存在 检测成本昂贵， 操作要求较高， 不利于推广的缺陷。 目前， 尚缺乏特异性好、 灵敏度高的生物 标志物， 对鼻咽癌放疗敏感性进行快速、 准确、 灵敏的相关诊断方法。 发明内容 0007 为了解决上述技术问题， 本发明提供一种鼻咽癌放疗敏感性多肽标志物 SPG03 及 其 ELISA 试剂盒， 用于鼻咽癌个体化治疗中的放疗敏感性辅助诊断。 0008 本发明提供的多肽标志物 SPG03 全长序。
16、列为 ： 0009 Ser-Pro-Leu-Phe-Met-Gly-Lys-Val-Val-Asn-Pro-Thr-Gln-Lys。 0010 本发明还提供与上述多肽标志物 SPG03 发生特异性结合的抗体。所述抗体包括单 克隆抗体和多克隆抗体， 所述单克隆抗体制备方法可参照专利 CN102539767 的方法进行制 备。 0011 所述多克隆抗体的制备方法按照如下步骤进行 ： 0012 1） 采用固相合成法制备合成肽 SPG03 ； 0013 2） 采用碳二亚胺偶联法将合成肽 SPG03 与载体蛋白牛血清白蛋白 （BSA） 偶联制备 免疫原 SPG03-BSA ； 0014 3） 将免疫原 。
17、SPG03-BSA 进行动物免疫， 获得免疫血清， 通过纯化， 获得浓度 2.9mg/ mL、 滴度 1:510000 的抗合成肽 SPG03 多克隆抗体。 0015 具体地， 包括以下步骤 ： 1） 采用碳二亚胺偶联法将合成肽 SPG03 偶联到载体蛋白 BSA（牛血清白蛋白） 上制备偶联物 SPG03-BSA， 联合 UV（紫外扫描） 和 SDS-PAGE（聚丙烯酰 胺凝胶电泳） 监测偶联物 SPG03-BSA ； 说 明 书 CN 103319571 A 4 3/6 页 5 0016 2） 将制备好的偶联物 SPG03-BSA 作为免疫， 结合弗氏完全佐剂与不完全佐剂免疫 新西兰大耳白兔。
18、， 每次偶联物抗原免疫剂量为 1mg， 免疫方式为颈背部皮下多点注射 ； 0017 3） 经3次免疫后检测免疫兔静脉血滴度， 达到1:10000以上后， 对免疫兔进行颈动 脉取血收集免疫全血， 离心分离后收集兔免疫血清 ； 0018 4） 采用 Protein A 亲和层析柱对抗合成肽 SPG03 的兔免疫血清进行纯化， 制备抗 合成肽 SPG03 的多克隆抗体， 检测多克隆抗体的滴度、 特异性、 灵敏性等， 得到抗血清多肽 标志物 SPG03 抗体。 0019 本发明进一步提供包括上述抗体的 ELISA 试剂盒。 0020 所述 ELISA 试剂盒进一步包括包被液、 2%OVA、 HRP 酶。
19、标二抗、 TMB 显色液、 2M 硫酸 和 96 孔酶联板中的一种或多种。 0021 其中， 所述抗体优选地为抗血清多肽标志物SPG03的兔源多克隆抗体， 所述HRP酶 标二抗为 HRP- 羊抗兔。 0022 本发明另一方面， 提供上述多肽标志物 SPG03 和上述抗体在制备用于检测鼻咽癌 放疗敏感性试剂中的应用。 0023 优选地， 所述用于检测鼻咽癌放疗敏感性试剂为包括上述抗体的 ELISA 试剂盒。 0024 所述 ELISA 试剂盒进一步包括包被液、 2%OVA、 HRP 酶标二抗、 TMB 显色液、 2M 硫酸 和 96 孔酶联板中的一种或多种。 0025 所述 ELISA 试剂盒检。
20、测多肽标志物 SPG03 的方法包括如下步骤 ： 0026 1） 采集样品 ； 0027 2） 用所述的试剂盒进行检测 ； 0028 3） 分析检测结果。 0029 具体步骤如下 ： 在 96 孔酶联板中， 将临床检测血清与包被液包被过夜， 清洗若干 次， 用20%OVA溶液封闭， 清洗若干次， 加入抗合成肽SPG03多克隆抗体， 适宜温度孵育后， 清 洗若干次， 加入 HRP 酶标二抗， 清洗若干次， 用 TMB 显色液显色， 再用 2M 硫酸终止， 450nm 检 测 OD 值。 0030 在本发明一个优选的实施例中， 所述方法包括如下步骤 ： 0031 1） 在 96 孔板中， 加入 9。
21、5L-80L 包被液， 再加入 5L-20L 待测血清样品， 4 放置过夜 ； 同时用 100L 包被液作为阴性对照 ； 0032 2） 弃包被液， 用 0.01M、 pH7.4 的 PBST 缓冲液 200-300L 清洗 4-6 次， 拍干 ； 0033 3） 加入 200-300L 的 2%OVA， 37中静置封闭 1.5-2 小时 ； 0034 4） 弃封闭液， 用 0.01M、 pH7.4 的 PBST 缓冲液 200-300L 清洗 4-6 次， 拍干 ； 0035 5） 加入 80-120L 抗合成肽 SPG03 的多抗， 37孵育 0.5-1 小时 ； 0036 6） 弃抗体液。
22、， 用 0.01M、 pH7.4 的 PBST 缓冲液 200-300L 清洗 4-6 次， 拍干 ； 0037 7） 加入 80-120L 抗多抗的酶标二抗， 37孵育 0.5-1 小时 ； 0038 8） 弃酶标二抗液， 用 0.01M、 pH7.4 的 PBST 缓冲液 200-300L 清洗 4-6 次， 拍干 ； 0039 9） 加入 80-120L TMB 显色液， 37避光显色 10-15min; 0040 10） 加入 40-60L2M 硫酸， 终止反应， 5min 内用酶联检测仪测定波长 450nm 的吸 光度值 (OD 值 )。 0041 本发明的有益效果 ：（1）本发明选。
23、取鼻咽癌放疗敏感性相关血清多肽标志物 说 明 书 CN 103319571 A 5 4/6 页 6 SPG03， 制备抗合成肽 SPG03 的多抗， 并应用到 63 份鼻咽癌血清样本 （包含放疗敏感和放疗 抗拒） 的分析， 经检测分析及数据统计， 发现该抗合成肽 SPG03 多抗的检测特异度为 100%， 灵敏度为80%， 表明该血清多肽标志物能明显区分鼻咽癌放疗敏感与放疗抗拒。 由此提供含 有该多抗的 ELISA 试剂盒和检测方法。 0042 （2） 本发明所提供的多抗针对多肽标志物SPG03的特异性强 ； 多肽标志物SPG03的 检测方法操作步骤简便可控的， 利于临床检测 ； 可进行高通量。
24、、 低成本的酶联检测仪检测。 0043 （3） 本发明基于该血清多肽标志物 SPG03 的 ELISA 试剂盒能够在实施鼻咽癌个体 化治疗体系中， 对鼻咽癌患者接收放射治疗前进行放疗敏感性评价， 起到辅助诊断的作用， 具有明显的实用性。 附图说明 0044 图 1 为本发明血清多肽标志物的合成肽 SPG03 标准样品的质谱 ； 0045 图 2A 为 SPG03-BSAD 紫外扫描监测结果， B 为 SPG03-BSAD 的 SDS-PAGE 电泳监测 结果， 其中， BSA 为牛血清白蛋白 ； SPG03-BSA 为 SPG03 与 BSA 的偶联物 ； 0046 图 3 为本发明的检测鼻咽。
25、癌放疗敏感组与放疗抗拒组的 ROC 曲线 ； 0047 图 4A 为本发明的检测鼻咽癌放疗敏感组的箱式图 ； B 为放疗抗拒组的箱式图。 具体实施方式 0048 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精 神和实质的情况下， 对本发明方法、 步骤或条件所作的修改或替换， 均属于本发明的范围。 SPG03 合成肽委托上海强耀生物科技有限公司合成。 0049 若未特别指明， 实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 0050 实施例 1 碳二亚胺偶联法制备 SPG03-BSA 偶联物 0051 1） 平衡 SPG03、 BSA、 EDC（碳二亚胺） 至室。
26、温， 分别用 0.1mol/L， pH6.0 的 MES 生物 缓冲液配制成 5mg/mL、 10mg/mL、 10mg/mL ； SPG03 全长序列为 ： 0052 Ser-Pro-Leu-Phe-Met-Gly-Lys-Val-Val-Asn-Pro-Thr-Gln-Lys。血清多肽标志 物的合成肽 SPG03 标准样品的质谱如图 1 所示。 0053 2） 将 SPG03 与 BSA 各吸取 1mg 于 5mL 小玻璃瓶中预先混合， 再加到 1mg EDC 的 5mL 小玻璃瓶中进行偶联， 反应在 25恒温箱中进行， 中速搅拌下偶联 12 小时 ； 0054 3） 反应结束后， 将偶联。
27、物置于 12-14KDa 的透析袋中， 用 0.02mol/L， pH7.4 的 PBS 透析 24 小时 ； 0055 4) 收集透析后的 SPG03-BSA 偶联物， 联合 UV（紫外扫描） 和 SDS-PAGE（聚丙烯酰 胺凝胶电泳） 监测偶联物 SPG03-BSA。 0056 5） UV 和 SDS-PAGE 监测结果如图 2 所示 ： UV 结果表明 ： 多肽 SPG03 与 BSA 的 UV 扫 描曲线明显不同， BSA 的特征吸收波长在 280nm 处， SPG03 的特征吸收在 278nm 处， 偶联抗 原 SPG03-BSA 的 UV 曲线比 BSA 整体上移， 且在 250。
28、nm 处的峰谷要比 BSA 明显升高， 说明偶 联反应改变了 BSA 的 UV 特性， 验证了多肽成功偶联 （UV 图） 。SDS-PAGE 结果显示， 偶联物条 带呈现弥散型 （虚框标识） ， 显著不同于 BSA 的条带 （SDS-PAGE） 。紫外和电泳监测结果表明 多肽 SPG03 成功偶联到 BSA 上。 说 明 书 CN 103319571 A 6 5/6 页 7 0057 实施例 2 抗合成肽 SPG03 多克隆抗体的制备方法 0058 1） 采用偶联物 SPG03-BSA 作为免疫原， 结合弗氏完全佐剂与不完全佐剂， 免疫新 西兰大耳白兔 ； 0059 2） 经第 3 次免疫后 。
29、3 天， 检测免疫兔静脉血滴度， 滴度在 1:10000 以上达到取血标 准 ； 0060 3） 对免疫兔进行颈动脉取血收集免疫全血， 离心分离后收集兔免疫血清 ； 0061 4） 采用 Protein A 亲和层析柱对抗合成肽 SPG03 的兔免疫血清进行纯化， 制备抗 合成肽SPG03的多克隆抗体， 检测该多克隆抗体的浓度2.9mg/mL、 滴度1:510000， 得到抗血 清多肽标志物 SPG03 抗体。说明免疫效果较好， 免疫兔血清中含有针对抗合成肽 SPG03 的 特异性抗体。 0062 实施例 3 多肽标志物 SPG03 的 ELSIA 试剂盒的组装 0063 1） 包被液 ： 0。
30、.1M pH9.6 的碳酸盐缓冲液 ； 0064 2） 2%OVA ： 2g/100mL 卵清蛋白 ； 0065 3） HRP 酶标二抗 ： 购自北京康为世纪生物科技公司 0066 4） TMB 显色液 ： A 液过氧化氢， B 液 TMB（四甲基联苯胺） ； 0067 5） 2M 硫酸 ； 0068 6） 96 孔酶联板。 0069 实施例 4 多肽标志物 SPG03 的 ELISA 检测方法 0070 样本 ： 临床经放射治疗后确诊的鼻咽癌放疗敏感血清 33 份， 鼻咽癌放疗抗拒血清 30 份。 0071 检测过程 ： 0072 1） 在 96 孔板中， 加入 90L 包被液， 再加入 1。
31、0L 待测血清样品， 4放置过夜 ； 同时用 100L 包被液作为阴性对照 ； 0073 2） 弃包被液， 用 0.01M、 pH7.4 的 PBST 缓冲液 250L 清洗 5 次， 拍干 ； 0074 3） 加入 200-300L 的 2%OVA， 37中静置封闭 2 小时 ； 0075 4） 弃封闭液， 用 0.01M、 pH7.4 的 PBST 缓冲液 250L 清洗 5 次， 拍干 ； 0076 5） 加入 100L 抗合成肽 SPG03 的多抗， 37孵育 1 小时 ； 0077 6） 弃抗体液， 用 0.01M、 pH7.4 的 PBST 缓冲液 250L 清洗 5 次， 拍干 。
32、； 0078 7） 加入 100L 抗多抗的酶标二抗， 37孵育 40min ； 0079 8） 弃酶标二抗液， 用 0.01M、 pH7.4 的 PBST 缓冲液 250L 清洗 5 次， 拍干 ； 0080 9） 加入 100LTMB 显色液 (A、 B 液各 50L)， 37避光显色 15min; 0081 10） 加入 50L2M 硫酸， 终止反应， 5min 内用酶联检测仪测定波长 450nm 的吸光度 值 (OD 值 )。 0082 结果经统计， 如图 3 的 ROC 曲线显示， 本试剂盒的敏感度达到 80%， 特异度达到 100% ； t 检验分析 P=4.83713E-080.。
33、05， 说明多肽标志物 SPG03 能明显区分两组样本 ； 箱式 图表明 （图4） ， 两组样本被显著分开， 其中位数相差显著， 两组之间交叉较少。 以上分析说明 本发明所述的血清多肽标志物SPG03及ELISA检测试剂盒能显著区分鼻咽癌放疗敏感与放 疗抗拒组， 特异性强， 重复性好。 0083 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 说 明 书 CN 103319571 A 7 6/6 页 8 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103319571 A 8 1/1 页 9 0001 序 列 表 CN 103319571 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103319571 A 10 2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103319571 A 11 。