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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410554331.X (22)申请日 2014.10.09 A61K 31/475(2006.01) A61K 49/22(2006.01) A61K 9/00(2006.01) A61K 47/24(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 唐春林 地址 404600 重庆市奉节县永安镇康宁街 2 号 (72)发明人 唐春林 刘泽英 高耀华 (54) 发明名称 一种长春新碱脂质微泡及其制备方法 (57) 摘要 本发明提供一种长春新碱脂质微泡， 包括磷 脂双分子层膜、 气体和载长春新碱的白蛋白纳米 。
2、粒， 其中气体和载长春新碱的白蛋白纳米粒均包 裹在磷脂双分子层膜内部。本发明具有相对较高 的载药量和包封率， 可提高靶位的血药浓度， 延长 药物在靶位的作用时间， 减少药物降解， 提高药物 稳定性， 并且纳米粒具有促进药物的选择性分布， 利于传递药物进入病变组织， 可以增加药效并减 少毒副作用。本发明还公开了这种脂质微泡的制 备方法， 制备工艺简单， 易于工业化， 制备过程不 涉及化学反应， 未采用毒性大的有机溶剂， 安全性 高， 环境友好性强。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 。
3、104382904 A (43)申请公布日 2015.03.04 CN 104382904 A 1/1 页 2 1. 一种长春新碱脂质微泡， 其特征在于 ： 所述脂质微泡包括磷脂双分子层膜、 气体和 载长春新碱的白蛋白纳米粒 ； 所述气体和载长春新碱的白蛋白纳米粒均包裹在磷脂双分子 层膜内部 ； 所述白蛋白为牛血清白蛋白。 2. 如权利要求 1 所述的长春新碱脂质微泡， 其特征在于 ： 所述磷脂为天然磷脂。 3. 如权利要求 2 所述的长春新碱脂质微泡， 其特征在于 ： 所述天然磷脂为蛋黄卵磷脂、 大豆卵磷脂和磷脂酰乙醇胺中的一种或几种混合。 4. 如权利要求 1 所述的长春新碱脂质微泡， 其。
4、特征在于 ： 所述气体为全氟丙烷。 5. 如权利要求 1-4 任一项所述长春新碱脂质微泡的制备方法， 其特征在于 ： 包括以下 步骤 ： 1) 载长春新碱白蛋白纳米粒混悬液的制备 ： 分别配制白蛋白水溶液和长春新碱的乙醇溶液， 然后将长春新碱乙醇溶液缓慢滴加到 白蛋白水溶液中， 然后加入戊二醛， 搅拌固化， 旋转蒸发除去乙醇， 即得载药白蛋白纳米粒 混悬液 ； 2) 包裹载长春新碱白蛋白纳米粒脂质微泡的制备 ： 将磷脂、 甘油和磷酸盐缓冲液按 55 60 5 8 100 的比例混合， 再加入适量步骤 1) 中制得的白蛋白纳米粒混悬液并加热， 然后充入气体振荡， 制得包裹载药白蛋白纳米粒 的脂质。
5、微泡， 所述比例为重量百分比。 6. 如权利要求 5 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述白蛋白水溶液的浓度为 0.8 5 ； 戊二醛的浓度为 0.2 0.3 ； 磷脂、 甘油和磷酸盐缓冲液的比例为 55 60 5 8 100。 7. 如权利要求 5 或 6 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述白蛋白水溶液的浓度为 0.8 5 ； 戊二醛的浓度为 0.2 0.3 ； 磷脂、 甘油和磷酸盐缓冲液的比例为 55 60 5 8 100 ； 长春新碱的乙醇溶液加入到白蛋白水溶液中的滴速控制在 0.1 6mL/ min。 8. 如权利要求 5 或 6 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述白蛋白水溶。
6、液的浓度为 0.8 5； 戊二醛的浓度为 0.25； 磷脂、 甘油和磷酸盐缓冲液的比例为 55 60 5 8 100 ； 长春新碱的乙醇溶液加入到白蛋白水溶液中的滴速控制在 0.5 3mL/min。 9.如权利要求5所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述气体充入后震荡的时间为5-300s。 10. 如权利要求 5 所述的制备方法， 其特征在于 ： 所述加热时间为 2 3h。 权 利 要 求 书 CN 104382904 A 2 1/7 页 3 一种长春新碱脂质微泡及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及长春新碱， 具体涉及长春新碱脂质微泡及其制备方法。 背景技术 0002 长春新碱为长春花。
7、中提取的生物碱， 为干扰蛋白质合成的抗癌药物， 主要对淋巴 瘤、 绒毛膜上皮癌及睾丸肿瘤有效， 其对肺癌、 乳腺癌、 单核细胞白血病也有效。 但是长春新 碱对光敏感， 对热不稳定， 而且具有神经系统毒性、 运动障碍、 骨髓抑制以及胃肠道反应。 现 有存在的长春新碱均存在药物靶位作用时间不长， 药物稳定性不够好， 药物降解速度较快 等问题。 0003 寻找高效、 低毒且具有良好生物相容性的药物载体是靶向给药的关键所在。靶向 给药系统发展的趋势是利用脂质体、 微球等作为药物载体， 其中脂质体由于可体内降解、 无 毒、 无免疫抑制作用等特点， 作为药物载体越来越受到人们的重视。 但是脂质体也存在很多。
8、 的局限性， 如靶向性不明显， 包封率较低， 易渗透。 尤其是到达靶位后释药缓慢， 往往很难达 到有效治疗浓度。 0004 随着超生显影技术的发展， 人们发现微泡能够显著改善超生图像的对比质量， 由 此发展出中间含气的超生微泡作为超生造影剂。 超生造影剂作为增强心肌、 肝、 脑等实质器 官的二维超生显像和血流多普勒效应， 明显提高超生对于病变区形态的分辨能力。 0005 尽管微泡在造影剂方面的研究日趋成熟， 但是将微泡作为一种新型的药物载体来 研究并不多见。尽管微泡在靶向给药及促进药物在靶部位的吸收具有独特的优势， 但存在 很多目前无法克服的技术难题 ： 如微泡作为药物载体， 其载药量较低， 。
9、造成输送到靶位的药 物浓度较低， 对药物来说不足以产生有效的药理作用等。 发明内容 0006 针对现有技术中存在的上述缺陷， 本发明提供一种长春新碱脂质微泡。 0007 本发明的另一目的是提供一种长春新碱脂质微泡的制备方法。 0008 本发明的目的是这样实现的 ： 0009 一种长春新碱脂质微泡， 其特征在于 ： 所述脂质微泡包括磷脂双分子层膜、 气体和 载长春新碱的白蛋白纳米粒 ； 所述气体和载长春新碱的白蛋白纳米粒均包裹在磷脂双分子 层膜内部。 0010 所述白蛋白为牛血清白蛋白。 0011 发明人在研究中发现， 制备的长春新碱脂质微泡， 容易出现外壳较硬， 弹性相对 差， 在超声时空化作。
10、用效应弱， 不能被低能量超声所击碎， 倘若加大超声能量又会造成正常 组织损伤。 0012 上述磷脂优选天然磷脂。 0013 在满足脂质微泡容易被超声击破的情况下， 发明人在研究中还发现， 长春新碱脂 质微泡中气体的选择有很大的讲究， 一旦控制不好就容易出现 ： 微泡里的气体扩散很快， 球 说 明 书 CN 104382904 A 3 2/7 页 4 壁塌陷而迅速失去声反射性， 并且不能随血液分布全身， 从而一定程度上影响长春新碱的 治疗效果。 0014 上述气体以全氟丙烷为佳。 0015 在满足脂质微泡容易被超声击破的情况下， 发明人还发现， 若控制不好， 制得的长 春新碱脂质微泡在体内的传输。
11、效率缓慢， 药物起效时间相对较慢， 从而一定程度上影响长 春新碱的用药。 0016 进一步， 天然磷脂优选蛋黄卵磷脂、 大豆卵磷脂和磷脂酰乙醇胺中的一种或几种 混合。 0017 所述的白蛋白纳米粒包括表面有修饰叶酸、 甘草次酸的载长春新碱白蛋白纳米 粒， 和表面没有修饰的载长春新碱白蛋白纳米粒。 0018 上述长春新碱脂质微泡的制备方法， 包括载长春新碱白蛋白纳米粒混悬液的制备 和包裹载长春新碱白蛋白纳米粒脂质微泡的制备。 0019 载长春新碱白蛋白纳米粒混悬液的制备 ： 0020 分别配制白蛋白水溶液和长春新碱的乙醇溶液， 然后将长春新碱乙醇溶液缓慢滴 加到白蛋白水溶液中， 然后加入戊二醛，。
12、 搅拌固化， 旋转蒸发除去乙醇， 即得载药白蛋白纳 米粒混悬液。 0021 包裹载长春新碱白蛋白纳米粒脂质微泡的制备 ： 0022 将磷脂、 甘油和磷酸盐缓冲液按比例混合， 再加入适量步骤 1 中制得的白蛋白纳 米粒混悬液并加热， 然后充入气体振荡， 制得包裹载药白蛋白纳米粒的脂质微泡。 0023 上述长春新碱的用量为临床处方量。本发明使用戊二醛为固化剂， 其用量为本领 域技术人员根据实际情况确定。 0024 发明人在实际过程中发现， 在采用上述制备方法制备脂质微泡过程中， 若控制不 好， 易使得制得的长春新碱脂质微泡易渗漏， 稳定性差， 保存时间短， 从而严重影响长春新 碱脂质微泡的用药效果。
13、。 0025 优选地， 上述白蛋白水溶液的浓度为0.85； 戊二醛的浓度为0.20.3； 磷脂、 甘油和磷酸盐缓冲液的比例为 55 60 5 8 100。 0026 进一步， 在保证制得的长春新碱脂质微泡不易渗漏， 稳定性好的情况下， 发明人在 研究中还发现， 若控制不好， 易出现制得的脂质微泡包封率低的技术问题。 0027 更优选地， 上述白蛋白水溶液的浓度为 0.8 5 ； 戊二醛的浓度为 0.2 0.3； 磷脂、 甘油和磷酸盐缓冲液的比例为 55 60 5 8 100 ； 长春新碱的乙醇溶液 加入到白蛋白水溶液中的滴速控制在 0.1 6mL/min。 0028 上述百分比为重量百分比。磷。
14、脂、 甘油与磷酸盐缓冲液的比例为质量比。 0029 最优选地， 上述白蛋白水溶液的浓度为 0.8 5 ； 戊二醛的浓度为 0.25 ； 磷 脂、 甘油和磷酸盐缓冲液的比例为 55 60 5 8 100 ； 长春新碱的乙醇溶液加入到白 蛋白水溶液中的滴速控制在 0.5 3mL/min。 0030 在保证包封效率的基础上， 发明人在研究中发现， 震荡时间与加热时间控制不好 会带来制得的长春新碱脂质微泡的粒径不均匀， 从而一定程度上影响脂质微泡透过体内膜 的比例及效率。 0031 进一步， 上述制备方法优选白蛋白水溶液的浓度为 0.8 5 ； 戊二醛的浓度为 说 明 书 CN 104382904 A。
15、 4 3/7 页 5 0.25 ； 磷脂、 甘油和磷酸盐缓冲液的比例为 55 60 5 8 100 ； 长春新碱的乙醇溶 液加入到白蛋白水溶液中的滴速控制在0.53mL/min ； 充入气体后震荡的时间为5-300s ； 加热时间为 2 3h。 0032 具体的说， 一种长春新碱脂质微泡的制备方法， 包括如下步骤 ： 0033 1) 载长春新碱白蛋白纳米粒混悬液的制备 ： 0034 分别配制浓度为 0.8 5白蛋白水溶液和长春新碱的乙醇溶液， 然后将长春 新碱乙醇溶液以 0.5 3mL/min 滴加到白蛋白水溶液中， 然后加入适量浓度为 0.25的戊 二醛， 搅拌固化， 旋转蒸发除去乙醇， 即。
16、得载药白蛋白纳米粒混悬液。 0035 2) 包裹载长春新碱白蛋白纳米粒脂质微泡的制备 ： 0036 将磷脂、 甘油和磷酸盐缓冲液按 55 60 5 8 100 的比例混合， 再加入适量 步骤 1 中制得的白蛋白纳米粒混悬液并加热 2 3h， 然后充入全氟丙烷机械法振荡 30s 50s， 制得包裹载药白蛋白纳米粒的脂质微泡。 0037 上述载长春新碱白蛋白脂质微泡直径为 4 7 微米。 0038 本发明所得的微泡可静注用于临床， 或者制成冻干粉针剂用于临床。 0039 一种长春新碱脂质微泡冻干粉针剂的制备方法， 包括如下步骤 ： 0040 1) 载长春新碱白蛋白纳米粒混悬液的制备 ： 0041 。
17、分别配制浓度为 0.8 5白蛋白水溶液和长春新碱的乙醇溶液， 然后将长春 新碱乙醇溶液以 0.5 3mL/min 滴加到白蛋白水溶液中， 然后加入适量浓度为 0.25的戊 二醛， 搅拌固化， 旋转蒸发除去乙醇， 即得载药白蛋白纳米粒混悬液。 0042 2) 包裹载长春新碱白蛋白纳米粒脂质微泡的制备 ： 0043 将磷脂、 甘油和磷酸盐缓冲液按 55 60 5 8 100 的比例混合， 再加入适量 步骤 1 中制得的白蛋白纳米粒混悬液并加热 2 3h， 然后充入全氟丙烷机械法振荡 30s 50s， 制得包裹载药白蛋白纳米粒的脂质微泡。 0044 3)、 预冻 ： 把分装好的长春新碱脂质微泡放入冻。
18、干箱内隔板上， 在手动界面中， 设 板层温度为 0、 1min( 开启电加热 )， 进箱完毕后， 待制品达到 1以下保持 60min ； 打开两 个压缩机， 设板温 -40、 1min， 使制品在 -35以下保持 60min ； 设板温 -11、 60min， 待制 品达 -11时， 使制品在 -11保持 60min ； 设板温 -38、 1min， 使制品在 -35以下保持 60min。 0045 4)、 一次干燥 ( 升华干燥 ) 0046 对后箱制冷， 待后箱温度达 -40时， 开启真空泵， 2s 后开小蝶阀， 对后箱抽真空。 0047 待后箱真空 90Pa 时， 开中隔阀， 待前箱真空。
19、 12pa 时， 设定导热油温度为 0， 有限量泄露为82pa， 对制品加热180min， 设定导热油温度为10， 有限量泄露为82pa， 至制品完全抽白。整个升华过程中， 前、 后箱真空度应 30Pa， 制品温度 -20， 冷凝器温 度 -50。如出现异常情况应减慢加热速度、 停止加热或降低板温。 0048 5)、 二次干燥 ( 解析干燥 ) 0049 设定板层温度为 20， 待制品温度越过 -25 -20温度段后， 打开有限量泄漏 205( 30Pa)， 使制品温度迅速上升到 20后， 关闭有限量泄漏， 恒温干燥 5 小时以上。 0050 整个过程中， 冷阱温度应 -50。恒温阶段前、 后。
20、箱真空为 5Pa。 0051 本发明的有益效果 ： 说 明 书 CN 104382904 A 5 4/7 页 6 0052 本发明为载药超声微泡给药系统， 进入体内后， 体表采用超声辐射， 使微泡定向爆 破， 在体内靶部位释放药物 ； 同时微泡的爆破可以造成 “声孔效应” ， 增强局部微血管和细胞 膜通透性， 促进药物渗透， 从而实现药物的靶向给药。 0053 本发明选用的天然磷脂能清除自由基， 延缓机体衰老 ； 改善脂类代谢， 防治静动脉 硬化， 参与组成细胞膜， 增强免疫功能， 促进神经传导， 提高大脑活力。 0054 本发明与将纳米粒吸附或连接于微泡表面的系统相比， 本发明首次制备包裹载。
21、药 白蛋白纳米粒的脂质微泡， 将载药白蛋白纳米粒包裹于微泡脂膜内部， 可在体表超声辐照 下在体内精确定位爆破， 释放出其包裹的白蛋白纳米粒， 从而提高纳米粒的靶向给药效率。 0055 本发明具有相对较高的载药量和包封率， 可提高靶位的血药浓度， 延长药物在靶 位的作用时间， 减少药物降解， 提高药物稳定性， 并且纳米粒具有促进药物的选择性分布， 利于传递药物进入病变组织， 可以增加药效并减少毒副作用。 0056 本发明采用的制备方法可显著提高微泡的载药量， 降低药物的降解， 实现药物在 靶位的缓释， 延长药物作用时间， 增加了药物的疗效 ； 本发明制备工艺简单， 制备过程不涉 及化学反应， 未。
22、采用毒性大的有机溶剂， 安全性高， 环境友好性强， 易于工业化。 0057 本发明制备的长春新碱脂质微泡冻干粉针极大地方便了药物的贮藏与运输， 保存 时间大大延长。 附图说明 ： 0058 图1为本发明实施例1所制备的载长春新碱白蛋白纳米粒脂质微泡的光学显微镜 (400 倍 ) 下的图像。 0059 图 2 为本发明制备的载长春新碱白蛋白纳米粒和全氟丙烷的脂质微泡的示意图。 0060 图 3 为本发明制备的包载长春新碱白蛋白纳米粒和全氟丙烷的脂质微泡的粒径 分析图。 0061 图 4 为本发明制备的包载长春新碱白蛋白纳米粒和全氟丙烷的脂质微泡的体外 显影图。 0062 图 5 为本发明制备的包。
23、载长春新碱白蛋白纳米粒和全氟丙烷的脂质微泡的兔肝 脏显影图。 0063 图 6 为本发明制备的包载长春新碱白蛋白纳米粒和全氟丙烷的脂质微泡在超声 前后的体外释放情况。 具体实施方式 ： 0064 以下通过实施例对本发明进行详细描述， 但本发明并不仅限于下述实施例。 0065 实施例 1 0066 1)、 卵磷脂混合液的制备 0067 将蛋黄卵磷脂 ： 甘油 ： 磷酸盐缓冲液以658100的比例混合均匀， 以质量百分 比计。 0068 2)、 长春新碱白蛋白纳米粒的制备 0069 采用去溶剂化法制备长春新碱白蛋白纳米粒， 精密称取 20mg 牛血清白蛋白溶于 2mL 水中， 另称取 50mg 长。
24、春新碱溶于 12mL 无水乙醇中， 以 1mL/min 的体积流量将长春新碱 说 明 书 CN 104382904 A 6 5/7 页 7 乙醇溶液滴加到白蛋白水溶液中， 加入100mL浓度为0.25的戊二醛， 避光搅拌4h固化， 于 35旋转蒸发除去乙醇， 即得长春新碱白蛋白纳米粒混悬液， 结果见图 1。离心法测得其包 封率为 88.48。 0070 3)、 载长春新碱白蛋白纳米粒脂质微泡的制备 0071 取步骤 1 制得的卵磷脂混合液 4mL 与步骤 2 制得的长春新碱白蛋白纳米粒 1mL 混 合均匀， 加热培养 2 个小时， 然后充入全氟丙烷至饱和后采用机械振荡法震荡 30s， 制得载 。
25、长春新碱白蛋白纳米粒的脂质微泡。将所得微泡于光学显微镜下观察， 结果见图 2。 0072 4) 载药微泡的粒径分析 0073 采用马尔文 MS2000 激光粒度仪测定载药微泡的粒径分布。 0074 将制备得到的长春新碱脂质微泡加到装有 800ml 经超声脱气的纯化水的烧杯中， 置于MS2000激光粒度仪， 2500rpm、 超声强度15、 时间2min分散处理， 检测粒径分布， 所得微 泡的粒径分布图见图 3。 0075 5)、 将制得的载长春新碱白蛋白纳米粒脂质微泡用水囊包裹， 测定其显影效果。 结 果表明本发明制备的微泡具有良好的体外显影效果 ( 图 4)。 0076 6)、 新西兰大白兔。
26、肝脏显影 0077 以新西兰大白兔 ( 新西兰大白兔来源于重庆医科大学实验动物中心 ) 为实验对 象， 应用速眠新 II 型 (1mL/Kg) 肌肉注射麻醉大白兔后， 仰卧位固体， 采用自身前后对照的 方法， 造影前， 将 1mL 的载长春新碱白蛋白纳米粒脂质微泡， 经兔耳缘静脉注入兔体内， 观 察兔肝脏部位的显影效果。结果表明本发明制备的微泡具有良好的体内显影效果 ( 见图 5)。 0078 7)、 体外超声释放 0079 应用透析袋法， 考察制得的载长春新碱白蛋白纳米粒脂质微泡在超声或不加超声 情况下不同时间点的长春新碱累计释放率 ( 见图 6)。结果表明在超声作用下， 微泡的释药 速率大。
27、大提高， 证明该微泡具有良好的超声响应性， 在超声作用下， 脂膜破裂， 释放其包裹 的长春新碱白蛋白纳米粒， 释药速率大大提高。 0080 对比例 1 0081 将实施例 1 中的全氟丙烷换成空气、 氧气或六氟化硫， 其余与实施例 1 相同。制得 的脂质微泡在超声条件下发现， 声反应弱， 24h 释药总量不足 70。 0082 实施例 2-10， 按照以下参数运行， 其他同实施例 1， 所述累积释放率实验为加超声 的情况下检测。 0083 说 明 书 CN 104382904 A 7 6/7 页 8 0084 说 明 书 CN 104382904 A 8 7/7 页 9 0085 本发明实施例。
28、 8-10 为对比实施例， 实验结果显示 ： 磷脂的种类， 磷脂、 甘油和磷酸 盐缓冲液的配比关系， 以及戊二醛的选取对本发明有着非常重要的影响。 0086 本发明实施例 1-7 的实验结果显示 ： 通过本发明的各个参数的配合， 能实现包封 率 82.3 92， 制得的载长春新碱白蛋白脂质微泡直径为 4 7 微米， 体外、 体内显影效 果良好， 且 24h 体内药物释放率为 80 92， 具有良好的应用前景。 0087 实施例 11 0088 将实施例 1 制得的长春新碱脂质微泡制成冻干粉针制剂 0089 预冻 ： 把分装好的长春新碱脂质微泡放入冻干箱内隔板上， 在手动界面中， 设板层 温度为。
29、 0、 1min( 开启电加热 )， 进箱完毕后， 待制品达到 1以下保持 60min ； 打开两个 压缩机， 设板温 -40、 1min， 使制品在 -35以下保持 60min ； 设板温 -11、 60min， 待制 品达 -11时， 使制品在 -11保持 60min ； 设板温 -38、 1min， 使制品在 -35以下保持 60min。 0090 - 次干燥 ( 升华干燥 ) 0091 对后箱制冷， 待后箱温度达 -40时， 开启真空泵， 2s 后开小蝶阀， 对后箱抽真空。 待后箱真空 90Pa 时， 开中隔阀， 待前箱真空 12pa 时， 设定导热油温度为 0， 有限泄露 为82pa。
30、， 对制品加热180min， 设定导热油温度为10， 有限量泄露为82pa， 至制品完全 抽白。 整个升华过程中， 前、 后箱真空度应30Pa， 制品温度-20， 冷凝器温度-50。 如出现异常情况应减慢加热速度、 停止加热或降低板温。 0092 二次干燥 ( 解析干燥 ) 0093 设定板层温度为 20， 待制品温度越过 -25 -20温度段后， 打开有限量泄漏 205( 30Pa)， 使制品温度迅速上升到 20后， 关闭有限量泄漏， 恒温干燥 5 小时以上。 0094 整个过程中， 冷阱温度应 -50。恒温阶段前、 后箱真空为 5Pa。 说 明 书 CN 104382904 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 104382904 A 10 2/2 页 11 图 6 说 明 书 附 图 CN 104382904 A 11 。