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1、(10)申请公布号 CN 104352929 A (43)申请公布日 2015.02.18 CN 104352929 A (21)申请号 201410548760.6 (22)申请日 2014.10.16 A61K 36/9064(2006.01) A61K 9/20(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 济南新起点医药科技有限公司 地址 250001 山东省济南市市中区 288 号恒 昌大厦 2303 (72)发明人 孙波 (54) 发明名称 一种阿里红咳喘片的制备方法及其在抑制小 鼠肝癌细胞 H22 细胞增殖药物中的应用 (57) 摘要 本发明属于中药技。
2、术领域， 具体涉及一种阿 里红咳喘片的制备方法及应用。本发明的阿里 红咳喘片的制备方法， 由阿里红 20g、 洋李 100g、 芦根 80g、 甘草 60g、 麻黄 50g、 木香 30g、 洋茴香 120g、 香附 30g、 豆蔻 20g 作为原料药制成， 采用 超临界萃取和微波萃取制备而成， 使得甘草酸含 量有很大提高。本发明还提供了阿里红咳喘片在 制备抑制小鼠肝癌细胞 H22 细胞增殖药物中的应 用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 1043529。
3、29 A CN 104352929 A 1/1 页 2 1. 一种阿里红咳喘片的制备方法， 由阿里红 20g、 洋李 100g、 芦根 80g、 甘草 60g、 麻黄 50g、 木香30g、 洋茴香120g、 香附30g、 豆蔻20g作为原料药制成， 其特征在于， 所述的制备方 法由下列步骤组成 ： 取洋茴香、 麻黄、 木香、 香附、 豆蔻， 加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作 为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 4-6%， 萃取压力 15-30MPa， 温度 30-50， CO2流量 l-3ml/g 生药min， 萃取时间 150-200min， 得超临界萃取物， 备用 ； 取。
4、其余中药， 粉 碎， 加入3L的70%乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率600-800W， 萃取2次， 每次5-10分钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到Dl01大孔吸附树脂柱上， 50%乙醇洗脱， 收集5倍量 柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微 波提取物混合， 加入淀粉， 70% 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 200 片， 每片重 0.3g。 2.根据权利要求l所述的阿里红咳喘片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取 中夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 5%。 3.根据权利要求l所述的阿里红咳喘片的制备方。
5、法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取 中萃取压力为 25 MPa。 4.根据权利要求l所述的阿里红咳喘片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取 中萃取温度为 40。 5.根据权利要求l所述的阿里红咳喘片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取 中 CO2流量 2ml/g 生药min。 6.根据权利要求l所述的阿里红咳喘片的制备方法， 其特征在于， 所述CO2超临界萃取 中萃取时间为 180min。 7. 根据权利要求 l 所述的阿里红咳喘片的制备方法， 其特征在于， 所述微波萃取功率 为 700W。 8. 根据权利要求 l 所述的阿里红咳喘片的制备方法， 其特征在于， 所。
6、述微波萃取每次 萃取时间为 8 分钟。 9.权利要求l所述的阿里红咳喘片在制备抑制小鼠肝癌细胞H22细胞增殖药物中的应 用。 权 利 要 求 书 CN 104352929 A 2 1/5 页 3 一种阿里红咳喘片的制备方法及其在抑制小鼠肝癌细胞 H22 细胞增殖药物中的应用 技术领域 0001 本发明属于中药技术领域， 具体涉及一种阿里红咳喘片的制备方法及其在抑制小 鼠肝癌细胞 H22 细胞增殖药物中的应用。 背景技术 0002 阿里红咳喘口服液标准号 WS-10245(ZD-0245)-2002， 记载于国家中成药标准汇编 内科肺系分册。由阿里红 20g、 洋李 100g、 芦根 80g、 。
7、甘草 60g、 麻黄 50g、 木香 30g、 洋茴香 120g、 香附 30g、 豆蔻 20g 作为原料药制成， 具有止咳， 平喘， 祛痰的功效。用于寒性咳嗽， 咯 痰不爽， 急慢性支气管炎、 哮喘。 0003 现有技术中， 尚未有阿里红咳喘口服液在提取制备方面采用超临界萃取和微波提 取技术的报道， 而挥发油提取， 水加热提取的方法， 工艺粗糙、 落后， 杂质多， 导致患者用量 很大， 不方便服用， 严重影响了本品在临床上应用。 发明内容 0004 为了解决上述的技术问题， 本发明提供了一种阿里红咳喘片的制备方法。 0005 本发明的另一个目的在于提供一种阿里红咳喘片在制备抑制小鼠肝癌细胞 。
8、H22 细胞增殖药物中的应用。 0006 本发明的目的是通过如下的方案实现的 ： 一种阿里红咳喘片的制备方法， 由阿里红20g、 洋李100g、 芦根80g、 甘草60g、 麻黄50g、 木香 30g、 洋茴香 120g、 香附 30g、 豆蔻 20g 作为原料药制成， 所述的制备方法由下列步骤组 成 ： 取洋茴香、 麻黄、 木香、 香附、 豆蔻， 加入到CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂 占总萃取溶剂的体积百分比为 4-6， 萃取压力 15-30MPa， 温度 30-50， CO2流量 l-3ml/ g 生药min， 萃取时间 150-200min， 得超临界萃取物， 备用 ；。
9、 取其余中药， 粉碎， 加入 3L 的 70乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 600-800W， 萃取 2 次， 每次 5-10 分 钟， 合并萃取液， 浓缩， 加到Dl01大孔吸附树脂柱上， 50乙醇洗脱， 收集5倍量柱体积洗脱 液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混 合， 加入淀粉， 70乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 200 片， 每片重 0.3g。 0007 优选的， 上述的阿里红咳喘片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中夹带剂占总萃 取溶剂的体积百分比为 5。 0008 优选的， 上述的阿里红咳喘片的制。
10、备方法中， 所述 CO2超临界萃取中萃取压力为 25MPa。 0009 优选的， 上述的阿里红咳喘片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中萃取温度为 40。 0010 优选的， 上述的阿里红咳喘片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中 CO2流量 2ml/ g 生药min。 说 明 书 CN 104352929 A 3 2/5 页 4 0011 优选的， 上述的阿里红咳喘片的制备方法中， 所述 CO2超临界萃取中萃取时间为 180min。 0012 优选的， 上述的阿里红咳喘片的制备方法中， 所述微波萃取功率为 700W。 0013 优选的， 上述的阿里红咳喘片的制备方法中， 所述微波萃取。
11、每次萃取时间为 8 分 钟。 0014 上述的阿里红咳喘片在制备抑制小鼠肝癌细胞 H22 细胞增殖药物中的应用。 0015 现有技术中， 阿里红咳喘口服液每次 10ml， 一日 3 次。阿里红咳喘口服液因其是 口服液， 味道较苦， 不适宜小儿服用， 另外， 如果调味需要加糖比较多， 不适糖尿病人服用， 患者依从性差。采用本发明方法制备成的阿里红咳喘片每片重 0.3g， 每次仅需 2 片， 一日 服用 3 次。在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证 明。且制备成片剂， 患者随水吞下即可， 服药量小且无苦味， 患者易于接受。 0016 试验一、 不同方法制备的阿里红咳。
12、喘片中甘草酸含量的比较 l、 仪器及试药本发明阿里红咳喘片 ： 按实施例1方法制备， 使用560g原料药， 经提取制 成 200 片， 每片重 0.3g。原阿里红咳喘口服液， 按照 WS-10245(ZD-0245)-2002 标准方法制 备。Agilent1200 高效液相色谱仪 ； METTLER AE240 电子分析天平 ； 甘草酸对照品 ( 中国药 品生物制品检定所 )。 0017 2、 方法 照高效液相色谱法 ( 中国药典 2010 年版一部附录 D) 测定。 0018 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基键合硅胶为填充剂 ； 甲醇 -0.2mol/L 醋酸 铵溶液 - 冰醋酸 (67。
13、 33 1) 为流动相 ； 检测波长为 250nm。理论板数按甘草酸单铵盐 峰计算应不低于 2000。 0019 对照品溶液的制备精密称取甘草酸单铵盐对照品 10mg， 置 50ml 量瓶中， 用流动 相溶解并稀释至刻度， 摇匀， 即得 ( 每 1ml 含甘草酸单铵盐对照品 0.2mg， 折合甘草酸为 0.1959mg)。 0020 本发明阿里红咳喘片供试品溶液的制备取本发明的阿里红咳喘片， 研细， 取 0.6g， 精密称定， 置具塞锥形瓶中， 加水 10ml 使溶解， 溶液滤过， 精密量取 2ml 滤液， 移至蒸发皿 中， 蒸干， 残渣加流动相使溶解， 移至 10ml 量瓶中， 加流动相至刻。
14、度， 即得。 0021 对照产品供试品溶液的制备取对照的阿里红咳喘口服液， 精密量取 2ml， 移至蒸发 皿中， 蒸干， 残渣加流动相使溶解， 移至 10ml 量瓶中， 加流动相至刻度， 即得。 0022 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 10l， 注入液相色谱仪， 测定， 摇匀， 即得。 0023 3、 结果 结果表明， 本发明阿里红咳喘片中甘草酸的含量为 3.6-7.2mg/ 片 ； 而原阿里红咳喘口 服液中甘草酸的含量为0.36mg/ml， 每次服用量2片的甘草酸含量为原口服液剂含量的2-4 倍， 在服用量减少的情况下， 甘草酸含量有很大提高。 0024 上述研究表明， 采用本。
15、发明制备方法制备的阿里红咳喘片， 有效成分含量远远高 于 WS-10245(ZD-0245)-2002 标准记载的方法制备的阿里红咳喘口服液。 具体实施方式 说 明 书 CN 104352929 A 4 3/5 页 5 0025 下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明， 以便本领域的技术人员更了解 本发明， 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例， 凡基于本发明上述 内容所实现的技术均属于本发明的范围。 0026 实施例 1 取阿里红 20g、 洋李 100g、 芦根 80g、 甘草 60g、 麻黄 50g、 木香 30g、 洋茴香 120g、 香附 30g、 豆蔻 20g，。
16、 将透骨草、 五气朝阳草、 姜黄加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 5， 萃取压力 25MPa， 温度 40， CO2流量 2ml/g 生 药 min， 萃取时间 180min， 得超临界萃取物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入 3L 的 70乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 700W， 萃取 2 次， 每次 8 分钟， 合并萃取液， 浓 缩， 加到Dl01大孔吸附树脂柱上， 50乙醇洗脱， 收集5倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 。
17、70 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 200 片， 每片重 0.3g。 0027 经检测， 成品中甘草酸的含量为 7.25mg/ 片。 0028 实施例 2 取阿里红 20g、 洋李 100g、 芦根 80g、 甘草 60g、 麻黄 50g、 木香 30g、 洋茴香 120g、 香附 30g、 豆蔻 20g， 将透骨草、 五气朝阳草、 姜黄加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 4， 萃取压力 30MPa， 温度 50， CO2流量 3ml/g 生 药 min， 萃取时间 150min， 得超临界萃取物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入 3。
18、L 的 70乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率 600W， 萃取 2 次， 每次 5 分钟， 合并萃取液， 浓 缩， 加到Dl01大孔吸附树脂柱上， 50乙醇洗脱， 收集5倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物混合， 加入淀粉， 70 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 200 片， 每片重 0.3g。 0029 经检测， 成品中甘草酸的含量为 4.52mg/ 片。 0030 实施例 3 取阿里红 20g、 洋李 100g、 芦根 80g、 甘草 60g、 麻黄 50g、 木香 30g、 洋茴香 120g、 香。
19、附 30g、 豆蔻 20g， 将透骨草、 五气朝阳草、 姜黄加入到 CO2超临界萃取器中， 乙醇作为夹带剂， 夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为 6， 萃取压力 15MPa， 温度 30， CO2流量 1ml/g 生 药 min， 萃取时间 200min， 得超临界萃取物， 备用 ； 取其余中药， 粉碎， 加入 3L 的 70乙醇， 投入微波萃取装置中进行微波萃取， 萃取功率800W， 萃取2次， 每次10分钟， 合并萃取液， 浓 缩， 加到Dl01大孔吸附树脂柱上， 50乙醇洗脱， 收集5倍量柱体积洗脱液， 减压回收乙醇， 浓缩并干燥， 得微波提取物， 备用 ； 将上述超临界萃取物和微波提取物。
20、混合， 加入淀粉， 70 乙醇制颗粒， 干燥， 压片， 制成 200 片， 每片重 0.3g。 0031 经检测， 成品中甘草酸的含量为 3.68mg/ 片。 0032 实施例 4 ： 阿里红咳喘片抑制小鼠肝癌细胞 H22 细胞增殖的实验研究资料 1. 实验材料 1.1 实验用细胞株 小鼠肝癌细胞 H22 细胞， 山东大学实验室细胞库， DMEM+10 FBS 常规培养。 0033 1.2 实验药物 研究药物 ： 本发明阿里红咳喘片 ： 按实施例 1 方法制备。 说 明 书 CN 104352929 A 5 4/5 页 6 0034 药液储液 ： 称取 100mg 阿里红咳喘片， 溶于 5ml。
21、 无水乙醇中， 0.2m 滤器过滤， 500ldoff 管分装， -20存储， 同时 0.2m 滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。 0035 1.3 实验试剂 DMEM(GIBCO 公司 Cat.No.12100-061 Lot.No.758137) ； 胎牛血清 ( 浙江天杭生物科 技有限公司 Lot.No.100419) ； NaHC03( 上海久亿化学试剂有限公司 Cat.No.11810-033 Lot.No.1088387) ； Trypsin(AMRESCO 公司 ) ； EDTA(AMRESCO 公司 ) ； Penicillin G Sodium Salt(AMRESCO公司1)。
22、 ； Streptomycin Sulfate(AMRESCO) ； 无水乙醇(淄博亚杜兰经贸有限 公司 ) ； MTT(Biosharp 批号 ： 0793) ： PBS( 实验室自配 ) ； 1.4 实验器材 莱卡倒置显微镜 ( 德国 Leica 型号 ： DMIL) ； 可见 - 紫外光微孔板检测仪 ( 美国 MD 公 司型号 ： SPECTRAMAX 190) ； CO2培养箱 (FORMA 型号 ： 3111) ； 超净台 ( 苏净集团安泰公司制 造型号 ： SW-CJ-ZFD) ； 纯水仪 ( 美国 Sprlng 公司型号 ： S/N 020579) ； 精密移液器 ( 法国吉 尔。
23、森公司型号 ： P2) ； 电子天平 ( 德国赛多利斯有限公司型号 ： BT323S) ； 全自动高压灭菌锅 ( 日本 SANYO 公司型号 ： MLS-3020) ； 台式电热鼓风干燥箱 ( 上海精密实验设备公司型号 ： DHG9123A) ； 冰箱 ( 西门子公司型号 ： KG18V21TI) ； 液氮罐 (CBS 型号 ： 2001) ； 低速离心机 ( 上海安亭科学仪器厂型号 ： KA-1000) ； 0.2m 滤器 (MILLIPORE 型号 ： SLGP033RB) ； 1cm 培 养皿 (NEST 公司 )、 96 孔培养板 (NEST 公司 ) ； 细胞计数板 ； 离心管、 移。
24、液管、 Tips 若干。 0036 2. 实验方法 1)H22 细胞用 DMEM+10 FBS 于 37、 5 CO2进行常规培养 (10cm 培养皿 )， 当细胞生 长至对数期时， 收集细胞， 弃去培养液， PBS 轻洗 3 遍， 加入 3ml 0.25胰蛋白酶 -0.04 EDTA， 37消化2min后， 向其中加入5ml完全培养基中和反应， 吹打细胞后将其转入离心管 中， 1000rpm 离心 5min， 调整细胞悬液浓度 3104个 /ml。 0037 2)将细胞种入96孔培养板中， 每孔加入细胞悬液180l， 培养板放入细胞培养箱 中 (37， 5 CO2) 常规培养。 0038 3。
25、) 根据细胞生长情况， 一般长至 50 -70， 加入阿里红咳喘片溶液， 继续培养 24h。 0039 4)24h 后加入 20l MTT 溶液 (5mg/ml， 即 0.5 MTT)， 继续培养 4h。 0040 5)4h 后扣板法倒去上清， 用吸水纸轻轻拍干， 每孔如入 200l 二甲基亚砜， 置摇 床上低速振荡 10min， 使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 490nm 处测量各孔的吸光值。 0041 6) 同时设置本底 ( 不加细胞， 只加培养液 )， 对照孔 ( 细胞、 相同浓度的药物溶解 介质、 培养液、 MTT、 二甲基亚砜 )， 每组设定 6 个复孔。 0042 7) 结果以。
26、药物对细胞的抑制率表示 ： 细胞增值抑制率 ( ) ( 对照孔 OD 值 - 给 药孔 OD 值 )、 对照孔 OD 值 100。实验重复 3 次。 0043 3. 统计处理 采用 Microsoft Excel 2007 软件中的相关分析和 Student t 检验， 数据以 meanS. D. 表示。 0044 4. 实验结果 MTT 法实验后统计结果显示， 与对照组比较， 当剂量达到 5mg/ml 时， 对 H22 细胞增殖抑 制有差异 (P0.05)， 剂量在 10mg/ml 时该差异具有显著性 (P0.01)， 当剂量达到 15-20mg/ 说 明 书 CN 104352929 A 6 5/5 页 7 ml 时有极显著性差异 (P0.001)。 0045 表 1 阿里红咳喘片对 H22 细胞增殖抑制影响研究 (XSD) 组别药物浓度 (mg/ml)抑制率 ( ) 对照组00 158.425.03 21016.179.86* 31525.1712.38* 42035.9616.53* 注 ： 与对照组比较， *PO.01 ； *P0.001。 0046 5. 实验结论 本发明的阿里红咳喘片可以抑制H22细胞增殖， 减少H22细胞的细胞生长数目， 该作用 呈剂量依赖性。 说 明 书 CN 104352929 A 7 。