抗肿瘤组合物.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102917717 A (43)申请公布日 2013.02.06 CN 102917717 A *CN102917717A* (21)申请号 201180028519.5 (22)申请日 2011.06.09 10165577.7 2010.06.10 EP 61/354361 2010.06.14 US A61K 35/76(2006.01) A61K 39/42(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (71)申请人 英特维特国际股份有限公司 地址 荷兰博克斯梅尔 (72)发明人 C.C. 施里尔 H.J.M. 贾格特 (74)专利代理机构 中国。

2、专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 李连涛 万雪松 (54) 发明名称 抗肿瘤组合物 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 包 含 禽 副 粘 病 毒 （Avian Paramyxovirus,APMV） 的药物组合物， 其用于治疗 哺乳动物的肿瘤。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.12.10 (86)PCT申请的申请数据 PCT/EP2011/059555 2011.06.09 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/154476 EN 2011.12.15 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 12 页 (19)中华人民共和国国家。

3、知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 12 页 1/1 页 2 1. 包含禽副粘病毒 （APMV） 的药物组合物， 其用于治疗哺乳动物的肿瘤， 其中所述治疗 包括对所述哺乳动物施用细胞毒性量的第一APMV的步骤以及随后在所述第一APMV施用后 2-56 周内对所述哺乳动物施用细胞毒性量的第二 APMV 的步骤， 其中所述第二 APMV 具有免 疫学上不同于第一 APMV 的 HN 蛋白的 HN 蛋白。 2.根据权利要求1的药物组合物， 其中所述第二APMV额外地具有免疫学上不同于第一 APMV 的 F 蛋白的 F 蛋白。 3. 根据权利要求 1 或 2 的药物组合物， 。

4、其中所述第一 APMV 是新城疫病毒。 4. 根据权利要求 1 或 2 的药物组合物， 其中所述第一 APMV 是 APMV3。 5.根据权利要求3的药物组合物， 其中所述第一APMV是新城疫病毒， 所述第二APMV是 APMV3。 6. 根据权利要求 4 的药物组合物， 其中所述第一 APMV 是 APMV3， 所述第二 APMV 是新城 疫病毒。 7.根据权利要求1-6中任一项的药物组合物， 其特征在于至少第一或第二APMV是溶解 性的。 8. 根据权利要求 7 的药物组合物， 其特征在于第一和第二 APMV 均是溶解性的。 9. 根据权利要求 1-8 中任一项的药物组合物， 其特征在于所。

5、述哺乳动物是马科动物、 犬科动物或猫科动物物种。 10. 根据权利要求 1-9 中任一项的药物组合物， 其特征在于在至少第一或第二 APMV 施 用期间共施用一定量的抗肿瘤药剂。 11.根据权利要求1-10中任一项的药物组合物， 其特征在于至少第一或第二APMV是携 带额外基因的重组 APMV。 权 利 要 求 书 CN 102917717 A 2 1/12 页 3 抗肿瘤组合物 0001 本发明涉及包含禽副粘病毒 （Avian Paramyxovirus, APMV） 的药物组合物， 其用 于治疗哺乳动物的肿瘤。 0002 新城疫病毒 （Newcastle disease virus, ND。

6、V） 是禽副粘病毒 （APMV） 的成员之一， 其导致多种鸟类感染。NDV 属于 APMV 1。该疾病以呼吸道、 脑或胃肠道的炎症为特征。 0003 数十年前即已知， 新城疫病毒具有另一种并且相当出乎意料的特性 ： 由于部分未 知的原因， 其在哺乳动物中具有抗肿瘤作用。因此， 仅次于接种禽类物种的兴趣， 对新城疫 病毒和其他副粘病毒在癌症治疗 （包括人癌症治疗） 中的用途的兴趣不断增加。 0004 当新城疫病毒在人体内复制时， 一般来讲， 病毒不会表现出毒力。感染 NDV 的人体 最熟知的症状是轻度结膜炎。首次参与用活的减毒 NDV 对大量鸡进行接种的兽医师常常患 有这种结膜炎。 0005 然。

7、而， 由于未研究透彻的原因， 哺乳动物肿瘤细胞的致病性大大高于非肿瘤细胞 的致病性。据估计， ND 在癌症细胞中的复制高于正常细胞中高达约 100.000 倍。 0006 NDV 不是唯一具有抗肿瘤作用 （例如溶瘤作用） 的 APMV。目前， APMV1、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9以及Mapuerta病毒和Fer-de-Lance病毒的溶瘤毒株是已知的， 参见例如美国专利申请 US2009/0208495。 0007 APMV 有两种类型 ： 溶解性 （lytic） 和非溶解性 （non-lytic） 毒株。溶解性和非溶 解性毒株二者均能够杀死癌症细胞， 但是溶解性细胞具有稍快的。

8、作用模式 （Schirrmacher, V. 等 , Int. J. Oncol. 2001 May; 18(5): 945-52） 。据推测， 溶解性毒株破坏已感染细 胞的质膜， 而非溶解性毒株表现为干扰细胞代谢。因此， 尽管机制不同， 溶解性和非溶解性 毒株二者均对肿瘤细胞具有毒性。 因此， 为了避免混淆， 溶解性和非溶解性毒株二者还将进 一步被称为细胞毒性毒株。 由于在文献中， 溶解性毒株也被称为溶瘤毒株， 因此此处溶解性 毒株的用词将指溶瘤毒株。 0008 已经对溶解性和非溶解性 NDV 毒株在抗击癌症中的用途进行了研究。这使得开发 出三种不同的基础性抗肿瘤疗法 ： 1） 对患者施用一。

9、种非溶解性或溶解性 APMV 毒株。 0009 2） 对患者施用所谓的肿瘤溶解剂 （oncolysates） ， 所述肿瘤溶解剂包含来自已体 外感染 APMV 的癌症细胞的质膜碎片。 0010 3） 对患者施用已感染非溶解性 APMV 毒株的完整癌症细胞。 0011 第一种方法的理论基础是溶解性病毒株的扩散以及随后该病毒株的复制将最终 导致体内所有肿瘤细胞的感染。这种方法的一个不利结果是， 一段时间后免疫应答将被诱 导， 其可能中和亲本和 / 或子代病毒。 0012 第二种和第三种方法的理论基础是当肿瘤细胞表面上的肿瘤特异性抗原与病毒 抗原相互联系时， 其被更好地识别。 第二种和第三种方法之间。

10、的选择取决于经推测， 是质膜 还是全细胞提供较好的应答。 0013 基于病毒的抗肿瘤方法 1、 2 和 3 的弊端是一段时间后将诱导针对 APMV 的免疫应 答， 其可能干扰亲本和 / 或子代病毒并阻断更多细胞感染。 说 明 书 CN 102917717 A 3 2/12 页 4 0014 这一难题已经通过几种途径解决。一些方法依赖于 i.a. 将编码干扰宿主免疫系 统的化合物的异源基因引入病毒基因组中。 0015 另一种方法是一周数次给予 （非常） 高剂量的病毒， 以克服所诱导抗体的作用， 或 诱导对病毒的某种免疫耐受性。 0016 其他方法尝试通过非常强力的首次攻击来规避第二轮和更多轮病毒。

11、感染的必要 性。这可以例如通过联合施用 NDV 和一些抗肿瘤药物 （例如细胞毒性或细胞抑制性化合物） 来进行。其他此类方法依赖于将编码例如靶向肿瘤特异性抗原的全长 IgG 抗体的基因引入 NDV 中。 0017 这些方法共有的弊端是， 与采用相对低浓度的 NDV 的基础性治疗相比， 每一种均 使患者更加恶化。因此， 需要替代性方法以减少与抗体诱导相关的难题。 0018 本发明的一个目的是提供减少与抗体诱导相关的难题并且不会面临上面提及之 弊端的方法。 0019 在该方面中， 本发明的一个实施方案涉及包含禽副粘病毒 （APMV） 的药物组合物， 其用于治疗哺乳动物的肿瘤， 其中所述治疗包括对所述。

12、哺乳动物施用细胞毒性量的第一 APMV 的步骤以及随后在第一 APMV 施用后 2-56 周内对该哺乳动物施用细胞毒性量的第二 APMV 的步骤， 其中所述第二 APMV 具有免疫学上不同于第一 APMV 的 HN 蛋白的 HN 蛋白。 0020 所 有 APMV 均 携 带 编 码 血 细 胞 凝 集 素 （Hemagglutinin） / 神 经 氨 酸 苷 酶 （Neuraminidase, HN） 活性的基因和编码融合 （F） 蛋白的基因。血细胞凝集素 / 神经氨酸 苷酶是保护性免疫应答的强力诱导者， 而融合蛋白也在某种 （尽管较少） 程度上参与保护性 免疫应答的诱导。 0021 现在。

13、令人惊讶地发现， 禽副粘病毒 （APMV s） 多个成员的血细胞凝集素 / 神经氨酸 苷酶和融合蛋白之间具有非常低的免疫学交叉反应性。 在一些情况下甚至实际上不存在免 疫学交叉反应性。这一出乎意料的发现开辟了减少或优选避免出现与首次施用 APMV 毒株 后免疫诱导相关之难题的新方法。 0022 达到此目的的一种途径是对哺乳动物施用细胞毒性量的第一 APMV， 随后在所述第 一APMV施用后2-56周内对该哺乳动物施用细胞毒性量的第二APMV， 注意第二APMV具有免 疫学上不同于第一 APMV 的 HN 蛋白的 HN 蛋白 （优选融合蛋白） 。 0023 本方面中的免疫学上不同是指第二 HN 。

14、蛋白 （优选融合蛋白） 来自不属于第一 APMV 的 APMV。仅仅作为示例， 如果第一 APMV 的 HN 蛋白属于 APMV1， 则第二 APMV 的 HN 蛋白必须 属于另一种 APMV， 例如 APMV3 或 APMV5， 以符合免疫学上不同的标准。 0024 通过依照这种方法， 由于不同 APMV 之间的 （非常） 低的免疫学交叉反应性， 第二 APMV 将较少或者甚至更少受到针对第一 APMV 的可能性免疫应答的阻碍。这使得能够随时 间进行数轮病毒施用。这种方法的优势是显而易见的， 当待受治疗的肿瘤是实体瘤时更是 如此。特别是在这种情况下， 肿瘤质 （tumor mass） 的所有。

15、细胞不可能在同一时间全部被感 染。肿瘤的核心将首先保持不被攻击。第一次病毒施用后被感染的那些细胞在肿瘤质中的 较深细胞层能够被感染之前将不得不死亡或消失。彼时， 针对病毒产生的免疫力能够很好 去除残留的病毒， 结果使得这些较深细胞层不会被杀死。然而现在用未针对其产生免疫应 答的第二 （必要时第三或更多） APMV 毒株进行第二轮 APMV 施用将解决这一问题。 0025 有几种方法可以对第一和第二 APMV 进行选择或筛选。一种简单的方法是使用选 说 明 书 CN 102917717 A 4 3/12 页 5 自由 APMV1、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 Mapuerta 病毒。

16、和 Fer-de-Lance 病毒组成的组中的一种 APMV 作为第一 APMV， 以及该组的另一种 APMV 作为第二 APMV。仅仅作为示例 ： 可以施用细胞毒性 量的 APMV1 作为第一 APMV， 随后在首次施用后 2-56 周内施用细胞毒性量的 APMV3。 0026 筛选第一和第二 APMV 的另一种更加复杂但是讲究的方法依赖于以下事实 ： 如上 面所述， 针对 APMV 的主要的免疫应答是针对病毒的 HN， 虽然较少程度上针对 F 蛋白。通过 简单地将一种特定APMV的HN编码基因以及如果需要F蛋白编码基因替换为另一种APMV的 那些， 可以两次使用相同的 APMV 骨架 ： 。

17、一次作为野生型， 第二次作为重组型， 所述重组型目 前携带另一种 APMV 的 HN 以及可能地还有 F 蛋白 （编码基因） ， 以替代野生型的那些。仅仅 作为示例 ： 可以使用 NDV 作为第一 APMV， 重组 NDV 作为第二 APMV， 其中重组 NDV 基于相同的 NDV 骨架， 但是目前携带另一种 APMV（例如 APMV3） 的 HN 以及可能地 F 蛋白 （编码基因） ， 以 替代初始 NDV 的 HN 或融合蛋白。第二 （重组 NDV） APMV 会 （更） 较少受到针对第一 APMV 产 生的免疫应答的阻碍， 因为 （虽然事实上第二 APMV 的基础是 NDV） 第二 （重。

18、组 NDV） 的主要免 疫原性决定子不是 NDV 的， 而是另一种 APMV（例如 APMV3） 的。 0027 第一和第二 APMV 施用之间 2-56 周的时间期具有以下理论基础 ： 一些肿瘤是快速 生长的， 而其他肿瘤或者甚至已转移的癌症细胞可以缓慢生长， 或甚至在很长一段时间中 是 “休眠的” 。因此， 取决于肿瘤的特征， 较早或较晚及时给予第二 APMV 可能是有益的。在 很多情况下， 第一和第二 APMV 施用之间的时间期较短， 因为 “休眠” 时间少于 56 周。此外， 可能希望避免细胞较早过度生长的风险。因此， 优选的时间期是 2 和 28 周之间， 按照优先 顺序更优选 2-。

19、20、 2-16、 2-12 或者甚至 2-8 周之间。 0028 这种新颖的方法具有超越现存方法的优势， 即其仅仅依赖于 APMV 的细胞毒性作 用， 因而原则上无需强制使用如上面所述已有方法所基于的， 干扰免疫系统和免疫应答的 细胞毒性药物或化合物或方案。 0029 本发明的一个额外优势是以下 ： 如果已经用根据本发明的组合物分两步对患者进 行治疗后， 一段时间后休眠的 （或） 已转移的肿瘤细胞开始分裂， 可以通过施用第三 APMV 以 及如果需要又一种 APMV s 简单地重复该步骤。 0030 鉴于某些免疫应答针对F蛋白激发的事实， 优选第二APMV不仅具有免疫学上不同 于第一 APM。

20、V 的 HN 蛋白的 HN 蛋白， 还具有免疫学上不同于第一 APMV 的 F 蛋白的 F 蛋白。 0031 应当理解的是， 如果例如一种NDV骨架用于第一和第二步中， 那么第二重组NDV中 的 HN 和融合蛋白应当优选来源于一种且相同的非 NDV APMV。作为示例， 如果第一 NDV 是 野生型 NDV， 那么第二 NDV， 重组 NDV 应当优选同时携带例如 APMV4 或 APMV5 的 HN 和融合蛋 白， 而非 APMV4 的 HN 和 APMV5 的融合蛋白。 0032 因此， 本发明的一个优选实施方案涉及根据本发明的药物组合物， 其中第二 APMV 额外地具有免疫学上不同于第一。

21、 APMV 的 F 蛋白的 F 蛋白。 0033 病毒的选择非常广泛。APMV 适用于抗肿瘤治疗是已知的， 并且在本领域已知很长 时间。 例如， 人癌症研究中使用的NDV毒株的概况包括i.a.毒株73-T （Cassel WA, Garrett RE. Cancer 18: 863-8, 1965） 、 Ulster （Bohle W, Schlag P, Liebrich W等, Cancer 66 (7): 1517-23, 1990） 、 MTH-68 (Csatary LK, Moss RW, Beuth J 等， Anticancer Res 19 (1B): 635-8, 1999。

22、)（Csatary LK, Eckhardt S, Bukosza I 等， Cancer Detect Prev 17 (6): 619-27, 1993） 、 Italien （Mallmann P. Hybridoma 12 (5): 559-66, 1993） 、 Hickman 说 明 书 CN 102917717 A 5 4/12 页 6 （Wheelock EF, Dingle JH. N Engl J Med 271(13): 645-51, 1964） 、 PV701（Pecora AL, Rizvi N, Cohen GI 等， J Clin Oncol 20 (9): 2。

23、251-66, 2002） 、 HUJ（Freeman AI, Zakay-Rones Z, Gomori JM 等， Mol Ther 13 (1): 221-8, 2006） 和 LaSota（Liang W, Wang H, Sun TM 等， World J Gastroenterol 9 (3): 495-8, 2003） 。 0034 关于施用途径， 再次， 本领域现存知识又给予技术人员充分的指导。 仅仅作为本领 域的示例， 提供以下概况 ： 在动物研究中， 已经通过 i.a. 瘤内、 腹膜内和静脉内途径完成 NDV 感染， 如 Schirrmacher V, Griesbach 。

24、A, Ahlert T., Int J Oncol 18 (5): 945-52, 2001中所综 述。通过肌内或皮下途径的 NDV 感染已经由 i.a. Heicappell R, Schirrmacher V, von Hoegen P 等， Int J Cancer 37 (4): 569-77, 1986 综述。在人体研究中， 在患者已经感染 溶解性 NDV 毒株的情况下， 已经使用了瘤内、 静脉内或肌内注射 （Cassel WA, Garrett RE, Cancer 18: 863-8, 1965, Csatary LK, Moss RW, Beuth J等， Anticancer。

25、 Res 19 (1B): 635-8, 1999, Pecora AL, Rizvi N, Cohen GI等， J Clin Oncol 20 (9): 2251-66, 2002, Csatary LK, Bakcs T, JAMA 281 (17): 1588-9, 1999, Wheelock EF, Dingle JH, N Engl J Med 271(13): 645-51, 1964, Csatary LK., Lancet 2 (7728): 825, 1971。 0035 还使用以下途径 ： 吸入和直接注射入结肠内 （即通过结肠造口术开口） 。 （Csatary LK, 。

26、Moss RW, Beuth J 等， Anticancer Res 19 (1B): 635-8, 1999 Jan-Feb, Csatary LK, Eckhardt S, Bukosza I 等， Cancer Detect Prev 17 (6): 619-27, 1993） 。 0036 此外， 可以在 National Cancer Institute 的 Position Description Questionaire “Newcastle Disease Virus (PDQ) Health Professional Version” 中找 到 APMV（例如 NDV） 在癌。

27、症治疗中的用途的全面概况。 0037 APMV 的细胞毒性量是诱导细胞死亡所必需的病毒量。理论上来讲， 一个 APMV 能 够感染并且杀死一个细胞。然而在实际环境中会施用多于将要被感染的肿瘤细胞数目的 量。 适且的量例如示于Csatary LK, Eckhardt S, Bukosza I等 ： Attenuated veterinary virus vaccine for the treatment of cancer. Cancer Detect Prev 17 (6): 619-27, 1993 中。一般来讲， 哺乳动物非肿瘤细胞中非常温和的感染行为使得允许施用相对高的剂 量。104和 。

28、1012pfu 之间广泛范围的剂量均是可以接受的剂量。105和 109pfu 之间的剂量是 大多数应用的优选剂量。上面引用的文献给予了这方面的充分指导。 0038 在新城疫感染是由强毒力或中等毒力 NDV 毒株引起的情况下， 在大多数西方国家 中该疾病是需要上报的。因此， 如果抗肿瘤组合物中使用 NDV 毒株， 应当选择低毒力毒株， 以规避上报。 0039 在所有的 APMV 中， 新城疫病毒 （NDV） 是最常使用的病毒。因此， 可以优先使用该 病毒作为第一或第二 APMV。因此， 本发明的一个更优选的实施方案涉及根据本发明的药物 组合物， 其中第一 APMV 是新城疫病毒。 0040 在第。

29、二APMV是重组APMV因而携带另一种APMV的HN蛋白以及如果需要还有 F蛋 白 （编码基因） 以替代该 APMV 野生型基因的情况下， 第一和第二 APMV 二者的优选 APMV 骨架 是 NDV。 0041 另一种诱人的 APMV 是 APMV3， 其可以作为第一或第二 APMV。因此， 本发明的另一 个更优选的实施方案涉及根据本发明的药物组合物， 其中第一 APMV 是 APMV3。 说 明 书 CN 102917717 A 6 5/12 页 7 0042 甚至更优选的是根据本发明的药物组合物， 其中第一 APMV 是新城疫病毒， 第二 APMV 是 APMV3， 反之亦可。因此， 本。

30、发明的一个甚至更优选的实施方案涉及根据本发明的药 物组合物， 其中第一 APMV 是新城疫病毒， 第二 APMV 是 APMV3。 0043 本发明的另一个这种甚至更优选的实施方案涉及根据本发明的药物组合物， 其中 第一 APMV 是 APMV3， 第二 APMV 是新城疫病毒。 0044 如上面所提及， 如果与非溶解性APMV相比， 溶解性APMV在较快杀死细胞的意义上 来说作用较快。因此， 优选 APMV 的一种或多种应当是溶解性 APMV。 0045 因此， 本发明的一个甚至更优选的实施方案涉及根据本发明的药物组合物， 其中 至少第一或第二 APMV 是溶解性的。 0046 该实施方案的。

31、最优选形式涉及根据本发明的药物组合物， 其中第一和第二 APMV 二者均是溶解性的。 0047 特别是在发达国家， 对罹患癌症的猫科动物和犬科动物的兴趣和爱护不断增加。 与人类似， 寿命的增加使这些动物中的癌症率增加。已经显示根据本发明的药物组合物在 猫科动物和犬科动物中疗效非常好。 0048 因此， 该实施方案的另一种形式是用于伴侣动物 （companion animals） 中的根据 本发明的药物组合物， 所述伴侣动物例如马科、 雪貂、 猫科和犬科动物物种。优选这种组合 物用于马科和犬科动物物种中， 更优选用于犬科动物物种中。 0049 如上面所示， 药物组合物当如此使用时具有超越已知抗癌。

32、症方法的显著优势。但 是仍然有理由将根据本发明的药物组合物与任何抗肿瘤药剂联合使用。 这种抗肿瘤药剂的 全面列表提供于例如美国专利申请 US2009/0208495 中。 0050 因此， 该实施方案的另一种形式涉及根据本发明的药物组合物， 其中在至少第一 或第二 APMV 施用期间， 共施用一定量的抗肿瘤药剂， 例如细胞毒性药物。 0051 第一和/或第二APMV可以是额外地携带异源基因或结合蛋白的重组APMV， 所述异 源基因例如编码使前体药物转化的酶。这种结合蛋白可以例如是抗体。这种基因的另一个 示例可以是编码携带免疫球蛋白结构域的融合蛋白的基因， 如 WO 2006/050984 中所。

33、描述。 0052 因此， 该实施方案的另一个形式是根据本发明的药物组合物， 其中至少第一或第 二 APMV 是携带额外基因的重组 APMV。 0053 根据本发明的药物组合物原则上应当包含药学上可接受的载体中的 APMV， 以使得 能够施用 APMV。载体的性质取决于 i.a. 施用途径。如果施用途径是通过吸入， 载体可以简 单地是无菌水、 生理盐水溶液或缓冲液。 如果优选途径是注射， 载体应当优选是等渗的并且 具有使其适于注射的 pH 限制。然而这种载体是本领域广泛已知的。 0054 本发明中使用的药学上可接受的载体的示例包括稳定剂 （例如 SPGA） 、 碳水化合物 （例如山梨醇、 甘露醇。

34、、 淀粉、 蔗糖、 葡萄糖、 右旋糖苷） 、 蛋白 （例如白蛋白和酪蛋白） 、 含有例 如胎牛血清或脱脂乳试剂的蛋白以及缓冲液 （例如磷酸盐缓冲液） 。特别是当疫苗中加入这 种稳定剂时， 疫苗非常适于冷冻干燥。 冷冻干燥是防止APMV失活的十分适宜的方法。 因此， 在一个更优选的形式中， 根据本发明的药物组合物是冻干形式的。 0055 携带异源基因的重组 APMV 可以 i.a. 通过描述用于很多非分段 （non-segmented） 负链 RNA 病毒的公知的逆向基因技术制备。参见例如 Conzelmann, J. Gen. Virol. 77: 381-389 (1996), Conzel。

35、mann, Ann. Rev. Genet. 32, 123-162 (1998), Palese 等， 说 明 书 CN 102917717 A 7 6/12 页 8 Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 11354-11358 (1996), Peeters 等， J. Virology 73: 5001-5009 (1999), Rmer-Oberdrfer 等， J. Gen virol. 80: 2987-2995 (1999)。 0056 实施例 ： 实施例 1 犬中不同低毒力 APMV 株的安全性和复制 1 简介 1.1 本实验的目的是评定低毒力禽副粘病毒 （AP。

36、MV） NDV Clone 30、 NDV Ulster 和 APMV3 在犬中是否是安全并且能够复制的。 0057 2 材料和方法 2.1 实验的简短概述 用活的低毒力NDV Clone 30、 NDV Ulster或APMV3通过口腔、 鼻腔、 眼部以及皮下途径 对 3 组比格犬 （每组 2 只动物） 进行接种， 如表 1“分组和剂量”中所示。将 4 只犬分成 3 组 （1-1-2） ， 用作接触对照 （contact control）（sentinel） 。在接种后第 3-6-9-13 和 15 天获 取口腔、 眼部和直肠拭子。鼻腔试子仅在接种后第 3 和 6 天获取。每周采集血液样品，。

37、 至接 种后 8 周。首次接种后第 6 周， 用 NDV Clone 30 或 APMV3 通过口腔、 鼻腔、 眼部以及皮下途 径对犬进行第 2 次接种 （参见表 1 “分组和剂量”） 。第 2 次接种后第 3 和 6 天， 获取口腔、 鼻 腔、 眼部和直肠拭子。拭子计划用于病毒再分离。第 1 次和第 2 次接种后第 3 和 6 天， 经由 膀胱采集尿液样品 （必要的话使用利尿剂） 。在每次接种后 14 天的期间内， 利用植入芯片测 量每只犬的体温。每日观察犬中疾病或其他异常的临床指征的出现情况。第 1 次接种后 8 周， 即第 2 次接种后 2 周， 对犬实施安乐死并进行肉眼研究。从胰脏、 。

38、脾脏、 肝脏、 肾脏、 脑、 心脏、 气管、 肺和腹股沟淋巴结中获取组织学样品。 0058 2.2 所使用的毒株 ： 活的 NDV Ulster ： - 9.7 log10 EID50/ml 活的 NDV Clone 30 ： - 9.5 log10 EID50/ml 活的 APMV3 ： - 8.7 log10 EID50/ml。 0059 表 1 ： 分组和剂量 说 明 书 CN 102917717 A 8 7/12 页 9 * 利用手动喷雾器进行鼻内接种。1 次吸入等于 72l。 0060 2.3 接种 在 T=0 时根据表 1 用活的 APMV 对犬进行接种。第 1 次接种后 6 周，。

39、 如表 1 中所示使动 物接受第 2 次接种。 0061 2.4 血液样品 每周从所有动物中采集用于进行血清学研究的血液样品， 直至 8 周。在第 1 次和第 2 次接种后 6 天而非 7 天采集血液样品 （已凝固并肝素化） 。接种前， 依照 SOP 5619.074 经由 颈静脉进行血液采样 （每只犬至少 4-5ml） 。利用血液样品 （已凝固） 确定 HI 和 IFT 的效价。 0062 2.5 HI 测定 通过血细胞凝集反应抑制 （HI） 试验确定 T=4、 T=6 和 T=8 周时 NDV 特异性抗体的血清 水平。 在微量滴定板中制备2倍系列稀释的血清， 并与含有8个血细胞凝集单位/5。

40、0l NDV 抗原的等体积混合。效价以对鸡红血球 （1%（体积 / 体积） ， 缓冲盐溶液中） 的血细胞凝集显 示完全抑制的最高稀释度的倒数表示。稀释度 1:2 时抑制血细胞凝集的样品视为是阳性 的。对每只经接种犬的血清对所有 3 种 APMV 的交叉反应性进行测试。 0063 2.6 IFT 测定 还通过免疫荧光测试 （IFT） 确定 T=4、 T=6 和 T=8 周时 NDV 特异性抗体的血清水平。 微量滴定板在 37 /5% CO2下用 RPMI 1640+ 标准抗生素混合物 +5% FCS 中的 100l/ 孔 1.5106/ml 鸡胚胎成纤维细胞 （CEF） “覆盖” 过夜。24 小。

41、时后， 用在 RPMI 1640+ 标准抗 生素混合物的培养基中以 1:100 稀释的 100l APMV 病毒 （NDV Clone 30、 NDV Ulster 或 APMV3） 替换培养基。24 小时后， 将板倒空， 并用 100l/ 孔的 96% 冰冻乙醇 （-70） 将被感 染的 CEFs 固定 30 分钟。在微量滴定板中制备 2 倍系列稀释的血清 （与几个 NDV 阳性和 NDV 阴性的鸡血清相邻） ， 将其加入到 （已清洗的） 经覆盖的板中， 并于 37温育 1 小时。随后对 板进行清洗 （3 次） ， 并与以 1:20 稀释的 FITC 标记的羊抗犬 IgG（H+L） 或羊抗鸡。

42、 IgG（H+L） 多克隆抗体温育。 于37温育1小时后， 对板进行清洗 （3次） ， 并在每孔中加入20l PBS/ 说 明 书 CN 102917717 A 9 8/12 页 10 甘油 （1:1） 。效价以显示特异性荧光信号的最高稀释度的倒数表示。效价 12 表示为 13 （log2） 。对每只经接种犬的血清对所有 3 种 APMV 的交叉反应性进行测试。 0064 2.7 拭子 第 1 次接种后在 T=3-6-9-13 和 15 天， 获取口腔、 眼部和直肠拭子。鼻腔拭子仅在第 1 次和第 2 次接种后第 3 和 6 天获取。第 2 次接种后第 3 和 6 天， 获取口腔、 鼻腔、 眼。

43、部和直肠 拭子。将拭子收集于加入了每毫升 1000U/1000g 青霉素 / 链霉素 （Pen/Strep） 的 2.5ml 2.5% 胰蛋白胨中 （储存于 -70） 。 0065 2.8 尿液 第 1 次和第 2 次接种后第 3 和 6 天， 经由膀胱获取尿液样品 （必要的话使用利尿剂） 。 0066 2.9 病毒再分离 通过用 0.1ml 未经稀释的样品材料接种 10 日龄含胚卵 （N=8） ， 进行病毒的再分离。孵 育4-6天后， 依照Spaerman和Kaerber的方法 （B. Bibrack and G. Whittmann, Editors, Virologische arbei。

44、tsmethoden, Fisher Verlag, Stuttgart (1974), pp. 3739中） 对所有卵中的尿囊液进行 HA 活性的测试。 0067 2.10 体温 在接种当天以及每次接种后 14 天的期间内， 利用植入芯片测量每只犬的体温。 0068 2.11 观察 每日观察动物中疾病或其他异常的临床指征的出现情况。 0069 2.12 组织学和病理学 实验结束时， 即第 1 次接种后 8 周 / 第 2 次接种后 2 周， 对所有犬实施安乐死并进行肉 眼研究。从胰脏、 脾脏、 肝脏、 肾脏、 脑、 心脏、 气管、 肺和腹股沟淋巴结中获取组织学样品。 0070 3 结果 说 。

45、明 书 CN 102917717 A 10 9/12 页 11 0071 3.1 NDV IF 和 HI 抗体效价 NDV IF抗体效价 ： 第1次接种后4周， 第1、 3和5组中能够检测到所接种APMV的抗体， 说 明 书 CN 102917717 A 11 10/12 页 12 表明这些 APMV 株在犬中复制并诱导产生抗体。由这些数据还清楚的是， 针对 NDV Ulster 产生的抗体与 NDV Clone 30 交叉反应， 反之亦然。APMV3 特异性抗体则不然， 其不与 NDV Ulster 或 NDV Clone 30 交叉反应。第 1 次接种后 6 周， 抗体效价与 4 周时的数。

46、据相当。有 趣的是， 第 2 次接种后 2 周 （T=6 周时犬接受第 2 次接种） ， 所有组中均能够检测到抗体效价 增加。这表明用活病毒进行第 2 次接种诱导了加强效应， 使得抗体效价由于病毒的复制而 增加。 0072 NDV HI 抗体效价 ： 由这些数据甚至更清楚的是， 用活病毒进行第 2 次接种诱导了 强烈的加强效应， 使得抗体效价很高。特别是在第 1 组和第 3 组中， 显然， 当与 T=4 周相比 时， T=6 周时抗体效价下降， 而第 2 次接种后 2 周， 抗体效价再次增加并且当与 T=4 周相比 时更高。这些数据还表明病毒在犬中复制。 0073 3.2 拭子和尿液样品 用第。

47、 1 次接种后第 3 和 6 天时收集的、 来自所有犬的口腔、 眼部和直肠拭子以及尿液样 品进行病毒的再分离。所有样品均评分为阴性。 0074 3.3 体温和观察 在接种当天以及每次接种后 14 天的期间内， 利用植入芯片测量每只犬的体温。未注意 到任何明显的温度变化。在实验期间， 没有明显观察到犬中出现疾病或其他异常的临床指 征。 0075 3.4 组织学和病理学 实验结束时， 对所有犬实施安乐死并进行肉眼研究。肉眼观察显示， 在第 5 组中的 1 只 犬中注意到脾脏上 3mm 厚的一大块白斑。这在显微镜下与病灶性中度急性囊下血肿一致。 犬中的脾脏血肿大多是源于创伤。尸检时， 所有其他动物未。

48、表现任何肉眼病变。从胰脏、 脾 脏、 肝脏、 肾脏、 脑、 心脏、 气管、 肺和腹股沟淋巴结中获取组织学样品。可以得出结论， 通过 鼻腔、 眼部和口服途径在犬中接种低毒力禽副粘病毒确实导致肺中的炎症病变， 特别是接 种 NDV Clone 30 和 NDV Ulster 的犬中。在 1 只接种 APMV3 的犬中注意到了胰脏炎症病变 和严重的大出血。 0076 结论 ： 1） NDV Clone 30、 NDV Ulster 和 APMV3 对犬具有感染性并且能够在犬中复制。 0077 2） 犬中未发现临床指征， 不能再分离出病毒。这表明在犬中使用这些病毒是安全 的。 0078 3） NDV 。

49、株和 APMV3 株之间不存在交叉免疫性。 0079 实施例 2 APMV3 在人肿瘤细胞株中的生长 细胞培养所使用的细胞 人结肠癌细胞株 CL188 所使用的培养基 CL188 ： RPMI 1640+10% FBS+1 标准抗生素混合物 +L- 谷氨酰胺 （L-glutamin） +2g/ml 两性 霉素 B（生长培养基） RPMI 1640+2% FBS+1 标准抗生素混合物 +2g/ml 两性霉素 B（保持培养基） 。 说 明 书 CN 102917717 A 12 11/12 页 13 0080 病毒株 ： 禽副粘病毒 3 型 9.7 log10 EID50/ml 卵来源 ： L11103 10 日龄含胚卵 L11203 11 日龄含胚卵 效价和 HA 测试 ： 胰蛋白胨 2.5% 青霉素 - 链霉素 5% 的鸡红血球 0.1M PBS 用 APMV3 接种细胞 。