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1、(10)申请公布号 CN 104069490 A (43)申请公布日 2014.10.01 CN 104069490 A (21)申请号 201310105135.X (22)申请日 2013.03.28 A61K 39/29(2006.01) A61P 31/14(2006.01) (71)申请人 国家纳米科学中心 地址 100190 北京市海淀区中关村北一条 11 号 (72)发明人 聂广军 王海 吴雁 苏世帅 (74)专利代理机构 北京润平知识产权代理有限 公司 11283 代理人 王凤桐 周建秋 (54) 发明名称 一种疫苗及其制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种制备疫苗的方法，。
2、 该方法 包括 ：（1） 在水溶液中， 将抗原蛋白与水溶性金源 混合， 得到混合后的物料 ；（2） 在步骤 （1） 得到的 混合后的物料与碱性物质接触。本发明还提供了 上述方法制备得到的疫苗。 通过上述技术方案， 本 发明的疫苗有效地降低了副作用， 例如对于戊肝 病毒疫苗， 将 ED50值降低了 60% 以上。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图3页 (10)申请公布号 CN 104069490 A CN 104069490 A 1/1。
3、 页 2 1. 一种制备疫苗的方法， 该方法包括 ： （1） 在水溶液中， 将抗原蛋白与水溶性金源混合， 得到混合后的物料 ； （2） 在步骤 （1） 得到的混合后的物料与碱性物质接触。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中， 步骤 （1） 中， 相对于每毫克的抗原蛋白， 以金元素 的含量计， 所述水溶性金源的用量为 0.04-0.4mol， 优选为 0.1-0.3mol。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 其中， 步骤 （1） 中， 所述水溶液中， 所述抗原蛋白的 浓度为 2-100mg/mL， 优选为 10-20mg/mL。 4. 根据权利要求 1 或 2 所述的方法， 。
4、其中， 步骤 （2） 中， 碱性物质的用量使得步骤 （1） 得到的混合后的物料与碱性物质接触后的 pH 值为 7.4-12， 优选为 8-10。 5. 根据权利要求 1 或 4 所述的方法， 其中， 步骤 （2） 中， 所述接触的时间为 1 分钟至 72 小时， 优选为 5 分钟至 1 小时。 6. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中， 所述碱性物质为氢氧化钠、 氢氧化钾、 碳酸钠、 碳 酸钾、 碳酸氢钠和碳酸氢钾中的至少一种。 7. 根据权利要求 1 所述的方法， 其中， 所述抗原蛋白为戊型肝炎病毒衣壳蛋白。 8.根据权利要求1所述的方法， 其中， 所述抗原蛋白具有SEQ ID NO ： 。
5、1所示的氨基酸序 列， 所述水溶性金源为 HAuCl4， 相对于每毫克的抗原蛋白， HAuCl4的用量为 0.1-0.3mol ； 所述水溶液中， 所述抗原蛋白的浓度为 2-100mg/mL ； 所述碱性物质为氢氧化钠， 氢氧化钠 的用量为使得步骤 （1） 中混合后的物料与碱性物质接触后的 pH 值为 8-10。 9. 权利要求 1-8 中任意一项所述的方法制备得到的疫苗。 权 利 要 求 书 CN 104069490 A 2 1/4 页 3 一种疫苗及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医药领域， 具体地， 涉及一种制备疫苗的方法， 以及该方法制备得 到的疫苗。 背景技术 0002。
6、 戊型病毒性肝炎既往称为肠道传播的非甲非乙型肝炎。1983 年 Balayan 等用免 疫电镜技术 (IEM) 从一名经口感染的志愿者粪便中检测到直径 27 30nm 的病毒颗粒， 并 用其感染绒猴成功， 因而认为该病毒是引起戊型肝炎的病原。1989 年 Reyes 等应用分子 克隆技术获得本病毒的基因克隆， 并正式将此型肝炎及其相关病毒分别命名为戊型肝炎 (Hepatitis E， 简称戊肝)和戊型肝炎病毒 （Hepatitis E virus， HEV） 。 1986年9月至1988 年 4 月， 中国新疆南部暴发流行， 共发病 119280 起， 死亡 707 人， 是迄今为止世界上最大。
7、的 一次戊型肝炎的流行。 0003 疫苗是用细菌、 病毒、 肿瘤细胞等制成的可使机体产生特异性免疫的生物制剂， 通 过疫苗接种使接受方获得免疫力。 但是多数疫苗在接种后的全身反应有发热和周身不适等 副作用。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种副作用低的疫苗及其制备方法。 0005 为了实现上述目的， 一方面， 本发明提供了一种制备疫苗的方法， 该方法包括 ： （1） 在水溶液中， 将抗原蛋白与水溶性金源混合， 得到混合后的物料 ；（2） 在步骤 （1） 中混合 后的物料与碱性物质接触。 0006 另一方面， 本发明还提供了上述方法制备得到的疫苗。 0007 通过上述技术方案， 本发明的。
8、疫苗有效地降低了副作用， 例如对于戊肝病毒疫苗， 将 ED50值降低了 60% 以上。 0008 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。 附图说明 0009 附图是用来提供对本发明的进一步理解， 并且构成说明书的一部分， 与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明， 但并不构成对本发明的限制。在附图中 ： 0010 图 1a 为所制备的戊肝病毒衣壳蛋白透射电镜图。 0011 图 1b 为所制备的生长有金纳米粒子戊肝病毒衣壳蛋白的蛋白透射电镜图。 0012 图 1c 为所制备的生长有金纳米粒子戊肝病毒衣壳蛋白的金纳米粒子透射电镜 图。 0013 图 2 为实施例 1 所得到。
9、的生长有金纳米粒子戊肝病毒衣壳蛋白的荧光激发光谱。 0014 图 3a 表示戊肝病毒衣壳蛋白的细胞毒性试验结果。 0015 图 3b 表示生长有金纳米粒子戊肝病毒衣壳蛋白的细胞毒性试验结果。 说 明 书 CN 104069490 A 3 2/4 页 4 0016 图 4 表示戊肝病毒衣壳蛋白和生长有金纳米粒子戊肝病毒衣壳蛋白疫苗效价结 果。 具体实施方式 0017 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是， 此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明， 并不用于限制本发明。 0018 在本发明中， 在未作相反说明的情况下， 使用的术语 “溶液” 的范围并不限于分散 质的粒子直。
10、径小于1nm的分散系 （真溶液） ， 而是泛指均一的液态混合物， 可以包括胶状分散 体 （胶体溶液） 。使用的气体和液体的体积数值均为标准状态下的数值。 0019 本发明提供了一种制备疫苗的方法， 该方法包括 ：（1） 在水溶液中， 将抗原蛋白与 水溶性金源混合， 得到混合后的物料 ；（2） 在步骤 （1） 中混合后的物料与碱性物质接触。 0020 其中， 步骤 （1） 中， 相对于每毫克的抗原蛋白， 以金元素的含量计， 所述水溶性金源 的用量可以为 0.04-0.4mol， 优选为 0.1-0.3mol。 0021 其中， 步骤 （1） 中， 所述水溶液中， 所述抗原蛋白的浓度可以为 2-1。
11、00mg/mL， 优选 为 10-20mg/mL。 0022 其中， 步骤 （2） 中， 碱性物质的用量使得步骤 （1） 中混合后的物料与碱性物质接触 后的 pH 值可以为 7.4-12， 优选为 8-10。 0023 其中， 步骤 （2） 中， 所述接触的时间可以为 1 分钟至 72 小时， 优选为 5 分钟至 1 小 时。 0024 其中， 所述碱性物质为氢氧化钠、 氢氧化钾、 碳酸钠、 碳酸钾、 碳酸氢钠和碳酸氢钾 中的至少一种。 0025 其中， 优选情况下， 所述抗原蛋白为戊型肝炎病毒衣壳蛋白。 0026 其中， 更优选情况下， 所述抗原蛋白具有 SEQ ID NO ： 1 所示的氨。
12、基酸序列。 0027 根据本发明提供的制备方法， 其中， 所述抗原蛋白来源于已知戊型肝炎病毒 （Hapatitis E virus， HEV） 。 其中， 所述抗原蛋白的病毒来源是指所述肝炎病毒疫苗蛋白的 编码基因所在的病毒物种， 上述肝炎病毒的基因的核苷酸序列及其编码的蛋白的氨基酸序 列已为本领域公知， 并已经由公共数据库 （如 NCBI） 收录。典型地， 本领域技术人员可以通 过查询公共数据库 （如 NCBI） 来得到所需的抗原蛋白的核酸编码序列和氨基酸序列， 并且通 过常规的基因工程方法来表达和纯化所需的抗原蛋白。 0028 根据本发明提供的制备方法， 其中， 优选情况下， 所用的抗原蛋。
13、白为氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示的蛋白。其中， 氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示的蛋白是戊型肝炎病毒 株开放读码框架 2 编码的蛋白的 453 至 631 位氨基酸的片段。 0029 其中， 作为一种特别优选的实施方式， 所述抗原蛋白具有 SEQ ID NO ： 1 所示 的氨基酸序列， 所述水溶性金源为 HAuCl4， 相对于每毫克的抗原蛋白， HAuCl4的用量为 0.1-0.3mol ； 所述水溶液中， 所述抗原蛋白的浓度为 10-20mg/mL ； 氢氧化钠的用量为使 得步骤 （1） 中混合后的物料与碱性物质接触后的 pH 值为 8-10。 0030 其。
14、中， 与碱性物质接触后的物料含有生长有金纳米粒子的戊肝病毒衣壳蛋白， 从而可以作为疫苗。可以通过常规的超滤来纯化所述疫苗。超滤的截留分子量可以为 15-200kDa。截留下来的那部分物料可以作为纯化的疫苗。 说 明 书 CN 104069490 A 4 3/4 页 5 0031 本发明还提供了上述方法制备得到的疫苗。 0032 实施例 1 0033 本实施例用于说明本发明提供的制备方法， 并且通过以下步骤完成 ： 0034 按照常规的基因工程方法来表达和纯化 SEQ ID NO ： 1 所示的蛋白， 纯化的蛋白经 过质谱鉴定其分子量为 19472.64， 与理论值完全相符， 确认成功合成了 S。
15、EQ ID NO ： 1 所示 的蛋白， 即得到了本实施例的戊肝病毒衣壳蛋白。将该蛋白作为抗原蛋白， 溶于水中， 配制 为 15mg/mL 的蛋白溶液。 0035 将 0.5mL 氯金酸水溶液 (20mmol/L， 4 ) 和 2.5mL 的蛋白溶液 (15mg/mL， 4 ) 混 合均匀， 然后用浓度为 1mol/L 的 NaOH 溶液将混合后的物料的 pH 调节至约 8.0， 维持 10min 后， 用截留分子量为 20kDa 的超滤膜进行超滤， 截留下来的那部分物料含有生长有金纳米 粒子的戊肝病毒衣壳蛋白， 可以作为纯化的戊肝病毒疫苗。 0036 实施例 2 0037 通过透射电镜 （美。
16、国 FEI， Tecnai G220S-TWIN， 200kV） 观察实施例 1 得到的戊肝病 毒衣壳蛋白和生长有金纳米粒子的戊肝病毒衣壳蛋白， 可见实施例 1 得到的生长有金纳米 粒子的戊肝病毒衣壳蛋白具有如图 1b 和图 1c 所示的显微形态。 0038 实施例 3 0039 通过 Pekin Elmer Instruments(Shanghai)Co.Ltd 公司 LS-55 型的荧光 / 磷光 / 发光分光光度计， 测得实施例 1 得到的生长有金纳米粒子的戊肝病毒衣壳蛋白具有如图 2 所示的荧光激发光谱。 0040 实施例 4 0041 将肝癌细胞和未成熟的 DC 细胞系 （购自 AT。
17、CC） 以每 35mm 内径的培养皿 103个的 密度分别接种于含有 2ml 的 DMEM 培养基 （购自 Gibco， 牌号 sh30022.01B， 且含 10 体积 % 的 胎牛血清） 的两个培养皿中， 在 37和 5 体积 % 的 CO2浓度下培养 24 小时后， 吸出培养基， 将2ml溶有不同浓度实施例1得到的戊肝病毒衣壳蛋白的培养基， 加入其中一只培养皿中， 将 2ml 溶有不同浓度生长有金纳米粒子的戊肝病毒衣壳蛋白的培养基， 加入另一只培养皿 中， 将上述2只培养皿在37和5%的CO2浓度下孵育24小时后， 按照文献(Qinghua Miao, 等， 生物材料 (Biomater。
18、ials),2010,31(28):7364-75) 中所述的 CCK-8 法检测细胞凋亡水 平。 结果如图3， 可以发现， 戊肝病毒衣壳蛋白在高浓度下是具有一定的细胞毒性的， 而生长 有金纳米粒子的戊肝病毒衣壳蛋白则没有细胞毒性。 0042 实施例 5 0043 将30只4.5周龄未孕雌性NIH小鼠分别随机分为3个小组， 每个小组10只。 以氢 氧化铝佐剂 （购自国药集团化学试剂有限公司， 货号 28151100） 稀释实施例 1 得到的戊肝病 毒衣壳蛋白及生长有金纳米粒子的戊肝病毒衣壳蛋白至终浓度分别为 1.6g/ml、 0.4g/ ml、 0.1g/ml， 以氢氧化铝佐剂为对照， 腹腔注。
19、射 1ml/ 只。所有试验动物于免疫后 4 周经 心脏采血， 离心收集血清， 然后用酶联免疫法检测 HEV179 特异性抗体的产生情况， 计算小 鼠阳转比例。根据抗体阳转比例， 以 Reed-Muench 法计算重组戊型肝炎疫苗 ED50。结果如 图4， 实施例1得到的生长有金纳米粒子的戊肝病毒衣壳蛋白的ED50为0.552g， 而戊肝病 毒衣壳蛋白的 ED50为 0.200g， 显著低于生长有金纳米粒子的戊肝病毒衣壳蛋白。 0044 实施例 6 说 明 书 CN 104069490 A 5 4/4 页 6 0045 本实施例用于说明本发明提供的制备方法， 并且通过以下步骤完成 ： 0046 。
20、将0.5mL氯金酸水溶液(20mmol/L， 4)和5mL的实施例1的蛋白溶液(10mg/mL， 4 ) 混合均匀， 然后用浓度为 1mol/L 的 NaOH 溶液将混合后的物料的 pH 调节至约 9.0， 维 持10min后， 用截留分子量为20kDa的超滤膜进行超滤， 截留下来的那部分物料含有生长有 金纳米粒子的戊肝病毒衣壳蛋白， 可以作为纯化的戊肝病毒疫苗。 0047 实施例 7 0048 本实施例用于说明本发明提供的制备方法， 并且通过以下步骤完成 ： 0049 将0.5mL氯金酸水溶液(20mmol/L， 4)和4mL的实施例1的蛋白溶液(10mg/mL， 4)混合均匀， 然后用浓度。
21、为1mol/L的NaOH溶液将混合后的物料的pH调节至约10.0， 维 持10min后， 用截留分子量为20kDa的超滤膜进行超滤， 截留下来的那部分物料含有生长有 金纳米粒子的戊肝病毒衣壳蛋白， 可以作为纯化的戊肝病毒疫苗。 。 0050 实施例 8 0051 按照实施例 5 的方法分别测得实施例 6 和 7 的生长有金纳米粒子的戊肝病毒衣壳 蛋白的 ED50分别为 0.48g 和 0.44g， 均显著高于戊肝病毒衣壳蛋白。 0052 根据实施例 5 和实施例 8 的数据可见， 本发明的疫苗有效地降低了副作用。 0053 以上详细描述了本发明的优选实施方式， 但是， 本发明并不限于上述实施方。
22、式中 的具体细节， 在本发明的技术构思范围内， 可以对本发明的技术方案进行多种简单变型， 这 些简单变型均属于本发明的保护范围。 0054 另外需要说明的是， 在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征， 在不矛 盾的情况下， 可以通过任何合适的方式进行组合， 为了避免不必要的重复， 本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。 0055 此外， 本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合， 只要其不违背本 发明的思想， 其同样应当视为本发明所公开的内容。 说 明 书 CN 104069490 A 6 1/2 页 7 0001 0002 序 列 表 CN 104069490 A 7 2/2 页 8 序 列 表 CN 104069490 A 8 1/3 页 9 图 1a图 1b 图 1c 说 明 书 附 图 CN 104069490 A 9 2/3 页 10 图 2 图 3a 说 明 书 附 图 CN 104069490 A 10 3/3 页 11 图 3b 图 4 说 明 书 附 图 CN 104069490 A 11 。