《防治番茄根结线虫病的生防菌株JDM2及其生防菌剂.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《防治番茄根结线虫病的生防菌株JDM2及其生防菌剂.pdf（7页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103305438 A (43)申请公布日 2013.09.18 CN 103305438 A *CN103305438A* (21)申请号 201310184780.5 (22)申请日 2013.05.20 CGMCC NO.7074 2012.12.31 C12N 1/20(2006.01) A01N 63/00(2006.01) A01P 5/00(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市钟灵街 50 号 (72)发明人 魏利辉 邵颖 万景旺 朱华 肖雷 (54) 发明名称 防治番。
2、茄根结线虫病的生防菌株 Jdm2 及其 生防菌剂 (57) 摘要 本发明涉及一种防治温室蔬菜根结线虫病 的生防菌株 Jdm2， 属于植物保护技术领域。该菌 是枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)， 将该菌 在 PD 培养液 30、 150rpm 振荡培养 20 24h， 然后 6000rpm 离心 10min， 取湿菌与菌体保藏液 按 1 40(g/mL) 配成菌剂， 成品中活菌总浓度为 3109 10 12CFU/mL。Jdm2 菌剂对番茄根结线虫 病防效为 48 69， 增产可达 31以上， 同时该 菌剂能够明显的促进温室蔬菜如番茄的生长， 提 高产量。该菌剂在移栽时通过灌。
3、根使用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103305438 A CN 103305438 A *CN103305438A* 1/1 页 2 1. 一 种 温 室 蔬 菜 根 结 线 虫 病 的 生 防 菌 株 Jdm2， 为 枯 草 芽 孢 杆 菌 (Bacillus subtilis)， 2012 年 12 月 31 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微。
4、生物研究所， 菌种保藏号为 CGMCC NO.7074。 2. 用权利要求 1 所述的生防菌株 Jdm2 制备的防治根结线虫病的生防菌剂。 3. 制备权利要求 2 所述生防菌剂的方法， 其特征在于 ： 1) 将权利要求 1 所述的菌株接种到 PD 培养液中 30、 150rpm 培养 16 20h 后在超净 工作台中分别取样测 OD600值， 测定过程中以未接菌的培养液来调零 ； 2)当培养至OD600值在0.50.8之间时， 将种子菌液以1100体积比加入PD培养液 中， 30、 150rpm 振荡培养 20 24h， 然后 6000rpm 离心 10min， 每 1000mL 培养液获得 。
5、13 16g 湿菌， 每 g 湿菌含 41010 1015个菌体 ； 3) 取湿菌与菌体保藏液按 1g 40mL 配成菌剂， 成品中活菌总浓度为 3109 31012CFU/mL。 4. 根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于， 所用 PD 培养液配制方法为 ： 用 200g 土豆削皮后切成小块放到水里煮， 沸腾后至少煮 20min 以上， 接着用四层医 用纱布过滤， 滤液加 20g 普通蔗糖， 定容至 1000mL， pH 值调至 7.2 7.4， 然后 121灭菌 20min ； 菌体保藏液为0.01mol/L磷酸盐缓冲液， 还含有浓度为0.001mol/L的Tween20非离 子型表。
6、面活性剂。 5. 权利要求 2 4 所述生防菌剂 Jdm2 产品在防治番茄根结线虫方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 103305438 A 2 1/5 页 3 防治番茄根结线虫病的生防菌株 Jdm2 及其生防菌剂 一、 技术领域 0001 本发明涉及一种防治温室蔬菜根结线虫病的生防菌株 Jdm2 及其生防菌剂， 属于 农作物防病治病技术领域， 专用于温室蔬菜根结线虫病的无公害防治。 0002 二、 背景技术背景 0003 根结线虫(Meloidogyne spp.)属植物根系专性内寄生物， 是世界性分布的威胁农 业生产的主要病原物， 也是世界各国对外检疫对象。它不仅使作物产量减少， 品质。
7、降低， 而 且可与其他病原物一起造成复合侵染。迄今已记载的根结线虫有约 70 种， 其中南方根结 线虫 (M.incognita)、 爪哇根结线虫 (M.javanica)、 和花生根结线虫 (M arenaria) 因其广 分布性和多寄生性， 是最重要的植物寄生线虫种类。在中国， 这三种根结线虫在大多数省 ( 区 ) 均有发生， 侵染农作物达百种以上， 大田作物、 蔬菜、 果树、 花卉、 药用植物等几乎每种 作物均可受到侵染。 蔬菜根结线虫病(为害对象 ： 黄瓜、 冬瓜、 西瓜、 丝瓜、 番茄、 辣椒、 茄子、 马铃薯、 莴苣、 菠菜、 胡萝卜、 白菜、 豆科蔬菜等几乎所有蔬菜 ) 是国内外。
8、最为严重的植物病 害之一。由植物寄生线虫侵袭寄生引起的植物病害， 受害植物可因侵入线虫吸收体内营养 而影响正常的生长发育 ； 线虫代谢过程中的分泌物还会刺激寄主植物的细胞和组织， 导致 植株畸形， 使农产品减产和质量下降 ； 此外， 还可以通过线虫危害， 加剧其它病害的发生， 尤 其是保护地蔬菜， 致使寄主常年减产 15 5， 有时达 70以上， 严重地制约了大棚蔬菜、 果树、 花卉等作物的生产和出口创汇， 有的甚至到了无法种植的地步。据估计， 我国农作物 的生产每年因根结线虫的为害而遭受的经济损失达亿元以上。 0004 由于根结线虫病害属于土传病害， 所以防治较为困难。 目前， 人们主要采取。
9、有机磷 类化学杀线虫剂、 选种抗病作物品种、 实施轮作、 建立无病种苗基地和对进出口农作物进行 严格的检疫来控制根结线虫病害的发生。化学杀线虫剂虽防效显著， 但其选择性差， 破坏 农作物的生态环境 ； 不易降解， 高残留， 对人畜极不安全 ； 破坏土壤结构， 造成土壤沙化 ； 抗 药性问题日益突出。这些因素使得化学杀虫剂的使用范围已受到严格的限制。因此， 非化 学性防治措施目前已成为农作物根结线虫病治理的核心， 而生物防治则为其中最有前途的 方法。 三、 发明内容 0005 1. 技术问题 0006 本发明的目的是针对现有技术中的对根结线虫病害有较高防效的生防制剂主要 集中在一些真菌制剂、 使。
10、用成本过高的缺陷， 提供开发一种防治蔬菜根结线虫病害的单一 生防菌菌株及其菌剂， 该菌剂的防效可达 50以上， 并且有增产功能。 0007 2. 技术方案 0008 一种防治温室蔬菜根结线虫病的生防菌株 Jdm2， 为枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)， 2012 年 12 月 31 日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 菌 种保藏号为 CGMCC N0.7074。 0009 生防菌株 Jdm2 用于制备生防菌剂的方法为 ： 说 明 书 CN 103305438 A 3 2/5 页 4 0010 1)将该菌株接种到PD培养液中分别培养37、 150rpm， 1。
11、620h后在超净工作台 中分别取样测 OD600值， 测定过程中以未接菌的培养液来调零 ； 0011 2) 当培养至 OD600值在 0.5 0.8 之间时， 将种子菌液以 1 100 体积比加入 PD 培养液中， 37、 150rpm振荡培养2024小时， 然后6000rpm离心10min， 每1000mL培养液 获得 13 16g 湿菌， 每克湿菌含 41010 1015个菌体， 取湿菌与菌体保藏液按 1g 40mL 配成菌剂， 成品中活菌总浓度为 1109 1012CFU/mL。 0012 3) 所用 PD 培养液配制方法为 ： 0013 用 200g 土豆削皮后切成小块放到水里煮， 沸。
12、腾后至少煮 20min 以上， 接着用四层 医用纱布过滤， 滤液加 20g 普通蔗糖， 定容至 1000mL， pH 值调至 7.2 7.4， 然后 121灭菌 20min。 0014 3. 有益效果 0015 本发明的优点和积极效果表现在 ： 本发明是专门针对温室蔬菜根结线虫病开发 的生防制剂。 由于是生物制剂， 完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题， 因而有利 于蔬菜的无公害生产， 农民可以不用或减少其他防治蔬菜根结线虫病化学农药的用量， 这 不仅可为农民节省开支， 而且有利于蔬菜的出口。同时， 该菌剂还有增产功能， 可为农民增 加收入。 0016 离体试验表明， 按 Jdm2 生防。
13、菌剂 1109CFU/mL， 该浓度对根结线虫二龄幼虫活性 和对卵的孵化都有很好的抑制作用 ( 表 1)。温室实验表明 ： 该菌制剂能显著降低根结线虫 的侵入， 并兼有促进进茄生长的作用。 温室大棚实验表明 ： 使用该菌剂对蔬菜根结线虫病害 的防治效果可达 48 69以上， 增产可达 31以上。 0017 该菌剂可以在栽苗时灌根使用。 四、 具体实施方式 0018 本发明涉及一种防治温室蔬菜根结线虫病生防菌株 Jdm2， 为芽孢杆菌 (Bacillus.spp)， 2012 年 12 月 31 日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心， 菌种保藏号为 CGMCC N0.7074。 。
14、0019 生防菌株 Jdm2 用于制备生防菌剂的方法为常规细菌培养法 ： 0020 1)将该菌株接种到PD培养液中分别培养37、 150rpm， 1620h后在超净工作台 中分别取样测 OD600值， 测定过程中以未接菌的培养液来调零 ； 0021 2) 当培养至 OD600值在 0.5 0.8 之间时， 将种子菌液以 1 100 体积比加入 PD 培养液中， 37、 150rpm 振荡培养 20 24h， 然后 6000rpm 离心 10min， 每 1000mL 培养液获 得 13 16g 湿菌， 每 g 湿菌含 41010 1015个菌体， 取湿菌与菌体保藏液按 1g 40mL 配 成 。
15、Jdm2 生防菌剂， 成品中活菌总浓度为 1109 1012CFU/mL。 0022 3) 所用 PD 培养液配制方法为 ： 0023 用 200g 土豆削皮后切成小块放到水里煮， 沸腾后至少煮 20min 以上， 接着用四层 医用纱布过滤， 滤液加 20g 普通蔗糖， 定容至 1000mL， pH 值调至 7.2 7.4， 然后 121灭菌 0024 ( 一 )、 室内离体测定 0025 1. 根结线虫二龄幼虫悬浮液的制备 说 明 书 CN 103305438 A 4 3/5 页 5 0026 从番茄根部挑取新鲜卵块， 置于自制孵化装置中进行孵化， 24h 后开始收集幼虫， 每天收集一次， 。
16、共收集一周。线虫液稀释为 100 条 J2/mL， 4保存待用。 0027 2.Jdm2 生防菌剂对南方根结线虫二龄幼虫的作用 0028 平均室温在 25时， 将菌悬液吸取 2mL， 加入直径为 7.5cm 的灭菌培养皿中， 再加 入 2mL 二龄幼虫的悬浮液， 以清水作对照， 各处理重复 3 次。分别在 12h、 24h、 36h、 48h 和 60h 后观察线虫的活力。 0029 3.Jdm2 生防菌剂对南方根结线虫卵块孵化的作用 0030 平均室温在 25时， 吸取菌悬液 2mL， 加入直径为 7.5cm 的灭菌培养皿中， 再加入 10 粒卵块， 以清水作对照， 各处理重复 3 次。分别。
17、在 24h、 48h 和 60h 后观察幼虫的孵化情 况。 0031 ( 二 )、 温室盆钵试验 0032 1. 番茄幼苗培育 0033 番茄种子进行表面消毒处理 ： 用 75的酒精处理 15s 后无菌水水洗三次， 5的次 氯酸钠溶液处理 15min 后无菌水水洗三次。表面消毒的种子播种于灭菌土中培育待用。 0034 2. 灭菌土制备 0035 将森林土、 细砂、 有机质按221体积混匀后， 高压灭菌锅内121灭菌20min。 灭菌后分装到直径 25cm 的盆钵中待用。 0036 3. 灌根 0037 接种供试菌株菌悬浮液 (109CFU/mL)40mL， 2 天后每钵接种南方根结线虫 100。
18、 条 J2/ml 二龄幼虫悬浮液 10mL。 0038 4. 培养 0039 接种后的盆钵随机排列于温室的平台上。25 28培养 8 周后缓慢取出接种植 株。用水轻洗根系， 分别测量根长、 茎长、 根和茎鲜重和干重， 并记录根结指数。 0040 ( 三 )、 温室大棚试验 0041 田间试验共设三个处理 ： A、 生防菌剂 Jdm2 ； B、 阿维菌素 (Avermectin) ； C、 空白对 照。每个小区 27m2， 小区间设三行隔离区， 各处理按完全随机区组排列， 重复 4 次， 全试验共 16 个小区。试验前先将试验地整平耙匀， 按上述设计方案分好小区， 开好隔离沟和种植穴。 在移栽时。
19、施用生防菌剂Jdm2， 将生防菌剂稀释1000倍， 按照每株苗1000mL量于移栽时灌根 处理 ； 1.8阿维菌素乳油移栽时每亩用 500mL， 按 1 1000 的比例稀释， 泼浇灌根。 0042 分别于移栽后30天、 60天、 90天及拔苗时调查根结线虫的危害程度及番茄生长情 况 ( 记录株高、 径粗 )， 计算防效， 以及番茄产量的增产率。 0043 病情指数 ( ) ( 各级植物株数 级值 )/( 调查总株数 最高级值 )100 0044 ( 四 )、 实验结果 0045 离体实验表明 ( 表 1)， 按 Jdm2 生防菌剂 1109CFU/mL， 该浓度对根结线虫 M.incogni。
20、ta 二龄幼虫 (J2) 活性和对卵的孵化都有很好的抑制作用， 24h 后对根结线虫二 龄幼虫活性抑制作用即可达到 64.42， 60h 后抑制率达到 76.83 ； 对根结线虫卵的孵化 也有明显的抑制作用。 0046 表 1 Jdm2 生防菌对根结线虫二龄幼虫活力及卵孵化的的影响 0047 说 明 书 CN 103305438 A 5 4/5 页 6 0048 温室盆钵试验 ( 表 2) 结果表明， Jdm2 生防菌剂能显著降低根结线虫的侵入， 对番 茄南方根结线虫病害的防效达 51.43， 并兼有明显促进番茄生长的作用。 0049 表 2 Jdm2 生防菌防治盆栽番茄根结线虫病盆栽试验 0050 0051 温室大棚试验 ( 表 3) ： 施用 JDM2 生防菌剂处理 30 天、 60 天和 90 天后， 生防菌剂 JDM2 对番茄根结线虫病的具有较好的防效， 单用生防菌剂要好于阿维菌素。混合使用生防 菌剂和阿维菌素效果并不是很好。另外， 使用生防菌剂不可促进番茄增产 ( 表 4)。 0052 表 3 Jdm2 生防菌防治盆栽番茄根结线虫病田间试验防效 0053 0054 表 4 Jdm2 生防菌防治盆栽番茄根结线虫病田间试验产量 0055 说 明 书 CN 103305438 A 6 5/5 页 7 说 明 书 CN 103305438 A 7 。