淫羊藿发酵生产宝藿苷I的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103305572 A (43)申请公布日 2013.09.18 CN 103305572 A *CN103305572A* (21)申请号 201310214031.2 (22)申请日 2013.05.31 C12P 19/60(2006.01) C12R 1/865(2006.01) (71)申请人 西昌丹阳生物科技有限责任公司 地址 615021 四川省凉山彝族自治州西昌市 川兴镇 (72)发明人 蒋洪武 杨红 刘卓艳 波拉提 . 马卡比力 江发玉 (74)专利代理机构 成都金英专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 51218 代理人 袁英 (54) 发明名称 淫羊。

2、藿发酵生产宝藿苷 I 的方法 (57) 摘要 本发明公开了淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的 方法， 它包括以下步骤 ： S1. 酵母菌在培养基中扩 繁， 稀释 ； S2. 将培养液与淫羊藿混合并搅拌均 匀， 置发酵罐密闭静态厌氧发酵 ； S3. 当淫羊藿苷 水解完全时， 将发酵原料用提取溶剂提取 ； S4. 浸 膏用二氯甲烷洗涤， 再用乙酸乙酯萃取 ； S5. 将乙 酸乙酯萃取液经氧化铝柱过滤后， 经硅胶吸附柱 层析， 得到宝藿苷 I 纯品。本发明的有益效果是 ： 采用微生物固态厌氧发酵水解含有淫羊藿苷的原 料， 操作简便， 易于实施， 高效快捷、 低成本、 高收 率、 无污染， 适于工业化大规模。

3、生产。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103305572 A CN 103305572 A *CN103305572A* 1/1 页 2 1. 淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法， 其特征在于 ： 它包括以下步骤 ： S1、 酵母菌在培养基中扩繁 8 12 小时， 扩繁培养条件为 pH6 7、 温度 15 35， 静 态发酵， 然后按扩繁液体积加22.5倍量的水稀释得到培养液 ； 所述的培养基用淀粉加水 配成， 淀粉的用量为酵。

4、母菌重量的400800倍， 淀粉中加入的水与淀粉重量比为46:1 ； S2、 将步骤 S1 得到的培养液与粉碎至 10 20 目的淫羊藿混合， 搅拌均匀， 淫羊藿与 培养液的重量比为 1:0.2 1.5， 然后置于发酵罐密闭静态厌氧发酵 ； 罐内温度保持 35 45， 发酵时间 48 72 小时 ； S3、 检测， 当淫羊藿苷水解完全时， 将发酵原料转入提取器用提取溶剂提取， 提取液浓 缩， 得含宝藿苷 的浸膏 ； 所述的提取溶剂为酯、 醇、 酮或醚 ； S4、 浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮， 再用乙酸乙酯萃取得到较 纯的宝藿苷 部分 ； S5、 将乙酸乙酯萃取液经氧化铝短柱。

5、过滤除去残存的鞣质等杂质， 滤液在 50温度 下减压浓缩成干浸膏 ； 按200300目工业层析硅胶 ： 干浸膏重量比为40 ： 1的比例上柱， 用 含乙醇依次为4%、 6%、 8%的二氯甲烷洗脱， 流出液薄层监测， 将含宝藿苷单一成分的流份 合并， 50以下浓缩成膏， 抽松， 乙醇溶解， 过滤， 滤液加蒸馏水， 析出晶体， 滤取晶体， 45 以下真空干燥至恒重， 得到含量 99% 以上的宝藿苷 纯品。 2. 根据权利要求 1 所述的淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法， 其特征在于 ： 所述的酵母 菌为高活性干酵母。 3. 根据权利要求 1 所述的淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法， 其特征在于 ：。

6、 所述的淀粉 为全薯粉或全麦粉。 4. 根据权利要求 1 所述的淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法， 其特征在于 ： 步骤 S2 中所 述的淫羊藿为淫羊藿干原料， 淫羊藿干原料与培养液的重量比为 1:1.2 1.5。 5. 根据权利要求 1 所述的淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法， 其特征在于 ： 步骤 S2 中所 述的淫羊藿为淫羊藿鲜品， 淫羊藿鲜品与培养液的重量比为 1:0.2。 6. 根据权利要求 1 所述的淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法， 其特征在于 ： 所述的浸膏 用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮的具体操作为 ： 浸膏先用石油醚洗涤除去 油脂、 蜡质、 叶绿素， 再用二氯甲。

7、烷萃取得到较干净的淫羊藿黄酮。 权 利 要 求 书 CN 103305572 A 2 1/10 页 3 淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法 技术领域 0001 本发明涉及中药成分提取工艺， 特别是淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法。 背景技术 0002 淫羊藿为为小檗科植物心叶淫羊藿， 淫羊藿 （Epimedium brevicornum Maxim.） 、 箭叶淫羊藿 （Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.） Maxim.） 、 柔毛淫羊藿 （Epimedium pubescens Maxim.） 、 巫山淫羊藿 （Epimedium wushanense T.S。

8、.Ying） 、 或朝鲜淫羊藿 （Epimedium koreanum Nakai） 的干燥地上部分。夏、 秋季茎叶茂盛时采割， 除去粗梗及杂 质， 晒干或阴干。 0003 淫羊藿， 是一种传统的补益中药， 具有补肾阳、 强筋骨、 祛风湿等多种功效， 用于治 疗阳痿遗精， 筋骨痿软， 风湿痹痛， 麻木拘挛 ； 更年期高血压。 0004 宝藿苷 I（Baohuoside I） ， 又名淫羊藿次苷 II（Icarisid II） ， 在五加皮、 柔毛淫 羊藿中有少量存在。宝藿苷 I 具有比淫羊藿苷更强、 更广泛的药理活性， 具有突出的抗骨质 疏松、 提高肌体免疫力、 抗氧化、 防治心脑血管疾病的功。

9、效 ； 对老年痴呆等退行性疾病， 也有 良好的预防和治疗作用。宝藿苷 I 对癌细胞有明显的生长抑制及诱导细胞凋亡的作用， 作 用机制被认为是与下调凋亡抑制基因SURFvivin的表达有关。 业内认为针对靶向survivin 的阻断性抗肿瘤疗法， 必将为肿瘤的治疗开辟新途径。 0005 此外宝藿苷 I 还同样具有和淫羊藿苷部分相同的药理作用。是开发多种新药及功 能食品的原料， 应用前景广阔。因其在淫羊藿药材中的含量较低， 难以分离纯化得到。宝藿 苷 的生产技术也就成为研究的热门课题。 0006 药代研究发现， 服用淫羊藿苷后， 在血液中大量检出宝藿苷 ， 表明淫羊藿中的淫 羊藿苷在体内经降解脱去。

10、了葡萄糖基， 得到宝藿苷 。转化率为 1/3。 0007 此前已有采用纤维素酶和-葡糖苷酶酶解含淫羊藿苷单体微量 （毫克级） 制备宝 藿苷 的报道， 以及经改进用纤维素酶酶解淫羊藿原料制备宝藿苷 的小试 （克级） 的工 艺报道。 0008 中国专利 201110186207.9 公开了一种从淫羊藿制备宝藿苷 I 的方法， 为用 1 千克 淫羊藿用稀醇加纤维素酶和吐温 80 在提取中酶解淫羊藿苷为宝藿苷 I 的小试工艺。但该 法尚存在以下技术缺陷 ： 0009 1. 因用低度醇提取， 提取液含有大量水， 浓缩能耗高， 浓缩温度也高， 时间长。由 于宝藿苷 I 的 C-8 位有敏感的异戊烯基， 其。

11、它部位还有较敏感的羰基、 酮基， 长时间高温对 产品破坏很大。同时， 低度醇含水多， 带出杂质多， 又增加了分离难度。低度醇浓缩后留下 水液， 对目标产物宝藿苷 I 不溶解， 影响提出效果。加乳化剂吐温 80 仅有助于已提出的淫 羊藿苷水解成宝藿苷I部分融入水中， 而植物组织中的宝藿苷I则难以提出， 导致提出不完 全。 0010 2. 纤维素酶价格高， 每吨原料使用 5 千克， 用量大。使该工艺产品无成本优势。 4. 由于该工艺的以上缺陷 （提不净、 带出杂质多、 产品破坏大） ， 提取物含量低， 导致产品提 说 明 书 CN 103305572 A 3 2/10 页 4 纯困难。生产 98%。

12、 以上产品需用制备柱纯化。由于中、 高压制备柱产量小， 成本高。一般不 属工业生产范畴。 0011 3. 该工艺仅为 1 千克淫羊藿原料的小试生产。非工业性制备。能否工业放大尚未 可知。 0012 此前也有用纤维素酶、 或 - 葡萄糖苷酶水解已提纯的淫羊藿苷为宝藿苷 I 的微 量实验工艺。用 100 毫克淫羊藿苷加等量的酶在缓冲溶液中水解。该法因是 0.1 克的微量 实验， 且用酶等量， 又须在 100 毫升的缓冲液中控温进行。既繁琐难控， 成本也太高。 发明内容 0013 本发明的目的在于克服现有技术的缺点， 提供一种高效快捷、 低成本高收率无污 染、 可工业化生产的淫羊藿发酵生产宝藿苷 I。

13、 的方法。 0014 本发明的目的通过以下技术方案来实现 ： 淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法， 它包 括以下步骤 ： 0015 S1、 酵母菌在培养基中扩繁 8 12 小时， 扩繁培养条件为 pH6 7、 温度 15 35， 静态发酵， 然后按扩繁液体积加 2 2.5 倍量的水稀释得到培养液 ； 所述的培养基用 淀粉加水配成， 淀粉的用量为酵母菌重量的400800倍， 淀粉中加入的水与淀粉重量比为 4 6:1 ； 0016 S2、 将步骤 S1 得到的培养液与粉碎至 10 20 目的淫羊藿混合， 搅拌均匀， 淫羊 藿与培养液的重量比为 1:0.2 1.5， 然后置于发酵罐密闭静态厌氧发酵 ；。

14、 罐内温度保持 35 45， 发酵时间 48 72 小时 ； 0017 S3、 检测， 当淫羊藿苷水解完全时， 将发酵原料转入提取器用提取溶剂提取， 提取 液浓缩， 得含宝藿苷 的浸膏 ； 所述的提取溶剂为酯、 醇、 酮或醚 ； 0018 S4、 浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮， 再用乙酸乙酯萃取得 到较纯的宝藿苷 部分 ； 0019 S5、 将乙酸乙酯萃取液经氧化铝短柱过滤除去残存的鞣质等杂质， 滤液在 50 温度下减压浓缩成干浸膏 ； 按 200 300 目工业层析硅胶 ： 干浸膏重量比为 40 ： 1 的比例 上柱， 用含乙醇依次为 4%、 6%、 8% 的二氯甲烷洗脱，。

15、 流出液薄层监测， 将含宝藿苷 单一成 分的流份合并， 50以下浓缩成膏， 抽松， 乙醇溶解， 过滤， 滤液加蒸馏水， 析出晶体， 滤取晶 体， 45以下真空干燥至恒重， 得到含量 99% 以上的宝藿苷 纯品。 0020 所述的酵母菌为高活性干酵母。 0021 所述的淀粉为全薯粉或全麦粉。 0022 步骤 S2 中所述的淫羊藿为淫羊藿干原料， 淫羊藿干原料与培养液的重量比为 1:1.2 1.5。 0023 步骤 S2 中所述的淫羊藿为淫羊藿鲜品， 淫羊藿鲜品与培养液的重量比为 1:0.2。 0024 所述的浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮的具体操作为 ： 浸膏 先用石油醚洗涤除去。

16、油脂、 蜡质、 叶绿素， 再用二氯甲烷萃取得到较干净的淫羊藿黄酮。 0025 本发明具有以下优点 ： 0026 本发明采用微生物固态厌氧发酵水解含有淫羊藿苷的原料， 形成工业规模制备宝 藿苷 的生产工艺 ； 进一步地， 本发明采用微生物固态厌氧发酵水解原料中的淫羊藿苷为 说 明 书 CN 103305572 A 4 3/10 页 5 宝藿苷 ， 再经洗涤、 萃取、 层析获得高纯度宝藿苷 ， 形成了高效快捷、 低成本高收率无 污染的工业生产工艺技术 ； 该工艺操作简便， 易于实施。 0027 本发明采用菌扩繁水解工艺， 菌用量少， 扩繁成本低 ； 菌及扩繁的培养基成本不足 400 元人民币 / 。

17、吨原料 ； 相比采用酶水解制备工艺， 解决了业内的酶水解工艺的酶用量大、 酶价高造成的高生产成本问题。 并且本发明采用固态发酵， 无发酵液排放， 解决了业内用酶 在缓冲液中水解或低醇水液中水解， 造成的水解缓冲液或去醇水液排放造成的污染。 0028 本发明采用固态发酵， 可用较水沸点低的溶剂提取， 容易浓缩， 能耗低， 并可减少 浓缩中的产品损失。而现有技术中采用低醇水酶解， 酶解液浓缩困难， 造成产品损失大， 提 出物的杂质多， 造成后续精制难。本发明水解后目标产品相近成分少， 分离精制容易， 仅洗 涤萃取、 过滤和硅胶吸附层析即可获得纯度 99% 以上的产品， 而现有技术中采用低醇水解 造。

18、成杂质多， 需树脂交换 （继续造成大量废水污染） 、 制备柱分离才能获得纯品。 0029 本发明采用密闭厌氧发酵， 发酵产生的二氧化碳迅速充斥于容器中， 成为保护剂， 避免了降解所得敏感成分的氧化破坏， 使目标产物得到稳定蓄存。 0030 本发明的菌扩繁、 提取、 分离精制， 无特殊设备条件要求， 适用于大规模工业生产， 已在 15 立方发酵罐中投料 2.4 吨的发酵水解和分离精制， 运行稳定。淫羊藿苷水解残留量 为原料的 3.6 14.5ppm（醇提出物的 20 80ppm） ， 水解收率达 99.24%， 获得含量 99.44% 的产品， 收率83%。 避免了酶水解仅实现1千克原料的小试，。

19、 不能形成工业生产的问题， 解决 了低成本高收率无污染工业规模生产宝藿苷 的业内难题。 0031 本发明产品收率高。本发明使用经定向扩繁的微生物发酵产生 - 葡糖苷酶， 高 选择性地只除去淫羊藿苷等苷类的 O- 葡糖基， 鼠李糖基不被水解。由于该水解的高度专 一性， 使得宝藿苷 I 收率很高 ； 同时， 厌氧发酵对敏感产物实现有效保护， 使水解收率超过 99%， 产品最终收率达到 83%。 0032 本发明产品品质优。生产的产品经中科院成都分院分析测试中心检验， 含量达到 99.44%， 无有害溶剂残留。 0033 本发明工艺简便， 易于工业生产。 本发明的菌来源方便， 容易扩繁 ； 发酵设备。

20、普通， 低沸点溶剂提取， 使浓缩容易， 仅洗涤萃取、 过滤、 吸附层析即得高纯产品， 适于工业化生 产。 0034 本发明生产成本低。由于水解成本低， 水解后宝藿苷 的相近成分少， 分离容易。 生产成本低。 0035 本发明生产过程环境友好。 本发明固态发酵无发酵废液产生， 低沸点溶剂提取， 可 完全回收， 无大量水液残留， 整个工艺过程无废液排放。 附图说明 0036 图 1 为本发明制得的宝藿苷 I 纯品 HPLC 分析图谱 ； 0037 图 2 为发酵原料醇提为膏送检宝藿苷 I 及相近成分 HPLC 图谱。 具体实施方式 0038 下面结合实施例对本发明做进一步的描述， 本发明的保护范围。

21、不局限于以下所 述 ： 说 明 书 CN 103305572 A 5 4/10 页 6 0039 淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法， 它包括以下步骤 ： 0040 S1、 酵母菌在培养基中扩繁 8 12 小时， 扩繁培养条件为 pH6 7、 温度 15 35， 静态发酵， 然后按扩繁液体积加 2 2.5 倍量的水稀释得到培养液 ； 所述的培养基用 淀粉加水配成， 淀粉的用量为酵母菌重量的400800倍， 淀粉中加入的水与淀粉重量比为 4 6:1， 0041 所述的淀粉为全薯粉或全麦粉 ； 优选地， 在培养温度为 25 30条件下， 培养 8 10 小时 ； 当培养温度 15时， 时间延长至 1。

22、2 24 小时 ； 0042 酵母菌为中华人民共和国行业标准QR/T1501-92规定的 “高活性干酵 母” ， 优级或一级品 ； 发酵力 750ml（CO2)。 0043 S2、 将步骤 S1 得到的培养液与粉碎至 10 20 目的淫羊藿混合， 搅拌均匀， 淫羊藿 与培养液的重量比为 1:0.2 1.5， 优选地， 当淫羊藿为淫羊藿干原料时， 淫羊藿干原料与 培养液的重量比为 1:1.2 1.5， 当淫羊藿为淫羊藿鲜品时， 淫羊藿鲜品与培养液的重量比 为 1:0.2 ； 然后置于发酵罐密闭静态厌氧发酵 ； 罐内温度保持 35 45， 发酵时间 48 72 小时 ； 0044 S3、 检测， 。

23、当淫羊藿苷水解完全时， 将发酵原料转入提取器用提取溶剂提取， 提取 液浓缩， 得含宝藿苷 的浸膏 ； 所述的提取溶剂为酯、 醇、 酮或醚 ； 所述的淫羊藿苷水解完 全即为淫羊藿苷残留量在规定值以下， 如 ： 所述的规定值可为发酵物料量的 25ppm ； 0045 淫羊藿苷残留量按 中华人民共和国药典 2010 年版规定方法检测。 0046 所述的提取溶剂为乙酸乙酯、 甲酸乙酯、 乙酸甲酯或比乙酸乙酯含碳略高的酯。 0047 所述的提取溶剂也可为乙醇、 甲醇、 异丙醇或丙醇。 0048 所述的提取溶剂也可为丙酮。 0049 所述的提取溶剂也可为乙醚。 0050 用于提取的酯， 最常用的是乙酸乙酯。

24、， 沸点更低的是甲酸乙酯、 乙酸甲酯。但后二 者水溶量更大， 带出杂质比前者多。含碳更高的酯， 如丙酸丁酯， 沸点太高， 提取液不便浓 缩。 用于提取的醇， 沸点较低的是乙醇 （即酒精） 。 甲醇沸点更低 （64.6） 、 但有毒 ； 异丙醇、 丙醇的沸点高一些， 价也高。上述醇的极性高， 与水充分混合， 带出杂质多。用于提取的酮， 主要是丙酮， 沸点低 （56.5） ， 极性介于醇、 酯之间。提取带出的杂质也介于二者之间。由 于为易制毒试剂。受管制。用于提取的醚， 主要是乙醚。沸点仅 34.5， 水溶性比乙酸乙酯 更小， 提出物比乙酸乙酯带出的杂质更少。但也是易制毒试剂， 受管制使用。且沸点。

25、过低、 可过氧化爆炸， 不便保管。 0051 将发酵原料转入提取罐， 加乙酸乙酯至没过原料面 10 厘米以上， 冷浸 4 小时或 50以下温浸 2 小时， 放出溶剂， 送去蒸馏 ； 提取罐内再补充溶剂至原液位， 冷浸 4 小时或 50以下温浸 1.5 2 小时， 放出溶剂， 该溶剂不再浓缩， 而是送入另一只提取罐作第一次 提取原料的提取试剂使用， 以节省能源， 并减少试剂和敏感成分损失 ； 同样， 第三、 四次提取 液分别做另一只罐第二、 三次提取试剂。 第四次提后残渣中有效成分如已按要求提净， 就可 加热蒸馏回收残留溶剂至净。放出残渣， 再加新提取原料， 如上重复操作， 继续提取。残渣 因发。

26、酵菌蛋白含量高， 为优质饲料 ； 提取液浓缩得到浸膏。 0052 S4、 浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮， 再用乙酸乙酯萃取得 到较纯的宝藿苷 部分 ； 说 明 书 CN 103305572 A 6 5/10 页 7 0053 如要单独收取黄酮， 先用石油醚洗涤除去油脂、 蜡质、 叶绿素， 再用二氯甲烷萃取 就得到较干净的淫羊藿黄酮。如不单独收黄酮， 直接用二氯甲烷洗涤， 油脂、 蜡质、 叶绿素、 淫羊藿黄酮就一起被洗出。宝藿苷 不被洗出。用乙酸乙酯萃取， 即仅萃取出宝藿苷 及相近成分。萃出物宝藿苷 含量大幅度提高。乙酸乙酯萃取后的残余物， 是更高极性的 多糖苷和糖类成分以及上。

27、述溶剂不容的杂质等。用于制取淫羊藿多糖、 多糖苷等。 0054 洗涤方法是将浸膏投入加有23倍量的6090沸程的石油醚的萃取罐中， 开 动搅拌器搅拌， 搅拌器转速控制在60120转/分， 至浸膏完全分散在石油醚中即止。 静置 让分层， 放出上层石油醚层 ； 再加放出量的石油醚， 同上操作， 至石油醚色浅为止。 在放净石 油醚后的罐中加入 2 3 倍体积比的二氯甲烷， 开动搅拌器搅拌， 搅拌器转速控制在 60 120 转 / 分， 至浸膏完全分散在二氯甲烷中为止。静置使分层， 放出下层二氯甲烷 ； 再加放 出量的二氯甲烷， 同上操作， 至二氯甲烷无色为止。 0055 二氯甲烷萃取出黄酮完成后， 。

28、在放干净二氯甲烷的罐中 （内留有浸膏） 再加入 2 3 倍体积比的乙酸乙酯， 开动搅拌器搅拌， 搅拌器转速控制在 60 120 转 / 分， 至浸膏完全 分散在乙酸乙酯中即止 ； 静置使分层， 放出上层的乙酸乙酯 ； 再加放出量的乙酸乙酯， 同上 操作。如无乳化， 可延长每次搅拌时间 3 5 分钟。萃取至乙酸乙酯无色， 且检测宝藿苷 低于规定值为止。 0056 S5、 将乙酸乙酯萃取液经氧化铝短柱过滤除去残存的鞣质等杂质， 滤液在 50 温度下减压浓缩成干浸膏 ； 按 200 300 目工业层析硅胶 ： 干浸膏重量比为 40 ： 1 的比例 上柱， 用含乙醇依次为 4%、 6%、 8% 的二氯。

29、甲烷洗脱， 流出液薄层监测， 将含宝藿苷 单一成 分的流份合并， 50以下浓缩成膏， 抽松， 乙醇溶解， 过滤， 滤液加蒸馏水， 析出晶体， 滤取晶 体， 45以下真空干燥至恒重， 得到含量 99% 以上的宝藿苷 纯品。 0057 由于乙酸乙酯中要溶入一小部分水， 这一小部分水仍会带出一小部分鞣质及氨基 酸等高极性杂质， 氧化铝对高极性物质吸附好， 尤其是对鞣质属不可逆吸附， 滤除效果极 好， 可干净彻底滤除。硅胶柱层析是要分开宝藿苷 和它的相近成分， 获得高纯品。 0058 实施例 1 ： 0059 淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法， 它包括以下步骤 ： 0060 S1、 取 40g 高活性。

30、干酵母在培养基中扩繁 10 小时， 扩繁培养条件为 pH6 7、 温度 25， 静态发酵， 然后按扩繁液体积加 2 倍量的水稀释得到培养液 ； 所述的培养基用淀粉加 水配成， 淀粉的用量为酵母菌重量的 500 倍 （20kg） ， 淀粉中加入的水与淀粉重量比为 6:1， 所述的淀粉为小麦粉 ； 高活性干酵母为中华人民共和国行业标准 QR/T1501-92 规定的 “高活性干酵母” ， 优级或一级品 ； 发酵力 750ml（CO2)。 0061 S2、 将步骤S1得到的培养液与240kg粉碎至1020目的淫羊藿干原料混合， 检测 淫羊藿苷含量为 0.55%， 搅拌均匀， 淫羊藿干原料与培养液的重。

31、量比为 1:1.5， 然后置于 1.5 立方米的发酵罐密闭静态厌氧发酵 ； 罐内温度保持 35， 发酵时间 72 小时 ； 0062 S3、 检测， 淫羊藿苷残留量11PPm。 将发酵原料转入提取器用提取溶剂提取， 提取液 浓缩， 得含宝藿苷的浸膏 ； 淫羊藿苷残留量按 中华人民共和国药典 2010年版规定方法 检测。 0063 所述的提取溶剂为乙酸乙酯、 甲酸乙酯、 乙酸甲酯或比乙酸乙酯含碳量更高的酯 ； 也可为乙醇、 甲醇、 异丙醇或丙醇， 也可为丙酮， 也可为乙醚。本实施例中采用的提取溶剂 说 明 书 CN 103305572 A 7 6/10 页 8 为乙酸乙酯。提取， 浓缩的具体过程。

32、为 ： 将发酵原料转入提取罐， 加乙酸乙酯至没过原料面 10 30 厘米， 冷浸 4 小时或 50以下温浸 2 小时， 放出溶剂， 送去蒸馏 ； 提取罐内再补充溶 剂至原液位， 冷浸4小时或50以下温浸1.52小时， 放出溶剂， 该溶剂不再浓缩， 而是送 入另一只提取罐作第一次提取原料的试剂使用， 以节省能源， 并减少试剂和敏感成分损失 ； 同样， 第三、 四次提取液分别做另一只罐第二、 三次提取试剂。第四次提后残渣中有效成分 如已按要求提净， 就可加热蒸馏回收残留溶剂至净。放出残渣， 再加新提取原料， 如上重复 操作， 继续提取。 残渣因发酵菌蛋白含量高， 为优质饲料 ； 提取液浓缩至无乙酸。

33、乙酯， 得到浸 膏。 0064 S4、 浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮， 再用乙酸乙酯萃取得 到较纯的宝藿苷 部分 ； 并且， 浸膏先用石油醚洗涤除去油脂、 蜡质、 叶绿素， 再用二氯甲 烷萃取得到较干净的淫羊藿黄酮。 0065 洗涤方法是将浸膏投入加有23倍量的6090沸程的石油醚的萃取罐中， 开 动搅拌器搅拌， 搅拌器转速控制在60120转/分， 至浸膏完全分散在石油醚中即止。 静置 让分层， 放出上层石油醚层 ； 再加放出量的石油醚， 同上操作， 至石油醚色浅为止。 在放净石 油醚后的罐中加入 2 3 倍体积比的二氯甲烷， 开动搅拌器搅拌， 搅拌器转速控制在 60 120。

34、 转 / 分， 至浸膏完全分散在二氯甲烷中为止。静置使分层， 放出下层二氯甲烷 ； 再加放 出量的二氯甲烷， 同上操作， 至二氯甲烷无色为止。 0066 二氯甲烷萃取出黄酮完成后， 在放干净二氯甲烷的罐中 （内留有浸膏） 再加入 2 3 倍体积的乙酸乙酯， 开动搅拌器搅拌， 搅拌器转速控制在 60 120 转 / 分， 至浸膏完全分 散在乙酸乙酯中即止 ； 静置使分层， 放出上层的乙酸乙酯 ； 再加放出量的乙酸乙酯， 同上操 作。如无乳化， 可延长每次搅拌时间 3 5 分钟。萃取至乙酸乙酯无色， 且检测宝藿苷 低于规定值为止。 0067 S5、 将乙酸乙酯萃取液经氧化铝短柱过滤除去残存的鞣质等。

35、杂质， 滤液 50减压 浓缩成干浸膏 ； 按200300目工业层析硅胶 ： 干浸膏重量比为40 ： 1的比例上柱， 用含乙醇 依次为 4%、 6%、 8% 的二氯甲烷洗脱， 流出液薄层监测， 将含宝藿苷 单一成分的流份合并， 50以下浓缩成膏， 抽松， 乙醇溶解， 过滤， 滤液加蒸馏水， 析出晶体， 滤取晶体， 45以下真 空干燥至恒重， 得到宝藿苷 纯品 0.8706 千克， 产品含量 99.44%， 收率 83.20%。 0068 如图 1 所示， 为该产品的 HPLC 分析图谱， 其检测结果如下表所示 ： 0069 峰 #保留时间面积面积 % 12.14443660.03 23.5558。

36、820.01 33.89117200.01 44.62479280.05 55.59413240.01 说 明 书 CN 103305572 A 8 7/10 页 9 0070 66.25811850.01 76.9414260.00 87.67115560.01 98.20521110.01 109.63969080.04 1110.103357620.21 1210.48611220.01 1311.3908710.01 1412.2141710010699.44 1512.73918140.01 1614.07514590.01 1714.42521910.01 1814.5711694。

37、0.01 1915.46728150.02 2015.87210260.01 2116.35822140.01 2217.01474390.04 2317.42638510.02 2417.85729980.02 2518.21311650.01 2619.34218640.01 0071 实施例 2 ： 0072 淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法， 它包括以下步骤 ： 0073 S1、 取 300g 高活性干酵母在培养基中扩繁 8 小时， 扩繁培养条件为 pH6 7、 温 度 35， 静态发酵， 然后按扩繁液体积加 2.5 倍量的水稀释得到培养液 ； 所述的培养基用淀 说 明 书 CN 10。

38、3305572 A 9 8/10 页 10 粉加水配成， 淀粉的用量为酵母菌重量的 666.7 倍 （200kg） ， 淀粉中加入的水与淀粉重量比 为 5:1， 所述的淀粉为小麦粉 ； 高活性干酵母为中华人民共和国行业标准 QR/ T1501-92 规定的 “高活性干酵母” ， 优级或一级品 ； 发酵力 750ml（CO2)。 0074 S2、 将步骤 S1 得到的培养液与 2.4 吨粉碎至 10 20 目的淫羊藿干原料混合， 搅 拌均匀， 淫羊藿干原料与培养液的重量比为 1:1.2， 然后置于 15 立方米的发酵罐密闭静态 厌氧发酵 ； 罐内温度保持 40， 发酵时间 65 小时 ； 007。

39、5 S3、 检测， 当淫羊藿苷残留量降至 6PPm 时， 将发酵原料转入提取器用提取溶剂提 取， 提取液浓缩， 得含宝藿苷 的浸膏 ； 淫羊藿苷残留量按 中华人民共和国药典 2010 年 版规定方法检测。 0076 所述的提取溶剂为乙酸乙酯、 甲酸乙酯、 乙酸甲酯或比乙酸乙酯含碳量更高的酯， 也可为乙醇、 甲醇、 异丙醇或丙醇， 也可为丙酮， 也可为乙醚。 本实施例中采用的提取溶剂为 乙酸乙酯。提取， 浓缩的具体过程为 ： 将发酵原料转入提取罐， 加乙酸乙酯至没过原料面 30 厘米， 冷浸 4 小时或 50以下温浸 2 小时， 放出溶剂， 送去蒸馏 ； 提取罐内再补充溶剂至原 液位， 冷浸4小。

40、时或50以下温浸1.52小时， 放出溶剂， 该溶剂不再浓缩， 而是送入另一 只提取罐作第一次提取原料的试剂使用， 以节省能源， 并减少试剂和敏感成分损失 ； 同样， 第三、 四次提取液分别做另一只罐第二、 三次提取试剂。 第四次提后残渣中有效成分如已按 要求提净， 就可加热蒸馏回收残留溶剂至净。 放出残渣， 再加新提取原料， 如上重复操作， 继 续提取。残渣因发酵菌蛋白含量高， 为优质饲料 ； 提取液浓缩至无乙酸乙酯， 得到浸膏。 0077 S4、 浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮， 再用乙酸乙酯萃取得 到较纯的宝藿苷 部分 ； 并且， 浸膏先用石油醚洗涤除去油脂、 蜡质、 叶绿。

41、素， 再用二氯甲 烷萃取得到较干净的淫羊藿黄酮。 0078 洗涤方法是将浸膏投入加有23倍量的6090沸程的石油醚的萃取罐中， 开 动搅拌器搅拌， 搅拌器转速控制在60120转/分， 至浸膏完全分散在石油醚中即止。 静置 让分层， 放出上层石油醚层 ； 再加放出量的石油醚， 同上操作， 至石油醚色浅为止。 在放净石 油醚后的罐中加入 2 3 倍体积比的二氯甲烷， 开动搅拌器搅拌， 搅拌器转速控制在 60 120 转 / 分， 至浸膏完全分散在二氯甲烷中为止。静置使分层， 放出下层二氯甲烷 ； 再加放 出量的二氯甲烷， 同上操作， 至二氯甲烷无色为止。 0079 二氯甲烷萃取出黄酮完成后， 在放。

42、干净二氯甲烷的罐中 （内留有浸膏） 再加入 2 3 倍体积的乙酸乙酯， 开动搅拌器搅拌， 搅拌器转速控制在 60 120 转 / 分， 至浸膏完全分 散在乙酸乙酯中即止 ； 静置使分层， 放出上层的乙酸乙酯 ； 再加放出量的乙酸乙酯， 同上操 作。如无乳化， 可延长每次搅拌时间 3 5 分钟。萃取至乙酸乙酯无色， 且检测宝藿苷 低于规定值为止。 0080 S5、 将乙酸乙酯萃取液经氧化铝短柱过滤除去残存的鞣质等杂质， 滤液 50减压 浓缩成干浸膏 ； 按200300目工业层析硅胶 ： 干浸膏重量比为40 ： 1的比例上柱， 用含乙醇 依次为 4%、 6%、 8% 的二氯甲烷洗脱， 流出液薄层监。

43、测， 将含宝藿苷 单一成分的流份合并， 50以下浓缩成膏， 抽松， 乙醇溶解， 过滤， 滤液加蒸馏水， 析出晶体， 滤取晶体， 45以下真 空干燥至恒重， 得到宝藿苷 纯品 8.612 千克， 产品含量 99.18%， 收率 82.26%。 0081 同法连续生产第二批原料 2.4 吨， 淫羊藿苷残留量为 8PPm， 得产品 8.629 千克， 第三批原料 2.4 吨， 淫羊藿苷残留量为 3.6PPm， 得产品 8.6880 千克， 含量 99.23%， 收率 说 明 书 CN 103305572 A 10 9/10 页 11 83.22%。 0082 经批量生产证明， 本生产工艺适宜工业性生。

44、产。具有设备普通， 生产操作控制性 强， 以及产品收率较高、 质量优、 生产成本低等优点。 0083 实施例 3 ： 0084 淫羊藿发酵生产宝藿苷 I 的方法， 它包括以下步骤 ： 0085 S1、 取 40g 高活性干酵母在培养基中扩繁 12 小时， 扩繁培养条件为 pH6 7、 温度 15， 静态发酵， 然后按扩繁液体积加 2 倍量的水稀释得到培养液 ； 所述的培养基用淀粉加 水配成， 淀粉的用量为酵母菌重量的 800 倍， 淀粉中加入的水与淀粉重量比为 4:1， 所述的 淀粉为小麦粉 ； 高活性干酵母为中华人民共和国行业标准QR/T1501-92规定的 “高活性干酵母” ， 优级或一级。

45、品 ； 发酵力 750ml（CO2)。 0086 S2、 将步骤 S1 得到的培养液与 1000kg 粉碎至 10 20 目的淫羊藿鲜品混合， 搅拌 均匀， 淫羊藿鲜品与培养液的重量比为 1:0.2， 然后置于 2.5 立方米的发酵罐密闭静态厌氧 发酵 ； 罐内温度保持 45， 发酵时间 48 小时 ； 0087 S3、 检测， 当淫羊藿苷残留量降至发酵物料液重量的十万分之一以下时， 将发酵原 料转入提取器用提取溶剂提取， 提取液浓缩， 得含宝藿苷 的浸膏 ； 淫羊藿苷残留量按 中 华人民共和国药典 2010 年版规定方法检测。 0088 所述的提取溶剂为乙酸乙酯、 甲酸乙酯、 乙酸甲酯或比乙。

46、酸乙酯含碳量更高的酯， 也可为乙醇、 甲醇、 异丙醇或丙醇， 也可为丙酮， 也可为乙醚。本实施例中采用的提取溶剂 为乙酸乙酯。提取， 浓缩的具体过程为 ： 将发酵原料转入提取罐， 加乙酸乙酯至没过原料面 10 30 厘米， 冷浸 4 小时或 50以下温浸 2 小时， 放出溶剂， 送去蒸馏 ； 提取罐内再补充溶 剂至原液位， 冷浸4小时或50以下温浸1.52小时， 放出溶剂， 该溶剂不再浓缩， 而是送 入另一只提取罐作第一次提取原料的试剂使用， 以节省能源， 并减少试剂和敏感成分损失 ； 同样， 第三、 四次提取液分别做另一只罐第二、 三次提取试剂。第四次提后残渣中有效成分 如已按要求提净， 就。

47、可加热蒸馏回收残留溶剂至净。放出残渣， 再加新提取原料， 如上重复 操作， 继续提取。 残渣因发酵菌蛋白含量高， 为优质饲料 ； 提取液浓缩至无乙酸乙酯， 得到浸 膏。 0089 S4、 浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮， 再用乙酸乙酯萃取得 到较纯的宝藿苷 部分 ； 并且， 浸膏先用石油醚洗涤除去油脂、 蜡质、 叶绿素， 再用二氯甲 烷萃取得到较干净的淫羊藿黄酮。 0090 洗涤方法是将浸膏投入加有23倍量的6090沸程的石油醚的萃取罐中， 开 动搅拌器搅拌， 搅拌器转速控制在60120转/分， 至浸膏完全分散在石油醚中即止。 静置 让分层， 放出上层石油醚层 ； 再加放出量的。

48、石油醚， 同上操作， 至石油醚色浅为止。 在放净石 油醚后的罐中加入 2 3 倍体积比的二氯甲烷， 开动搅拌器搅拌， 搅拌器转速控制在 60 120 转 / 分， 至浸膏完全分散在二氯甲烷中为止。静置使分层， 放出下层二氯甲烷 ； 再加放 出量的二氯甲烷， 同上操作， 至二氯甲烷无色为止。 0091 二氯甲烷萃取出黄酮完成后， 在放干净二氯甲烷的罐中 （内留有浸膏） 再加入 2 3 倍体积的乙酸乙酯， 开动搅拌器搅拌， 搅拌器转速控制在 60 120 转 / 分， 至浸膏完全分 散在乙酸乙酯中即止 ； 静置使分层， 放出上层的乙酸乙酯 ； 再加放出量的乙酸乙酯， 同上操 作。如无乳化， 可延长每次搅拌时间 3 5 分钟。萃取至乙酸乙酯无色， 且检测宝藿苷 说 明 书 CN 103305572 A 11 10/10 页 12 低于规定值为止。 0092 S5、 将乙酸乙酯萃取液经氧化铝短柱过滤除去残存的鞣质等杂质， 滤液 50减压 浓缩成干浸膏。