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1、(10)申请公布号 CN 103525937 A (43)申请公布日 2014.01.22 CN 103525937 A (21)申请号 201310509511.1 (22)申请日 2013.10.24 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 新疆农垦科学院 地址 832000 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 石河子乌伊公路 221 号 (72)发明人 穆培源 张晓科 相吉山 徐红军 张钰玉 桑伟 韩新年 聂迎彬 崔凤娟 邹波 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54) 发明名称 用于鉴定小麦面粉。
2、色泽相关基因的 PCR 体系 (57) 摘要 本发明公开了一种用于鉴定或辅助鉴定面粉 色泽相关基因的 PCR 体系及其应用。本发明所提 供的 PCR 体系中的引物对组为如下任一 ： 1） 引物 对组 A、 引物对组 B 和引物对组 C ； 2） 引物对组 A 和引物对组 C ； 3） 引物对组 C ； 引物对组 A 由引物 对 1（序列 1 和序列 2） 、 引物对 2（序列 3 和序列 4） 和引物对 3（序列 5 和序列 6） 组成 ； 引物对组 B 由引物对 4（序列 7 和序列 8） 和引物对 5（序列 9 和序列 10） 组成 ； 引物对组 C 由引物对 6（序列 11 和序列 12。
3、） 、 引物对 7（序列 13 和序列 14） 和 引物对 8（序列 15 和序列 16） 组成。这些引物对 组各引物间不存在抑制和错配， 实现同一温度一 次 PCR 完成一组基因的鉴别， 且结果可靠、 特异性 强。本发明为小麦色泽品质育种提供参考。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 18 页 序列表 10 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书18页 序列表10页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103525937 A CN 103525937 A 1/3 页 2 1. 用于鉴定或辅助鉴定待测小麦面粉色泽相关。
4、基因的多重 PCR 引物对组， 所述面粉 色泽相关基因为 Psy-B1 基因、 TaZds-A1 基因、 TaZds-D1 基因、 Ppo-A1 基因、 Psy-A1 基因、 TaLox-B1 基因和 Ppo-D1 基因， 其特征在于 ： 所述多重 PCR 引物对组由引物对组 A、 引物对 组 B 和引物对组 C 组成 ； 所述引物对组 A 由特异于所述 Psy-B1 基因的两个引物对， 和特异 于所述 TaZds-A1 基因的一个引物对组成 ； 所述引物对组 B 由特异于所述 TaZds-D1 基因的 一个引物对， 和特异于所述 Ppo-A1 基因的一个引物对组成 ； 所述引物对组 C 由特。
5、异于所述 Psy-A1基因的一个引物对、 特异于所述TaLox-B1基因的一个引物对， 和特异于所述Ppo-D1 基因的一个引物对组成 ； 所述引物对组 A 中， 所述特异于所述 Psy-B1 基因的两个引物对分别为序列表中序列 1 和序列 2 所示的两条单链 DNA 组成的引物对 1， 以及序列 3 和序列 4 所示的两条单链 DNA 组 成的引物对 2 ； 所述特异于所述 TaZds-A1 基因的一个引物对为序列表中序列 5 和序列 6 所 示的两条单链 DNA 组成的引物对 3 ； 所述引物对组 B 中， 所述特异于所述 TaZds-D1 基因的一个引物对为序列表中序列 7 和 序列 8。
6、 所示的两条单链 DNA 组成的引物对 4 ； 所述特异于所述 Ppo-A1 基因的一个引物对为 序列表中序列 9 和序列 10 所示的两条单链 DNA 组成的引物对 5 ； 所述引物对组 C 中， 所述特异于所述 Psy-A1 基因的一个引物对为序列表中序列 11 和 序列12所示的两条单链DNA组成的引物对6 ； 所述特异于所述TaLox-B1基因的一个引物对 为序列表中序列13和序列14所示的两条单链DNA组成的引物对7 ； 所述特异于所述Ppo-D1 基因的一个引物对为序列表中序列 15 和序列 16 所示的两条单链 DNA 组成的引物对 8。 2.用于鉴定或辅助鉴定待测小麦面粉色泽相。
7、关基因的多重PCR引物对组， 为下述1） 或 2） ： 1） 由权利要求 1 中的所述引物对组 A 和所述引物对组 C 组成的引物对组 ； 2） 为权利要求 1 中的所述引物对组 C。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的引物对组， 其特征在于 ： 所述引物对组 A 中每个引物对 的两条引物在 PCR 反应体系中等量使用， 且所述引物对 1， 所述引物对 2 和所述引物对 3 在 PCR反应体系中的摩尔比为6:6:5 ； 所述特异引物对组B中每个引物对的两条引物在PCR反 应体系中等量使用， 且所述引物对 4 和所述引物对 5 在 PCR 反应体系中的摩尔比为 12:6 ； 所述引物对组 C。
8、 中每个引物对的两条引物在 PCR 反应体系中等量使用， 且所述引物对 6、 所 述引物对 7 和所述引物对 8 在 PCR 反应体系中的摩尔比为 5:10:10。 4. 含有权利要求 1-3 中任一所述引物对组的试剂盒。 5. 权利要求 1-3 中任一所述引物对组的制备方法， 其特征在于 ： 所述制备方法包括将 权利要求 1-3 中任一所述引物对组中各引物对的所述两条单链 DNA 分别单独包装的步骤。 6. 权利要求 4 所述试剂盒的制备方法， 包括如下步骤 ： 将权利要求 1-3 中任一所述的 引物对组中各引物对的所述两条单链 DNA 分别单独包装后， 与下述物质中的至少一种包装 在同一试。
9、剂盒内 ： PCR 反应缓冲液、 DNA 聚合酶和 4 种 dNTP。 7. 下述 a1） 或 a2） 或 a3） 的方法 ： a1） 鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Psy-B1a、 Psy-B1b和Psy-B1c这三种基因中哪一种， 含有 TaZds-A1a 和 TaZds-A1b 这两种基因中哪一种， 含有 TaZds-D1a 和 TaZds-D1b 这两种 基因中哪一种， 含有 Ppo-A1a 基因和 Ppo-A1b 基因这两种基因中哪一种 ； 含有 Psy-A1a 或 权 利 要 求 书 CN 103525937 A 2 2/3 页 3 Psy-A1c 基因还是含有 Psy-A1b 基因，。
10、 含有 TaLox-B1a 和 TaLox-B1b 这两种基因中哪一种， 以及含有 Ppo-D1a 和 Ppo-D1b 这两种基因中哪一种 ； a2） 鉴定或辅助鉴定待测小麦含有Psy-B1a、 Psy-B1b和Psy-B1c这三种基因中哪一种， 以及含有TaZds-A1a和TaZds-A1b这两种基因中哪一种 ； 含有Psy-A1a或Psy-A1c基因还是 含有 Psy-A1b 基因， 含有 TaLox-B1a 和 TaLox-B1b 这两种基因中哪一种， 以及含有 Ppo-D1a 和 Ppo-D1b 这两种基因中哪一种 ； a3） 鉴定或辅助鉴定待测小麦含有 Psy-A1a 或 Psy-A。
11、1c 基因还是含有 Psy-A1b 基因， 含 有 TaLox-B1a 和 TaLox-B1b 这两种基因中哪一种， 以及含有 Ppo-D1a 和 Ppo-D1b 这两种基 因中哪一种 ； 其特征在于 ： 所述 a1） 的方法包括下述 （1） 和 （2） 的步骤 ： 所述 （1） 为如下 b1） 和 b2） ： b1） 以待测小麦的基因组DNA为模板， 用权利要求1-3中任一所述引物对组中的所述引 物对组 A 进行 PCR 反应， 所述 PCR 反应的退火温度为 59 ； b2） 以待测小麦的基因组 DNA 为模板， 用权利要求 1 或 3 所述引物对组中所述引物对组 B 进行 PCR 反应，。
12、 所述 PCR 反应的退火温度为 62 ； b3） 以待测小麦的基因组DNA为模板， 用权利要求1-3中任一所述引物对组中所述引物 对组 C 进行 PCR 反应， 所述 PCR 反应的退火温度为 64 ； （2） 检测步骤 （1） 得到的 PCR 产物的大小， 按照如下方法根据 PCR 产物确定所述待测小 麦含有 Psy-B1a、 Psy-B1b 和 Psy-B1c 这三种基因中哪一种， 含有 TaZds-A1a 和 TaZds-A1b 这两种基因中哪一种， 含有 TaZds-D1a 和 TaZds-D1b 这两种基因中哪一种， 含有 Ppo-A1a 基 因和 Ppo-A1b 基因这两种基因中。
13、哪一种， 含有 Psy-A1a 或 Psy-A1c 基因还是含有 Psy-A1b 基因， 含有 TaLox-B1a 和 TaLox-B1b 这两种基因中哪一种， 以及含有 Ppo-D1a 和 Ppo-D1b 这 两种基因中哪一种 ： 以所述引物对组 A 进行 PCR 反应的产物中， 若含有大小为 151bp 的 DNA 片段， 则所述待 测小麦含有 Psy-B1a 基因或候选含有 Psy-B1a 基因 ； 若含有大小为 156bp 的 DNA 片段， 则所 述待测小麦含有 Psy-B1b 基因或候选含有 Psy-B1b 基因 ； 若含有大小为 428bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有。
14、Psy-B1c基因或候选含有Psy-B1c基因 ； 若含有大小为183bp的DNA片 段， 则所述待测小麦含有 TaZds-A1a 基因或候选含有 TaZds-A1a 基因 ； 若含有大小为 179bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 TaZds-A1b 基因或候选含有 TaZds-A1b 基因 ； 以所述引物对组 B 的进行 PCR 反应的产物中， 若不含有大小为 981bp 的 DNA 片段， 则所 述待测小麦含有TaZds-D1a基因或候选含有TaZds-D1a基因 ； 若含有大小为981bp的DNA片 段， 则所述待测小麦含有 TaZds-D1b 基因或候选含有 TaZds-D。
15、1b 基因 ； 若含有大小为 685bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 Ppo-A1a 基因或候选含有 Ppo-A1a 基因 ； 若含有大小为 876bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 Ppo-A1b 基因或候选含有 Ppo-A1b 基因 ； 以所述引物对组 C 的进行 PCR 反应的产物中， 若含有大小为 194bp 的 DNA 片段， 则所述 待测小麦含有 Psy-A1a 或 Psy-A1c 基因或候选含有 Psy-A1a 或 Psy-A1c 基因 ； 若含有大小 为 231bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 Psy-A1b 基因或候选含有 Psy-A1b 基。
16、因 ； 若不含 有大小为 791bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 TaLox-B1a 基因或候选含有 TaLox-B1a 基因 ； 若含有大小为 791bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 TaLox-B1b 基因或候选含有 权 利 要 求 书 CN 103525937 A 3 3/3 页 4 TaLox-B1b 基因 ； 若含有大小为 571bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 Ppo-D1a 基因或候 选含有 Ppo-D1a 基因 ； 若不含有大小为 571bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 Ppo-D1b 基 因或候选含有 Ppo-D1b 基因 ； 。
17、所述 a2） 的方法包括下述 （3） 和 （4） 的步骤 ： 所述 （3） 为如下 c1） 和 c2） ： c1） 以待测小麦的基因组DNA为模板， 用权利要求1-3中任一所述引物对组中的所述引 物对组 A 进行 PCR 反应， 所述 PCR 反应的退火温度为 59 ； c2） 以待测小麦的基因组DNA为模板， 用权利要求1-3中任一所述引物对组中所述引物 对组 C 进行 PCR 反应， 所述 PCR 反应的退火温度为 64 ； （4） 检测步骤 （3） 得到的 PCR 产物的大小， 所述检测步骤 （3） 得到的 PCR 产物的大小的 方法同步骤 （2） ； 所述 a3） 的方法包括下述 （5。
18、） 和 （6） 的步骤 ： （5） 以待测小麦的基因组 DNA 为模板， 用所述引物对组中所述引物对组 C 进行 PCR 反 应， 所述 PCR 反应的退火温度为 64 ； （6） 检测步骤 （5） 得到的 PCR 产物的大小， 所述检测步骤 （5） 得到的 PCR 产物的大小的 方法同步骤 （2） 。 8. 根据权利要求 7 所述的方法， 其特征在于 ： 所述大小为 151bp 的 DNA 片段的核苷酸 序列如序列表中序列17所示 ； 所述大小为156bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列 18 所示 ； 所述大小为 428bp 的 DNA 片段的核苷酸序列如序列表中序列 19 所示 ；。
19、 所述大小为 183bp 的 DNA 片段的核苷酸序列如序列表中序列 20 所示 ； 所述大小为 179bp 的 DNA 片段的 核苷酸序列如序列表中序列21所示 ； 所述大小为981bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表 中序列22所示 ； 所述大小为685bp的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列23所示 ； 所述 大小为 876bp 的 DNA 片段的核苷酸序列如序列表中序列 24 所示 ； 所述大小为 194bp 的 DNA 片段的核苷酸序列如序列表中序列25所示 ； 所述大小为231bp的DNA片段的核苷酸序列如 序列表中序列 26 所示 ； 所述大小为 791bp 的 DNA 片段的。
20、核苷酸序列如序列表中序列 27 所 示 ； 所述大小为 571bp 的 DNA 片段的核苷酸序列如序列表中序列 28 所示。 9. 一种培育面粉白度提高的小麦品种的方法， 包括采用通过权利要求 7 的方法鉴定得 到的如下 a） -g） 中至少一种的小麦作为亲本进行育种的步骤 ： a） 含有或候选含有 Psy-B1b 基因 ； b） 含有或候选含有 TaZds-A1a 基因 ； c） 含有或候选含有 TaZds-D1b 基因 ； d） 含有或候选含有 Ppo-A1b 基因 ； e） 含有或候选含有 Psy-A1b 基因 ； f） 含有或候选含有 TaLox-B1a 基因 ； g） 含有或候选含有。
21、 Ppo-D1a 基因。 权 利 要 求 书 CN 103525937 A 4 1/18 页 5 用于鉴定小麦面粉色泽相关基因的 PCR 体系 技术领域 0001 本发明涉及一种用于鉴定或辅助鉴定面粉色泽相关基因的 PCR 体系及其应用， 特 别涉及一种用于鉴定或辅助鉴定待测新疆冬小麦的面粉色泽相关基因如 Psy-A1、 TaLox-B1 和 Ppo-D1 的多重 PCR 引物对组、 试剂盒及其应用。 背景技术 0002 小麦面制食品作为我国人民最重要的主食之一， 为我国以面食为主地区的人民提 供 50-80% 以上的能量来源。随着社会生活水平不断提高， 人们对小麦面制品品质的要求越 来越高，。
22、 品质育种也越来越受到重视。 中国作为小麦最大的生产国和消费国， 每年仅用来生 产面条的小麦量约占小麦总消费量的 40%。而面条、 馒头、 饺子等我国传统的蒸煮类面制食 品， 色泽越白越受到我国消费者青睐。因此， 在我国传统面制品的感官评价体系中， 面制品 的色泽占很大的比例， 越白评分越高。然而， 目前我国主栽小麦品种的面粉平均白度较低 （74.8） ， 不能满足市场和消费者对面粉白度 （80.0 以上） 的要求。在 2005 年前， 大多数面粉 厂为满足消费者对面粉白度的要求， 向面粉中添加过氧化苯甲酰 （BPO） 。 但BPO会破坏营养 物质且对人类健康构成威胁， 在国家最新修订的小麦粉。
23、标准中， 已明确规定禁止使用 BPO。 因此制订育种目标， 选育出自然白的小麦具有重要意义。 同时， 亮黄色的面粉也有一定的消 费量， 如黄碱面条、 乌冬面、 意大利面等也很受欢迎。因此， 根据不同的加工目的， 分别需要 选育适合加工高白度或亮黄色面粉的小麦新品种。 0003 除了环境、 增白剂、 加工方式和栽培措施等外， 小麦面粉及面制品颜色的形成主要 受色素类物质和氧化还原酶类等遗传物质的影响。色素类物质主要包括黄色素 （Yellow pigment， YP） 和棕色素 （Brown pigment） ， 黄色素主要由类胡萝卜素 （Carotenoid） 和类黄 酮 （Flavonoid）。
24、 组成， 面粉中的氧化酶类主要包括多酚氧化酶 （Polyphenol oxidase， PPO） 、 脂肪氧化酶 （Lipoxygenase， LOX） 和过氧化物酶 （Peroxidase， POD） 。YP 含量、 LOX 及 PPO 活性对面粉及面制品的色泽有重要影响。 YP含量与面团黄度的相关系数高达0.8-0.9 ； LOX 可催化多不饱和脂肪酸加氧形成过氧化物， 反应所释放的氧自由基进一步氧化色素分子， 使面粉变白 ； PPO 在氧分子的参与下可催化单酚类物质最终变为氧合醌， 生成褐色物质， 决 定面粉及面制品加工和贮存过程中色泽褐变的 50-70%。当需要自然白小麦时， 应选择含。
25、低 YP 含量基因型、 高 LOX 活性基因型及低 PPO 活性基因型的小麦品种 （系） 。 0004 多重 PCR 是一种高效、 低成本的检测方法， 已成为研究的热点。虽然已经报道了数 套与小麦面粉色泽基因相关的多重PCR体系， 但仅涉及到PPO活性基因的Ppo-A1和Ppo-D1 位点， 或 PSY 活性基因的 Psy-A1 位点， 还未见到检测 PSY 活性基因的 Psy-B1 位点、 ZDS 活 性基因的 TaZds-A1 和 TaZds-D1 位点， 以及 LOX 活性基因 TaLox-B1 位点的多重 PCR 体系的 报道。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种用于鉴定或辅助。
26、鉴定面粉色泽相关基因的 PCR 体系 说 明 书 CN 103525937 A 5 2/18 页 6 及其应用， 特别涉及一种用于鉴定或辅助鉴定待测新疆冬小麦的面粉色泽相关基因如 Psy-A1、 TaLox-B1 和 Ppo-D1 的多重 PCR 引物对组、 试剂盒及其应用。 0006 本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定待测小麦拉面品质性状相关基因的多重 PCR 引物对组为如下 a1） 或 a2） 或 a3） 的引物对组 ： 0007 a1） 由引物对组 A、 引物对组 B 和引物对组 C 组成的引物对组 ； 0008 a2） 由引物对组 A 和引物对 C 组成的引物对组 ； 0009 a3） 。
27、引物对组 C ； 0010 所述面粉色泽相关基因为 Psy-B1 基因、 TaZds-A1 基因、 TaZds-D1 基因、 Ppo-A1 基 因、 Psy-A1 基因、 TaLox-B1 基因和 Ppo-D1 基因。 0011 所述引物对组A由特异于所述Psy-B1基因的两个引物对， 和特异于所述TaZds-A1 基因的一个引物对组成 ； 具体的， 所述特异于所述 Psy-B1 基因的两个引物对分别为序列表 中序列 1 和序列 2 所示的两条单链 DNA 组成的引物对 1， 以及序列 3 和序列 4 所示的两条单 链 DNA 组成的引物对 2 ； 所述特异于所述 TaZds-A1 基因的一个。
28、引物对为序列表中序列 5 和 序列 6 所示的两条单链 DNA 组成的引物对 3 ； 0012 所述引物对组B由特异于所述TaZds-D1基因的一个引物对， 和特异于所述Ppo-A1 基因的一个引物对组成 ； 具体的， 所述特异于所述 TaZds-D1 基因的一个引物对为序列表中 序列 7 和序列 8 所示的两条单链 DNA 组成的引物对 4 ； 所述特异于所述 Ppo-A1 基因的一个 引物对为序列表中序列 9 和序列 10 所示的两条单链 DNA 组成的引物对 5 ； 0013 所述引物对组 C 由特异于所述 Psy-A1 基因的一个引物对、 特异于所述 TaLox-B1 基因的一个引物对。
29、， 和特异于所述 Ppo-D1 基因的一个引物对组成 ； 具体的， 所述特异于所 述 Psy-A1 基因的一个引物对为序列表中序列 11 和序列 12 所示的两条单链 DNA 组成的引 物对 6 ； 所述特异于所述 TaLox-B1 基因的一个引物对为序列表中序列 13 和序列 14 所示的 两条单链 DNA 组成的引物对 7 ； 所述特异于所述 Ppo-D1 基因的一个引物对为序列表中序列 15 和序列 16 所示的两条单链 DNA 组成的引物对 8。 0014 其中， 序列 1 由 21 个核苷酸组成 ； 序列 2 由 20 个核苷酸组成 ； 序列 3 由 21 个核苷 酸组成 ； 序列 。
30、4 由 20 个核苷酸组成 ； 序列 5 由 21 个核苷酸组成 ； 序列 6 由 24 个核苷酸组 成 ； 序列 7 由 21 个核苷酸组成 ； 序列 8 由 23 个核苷酸组成 ； 序列 9 由 21 个核苷酸组成 ； 序 列 10 由 20 个核苷酸组成 ； 序列 11 由 20 个核苷酸组成 ； 序列 12 由 22 个核苷酸组成 ； 序列 13 由 23 个核苷酸组成 ； 序列 14 由 16 个核苷酸组成 ； 序列 15 由 18 个核苷酸组成 ； 序列 16 由 20 个核苷酸组成。 0015 本发明中， 所述 Psy-B1 基因涉及三个等位基因， 分别是 Psy-B1a、 Ps。
31、y-B1b 和 Psy-B1c ； 所述 TaZds-A1 基因涉及两个等位基因， 分别是 TaZds-A1a 和 TaZds-A1b ； 所述 TaZds-D1 基因涉及两个等位基因， 分别是 TaZds-D1a 和 TaZds-D1b ； 所述 Ppo-A1 基因涉及 两个等位基因， 分别是 Ppo-A1a 和 Ppo-A1b ； 所述 Psy-A1 基因涉及三个等位基因， 分别是 Psy-A1a、 Psy-A1b和Psy-A1c ； 所述TaLox-B1基因涉及两个等位基因， 分别是TaLox-B1a和 TaLox-B1b ； 所述 Ppo-D1 基因涉及两个等位基因， 分别是 Ppo-。
32、D1a 和 Ppo-D1b。 0016 所述引物对组 A 中每个引物对的两条引物在 PCR 反应体系中等量使用， 且所述引 物对 1， 所述引物对 2 和所述引物对 3 在 PCR 反应体系中的摩尔比为 6:6:5 ； 所述引物对组 B中每个引物对的两条引物在PCR反应体系中等量使用， 且所述引物对4和所述引物对5在 说 明 书 CN 103525937 A 6 3/18 页 7 PCR 反应体系中的摩尔比为 12:6 ； 所述引物对组 C 中每个引物对的两条引物在 PCR 反应体 系中等量使用， 且所述引物对 6、 所述引物对 7 和所述引物对 8 在 PCR 反应体系中的摩尔比 为 5:1。
33、0:10。 0017 具体的， 所述引物对组 A 中， 所述引物对 1 中的序列 1 和序列 2 所示的两条 DNA 单 链在所述 PCR 反应体系中的终浓度均为 0.3M ； 所述引物对 2 中的序列 3 和序列 4 所示的 两条 DNA 单链在所述 PCR 反应体系中的终浓度均为 0.3M ； 所述引物对 3 中的序列 5 和序 列 6 所示的两条 DNA 单链在所述 PCR 反应体系中的终浓度均为 0.25M。所述引物对组 B 中， 所述引物对 4 中的序列 7 和序列 8 所示的两条 DNA 单链在所述 PCR 反应体系中的终浓 度均为0.6M ； 所述引物对5中的序列9和序列10所示。
34、的两条DNA单链在所述PCR反应体 系中的终浓度均为 0.3M ； 所述引物对组 C 中， 所述引物对 6 中的序列 11 和序列 12 所示 的两条 DNA 单链在所述 PCR 反应体系中的终浓度均为 0.25M ； 所述引物对 7 中的序列 13 和序列 14 所示的两条 DNA 单链在所述 PCR 反应体系中的终浓度均为 0.5M ； 所述引物对 8 中的序列 15 和序列 16 所示的两条 DNA 单链在所述 PCR 反应体系中的终浓度均为 0.5M。 0018 含有所述引物对组的试剂盒也属于本发明的保护范围。 0019 所述引物对组的制备方法也属于本发明的保护范围。 0020 所述引。
35、物对组的制备方法， 具体可包括将所述引物对组中各引物对的所述两条单 链 DNA 分别单独包装的步骤。 0021 所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。 0022 所述试剂盒的制备方法， 具体可包括如下步骤 ： 将所述引物对组中各引物对的所 述两条单链 DNA 分别单独包装后， 与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内 ： PCR 反应 缓冲液、 DNA 聚合酶和 4 种 dNTP。 0023 下述 a1） 或 a2） 或 a3） 的方法也属于本发明的保护范围 ： 0024 a1） 鉴定或辅助鉴定待测小麦含有 Psy-B1a、 Psy-B1b 和 Psy-B1c 这三种基因中哪 一种， 含。
36、有 TaZds-A1a 和 TaZds-A1b 这两种基因中哪一种， 含有 TaZds-D1a 和 TaZds-D1b 这 两种基因中哪一种， 含有 Ppo-A1a 基因和 Ppo-A1b 基因这两种基因中哪一种 ； 含有 Psy-A1a 或 Psy-A1c 基因还是含有 Psy-A1b 基因， 含有 TaLox-B1a 和 TaLox-B1b 这两种基因中哪一 种， 以及含有 Ppo-D1a 和 Ppo-D1b 这两种基因中哪一种 ； 0025 a2） 鉴定或辅助鉴定待测小麦含有 Psy-B1a、 Psy-B1b 和 Psy-B1c 这三种基因中哪 一种， 以及含有 TaZds-A1a 和 。
37、TaZds-A1b 这两种基因中哪一种 ； 含有 Psy-A1a 或 Psy-A1c 基 因还是含有 Psy-A1b 基因， 含有 TaLox-B1a 和 TaLox-B1b 这两种基因中哪一种， 以及含有 Ppo-D1a 和 Ppo-D1b 这两种基因中哪一种 ； 0026 a3） 鉴定或辅助鉴定待测小麦含有 Psy-A1a 或 Psy-A1c 基因还是含有 Psy-A1b 基 因， 含有 TaLox-B1a 和 TaLox-B1b 这两种基因中哪一种， 以及含有 Ppo-D1a 和 Ppo-D1b 这两 种基因中哪一种 ； 0027 所述 a1） 的方法包括下述 （1） 和 （2） 的步骤。
38、 ： 0028 所述 （1） 为如下 b1） 、 b2） 和 b3） ： 0029 b1） 以待测小麦的基因组 DNA 为模板， 用所述引物对组中的所述引物对组 A 进行 PCR 反应， 所述 PCR 反应的退火温度为 59 ； 0030 在本发明中， 所述 PCR 反应的程序具体为 ： 95预变性 5min ； 95变性 45s， 59 说 明 书 CN 103525937 A 7 4/18 页 8 退火 45s， 72延伸 30s， 扩增反应进行 35 个循环 ； 72延伸 10min ； 4， 保温结束。 0031 b2） 以待测小麦的基因组 DNA 为模板， 用所述引物对组中所述引物对。
39、组 B 进行 PCR 反应， 所述 PCR 反应的退火温度为 62 ； 0032 在本发明中， 所述 PCR 反应的程序具体为 ： 95预变性 5min ； 95变性 30s， 62 退火 30s， 72延伸 70s， 扩增反应进行 34 个循环 ； 72延伸 5min ； 4， 保温结束。 0033 b3） 以待测小麦的基因组 DNA 为模板， 用所述引物对组中所述引物对组 C 进行 PCR 反应， 所述 PCR 反应的退火温度为 64 ； 0034 在本发明中， 所述 PCR 反应的程序具体为 ： 95预变性 5min ； 94变性 1min， 64 退火 1min， 72延伸 90s， 。
40、扩增反应进行 36 个循环 ； 72延伸 8min ； 4， 保温结束。 0035 （2）检测步骤 （1）得到的 PCR 产物的大小， 按照如下方法根据 PCR 产物确定所 述待测小麦含有 Psy-B1a、 Psy-B1b 和 Psy-B1c 这三种基因中哪一种， 含有 TaZds-A1a 和 TaZds-A1b 这两种基因中哪一种， 含有 TaZds-D1a 和 TaZds-D1b 这两种基因中哪一种， 以及 含有Ppo-A1a基因和Ppo-A1b基因这两种基因中哪一种， 含有Psy-A1a或Psy-A1c基因还是 含有 Psy-A1b 基因， 含有 TaLox-B1a 和 TaLox-B1。
41、b 这两种基因中哪一种， 以及含有 Ppo-D1a 和 Ppo-D1b 这两种基因中哪一种 ： 0036 以所述引物对组 A 进行 PCR 反应的产物中， 若含有大小为 151bp 的 DNA 片段， 则所 述待测小麦含有 Psy-B1a 基因或候选含有 Psy-B1a 基因 ； 若含有大小为 156bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 Psy-B1b 基因或候选含有 Psy-B1b 基因 ； 若含有大小为 428bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有Psy-B1c基因或候选含有Psy-B1c基因 ； 若含有大小为183bp的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 TaZds-A1。
42、a 基因或候选含有 TaZds-A1a 基因 ； 若含有大小为 179bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 TaZds-A1b 基因或候选含有 TaZds-A1b 基因 ； 0037 以所述引物对组 B 的进行 PCR 反应的产物中， 若不含有大小为 981bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 TaZds-D1a 基因或候选含有 TaZds-D1a 基因 ； 若含有大小为 981bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 TaZds-D1b 基因或候选含有 TaZds-D1b 基因 ； 若含有大小为 685bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 Ppo-A1a 基因或候。
43、选含有 Ppo-A1a 基因 ； 若含有大 小为 876bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 Ppo-A1b 基因或候选含有 Ppo-A1b 基因 ； 0038 以所述引物对组 C 的进行 PCR 反应的产物中， 若含有大小为 194bp 的 DNA 片段， 则 所述待测小麦含有 Psy-A1a 或 Psy-A1c 基因或候选含有 Psy-A1a 或 Psy-A1c 基因 （Psy-A1c 基因极少） ； 若含有大小为 231bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 Psy-A1b 基因或候选 含有 Psy-A1b 基因 ； 若不含有大小为 791bp 的 DNA 片段， 则所述待。
44、测小麦含有 TaLox-B1a 基因或候选含有 TaLox-B1a 基因 ； 若含有大小为 791bp 的 DNA 片段， 则所述待测小麦含有 TaLox-B1b 基因或候选含有 TaLox-B1b 基因 ； 若含有大小为 571bp 的 DNA 片段， 则所述待测 小麦含有 Ppo-D1a 基因或候选含有 Ppo-D1a 基因 ； 若不含有大小为 571bp 的 DNA 片段， 则所 述待测小麦含有 Ppo-D1b 基因或候选含有 Ppo-D1b 基因。 0039 所述 a2） 的方法包括下述 （3） 和 （4） 的步骤 ： 0040 所述 （3） 为如下 c1） 和 c2） ： 0041 。
45、c1） 以待测小麦的基因组 DNA 为模板， 用所述引物对组中的所述引物对组 A 进行 PCR 反应， 所述 PCR 反应的退火温度为 59 ； 0042 在本发明中， 所述 PCR 反应的程序具体为 ： 95预变性 5min ； 95变性 45s， 59 说 明 书 CN 103525937 A 8 5/18 页 9 退火 45s， 72延伸 30s， 扩增反应进行 35 个循环 ； 72延伸 10min ； 4， 保温结束。 0043 c2） 以待测小麦的基因组 DNA 为模板， 用所述引物对组中所述引物对组 C 进行 PCR 反应， 所述 PCR 反应的退火温度为 64 ； 0044 在。
46、本发明中， 所述 PCR 反应的程序具体为 ： 95预变性 5min ； 94变性 1min， 64 退火 1min， 72延伸 90s， 扩增反应进行 36 个循环 ； 72延伸 8min ； 4， 保温结束 ； 0045 （4） 检测步骤 （3） 得到的 PCR 产物的大小， 所述检测步骤 （3） 得到的 PCR 产物的大 小的方法同步骤 （2） 。 0046 所述 a3） 的方法包括下述 （5） 和 （6） 的步骤 ： 0047 （5） 以待测小麦的基因组 DNA 为模板， 用所述引物对组中所述引物对组 C 进行 PCR 反应， 所述 PCR 反应的退火温度为 64 ； 0048 在本发。
47、明中， 所述 PCR 反应的程序具体为 ： 95预变性 5min ； 94变性 1min， 64 退火 1min， 72延伸 90s， 扩增反应进行 36 个循环 ； 72延伸 8min ； 4， 保温结束 ； 0049 （6） 检测步骤 （5） 得到的 PCR 产物的大小， 所述检测步骤 （5） 得到的 PCR 产物的大 小的方法同步骤 （2） 。 0050 在上述方法中， 所述大小为 151bp 的 DNA 片段的核苷酸序列具体如序列表中序列 17 所示 ； 所述大小为 156bp 的 DNA 片段的核苷酸序列具体如序列表中序列 18 所示 ； 所述大 小为 428bp 的 DNA 片段的。
48、核苷酸序列具体如序列表中序列 19 所示 ； 所述大小为 183bp 的 DNA 片段的核苷酸序列具体如序列表中序列 20 所示 ； 所述大小为 179bp 的 DNA 片段的核苷 酸序列具体如序列表中序列21所示 ； 所述大小为981bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序 列表中序列 22 所示 ； 所述大小为 685bp 的 DNA 片段的核苷酸序列具体如序列表中序列 23 所示 ； 所述大小为 876bp 的 DNA 片段的核苷酸序列具体如序列表中序列 24 所示 ； 所述大小 为 194bp 的 DNA 片段的核苷酸序列具体如序列表中序列 25 所示 ； 所述大小为 231bp 的 DN。
49、A 片段的核苷酸序列如序列表中序列26所示 ； 所述大小为791bp的DNA片段的核苷酸序列具 体如序列表中序列27所示 ； 所述大小为571bp的DNA片段的核苷酸序列具体如序列表中序 列 28 所示。 0051 在本发明的一个实施例中， 用所述引物对组中的所述引物对组 A 进行 PCR 反应的 反应体系中， 作为模板的所述待测小麦的基因组 DNA 的量为 100-200ng， dNTPs 的终浓度为 200M， DNA 聚合酶的量为 1.5U。PCR 反应程序具体为 ： 95预变性 5min ； 95变性 45s， 59退火 45s， 72延伸 30s， 扩增反应进行 35 个循环 ； 72延伸 10min ； 4， 保温结束。 0052 在本发明的一个实施例中， 用所述引物对组中的所述引物对组 B 进行 PCR 反应的 反应体系中， 作为模板的所述待测小麦的基因组 DNA 的量为 100-200ng， dNTPs 的终浓度为 200M。PCR 反。