检验CYP3A4内含子SNP具有增强子和启动子功能的报告基因方法.pdf

本发明涉及一种针对人的CYP3A4内含子序列和验证该序列SNP同时具有增强子和启动子增强表达功能的检验CYP3A4内含子SNP具有增强子和启动子功能的报告基因方法，包括从人CYP3A4基因组中选择内含子序列、CYP3A4启动子序列荧光素酶报告基因质粒的构建、CYP3A4内含子SNP增强子荧光素酶报告基因载体的构建、CYP3A4内含子SNP启动子荧光素酶报告基因载体的构建、HepG2细胞培养和转染、双荧光素酶活性测定，应用本发明发现人CYP3A4内含子SNP同时具有增强子和启动子的功能，应用本发明可以筛选提高CYP3A4酶的产量的SNP，对进一步体外研究或筛选CYP3A4酶代谢的药物将具有重要的应用价值。

权利要求书
1.  一种检验CYP3A4内含子SNP具有增强子和启动子功能的报告基因方法，需要在人的CYP3A4基因组中选择内含子SNP，其中所述的内含子SNP具有至少如下特征：
（I）位于编码CYP3A4酶的CYP3A4基因的两个外显子之间的内含子，并且
（II）内含子包含典型的GT……AG剪接结构，即5′端有GT剪接位点，3端有AG剪接位点，并且
（III）在内含子3′末端剪接点的上游20～50核苷酸范围内，还有一个在剪接中有重要作用的位点，其序列中含有A，称为分支部位，并且
（IV）体内实验已证实该内含子中的SNP影响CYP3A4酶活性，并且
（V）内含子中该SNP变异不影响剪接，即不影响II）中的剪接位点及III）中的分支部位，并且
（VI）内含子中该SNP变异不编码micro RNA。

2.  根据权利要求1所述的检验CYP3A4内含子SNP具有增强子和启动子功能的报告基因方法，其特征在于：还包括CYP3A4启动子序列荧光素酶报告基因质粒的构建、CYP3A4内含子SNP增强子荧光素酶报告基因载体的构建、CYP3A4内含子SNP启动子荧光素酶报告基因载体的构建、HepG2细胞培养和转染、双荧光素酶活性测定；具体步骤如下：
步骤1： CYP3A4启动子序列荧光素酶报告基因质粒的构建，过程是：

1.  1、DNA提取和基因型分析
取健康志愿者外周静脉血，EDTA抗凝，并用标准酚-氯仿法提取健康志愿者的全基因组DNA，置于冰箱备用；采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析对CYP3A4内含子SNP多态性位点进行基因型分析；通过PCR扩增产物直接测序验证基因型检测方法的可靠性，

1.  2、CYP3A4启动子PCR扩增，

1.  3、PCR产物胶回收，

1.  4、双酶切胶回收PCR产物及pGL3-Basic Vector载体后，用琼脂糖凝胶
电泳并分别胶回收目的DNA片段及载体，

1.  5、连接酶切后CYP3A4启动子及pGL3载体，并用连接产物转化DH5α大
肠杆菌，挑取单克隆小提质粒，酶切和测序，获得pGL3-P重组质粒，

1.  6、pGL3-P重组质粒进一步培养扩增；
步骤2：CYP3A4内含子SNP增强子荧光素酶报告基因载体的构建，过程是：

2.  1、CYP3A4 内含子SNP的DNA片段PCR扩增，包括插入荧光素酶报告基因luc上、下游CYP3A4内含子SNP目的DNA片段，

2.  2、PCR产物胶回收，

2.  3、双酶切胶回收PCR产物及pGL3-P重组质粒载体后，用琼脂糖凝胶电泳并分别胶回收CYP3A4内含子SNP及载体，

2.  4、连接酶切后CYP3A4内含子SNP片段及pGL3-P载体，并用连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑单克隆、小提质粒、酶切和测序，获得获得正向插入重组质粒和反向插入重组质粒，

2.  5、正向插入重组质粒及反向插入重组质粒重组质粒进一步培养扩增；
步骤3：CYP3A4内含子SNP启动子荧光素酶报告基因载体的构建，过程是：

3.  1、CYP3A4内含子SNP的DNA片段PCR扩增，包括插入荧光素酶报告基因luc上游正、反向CYP3A4内含子SNP目的DNA片段，

3.  2、PCR产物胶回收，

3.  3、双酶切胶回收PCR产物及pGL3载体后，用琼脂糖凝胶电泳并分别胶回收CYP3A4内含子SNP及载体，

3.  4、连接酶切后CYP3A4内含子SNP片段及pGL3载体，并用连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑单克隆、小提质粒、酶切和测序，获得重组质粒，

3.  5、将重组质粒进一步培养扩增；
步骤4：HepG2细胞培养和转染，过程是：

4.  1、HepG2细胞培养，
用含10%小牛血清、含双抗100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下传代培养，

4.  2、转染前一天，细胞接种于24孔板，当细胞融合度约90%时，进行转染：将pGL3和上述重组质粒及内参照质粒pRL-TK，目的质粒与内参质粒以20：1共转染，按照LipofectamineTM2000说明书瞬时转染HepG2细胞；转染前，用适量不含抗生素的无血清培养液分别稀释质粒和LipofectamineTM2000脂质体后，将二者混合，室温放置20 min，加入培养板孔中，摇板轻混匀后放入37℃细胞培养箱中培养；转染后5 h换液，换成含血清培养基，继续培养；孵育收集转染后48 h的细胞进行荧光素酶活性测定；
步骤5：双荧光素酶活性测定，过程是：

5.  1、细胞收获：除去转染培养后培养液中细胞培养基，１×PBS冲洗细胞，加入 1×PLB细胞裂解液100 μl，室温轻缓晃动培养板15 min后，再吹打细胞，收集细胞裂解液，立即测定或－80℃保存，

5.  2、双荧光素酶活性测定：细胞裂解后用双荧光报告基因试剂盒在发光检测仪上检测荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶的活性与内参照质粒pRL-TK中的海肾荧光素酶的活性比值作为被检测的质粒在转染细胞后所测得的荧光素酶的相对活性。

说明书检验CYP3A4内含子SNP具有增强子和启动子功能的报告基因方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种针对人的CYP3A4内含子序列和验证该序列SNP同时具有增强子和启动子增强表达功能的检验CYP3A4内含子SNP具有增强子和启动子功能的报告基因方法。
发明背景
    CYP3A4酶是成人体内最重要的药物代谢酶，代谢的药物占临床上所用药物的一半左右。该酶的活性影响药物的疗效，与药物的不良反应有关，并且存在明显的个体差异。研究表明CYP3A4酶在肝内的表达存在约40倍的个体差异，且这种差异约90%是由于人CYP3A4基因遗传变异引起，如果能找出导致个体差异的遗传标志物，不但可以指导安全有效的用药，而且具有极大的经济学价值。单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP是CYP3A4基因遗传变异中最常见的形式，其中已知CYP3A4 SNP功能位点（多数外显子SNP）极低的等位基因频率使其对酶活性个体差异的影响范围较有限，且在中国人群中的变异频率绝大多数低于5%，因此CYP3A4酶活性的大部分个体差异还不能通过现有遗传有关的研究证实。
近年来，内含子的研究成为科研工作者观注的焦点， 越来越多的研究发现内含子可影响基因的表达、调控，如影响剪接及编码MicroRNA、通过调节转录延伸或RNA加工/折叠影响RNA水平，内含子也可作为增强子及启动子等。启动子是与RNA聚合酶特异性识别和结合功能有关的一段DNA序列，它是基因的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。增强子是增强基因启动子工作效率的顺式作用的一段DNA序列，能够在相对于启动子的任何方向和任何位置(上游或下游)上都发挥作用。在细胞色素P450氧化酶(CYP)基因中，内含子SNP影响剪接（如CYP3A5*3）及内含子SNP影响RNA表达、加工或折叠的方法已有报道，且通过软件分析，在MicroRNA数据库中可比对发现与靶基因序列匹配的MicroRNA。到目前为止，体外研究尚无理想的高表达CYP3A4酶的哺乳动物细胞株，现在常用的肝癌细胞株HepG2细胞产量极低，寻求可增强CYP3A4基因表达、提高CYP3A4酶产量的内含子增强子或具有强转录活性的内含子启动子，对体外研究或筛选CYP3A4酶代谢的药物将具有重要的应用价值，而体外实验检验CYP3A4内含子SNP同时具有增强子和启动子功能的方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足而提供一种针对人CYP3A4内含子序列和验证该序列SNP具有增强表达功能的，并可为其它真核基因内含子SNP同时具有增强子和启动子功能鉴定提供参考的检验CYP3A4内含子SNP具有增强子和启动子功能的报告基因方法。
本发明的目的是这样实现的：
一种检验CYP3A4内含子SNP具有增强子和启动子功能的报告基因方法，首先需要在人的CYP3A4基因组中选择内含子SNP，其中所述的内含子SNP具有至少如下特征：
（I）位于编码CYP3A4酶的CYP3A4基因的两个外显子之间的内含子，并且
（II）内含子包含典型的GT……AG剪接结构，即5′端有GT剪接位点，3端有AG剪接位点，并且
（III）在内含子3′末端剪接点的上游20～50核苷酸范围内，还有一个在剪接中有重要作用的位点，其序列中含有A，称为分支部位，并且
（IV）体内实验已证实该内含子中的SNP影响CYP3A4酶活性，并且
（V）内含子中该SNP变异不影响剪接，即不影响II）中的剪接位点及III）中的分支部位，并且
（VI）内含子中该SNP变异不编码micro RNA。 
还包括CYP3A4启动子序列荧光素酶报告基因质粒的构建、CYP3A4内含子SNP增强子荧光素酶报告基因载体的构建、CYP3A4内含子SNP启动子荧光素酶报告基因载体的构建、HepG2细胞培养和转染、双荧光素酶活性测定；具体步骤如下：
步骤1： CYP3A4启动子序列荧光素酶报告基因质粒的构建，过程是：
1.1、DNA提取和基因型分析
取健康志愿者外周静脉血，EDTA抗凝，并用标准酚-氯仿法提取健康志愿者的全基因组DNA，置于冰箱备用；采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析对CYP3A4内含子SNP多态性位点进行基因型分析；通过PCR扩增产物直接测序验证基因型检测方法的可靠性，
1.2、CYP3A4启动子PCR扩增，
1.3、PCR产物胶回收，
1.4、双酶切胶回收PCR产物及pGL3-Basic Vector载体后，用琼脂糖凝胶
电泳并分别胶回收目的DNA片段及载体，
1.5、连接酶切后CYP3A4启动子及pGL3载体，并用连接产物转化DH5α大
肠杆菌，挑取单克隆小提质粒，酶切和测序，获得pGL3-P重组质粒，
1.6、pGL3-P重组质粒进一步培养扩增；
步骤2：CYP3A4内含子SNP增强子荧光素酶报告基因载体的构建，过程是：
2.1、CYP3A4 内含子SNP的DNA片段PCR扩增，包括插入荧光素酶报告基因luc上、下游CYP3A4内含子SNP目的DNA片段，
2.2、PCR产物胶回收，
2.3、双酶切胶回收PCR产物及pGL3-P重组质粒载体后，用琼脂糖凝胶电泳并分别胶回收CYP3A4内含子SNP及载体，
2.4、连接酶切后CYP3A4内含子SNP片段及pGL3-P载体，并用连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑单克隆、小提质粒、酶切和测序，获得获得正向插入重组质粒和反向插入重组质粒，
2.5、正向插入重组质粒及反向插入重组质粒重组质粒进一步培养扩增；
步骤3：CYP3A4内含子SNP启动子荧光素酶报告基因载体的构建，过程是：
3.1、CYP3A4内含子SNP的DNA片段PCR扩增，包括插入荧光素酶报告基因luc上游正、反向CYP3A4内含子SNP目的DNA片段，
3.2、PCR产物胶回收，
3.3、双酶切胶回收PCR产物及pGL3载体后，用琼脂糖凝胶电泳并分别胶回收CYP3A4内含子SNP及载体，
3.4、连接酶切后CYP3A4内含子SNP片段及pGL3载体，并用连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑单克隆、小提质粒、酶切和测序，获得重组质粒，
3.5、将重组质粒进一步培养扩增；
步骤4：HepG2细胞培养和转染，过程是：
4.1、HepG2细胞培养，
用含10%小牛血清、含双抗100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下传代培养，
4.2、转染前一天，细胞接种于24孔板，当细胞融合度约90%时，进行转染：将pGL3和上述重组质粒及内参照质粒pRL-TK，目的质粒与内参质粒以20：1共转染，按照LipofectamineTM 2000说明书瞬时转染HepG2细胞；转染前，用适量不含抗生素的无血清培养液分别稀释质粒和LipofectamineTM 2000脂质体后，将二者混合，室温放置20 min，加入培养板孔中，摇板轻混匀后放入37℃细胞培养箱中培养；转染后5 h换液，换成含血清培养基，继续培养；孵育收集转染后48 h的细胞进行荧光素酶活性测定；
步骤5：双荧光素酶活性测定，过程是：
5.1、细胞收获：除去转染培养后培养液中细胞培养基，１×PBS冲洗细胞，加入 1×PLB细胞裂解液100 μl，室温轻缓晃动培养板15 min后，再吹打细胞，收集细胞裂解液，立即测定或－80℃保存，
5.2、双荧光素酶活性测定：细胞裂解后用双荧光报告基因试剂盒在发光检测仪上检测荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶的活性与内参照质粒pRL-TK中的海肾荧光素酶的活性比值作为被检测的质粒在转染细胞后所测得的荧光素酶的相对活性。
本发明的方法发现CYP3A4内含子SNP同时具有增强子和启动子的功能，发现了增强CYP3A4基因的表达的内含子增强子及启动子，可用来筛选提高CYP3A4酶的产量的SNP，对进一步体外研究或筛选CYP3A4酶代谢的药物将具有重要的应用价值。
附图说明
图1 为本发明构建CYP3A4启动子、CYP3A4 内含子SNP增强子及启动子荧光素酶报告基因载体，瞬时转染HepG2细胞及检测内含子SNP增强子及启动子功能的技术路线图。
图2为CYP3A4启动子报告基因载体启动子插入部位示意图。
图3为有CYP3A4启动子时荧光素酶报告基因luc上游CYP3A4*1G等位基因插入部位示意图。
图4为有CYP3A4启动子时荧光素酶报告基因luc 下游CYP3A4*1G等位基因插入部位示意图。
图5为无启动子时荧光素酶报告基因luc 上游CYP3A4*1G等位基因插入部位示意图。
图6为荧光素酶报告基因 luc 上游重组质粒酶切结果。
图7为荧光素酶报告基因luc 上游PGL3-P重组质粒测序图。
图8为荧光素酶报告基因 luc 上游PGL3-P-F-1587 bp G/A重组质粒（CYP3A4启动子上游）测序图。
图9为荧光素酶报告基因luc 上游PGL3-P-R-1587 bp G重组质粒（CYP3A4启动子上游）测序图。
图10为荧光素酶报告基因luc 上游PGL3-P-R-1587 bp A重组质粒（CYP3A4启动子上游）测序图。
图11为荧光素酶报告基因 luc 下游PGL3-P-F-1587 bp G/A重组质粒（CYP3A4启动子下游）测序图。
图12为荧光素酶报告基因 luc 下游PGL3-P-R-1587 bp G/A重组质粒（CYP3A4启动子下游）测序图。 
图13为荧光素酶报告基因 luc 上游PGL3-F-1587 bp G/A重组质粒（无启动子时）测序图。 
图14为荧光素酶报告基因 luc 上游PGL3-R-1587 bp G/A重组质粒（无启动子时）测序图。 
图15为HepG2细胞中CYP3A4启动子活性。
图16为荧光素酶报告基因 luc 上游CYP3A4*1G对CYP3A4启动子的转录增强作用。
图17为荧光素酶报告基因 luc 下游CYP3A4*1G对CYP3A4启动子的转录增强作用。
图18 为CYP3A4*1G等位基因在内含子10全长中的转录激活作用（内含子启动子活性）。
具体实施方案
本发明因涉及一种人CYP3A4内含子序列和验证该序列SNP具有增强表达功能的方法，包括从CYP3A4基因组中选择内含子序列，因此CYP3A4基因组内含子序列需满足的条件如下：
    1.1 位于编码CYP3A4酶的CYP3A4基因的两个外显子之间的内含子，并且
    1.2 内含子包含典型的GT……AG剪接结构，即5′端有GT剪接位点，3′端有AG剪接位点，并且
    1.3 在内含子3′端末端剪接点的上游20～50个核苷酸范围内，还有一个在剪接中有重要作用的位点，其序列中含有A，称为分支部位，并且
    1.4 体内实验已证实该内含子中的SNP影响CYP3A4酶活性，并且
1.5 内含子中该SNP变异不影响剪接，即不影响1.2中的剪接位点及1.3中的分支部位，并且
    1.6 内含子中该SNP变异不编码micro RNA。 
一种检验人CYP3A4内含子SNP具有增强子和启动子功能的方法，还包括CYP3A4启动子序列荧光素酶报告基因质粒的构建、CYP3A4内含子SNP增强子荧光素酶报告基因载体的构建、CYP3A4内含子SNP启动子荧光素酶报告基因载体的构建、HepG2细胞培养和转染、双荧光素酶活性测定；
步骤1： CYP3A4启动子序列荧光素酶报告基因质粒的构建，过程是：
1.1DNA提取和基因型分析
取健康志愿者外周静脉血，EDTA抗凝，并用标准酚-氯仿法提取健康志愿者的全基因组DNA，置于冰箱备用；采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析对CYP3A4内含子SNP多态性位点进行基因型分析；通过PCR扩增产物直接测序验证基因型检测方法的可靠性，
1.2CYP3A4启动子PCR扩增，
1.3PCR产物胶回收，
1.4双酶切胶回收PCR产物及pGL3-Basic Vector载体后，用琼脂糖凝胶电泳并分别胶回收目的DNA片段及载体，
1.5连接酶切后CYP3A4启动子及pGL3载体，并用连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑取单克隆小提质粒，酶切和测序，获得pGL3-P重组质粒，
1.6pGL3-P重组质粒进一步培养扩增；
步骤2：CYP3A4内含子SNP增强子荧光素酶报告基因载体的构建，过程是：
2.1CYP3A4 内含子SNP的DNA片段PCR扩增，包括插入荧光素酶报告基因luc上、下游CYP3A4内含子SNP目的DNA片段，
2.2PCR产物胶回收，
2.3双酶切胶回收PCR产物及pGL3-P重组质粒载体后，用琼脂糖凝胶电泳并分别胶回收CYP3A4内含子SNP及载体，
2.4连接酶切后CYP3A4内含子SNP片段及pGL3-P载体，并用连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑单克隆、小提质粒、酶切和测序，获得获得正向插入重组质粒和反向插入重组质粒，
2.5正向插入重组质粒及反向插入重组质粒重组质粒进一步培养扩增；
步骤3：CYP3A4内含子SNP启动子荧光素酶报告基因载体的构建，过程是：
3.1CYP3A4内含子SNP的DNA片段PCR扩增，包括插入荧光素酶报告基因luc上游正、反向CYP3A4内含子SNP目的DNA片段，
3.2PCR产物胶回收，
3.3双酶切胶回收PCR产物及pGL3载体后，用琼脂糖凝胶电泳并分别胶回收CYP3A4内含子SNP及载体，
3.4连接酶切后CYP3A4内含子SNP片段及pGL3载体，并用连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑单克隆、小提质粒、酶切和测序，获得重组质粒，
3.5将重组质粒进一步培养扩增；
步骤4：HepG2细胞培养和转染，过程是：
4.1HepG2细胞培养，
用含10%小牛血清、含双抗100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下传代培养，
4.2转染前一天，细胞接种于24孔板，当细胞融合度约90%时，进行转染：将pGL3和上述重组质粒及内参照质粒pRL-TK，目的质粒与内参质粒以20：1共转染，按照LipofectamineTM 2000说明书瞬时转染HepG2细胞；转染前，用适量不含抗生素的无血清培养液分别稀释质粒和LipofectamineTM 2000脂质体后，将二者混合，室温放置20 min，加入培养板孔中，摇板轻混匀后放入37℃细胞培养箱中培养；转染后5 h换液，换成含血清培养基，继续培养；孵育收集转染后48 h的细胞进行荧光素酶活性测定；
步骤5：双荧光素酶活性测定，过程是：
5.1细胞收获：除去转染培养后培养液中细胞培养基，１×PBS冲洗细胞，加入 1×PLB细胞裂解液100 μl，室温轻缓晃动培养板15 min后，再吹打细胞，收集细胞裂解液，立即测定或－80℃保存，
5.2双荧光素酶活性测定：细胞裂解后用双荧光报告基因试剂盒在发光检测仪上检测荧光素酶活性，以萤火虫荧光素酶的活性与内参照质粒pRL-TK中的海肾荧光素酶的活性比值作为被检测的质粒在转染细胞后所测得的荧光素酶的相对活性。
内含子增强子对不同物种、不同基因的启动子的影响程度不同，因此，研究人CYP3A4（再次出现仅以CYP3A4表示）内含子SNP作为增强子时使用CYP3A4基因启动子区序列（5'端上游启动子区）为较理想的选择。
    CYP3A4基因内含子10 SNP CYP3A4*1G（20230G>A，rs2242480）在中国人群变异频率达30%，且体内研究发现该SNP通过影响CYP3A4酶活性从而影响了阿托伐他汀、环孢素及芬太尼等药物对人体的疗效。了解CYP3A4酶基因内含子10 SNP CYP3A4*1G具体功能和机制，将从遗传学角度解释CYP3A4酶活性差异形成的原因，对于临床有关CYP3A4酶代谢药物的个体化用药可提供新的理论基础及指导。CYP3A4*1G位于具有典型剪接结构的内含子中，该变异不影响剪接/编码MicroRNA、不通过调节转录延伸或RNA加工/折叠影响RNA水平，是否作为增强子及充当启动子发挥作用，尚未见报道，现以CYP3A4基因内含子10 SNP CYP3A4*1G为例具体说明。
内含子SNP 10 CYP3A4*1G满足如下条件：
1.1 位于编码CYP3A4酶（蛋白质）的CYP3A4基因的两个外显子之间的内含子，并且
1.2 内含子包含典型的GT……AG剪接结构，即5′端有GT剪接位点，3′端有AG剪接位点，并且
1.3 在内含子3′端末端剪接点的上游20～50个核苷酸范围内，还有一个在剪接中有重要作用的位点，其序列中含有A，称为分支部位，并且
1.4 体内实验已证实该内含子中的SNP影响CYP3A4酶活性（Gao Y, Zhang LR, Fu Q. Eur J Clin Pharmacol, 2008, 64(9):877-882；Zhang W, Chang YZ, Kan QC, et al. Eur J Clin Pharmacol, 2010, 66(1):61-66；Dong ZL, Li H, Chen QX, et al. J Clin Pharm Ther, 2012, 37(2):153-156；Yuan R, Zhang X, Deng Q, et al.. Clin Chim Acta, 2011, 412(9-10):755-760；Qiu XY, Jiao Z, Zhang M, et al.. Eur J Clin Pharmacol, 2008, 64(11):1069-1084；Hu YF, Tu JH, Tan ZR, et al.. Xenobiotica, 2007, 37(3):315-327，有关文章中的CYP3A4*18B实际为CYP3A4*1G），并且
1.5 内含子中该SNP变异不影响剪接，即不影响1.2中的剪接位点及1.3中的分支部位，并且
1.6 内含子中该SNP变异不编码micro RNA。 
2. 如图1所示，一种检验人CYP3A4内含子SNP具有增强子和启动子功能的方法，包括构建含CYP3A4基因启动子序列荧光素酶报告基因及内含子CYP3A4*1G启动子及增强子序列荧光素酶报告基因载体，HepG2细胞培养和转染、双荧光素酶活性测定的步骤如下：
2.1如图2所示，步骤一：CYP3A4基因启动子序列荧光素酶报告基因质粒的构建过程是：
2.1.1 DNA提取和基因型分析
取健康志愿者外周静脉血2~3 ml，EDTA抗凝，并用标准酚-氯仿法提取健康志愿者的全基因组DNA，置于-20℃冰箱备用。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）对内含子10 SNP CYP3A4*1G（20230G>A，rs2242480）多态性位点进行基因型分析（任欣伟, 杨卫红, 李彦鹏, 蔡要欣, 贾  敏, 张莉蓉. 河南地区汉族人群中CYP3A4*1G和CYP3AP1*3多态性分布及连锁不平衡分析. 中国新药与临床杂志. 2010; 29(8):602-605.）；
2.1.2 CYP3A4启动子PCR扩增；
2.1.2.1 引物设计
根据NCBI数据库中CYP3A4基因5'端上游启动子区序列（60256~61990，AF280107），设计一对引物，在上游和下游引物的5'端分别加上XhoI和HindIII酶切位点和保护碱基。CYP3A4启动子区PCR引物序列见表1。
表1 构建CYP3A4启动子及CYP3A4*1G等位基因重组质粒所用PCR引物
 引物（5′ to 3′）限制性内切酶CYP3A4 启动子F TAACTCGAGCCGGCACACACCTGGCACAACACTXhoI R GCAAAGCTTCTGTGTTGCTCTTTGCTGGGCTATGHindIII（luc 上游）CYP3A4*1G（正向）1587 bp GF1TGCGGTACCGTGAGTGGATGGTACATGGAGAAGGKpnI（luc 上游）CYP3A4*1G（正向）1587 bp AF2TGCGGTACCGTGAGTGGATGATACATGGAGAAGGKpnI（luc 上游）CYP3A4*1G（正向）1587 bp G/AR AGAACGCGTCTGGAAAGAACGAAACAGATTTGGAMluI（luc 上游）CYP3A4*1G（反向）1587 bp G F1AGAACGCGTGTGAGTGGATGGTACATGGAGAAGGMluI（luc 上游）CYP3A4*1G（反向）1587 bp AF2AGAACGCGTGTGAGTGGATGATACATGGAGAAGGMluI（luc 上游）CYP3A4*1G（反向）1587 bp G/AR GTTGGTACCCTGGAAAGAACGAAACAGATTTGGAKpnI（luc 上游）CYP3A4*1G（正向）181 bp G/AF TAGGGTACCGCTATGAAACCACGAGCAGTGTKpnI R AGAACGCGTGGGAAGTGGTGAGGAGGCMluI（luc 上游）CYP3A4*1G（正向）287 bp G/AF TACGGTACCCACCCTGATGTCCAGCAGAAACTKpnI R AGAACGCGTAATAGAAAGCAGATGAACCAGAGCCMluI（luc下游）CYP3A4*1G（正向）1587 bp GF1TGAGTCGACGTGAGTGGATGGTACATGGAGAAGGSalI（luc下游）CYP3A4*1G（正向）1587 bp AF2TGAGTCGACGTGAGTGGATGATACATGGAGAAGGSalI（luc下游）CYP3A4*1G（正向）1587 bp G/AR AGAGGATCCCTGGAAAGAACGAAACAGATTTGGABamHI（luc下游）CYP3A4*1G（反向）1587 bp GF1AGAGGATCCGTGAGTGGATGGTACATGGAGAAGGBamHI（luc下游）CYP3A4*1G（反向）1587 bp AF2AGAGGATCCGTGAGTGGATGATACATGGAGAAGGBamHI（luc下游）CYP3A4*1G（反向）1587 bp G/AR GTTGTCGACCTGGAAAGAACGAAACAGATTTGGASalI
luc 上游或下游，分别表示荧光素酶基因（luciferase gene）的上游或下游；F或R，分别表示上游或下游引物；F1和F2，分别表示上游引物含G或A等位基因；下划线，表示限制性内切酶胶酶切位点。
2.1.2.2 扩增片段选择
  根据实验目的，需要扩增CYP3A4启动子序列SEQ ID NO:1备构建载体用。扩增的CYP3A4启动子区域来自参考文献［Wang D, Guo Y, Wrighton SA, et al. Intronic polymorphism in CYP3A4 affects hepatic expression and response to statin drugs. Pharmacogenomics J. 2011;11(4):274-286］。
    2.1.2.3 PCR扩增体系设计
PCR反应体系（50 μl）：
试剂体积（μl）终浓度PrimeSTAR?MaxPremix（2×）251×F30.3 μMR30.3 μM模板DNA4200 ng以上超纯水15 
2.1.2.4 PCR扩增条件选择
PCR三步反应的反应条件：98 ℃，10 s；55 ℃，15 s；72 ℃，120 s。循环35次。
2.1.3 PCR产物胶回收
将50 μl PCR扩增产物加入适量10×loading buffer，经1%琼脂糖凝胶（制备1%琼脂糖凝胶时，称0.5 g琼脂糖加稀释好的1×TAE溶液50 ml溶解）电泳分离，凝胶成像系统观察，并在紫外透射反射仪下观察，切出CYP3A4 启动子目的DNA片段。
用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit纯化； 
2.1.4 双酶切胶回收PCR产物及pGL3-Basic Vector（pGL3）载体后，用琼脂糖凝胶电泳并分别胶回收目的DNA片段及载体，并测定
2.1.4.1 载体pGL3的双酶切及酶切后载体DNA的回收
（1）双酶切反应体系（20 μl）：
试剂体积（μl）10×NEB缓冲液42载体pGL310100×BSA0.2内切酶XhoI0.5内切酶HindIII -HF0.5超纯水6.8
（2）37 ℃水温双酶切水浴3 h。
（3）双酶切后载体DNA的胶回收纯化
双酶切pGL3质粒产物，经l%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察，在紫外灯下切出目的片段，用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit纯化。
2.1.4.2 CYP3A4启动子片段的双酶切及目的片段的胶回收
（1）双酶切反应体系（50 μl）：
试剂体积（μl）10×NEB缓冲液45模板DNA（CYP3A4启动子片段）42.5100×BSA0.5内切酶XhoI1内切酶HindIII -HF1
（2）37 ℃水温下双酶切水浴过夜（16~24 h）。  
（3）双酶切CYP3A4启动子片段的胶回收纯化
双酶切CYP3A4启动子DNA产物，经l%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察，在紫外灯下切出目的片段，用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit纯化。
2.1.4.3胶回收后CYP3A4启动子PCR产物及pGL3载体质粒DNA浓度的测定
使用NanoDrop 2000测定DNA浓度：
（1）加2 μl去离子水清洗加样孔3次。
（2）加2 μl样品溶剂，点击blank图标，measure图标呈现绿色。
（3）分别加2 μl胶回收后CYP3A4启动子PCR产物及pGL3载体质粒，测定相应样品的DNA浓度。
（4）测定样品DNA浓度后，需用去离子水冲洗加样孔。
2.1.5如图6、7所示， 连接上述酶切后CYP3A4启动子及pGL3载体，并用连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑单克隆、小提质粒、酶切和测序，获得pGL3-P重组质粒。  
2.1.5.1 CYP3A4启动子片段与载体pGL3连接成pGL3-P重组质粒 （25 μl体系）：
试剂体积（μl）10×T4 DNA Ligase Buffer2.5CYP3A4启动子片段17.5载体pGL34T4 DNA Ligase1
16℃连接反应，16h，在H2O3-96L金属浴连接仪；
2.1.5.2  pGL3-P重组质粒转化DH5α感受态细胞
（1）DH5α感受态细胞的制备
A．取适量DH5α甘油菌，以Z字形轨迹在无抗性的LB平板上划线，将划过线的LB平板37 ℃培养过夜；
B．挑取LB平板上单菌落克隆，加入含2 ml LB液的长试管中，220 rpm，37 ℃摇床中振荡培养过夜（12~16 h）；
C．1 ml过夜菌在100 ml LB液中扩大培养，37 ℃、220 rpm振荡培养3 h；
D．至OD 600nm=0.315，将菌液加入事先预冷的无菌50 ml管中，4 ℃、4000 rpm离心10 min后，弃上清液，管子倒置于纸上，使残留培养液流尽；
E．加入10 ml冰预冷的0.1 M CaCl2重悬，冰上放置 30 min。然后4 ℃、4000 rpm离心10 min后，弃上清液，管子倒置于纸上，使残留培养液流尽；
F．加入2 ml冰预冷的0.1 M CaCl2重悬菌体后，即为DH5α感受态细胞。加入无菌甘油成为20%甘油菌，100 μl/管分装后，-80 ℃冰箱冻存备用。
（2）转化反应 
A. 取新制100 μl DH5α感受态细胞，分别加入载体2 μl DNA（阳性对照）和10 μl pGL3-P重组质粒连接体系，混匀，冰上放置 30 min；
B. 42 ℃水浴热击 90 s，立即冰上放置5 min，然后，加LB液900 μl，37 ℃、150 rpm振荡培养1 h；
C. 室温4000 rpm离心5 min，吸弃上清液800 μl，混匀后涂布LA培养板。将涂布后的培养板放入37 ℃培养箱中，正面放置30 min后再倒放培养板，过夜培养。
2.1.5.3 重组pGL3-P阳性克隆的鉴定
（1）在pGL3-P转化板上，挑单菌落克隆，加入含3 ml LB液及3 μl氨苄青霉素抗生素的长试管中，220 rpm，37 ℃摇床中振荡培养过夜；
（2）按照TIANprep Mini Plasmid Kit 质粒小提试剂盒说明书提取质粒；
（3）取10 μl上述重组质粒，经1%琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定是否重组pGL3-P质粒；
（4）重组pGL3-P质粒经XhoI和HindIII -HF双酶切（10 μl）：
试剂体积（μl）10×NEB缓冲液41重组pGL3-P质粒5100×BSA0.1内切酶XhoI0.25内切酶HindIII -HF0.25超纯水3.4
37 ℃水浴，酶切反应3 h。1%琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定是否重组pGL3-P质粒，如图6所示为酶切图；
（5）选取阳性重组质粒pGL3-P，进行测序鉴定，如图7所示为测序图。
2.1.6 pGL3-P重组质粒进一步培养扩增
（1）重组pGL3-P质粒的扩增
A．取少量重组pGL3-P甘油菌菌液，在含氨苄青霉素的LA培养板上Z字形划板，划板后的LA培养板在培养箱37 ℃培养过夜；
B．挑取单菌落克隆，加入含4 ml LB液及4 μl氨苄青霉素的长试管中，220 rpm、37 ℃振荡培养过夜；
C． 取2 ml过夜菌在含200 ml LB液及200 μl氨苄青霉素的锥形瓶中扩大培养，37 ℃、220 rpm振荡培养过夜；
（2）重组pGL3-P质粒的纯化
按照TIANGEN High Pure Plasmid Kit高纯度质粒大提试剂盒说明书提取质粒。
重组pGL3-P质粒的浓度测定，按照前述DNA浓度测定方法进行。
2.2 步骤二：CYP3A4内含子CYP3A4*1G增强子荧光素酶报告基因载体的构建，分别为CYP3A4*1G位于CYP3A4启动子上游或CYP3A4启动子控制的luc 下游时的增强子荧光素酶报告基因载体示意图，如图3和图4所示，以考察CYP3A4*1G同位置不同方向及不同位置时CYP3A4*1G对CYP3A4启动子的增强作用，过程是：
2.2.1 CYP3A4*1G（G/A）DNA片段（内含子10全长1587bp）PCR扩增，包括插入荧光素酶报告基因luc上、下游（正、反向）CYP3A4*1G目的DNA片段
2. 2.1.1 引物设计，引物序列见表1
根据CYP3A4基因（AF280107）在CYP3A4*1G所在的内含子10全长（1587 bp）分别设计位于CYP3A4启动子同位置、不同方向及不同位置、不同方向的一系列引物，以人的基因组CYP3A4*1G GG/AA为模板，利用PCR分别扩增CYP3A4*1G等位基因在内含子10全长（1587 bp）中，位于CYP3A4启动子上游时在上、下游引物的5'端分别加上KpnI 和MluI酶切位点和保护碱基，位于CYP3A4启动子下游时在上、下游引物的5'端分别加上BamHI和SalI酶切位点和保护碱基。PCR引物序列见附表1。
2. 2.1.2 扩增片段选择
根据CYP3A4基因（AF280107），选择CYP3A4*1G G等位基因所在的内含子10全长1587 bp序列SEQ ID NO:2或者CYP3A4*1G A等位基因所在的内含子10全长1587 bp序列SEQ ID NO:3，用以考察CYP3A4*1G（G或A等位基因）对CYP3A4启动子的增强子作用。
2. 2.1.3 PCR扩增体系设计
CYP3A4*1G 1587 bp G（不同位置不同方向）PCR反应体系（50 μl）如下：
试剂体积（μl）PrimeSTAR?MaxPremix（2×）25（1587 bp G）F13（1587 bp）R3模板DNA（CYP3A4*1G GG）4超纯水15
CYP3A4*1G 1587 bp A（不同位置不同方向）PCR反应体系（50 μl）如下：
试剂体积（μl）PrimeSTAR?MaxPremix（2×）25（1587 bp A）F23（1587 bp）R3模板DNA（CYP3A4*1G AA）4超纯水15
    2. 2.1.4 扩增条件选择
PCR三步反应的反应条件：98 ℃，10 s；60 ℃，15 s；72 ℃，120 s。循环35次。
    2.2.2 PCR产物胶回收
将50 μl PCR扩增产物加入适量10×loading buffer，经1%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察，并在紫外透射反射仪下观察，分别切出CYP3A4*1G  1587 bp G/A（同位置或不同位置不同方向）目的DNA片段。用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit纯化。并同时检测上述目的DNA片段的浓度。
    2.2.3 双酶切胶回收PCR产物及pGL3-P重组质粒载体后，用琼脂糖凝胶电泳并分别胶回收目的DNA片段及载体
2.2.3.1 重组质粒载体pGL3-P的双酶切及酶切后载体DNA的回收
A: 双酶切pGL3-P CYP3A4启动子上游时的反应体系（20 μl）
试剂体积（μl）10×NEB缓冲液42载体pGL3-P10内切酶KpnI-HF0.5内切酶MluI0.75超纯水6.75
37 ℃水温双酶切水浴3 h。
B: 双酶切pGL3-P CYP3A4启动子控制的下游时的反应体系（50 μl）
试剂体积（μl）10×NEB缓冲液45载体pGL3-P2（2μg）内切酶SalI-HF 1.5超纯水42
37 ℃水温双酶切水浴1-3 h。65 ℃灭活20 min，冰上降温，加BamHI 37 ℃双酶切水浴2 h。
双酶切后载体DNA的胶回收纯化：双酶切pGL3-P质粒产物，经l%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察，在紫外灯下切出目的片段，用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit纯化。并同时测定目的DNA片段的浓度。
2.2.3.2 一系列CYP3A4*1G 1587 bp G/A DNA片段的双酶切及目的片段的胶回收
A: 位于CYP3A4启动子上游时的双酶切反应体系（50 μl）如下:
试剂体积（μl）10×NEB缓冲液45模板DNA（1587 bp G/A）25内切酶KpnI-HF 0.5内切酶MluI 0.75超纯水18. 75
B: 位于CYP3A4启动子控制的下游时的双酶切反应体系（50 μl）如下:
试剂体积（μl）10×NEB缓冲液45模板DNA（1587 bp G/A）25内切酶BamHI0.5内切酶SalI-HF0.75超纯水18. 75
37 ℃水温双酶切水浴过夜（16~24 h）。
双酶切上述1587 bp G/A DNA片段产物，经l%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶成像系统观察，在紫外灯下切出目的片段，用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit纯化，并同时测定目的DNA片段的浓度。
2.2.4 连接酶切后的一系列CYP3A4*1G片段及pGL3-P载体，并用连接产物转化DH5α大肠杆菌，①挑单克隆、小提质粒、酶切和测序，获得luc上游pGL3-P-F-1587 G/A及pGL3-P-R-1587 G/A重组质粒（F表示正向插入，R表示反向插入），如图6，8、9和10所示为酶切及测序结果，②采用菌液PCR方法后再酶切鉴定，获得luc下游pGL3-P-F-1587 G/A及pGL3-P-R-1587 G/A重组质粒（F表示正向插入，R表示反向插入），如图6，11和12所示为酶切及测序结果。
2.2.4.1 连接体系如下:
试剂体积（μl）10×T4 DNA Ligase Buffer2CYP3A4*1G 1587bp G/A （luc上、下游正向和反向）8载体pGL3-P1T4 DNA Ligase1超纯水8
16℃连接反应，16h，在H2O3-96L金属浴连接仪。
2.2.4.2  luc 上、下游pGL3-P-F-1587 bp G/A重组质粒转化DH5α感受态细胞
转化方法与步骤2.1.5.2相同。
2.2.4.3 重组luc上、下游pGL3-P-F-1587 bp G/A、pGL3-P-R-1587 bp G/A阳性克隆的鉴定：
（1）A: 在luc上游pGL3-P-F-1587 bp G/A、pGL3-P-R-1587 bp G/A转化板上，分别挑单克隆，加入含3ml LB液及3 μl氨苄青霉素抗生素的长试管中，220 rpm，37℃摇床中振荡培养过夜；
B: luc 下游pGL3-P-F-1587 bp G/A和pGL3-P-R-1587 bp G/A重组质粒菌液PCR
做菌液PCR时，PCR体系10 μl即可，DNA记为0。需设阳性和阴性对照。PCR反应体系如下所示，PCR反应条件与步骤2.2.1.4的反应条件相同。
luc 下游重组质粒PCR反应体系（10 μl）如下:
试剂体积（μl）PrimeSTAR?MaxPremix（2×）5luc 下游（1587 bp G/A）F1/F20.6（1587 bp）R0.6模板DNA（待鉴定克隆及阴性对照）0超纯水3.8
附阳性对照，即 
luc 下游重组质粒PCR反应体系（50 μl）如下:
试剂体积（μl）PrimeSTAR?MaxPremix（2×）5luc 下游（1587 bp G/A）F1/F20.6（1587 bp）R0.6模板DNA（CYP3A4*1G G/A）阳性对照0.1超纯水3.7
用记号笔在LA板背面划横线和竖线，画出24个格子，写上编号备用。
取灭菌的牙签，在转化板的克隆上蘸一下，在LA培养板上划一短横线后，再在PCR体系中转一下，抽去牙签。依次按顺序操作，记清编号。为防止混淆及省时间，可最后一次性丢弃牙签。将菌液PCR管PCR扩增。并将此划线培养板37℃培养过夜。
菌液PCR扩增结果可经1%琼脂糖凝胶电泳判断。电泳待鉴定克隆时，每行设有阴性、阳性和Marker。
据菌液PCR阳性克隆编号，选取过夜培养的划线培养板上生长的对应的阳性菌落，挑单克隆或取菌后，再在新的LA培养板上37 ℃过夜培养后，挑单克隆并过夜摇菌。
（2）按照TIANprep Mini Plasmid Kit质粒小提试剂盒说明书提取质粒。
（3）取10 μl上述重组质粒，经1%琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定是否重组luc上、下游pGL3-P-F-1587 bp G/A、pGL3-P-R-1587 bp G/A质粒。
（4）重组luc上、下游pGL3-P-F-1587 bp G/A和pGL3-P-R-1587 bp G/A质粒分别经KpnI-HF和MluI及BamHI和SalI的双酶切。
试剂体积（μl）10×NEB缓冲液41luc 上、下游pGL3-P-F-1587 bp G/A、pGL3-P-R-1587 bp G/A质粒5内切酶KpnI-HF 或BamHI0.25内切酶MluI 或SalI-HF0.5超纯水3.25
双酶切体系（10 μl）如下：
37 ℃水浴，酶切反应3 h。1%琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定是否重组luc 上、下游pGL3-P-F-1587 bp G/A、pGL3-P-R-1587 bp G/A质粒。
（5）选取酶切后阳性重组质粒luc 上、下游pGL3-P-F-1587 bp G/A、pGL3-P-R-1587 bp G/A质粒，进行测序鉴定，如图8、9、10、11和12所示为测序结果。
2.2.5 luc上、下游pGL3-P-F-1587 G/A及pGL3-P-R-1587 G/A重组质粒进一步培养扩增按照步骤 2.1.6中实验方法，对重组luc 上、下游pGL3-P-F-1587 bp G/A、pGL3-P-R-1587 bp G/A质粒进行扩增，并用TIANGEN High Pure Plasmid Kit高纯度质粒大提试剂盒大提质粒。
2.3 步骤三：CYP3A4*1G启动子荧光素酶报告基因载体的构建过程是：
2.3.1 CYP3A4*1G（G/A）DNA片段（内含子10全长1587bp）PCR扩增（包括插入荧光素酶报告基因luc上游正、反向CYP3A4*1G目的DNA片段），扩增条件及方法同步骤2.2.1。
2.3.2 PCR产物胶回收
方法和条件同步骤 2.1.3。
2.3.3 双酶切胶回收PCR产物及pGL3载体后，用琼脂糖凝胶电泳并分别胶回收目的DNA片段及载体
pGL3载体回收的相关实验步骤同步骤2.1.4.1，PCR产物回收的的相关实验步骤同步骤 2.2.3.2。
2.3.4 连接酶切后CYP3A4*1G片段及pGL3载体，并用连接产物转化DH5α大肠杆菌，挑取单克隆、小提质粒、酶切和测序，如图6和图13、14所示为酶切和测序结果，获得pGL3-F-1587 G/A和pGL3-R-1587 G/A重组质粒。
操作方法可参考步骤 2.1.5中的实验方法。
2.3.5 pGL3 -F-1587 G/A和pGL3-R-1587 G/A重组质粒进一步培养扩增
操作方法可参考步骤2.1.6中的实验方法。
2.4 步骤四：HepG2细胞培养和转染
2.4.1 HepG2细胞培养
用含10%小牛血清、含双抗100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下传代培养。
2.4.2 转染前一天，细胞接种于24孔板，当细胞融合度约90%时，进行转染：
将pGL3和上述重组质粒及内参照质粒pRL-TK（目的质粒与内参质粒以20：1共转染）按照LipofectamineTM 2000说明书瞬时转染HepG2细胞。转染前，用适量不含抗生素的无血清培养液分别稀释质粒和LipofectamineTM 2000脂质体后，将二者混合，室温放置20 min，加入培养板孔中，摇板轻混匀后放入37℃细胞培养箱中培养。转染后5 h换液，换成含血培养基，继续培养。孵育收集转染后48 h的细胞进行荧光素酶活性测定。
2.5 步骤五：双荧光素酶活性测定
    2.5.1 细胞收获：除去步骤2.4.2中传染培养后的细胞培养基，１×PBS冲洗细胞，加入 1×PLB （Passive Lysis Buffer）细胞裂解液100 μl，室温轻缓晃动培养板15 min后，再吹打细胞，收集细胞裂解液，立即测定或－80℃保存。
    2.5.2 双荧光素酶活性测定：细胞裂解后用双荧光报告基因试剂盒在在发光检测仪上检测荧光素酶活性，以萤火虫（Firefly）荧光素酶的活性与内参照质粒pRL-TK中的海肾（Renilla）荧光素酶的活性比值作为被检测的质粒在转染细胞后所测得的荧光素酶的相对活性。
2.5.3荧光素酶活性实验结果:
如图15所示，检验HepG2细胞中CYP3A4启动子活性：
用荧光素酶报道基因检验人CYP3A4 启动子位于luc 上游时的荧光素酶活性。左半幅为瞬时转染质粒示意图，右半幅为对应质粒的相对荧光素酶活性，以无启动子的pGL3的相对荧光素酶活性为100%来计算其他质粒的相对荧光素酶活性值。数据以均值±SEM表示，每组3复孔，实验单独做5轮，其中**P<0.01。
结果显示CYP3A4启动子在HepG2细胞的相对荧光素酶活性为pGL3的23倍左右，表明CYP3A4启动子区1735 bp片段具有较强的启动子活性，成功构建了含CYP3A4启动子的报告基因载体，为进一步研究CYP3A4 SNP对CYP3A4启动子的调控关系奠定了实验基础。
如图16及17所示，检验luc 上游及下游CYP3A4*1G对CYP3A4启动子的转录增强作用：
如图16所示，在HepG2细胞中用荧光素酶报道基因检验1587 bp G/A正向或反向位于CYP3A4启动子上游时的荧光素酶活性。左图为瞬时转染质粒示意图，右图为对应质粒的相对荧光素酶活性，以CYP3A4启动子的相对荧光素酶活性为100%来计算其他质粒的相对荧光素酶活性值。数据以均值±SEM表示，每组3复孔，实验单独做5轮，其中 *P<0.05；**P<0.01。
如图17所示，在HepG2细胞中用荧光素酶报道基因检验1587 bp G或A正向或反向位于CYP3A4启动子下游时的荧光素酶活性。左图为瞬时转染质粒示意图，右图为对应质粒的相对荧光素酶活性，以CYP3A4启动子的相对荧光素酶活性为100%来计算其他质粒的相对荧光素酶活性值。数据以均值±SEM表示，每组3复孔，实验单独做5轮，其中 *P<0.05；**P<0.01。
构建的一系列携带1587 bp G或A的增强子报告基因载体，转染HepG2细胞后，观察了1587 bp G和1587 bp A在CYP3A4启动子同位置（启动子上或下游）不同方向及不同位置（启动子上游及下游）时对该启动子的转录增强作用，发现在HepG2细胞中1587 bp G对CYP3A4启动子的转录增强作用和转录增强程度具有位置和方向依赖性；1587 bp A对CYP3A4启动子的转录增强作用及转录增强程度与位置、方向均无关。此结果表明在HepG2细胞中内含子SNP CYP3A4*1G是具有独特的等位基因依赖性的增强子。
如图18所示，检验CYP3A4*1G的启动子活性：在HepG2细胞中用荧光素酶报道基因检验无启动子时1587 bp G或A正向或反向位于luc 上游时的荧光素酶活性。左图为瞬时转染质粒示意图，右图为对应质粒的相对荧光素酶活性，以无启动子的pGL3的相对荧光素酶活性为100%来计算其他质粒的相对荧光素酶活性值。数据以均值±SEM表示，每组3复孔，实验单独做5轮，其中 *P<0.05；**P<0.01。
构建的一系列携带1587 bp G或A的启动子报告基因载体，转染HepG2细胞后，观察了1587 bp G和1587 bp A在无启动子存在情况下，位于luc 上游时的转录激活作用，发现在HepG2细胞中1587 bp G与1587 bp A均具有启动子活性（具有正向方向依赖性），且1587 bp A的启动子活性强于1587 bp G及CYP3A4启动子的活性。此结果表明在HepG2细胞中CYP3A4*1G是具有独特的等位基因依赖性的启动子。
综上，根据图16、17和图18结果，表明在HepG2细胞中内含子SNP CYP3A4*1G是具有独特的等位基因依赖性的增强子和启动子。
到目前为止，体外研究尚无理想的高表达人CYP3A4酶的哺乳动物细胞株，现在常用的肝癌细胞株HepG2细胞产量极低，应用本发明可发现增强CYP3A4基因表达的内含子增强子及启动子，筛选提高CYP3A4酶的产量的SNP，对体外研究或筛选CYP3A4酶代谢的药物将具有重要的应用价值。
序列表
<110>
<120>一种检验人CYP3A4内含子SNP同时具有增强子和启动子功能的荧光报告基因方法
<160> 3
<170> PatentIn Version 3.3
<210> 1
<211> 1735
<212> DNA
<213> CYP3A4启动子(SEQ ID NO：1)
<400> 1
ccggcacaca cctggcacaa cactgcacat gacattcacc cacttggcct tgaatctgac      60
aaggaatctg gcatgatgtt cacccactca ggccaggtgc cgagcagccc tggaggctta     120
ggggccagag ggatgggaaa aggtgtcttt ctggggtgag tatcagtttc tgcaggaggg     180
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gacatgcaga ggcccagcaa tctcagctaa gtcaactcca ccagcctttc tagttgccca    1020
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cccttgagga gctcacctct gttcagggaa acaggcgtgg aaacacaatg gtggtaaaga    1140
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tgataagaac ccagaaccct tggactcccc agtaacattg attgagttgt ttatgatacc    1500
tcatagaata tgaactcaaa ggaggtcagt gagtggtgtg tgtgtgattc tttgccaact    1560
tccaaggtgg agaagcctct tccaactgca ggcagagcac aggtggccct gctactggct    1620
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ctgctgtgca gggcaggaaa gctccatgca catagcccag caaagagcaa cacag         1735
<210> 2
<211>1587
<212> DNA
<213> CYP3A4*1G G等位基因（SEQ ID NO：2）
<400> 2
gtgagtggat ggtacatgga gaaggaggga ggaggtgaaa ccttagcaaa aatgcctcct      60
caccacttcc caggagaatt tttataaaaa gcataatcac tgattctttc actgactcta     120
tgtaggaagg ctctgaaaag aaaaagaaag aaacatagca aatggttgct actggcagaa     180
gcgtaagatc tttgtaaaac gtgctggctc tggttcatct gctttctatt actacaataa     240
tgctaagtaa aaaacctcca aaaacctcag tggcatctaa caataagcat ttgttgctca     300
cactcatttc acattggttt tggttgtgaa ttacatgttt gcagcaggca ccatagtggt     360
gtgtgatgtc cccttagctg tatccacata tggacacagg aatttgctct ttttatctct     420
ttttattttc ttggttacag acatgtgact tttttttttg aaaggtaaca atcactttct     480
catatgttat ttgatgctag tggtcatagc ctattagtca catttgtttc aatgagaaag     540
aaaaaccagt acacggttat gctaaggatt tcagtccctg gggtgagagc cgtctcgaat     600
gtctccccac ttcataactc ctccacacat catagttgga tagtgagctc tgctgatatt     660
ggcaggactt gctctggtct ggctgtagtc tgacggagcc tggccctggg tgtgctgtgc     720
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<210> 3
<211> 1587
<212> DNA
<213> CYP3A4*1G A等位基因（SEQ ID NO：3）
<400> 3
gtgagtggat gatacatgga gaaggaggga ggaggtgaaa ccttagcaaa aatgcctcct    60
caccacttcc caggagaatt tttataaaaa gcataatcac tgattctttc actgactcta     120
tgtaggaagg ctctgaaaag aaaaagaaag aaacatagca aatggttgct actggcagaa   180
gcgtaagatc tttgtaaaac gtgctggctc tggttcatct gctttctatt actacaataa     240
tgctaagtaa aaaacctcca aaaacctcag tggcatctaa caataagcat ttgttgctca     300
cactcatttc acattggttt tggttgtgaa ttacatgttt gcagcaggca ccatagtggt     360
gtgtgatgtc cccttagctg tatccacata tggacacagg aatttgctct ttttatctct     420
ttttattttc ttggttacag acatgtgact tttttttttg aaaggtaaca atcactttct     480
catatgttat ttgatgctag tggtcatagc ctattagtca catttgtttc aatgagaaag     540
aaaaaccagt acacggttat gctaaggatt tcagtccctg gggtgagagc cgtctcgaat     600
gtctccccac ttcataactc ctccacacat catagttgga tagtgagctc tgctgatatt     660
ggcaggactt gctctggtct ggctgtagtc tgacggagcc tggccctggg tgtgctgtgc     720
aggctgactc agctctcccc acacctatct catgttccag tcaggcagta actggtgaag     780
aagccaagct aggaaccagg atatctggct cctgagctaa agtcttaaaa cactatcata     840
ttgccttcca aatataacac caaatactag gtgcatatca cccacactgt tttcagacct     900
ctgccaaaat tgggattctt tgtggtatga agagacacgg ctttggggct ggcccggctg     960
tggcagtgag gtgaacacaa agggatgttc ttcagagatt acagtccagc cctgaagcaa    1020
caactaggag actgtttcag caagtgagga cagggctgtg tggggttcta tcctctttat    1080
aacttccact agcactgaaa tcgtgttctc tggttacatc caaccagaac cttctttgtc    1140
atttttggga tagaaaggga ctagtttatc ctcaaattat ttatggagat tttatataat    1200
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cacatatata tacacatata tatgtgtgtg tgtatgtgtg tgtgtatata tatatacaca    1320
tatatacacg gttatgctaa ggatttcagt ccctggggtg agagccttcc cgaatgcttc    1380
ccaccttcat aactcctcca cacatctcag tgggccactg agcacagcaa tgggcatgac    1440
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ctcctaatac ttcattagta ctgcatggac tgagttaaaa gttaattcaa aatctcaatt    1560
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