降低胆固醇水平的脂质体 相关申请
本申请要求 2009 年 3 月 27 日提交的美国临时申请第 61/202,699 号的优先权， 在 此将该美国临时申请的全部内容并入本文。
技术领域
本申请总体上涉及脂质颗粒 ( 例如， 脂质体 )， 所述脂质颗粒本身作为治疗剂是有 用的或者所述脂质颗粒可用于递送药物和药物的递送方法， 并且， 具体而言， 本申请涉及使 用诸如脂质体之类的脂质颗粒递送药物的方法。 发明内容
本发明提供一种降低细胞胆固醇水平的方法， 所述方法包括将含有诸如脂质体或 胶束之类的脂质颗粒的组合物给药于有此需要的受治者， 所述脂质颗粒能够进入细胞。 附图说明 图 1 表示 a) 甲羟戊酸途径和类异戊二烯的合成以及 b) 不同治疗剂对不同细胞靶 标的影响。PP ＝焦磷酸盐， FTI ＝法呢基转移酶抑制剂， GGTI ＝香叶基香叶基转移酶抑制 剂， IPP ＝异戊基焦磷酸盐。
图 2 是下列脂质的示意图， A)22:6PE ； B)22:6PC ； C)PI ； D)PS ； E)DOPE ； F)CHEMS。
图 3 表示使用了抗肌动蛋白和抗 HMGCS 抗体的 22:6ER 脂质体处理的、 JC-1- 感染 的 Huh 7.5 细胞 (MOI ＝ 0.5) 的蛋白质印迹分析结果。
图 4 表示 22:6PE:22:6PC:PI:PS 处理的、 JC1 感染的 Huh7.5 细胞 (MOI ＝ 0.5) 中 游离胆固醇和总胆固醇的定量结果。
图 5 表示用 22:6 脂质体处理的 PHA 刺激的 PBMC 的定量结果。
图 6(A) 至图 6(E) 表示与用 22:6ER 脂质体处理了 16 天的 JC-1- 感染的 Huh 7.5 细胞 (MOI ＝ 0.02) 有关的数据。(A) 整个处理过程中 Huh 7.5 细胞中 JC-1 HCVcc 感染水 平。(B)JC-1 HCVcc 分泌。(C) 分泌的 JC-1 HCVcc 颗粒的感染性。(D) 细胞中游离的胆固 醇水平。(E) 细胞中酯化的胆固醇。数据代表来自两个独立的实验的一式三份样品的平均 值。
图 7 表示 22:6 ER 脂质体处理的 JC-1 HCVcc、 PEG 化的 22:6 ER 脂质体处理的 JC-1 HCVcc 以及未处理的 JC-1 HCVcc 的感染性数据， 所述 JC-1 HCVcc 用外源性胆固醇处理 ( 胆 固醇的最终浓度为 15μg/ml 和 150μg/ml)。
图 8 表示在用 JC-1 HCVcc 感染 (MOI ＝ 0.5) 之前用 22:6 ER 脂质体处理了 4 天 的未感染的 Huh 7.5 细胞的定量结果。
图 9(A) 显示用 22:6 ER 脂质体处理 4 天的过程中 HIV-1 的三种基因不同的初级 分离物 (LAI， 93UG067 和 93RW024) 的平均分泌。图 9(B) 显示 22:6 ER 脂质体处理的 PBMC 分泌的 HIV-1 的感染性。
图 10 显示未感染的 Huh 7.5 细胞的实验结果， 所述细胞在存在用于上调和下调脂 蛋白受体表达的药物 ( 分别为 SQ 和 25-HC) 的条件下在无血清完全 DMEM 中培养 24 小时。
图 11 显示在 Huh 7.5 细胞感染 1 小时的过程中， 将 22:6 puER 脂质体加至 HCVcc 病毒原液中的实验结果。 具体实施方式
术语的定义
除非另有说明， 单数形式 (“a” 或 “an” ) 是指一个 ( 一种 ) 或一个以上 ( 一种以 上 )。
如本文使用的术语 “病毒感染” 描述了疾病状态， 在所述疾病状态中， 病毒入侵健 康细胞， 使用所述细胞的再生机制以繁殖或复制并且最终溶解所述细胞， 导致细胞死亡， 释 放病毒颗粒并且通过新产生的子代病毒感染其他细胞。 一些病毒的潜在性感染也可能是由 病毒感染引起的。
如本文使用的术语 “治疗或预防病毒感染” 是指抑制特定病毒的复制， 抑制病毒传 播或防止病毒定居于其宿主中， 以及改善或缓解由病毒感染引起的疾病的症状。如果病毒 载荷降低， 死亡率和 / 或发病率降低， 那么认为所述治疗是治疗性的。
术语 “治疗剂” 是指药剂， 例如， 分子或化合物， 所述药剂可有助于治疗生理病症， 例如病毒感染或由此引起的疾病。
术语 “脂质体” 可被定义为含有脂质的双层结构的颗粒， 所述脂质体通常是球形双 层结构。术语 “脂质体” 包括单层脂质体和多层脂质体。本文所讨论的脂质体可包括由下 列缩写所表示的一种或一种以上脂质。
CHEMS 代表琥珀酸胆固醇单酯脂质。
DOPE 代表二油酰基磷脂酰基乙醇胺脂质。
DOPC 代表二油酰基磷脂酰基胆碱脂质。
PE 代表磷脂酰基乙醇胺脂质或其衍生物。
PEG-PE 代表与聚乙二醇 (PEG) 结合的 PE 脂质。PEG-PE 的一个实例可以是聚乙二 醇 - 二硬脂酰基磷脂酰基乙醇胺脂质。PEG 的 PEG 组分的分子量可不同。
Rh-PE 代表丽丝胺若丹明 B- 磷脂酰基乙醇胺脂质。
MCC-PE 代表 1， 2- 二油酰基 -sn- 甘油基 -3- 磷酸乙醇胺 -N-[4-(p- 马来酰亚胺基 甲基 ) 环己烷 - 羧酰胺 ] 脂质。
PI 代表磷脂酰肌醇脂质。
PS 代表磷脂酰丝氨酸脂质。
术语 “细胞内递送” 是指将包封的物质从脂质体递送进入任何细胞内腔室。
IC50 或 IC90( 抑制浓度 50 或 90) 是指用于达到使病毒感染分别降低 50％或 90％ 的治疗剂的浓度。
PBMC 代表外周血单核细胞。
sCD4 代表可溶的 CD4 分子。 “可溶的 CD4” 或 “sCD4” 或 “D1D2” 是指 CD4 分子或 其片段， 如本领域普通技术人员所理解的， 所述 CD4 分子或其片段在水溶液中并且可通过 改变 HIV Env 的构型来模拟天然的膜锚定的 CD4 的活性。可溶的 CD4 的一个实例是在如Salzwedel 等人， J.Virol.74 ： 326 333， 2000 中描述的双结构域可溶 CD4(sCD4 或 D1D2)。
MAb 代表单克隆抗体。
DNJ 代表脱氧野尻霉素。
NB-DNJ 代表 N- 丁基脱氧野尻霉素。
NN-DNJ 代表 N- 壬基脱氧野尻霉素。
BVDV 代表牛病毒性腹泻病毒。
HBV 代表乙型肝炎病毒。
HCV 代表丙型肝炎病毒。
HIV 代表人免疫缺陷病毒。
Ncp 代表非细胞病变。
Cp 代表细胞病变。
ER 代表内质网。
CHO 代表中国仓鼠卵巢细胞。
MDBK 代表马达氏牛肾细胞。
PCR 代表聚合酶链反应。 FOS 代表游离寡糖。
HPLC 代表高效液相色谱。
PHA 代表植物红血球凝集素。
FBS 代表胎牛血清。
TCID50 代表 50％组织培养物感染剂量。
ELISA 代表酶联免疫吸附分析。
IgG 代表免疫球蛋白。
DAPI 代表 4’ ， 6- 二脒基 -2- 苯基吲哚。
PBS 代表磷酸盐缓冲盐水。
LD 代表脂质小滴。
NS 代表非结构性。
“MOI” 是指感染复数。
DMEM 是指 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基。
相关文件
本 申 请 公 开 的 内 容 通 过 引 用 合 并 了 美 国 专 利 公 开 第 20080138351 号、 第 20090252785 号和第 20030124160 号的全部内容。
巨噬细胞和胆固醇代谢 ：
巨噬细胞像其他细胞 ( 除了肝细胞 ) 一样不能将胆固醇降解至任何可检测的程 度。因此， 细胞胆固醇含量基本上会是胆固醇摄入和胆固醇流出之间的平衡。将胆固醇递 送至细胞的两个主要机制可以是受体介导的摄取血浆低密度脂蛋白 (LDL) 和细胞内胆固 醇的生物合成。 递送胆固醇的这两个主要途径中的每一个可完全满足在缺乏胆固醇的情况 下细胞的需要， 并且可被高度调节 (Brown and Goldstein 1999， 完全引用内容请参见下面 参考文献部分的内容 )。 然而， 在一些病理生理学条件下， 例如炎症、 高血浆 LDL 浓度和氧化 应激可导致形成修饰的 ( 大多数是氧化的 )LDL(Steiberg， Parthasarathy 等人， 1989)。修
饰的 LDL 可与在若干细胞类型 ( 包括巨噬细胞 ) 上表达的清道夫受体 (SR) 相互作用。 修饰 的脂蛋白的摄取不以响应细胞胆固醇含量的方式被调节并且可导致过量的胆固醇不受控 制地递送至巨噬细胞 (Hajjar and Haberland 1997 ； Dhaliwal and Steinbrecher 2000)。 如果不通过增加胆固醇的流出来补偿， 那么这可导致胆固醇积累并且形成富脂泡沫细胞， 随后在动脉壁形成脂肪纹， 这是动脉粥样硬化斑块形成中最早期的步骤之一。富胆固醇巨 噬细胞也可以是动脉粥样硬化发病机制的其他要素的可能的起因， 所述其他要素例如， 炎 症长期存在， 平滑肌细胞的表型修饰以及细胞外基质蛋白的过量产生 (Lusis 2000)。过量 胆固醇可通过下调胆固醇生物合成以及 LDL 受体的表达来补偿。然而， 细胞通过降低 LDL 摄取和胆固醇生物合成来补偿由修饰的 LDL 递送的严重过量的胆固醇的能力可受到限制。 补偿过量的游离胆固醇的两种其他机制可以是合成胆固醇酯和胆固醇流出。 虽然合成胆固 醇酯可提供暂时的缓解， 但是胆固醇酯的连续产生可导致细胞内脂质小滴的过量积累。巨 噬细胞过量负载胆固醇可导致所述巨噬细胞凋亡和坏死， 这促使晚期动脉粥样硬化斑块的 核心坏死和钙化 (Tabas 2002 ； Tabas 2002)。
细胞中胆固醇生物合成的甲羟戊酸途径 ：
甲羟戊酸 - 类异戊二烯途径的第一步可包括通过 HMG-CoA 合成酶 (HMGCS) 的作用 从乙酰基 -CoA 通过乙酰乙酰基 CoA 合成 3- 羟基 -3- 甲基戊二酰基 (HMG)-CoA。HMG-CoA 还原酶 (HMGCR) 本质上是最高度调节的酶之一， HMG-CoA 还原酶 (HMGCR) 可催化 HMG-CoA 转 化为甲羟戊酸 (Goldstein and Brown 1990)。 已广泛研究了通过他汀类药物和双膦酸盐对 甲羟戊酸途径和下游类异戊二烯生物合成途径进行合理的治疗剂控制并且已发现上述合 理的治疗剂控制在多种疾病中是令人关注的且是革命性的选择 (Buhaescu and Izzedine 2007)。图 1 表示甲羟戊酸途径和类异戊二烯生物合成。也表示了一些关键治疗剂对其不 同的细胞靶标的作用。
胆固醇和病毒复制 ：
许多病毒可依赖胆固醇进行病毒复制。这些病毒包括但不限于 ： 属于疱疹病毒 科家族的病毒， 例如， 单纯疱疹病毒 ( 参见， 例如， Itzhaki and Wozniak 2006) 和艾伯斯 坦 - 巴尔病毒 ( 参见， 例如， Katzman and Longnecker 2003)， 所述单纯疱疹病毒可以是 HSV1 病毒或 HSV2 病毒 ； 属于正黏液病毒科家族的病毒， 例如流感病毒 ( 参见， 例如， Sun and Whittaker 2003)， 所述流感病毒可以是流感病毒 A、 流感病毒 B 或流感病毒 C ； 逆转录 酶病毒， 例如， 鼠白血病病毒 ( 参见， 例如， Beer， Pedersen 等人， 2005) 和人类免疫缺陷病毒 (HIV)( 参见， 例如， del Real 等人， 2000 ； Campbell， Crowe 等人， 2001)(HIV1 或 HIV2 病毒 ) ； 属于痘病毒科家族的病毒， 例如， 牛痘病毒 ( 参见， 例如， Chung， Huang 等人， 2005) ； 多瘤病毒 ( 参见， 例如， Kaur， Gopalakrishna 等人， 2004) ； 属于披膜病毒科家族的病毒， 例 如西门利克 (Semiliki) 森林病毒 ( 参见， 例如， Chatterjee， Eng 等人， 2002) ； 属于丝状病 毒科家族的病毒， 例如， 埃博拉病毒 ( 参见， 例如， Empig and Goldsmith 2002) 和马尔堡病 毒 ( 参见， 例如， Bavari， Bosio 等人， 2002) ； 属于黄病毒科家族的病毒， 包括属于黄病毒属 的病毒 ( 例如， 登革病毒 ( 参见， 例如， Reyes-del Valle， Chavez-Salinas 等人， 2005)) 和 属于丙型肝炎病毒属的病毒 ( 例如， 丙型肝炎病毒 (HCV)( 参见， 例如， Aizaki， Morikawa 等 人， 2008)) ； 属于副粘病毒科家族的病毒， 例如， 麻疹病毒 ( 参见， 例如， Manie， Debreyne 等 人， 2000) ； 以及属于肝脱氧核糖核酸病毒科家族的病毒， 例如， 乙型肝炎病毒 (HBV)( 参见，例如， Bremer， Bung 等人， 2009)。不是所有这些病毒可感染巨噬细胞， 这说明胆固醇需求不 限于特定细胞类型的感染。尽管普遍认为胆固醇可以是包装病毒的膜的重要成分， 但是令 人惊讶的是， 几乎不知道为什么胆固醇参与病毒复制以及胆固醇如何参与病毒复制。对胆 固醇在病毒复制中的作用的大多数认识可限于质膜中的脂筏、 富含神经鞘脂的微结构域和 富含胆固醇的微结构域的作用。若干包装的病毒可使用类筏结构域作为病毒组装的平台， 例如， HIV(Campbell， Crowe 等人， 2001)， 埃博拉病毒和马尔堡病毒 (Bavari， Bosio 等人， 2002)， 麻疹病毒 (Vincent， Gerlier 等人， 2000) 以及流感病毒 (Scheiffele， Rietveld 等 人， 1999 ； Leser and Lamb 2005)。基于发现了红血球凝集素在脂筏中聚集， 脂筏也可用作 病毒感染过程中的进入点， 如流感病毒所表现的 (Takeda， Leser 等人， 2003)。
胆固醇耗竭对 HIV 的作用 ：
胆固醇耗竭对 HIV 复制的作用也可以是间接的， 由响应细胞胆固醇含量变化和 / 或胆固醇合成速度变化的细胞代谢的多种变化引起。例如， 通过他汀类药物抑制胆固醇生 物合成可降低 HMG-CoA 还原酶的所有上游中间体的固定浓度， 包括那些蛋白质异戊二烯化 作用中所涉及的中间体 (Buhaescu and Izzedine 2007)。小 G 蛋白的异戊二烯化作用的 降低可导致抑制 Rho- 鸟苷三磷酸酶 (GTPase) 和 Rho-A 活化， 这使得病毒进入减少 (del Real， Jimenez-Baranda 等人， 2004)。此外， 他汀类药物可具有不依赖于其对胆固醇生物 合成的作用的多重有益作用， 所述多重有益作用可降低 HIV 感染。这些作用可包括由他汀 类药物抑制粘附分子表达的能力 (Jain and Ridker 2005) 或抑制诸如 ICAM-1 和 LFA-1 之类的受体 - 配体对在内皮细胞和白细胞上的相互作用 (Nishibori， K.Takahashi 等人， 2003) 的能力而产生的抗炎性质。通过他汀类药物抑制 ICAM-1 和 LFA-1 的相互作用可减 少 HIV 粘附至细胞 (Giguere and Tremblay 2004)。许多研究已调查了胆固醇在 HIV 生命 周期中的作用。在脂筏处出现 HIV-1 从宿主细胞中出芽， 这导致较高的病毒包膜的胆固醇 与磷脂的摩尔比例 ( ＞ 1.0)(Aloia， Tian 等人， 1993 ； Nguyen and Hildreth， 2000)。与 筏的这种亲和性可由 Gag 前体确定， 所述亲和性尤其可与这些膜的结构域相关 (Ono and Freed 2001 ； Ding， Derdowski 等人， 2003 ； Holm， Weclewicz 等人 2003)。脂筏结合可由 Gag 的 N- 末端介导并且可通过 Gag-Gag 相互作用结构域显著增强。细胞胆固醇的耗竭和筏数 量的减少可显著地并且特异性地降低 HIV-1 颗粒的产量 (Ono and Freed 2001)。除了上 述降低胆固醇的药物对 HIV 进入的间接作用之外， 一些研究还提出脂筏作为 HIV 进入点 的作用。该模型依赖于 CD4、 HIV 细胞受体以及趋化因子受体在 HIV 进入位点的共帽现象 (Alfano， Schmidtmayerova 等人， 1999)， 所述模型也可依赖于胆固醇 (Nguyen， Giri 等人， 2005)。Viard 和其他人的研究 (Viard， Parolini 等人， 2002) 说明胆固醇耗竭的细胞不能 形成病毒 - 细胞融合必需的 CD4 和 CXCR4( 或 CCR5) 簇。Manes 等人也报道了类似的观察 结果 ( del Real 等人， 2000)， Manes 等人提出了对 gp-120 诱导的筏的横向重组 作用， 该作用使 CD4-gp120 复合物与筏相关趋化因子受体集中在一起。然而， 后来的报道 显示 CD4 和趋化因子受体与筏的结合可能不是 HIV 感染所必需的 (Percherancier， Lagane 等人， 2003 ； Popik and Alce 2004)。对这些发现结果的一般解释可能是许多研究使用过 表达 HIV 受体的细胞来进行。这些细胞通常可具有与原代细胞不同的行为， 如先前对从趋 化因子受体发出的信号所证明的， 这些细胞可以是 HIV 进入原代细胞所必需的 (Alfano， Schmidtmayerova 等人 1999)。所有这些文章在以下方面意见一致 ： HIV 进入依赖于靶细胞膜中的胆固醇， 因为胆固醇耗竭抑制了由筏相关 CD4 以及筏排除 CD4 介导的 HIV 进入 (Popik and Alce 2004)。
胆固醇在 HIV 病毒粒子的感染性方面的重要性通过实验来证明， 在实验中， 用螯 合胆固醇的药物 ( 例如， MβCD) 处理 HIV 颗粒使得病毒不能进入细胞 (Campbell， Crowe 等 人 2002 ； Guyader， Kiyokawa 等人 2002)。胆固醇耗竭的 HIV-1 病毒粒子可显示出病毒粒子 脂质双层的瓦解 (Campbell， Crowe 等人 2002)， 还可显示出正常水平的 gp120Env(Guyader， Kiyokawa 等人 2002)。 一个研究表明 MβCD 可渗透病毒膜， 导致成熟的 Gag 蛋白 ( 衣壳基质 和 p6) 损失而不损失 Env 糖蛋白 (Graham， Chertova 等人 2003)。电子显微镜揭示了胆固醇 耗竭的病毒粒子的病毒膜内的孔以及病毒核心结构的扰动 (Graham， Chertova 等人 2003)。
HIV 和动脉粥样硬化 ：
HIV 感染可持续地与形成动脉粥样硬化的风险增加有关 (Hsue， Lo 等人 2004 ； van Wijk， de Koning 等人 2006) 并且与冠状动脉疾病 (CAD) 的风险增加至少三倍有关 (Hsue and Waters 2005)。这种相关性先前仅归因于抗逆转录病毒疗法的不良作用。虽然胆固 醇代谢产生的许多变化 ( 例如 LDL 提高 (El-Sadr， Mulli 等人 2005) 以及通过 CD36 表 达诱导胆固醇摄入增加 (Allred， Smart 等人 2006)) 可能是由抗逆转录病毒疗法引起的 (Carpentier， Patterson 等人 2005)， 但是所述疗法和 HIV 感染本身对胆固醇代谢变化的相 对贡献还有待确定。 初期研究可说明 HIV 感染本身可对 CAD 风险的增加起关键作用。 HIV 可 感染巨噬细胞并且减少这些细胞中的逆向胆固醇输送。 减少胆固醇从巨噬细胞中流出可导 致细胞内胆固醇积累 (Feng and Tabas 2002) 并且在动物模型 (Aiello， Brees 等人 2002) 和人体内 (Oram 2000) 形成动脉粥样硬化。当与血脂异常相关时， 该过程可以是特别快速 的。这可说明当与抗逆转录病毒疗法引起的血脂异常相关时， HIV 感染巨噬细胞可导致胆 固醇在巨噬细胞内积累并且快速形成动脉粥样硬化。
细胞胆固醇和 HCV ：
HCV 感染主要限于肝细胞 (Chisari 2005)， 肝细胞可能在哺乳动物胆固醇体内平 衡方面起到重要作用。已表明 CD81(Soldaini， Wack 等人 2003 ； Cherukuri， Shoham 等人 2004) 和 SR-BI(Rhainds， Bourgeois 等人 2004) 定位于富含胆固醇的质膜微结构域 ( 或脂 筏 )， 这两个细胞受体是 HCV 进入细胞所必需的。SR-BI 可与称为小凹 (caveolae) 的富含 胆固醇的质膜微结构域结合 (Babitt， Trigatti 等人， 1997 ； Graf， Connell 等人， 1999)。已 表明 CD81 与胆固醇相互作用 (Charrin， Manié 等人 2003)， 该作用为物理作用。 虽然目前还 不知道 HCV 感染对细胞胆固醇的依赖， 但是 HCVpp 与脂质体的融合可通过目标膜中胆固醇 的存在来提高 (Lavillette， Bartosch et al.2006)。这些数据可有力地说明质膜胆固醇 可以是 HCV 进入所必需的。已表明 HCV 感染可依赖于 CD81 和 SR-BI 之间的协作相互作用 以及细胞胆固醇含量可对 HCV 进入产生非常大的影响， 可能通过调节细胞表面表达和 CD81 定位来影响 (Kapadia， Barthet al.2007)。
目前的研究已表明胆固醇和神经鞘脂在 HCV 感染和病毒粒子成熟方面的重要作 用。具体而言， 成熟的 HCV 颗粒可富含胆固醇 (Aizaki， Morikawa 等人 2008)。HCV 耗竭或 病毒粒子相关 SM 的水解导致感染性损失 (Aizaki， Morikawa 等人 2008)。而且， 加入外源 性胆固醇可恢复感染性。此外， 部分结构蛋白质可位于细胞内脂筏样膜结构 (Aizaki， Lee 等人 2004)。公开的内容
本发明的发明人发现诸如脂质体之类的脂质颗粒可通过下调胆固醇的生物合成 途径中所涉及的第一批酶中的一个 (HMGCS) 来抑制胆固醇的生物合成， 所述脂质颗粒能够 进入细胞和 / 或细胞内递送包封在该颗粒内部的物质。
在一些实施方式中， 所述脂质颗粒可包含至少一种 PE 脂质和 / 或其衍生物。 PE 脂 质衍生物的例子包括 DOPE 和结合的 PE 脂质。所述结合的 PE 脂质可包括与诸如聚乙二醇 之类的亲水性聚合物结合的 PE 脂质和与诸如荧光标记物之类的标记物结合的 PE 脂质。所 述 PE 脂质可以是单饱和的或多饱和的。
在一些实施方式中， 所述脂质颗粒可包括一种或一种以上 PI 脂质、 PS 脂质、 PC 脂 质和 CHEMS 脂质， 其中的每一种可以是单饱和的或多饱和的。
在一些实施方式中， 所述脂质颗粒可包含一种或一种以上与诸如聚乙二醇之类的 亲水性聚合物结合的脂质。亲水性聚合物的分子量可不同。结合的亲水性聚合物的使用可 增加脂质颗粒的体内稳定性和循环时间。
在一些实施方式中， 能够抑制胆固醇的脂质颗粒可以是含有 PE 脂质和 / 或其衍生 物以及 CHEMS 脂质的脂质颗粒， 例如美国专利公开第 20080138351 号中公开的 pH 敏感脂质 体。例如， 这样的脂质颗粒可以是摩尔比为 6 ∶ 4 或 6 ∶ 3 的 DOPE-CHEMS 脂质体或摩尔比 为 6 ∶ 3 ∶ 0.1 的 DOPE ∶ CHEMS ∶ PEG-PE。 在一些实施方式中， 能够抑制胆固醇的脂质颗粒可以是含有 PE 脂质和 / 或其衍生 物以及 PI 和 / 或 PS 脂质的脂质颗粒。这些脂质颗粒的例子包括 2009 年 3 月 25 日提交的 美国专利申请第 12/410,750 号中公开的靶定 ER 的脂质体。在一些实施方式中， 所述脂质 颗粒可以是包括 PE 脂质、 PI 脂质、 PS 脂质和 PC 脂质的脂质颗粒， PE 脂质、 PI 脂质、 PS 脂 质和 PC 脂质中的每一种可以是单饱和的或多饱和的。
在一些实施方式中， 能够抑制胆固醇的脂质颗粒可以是多不饱和脂质颗粒， 即， 包 括至少一种多不饱和脂质的脂质颗粒。本文使用的术语 “多不饱和脂质” 是指疏水尾端中 含有一个以上不饱和化学键的脂质， 所述不饱和化学键例如双键或三键。在一些实施方式 中， 所述多不饱和脂质在其疏水尾端中可具有 2 个至 8 个或 3 个至 7 个或 4 个至 6 个双键。 多不饱和脂质颗粒在美国专利公开第 20090252785 号中公开。多不饱和脂质的例子在美国 专利公开第 20090252785 号的图 2A 至图 2B 以及图 22A 至图 22D 中显示。
靶定部分
在一些实施方式中， 含有所述脂质颗粒的组合物可包含至少一种靶定部分， 所述 靶定部分可与脂质颗粒结合或插入所述颗粒的脂质层或脂质双层。在一些实施方式中， 所 述靶定部分可以是配体或抗体， 所述配体可以是病毒包膜蛋白的配体， 所述抗体可以是抗 病毒包膜蛋白的抗体。这样的部分可用于将所述颗粒靶定至受病毒感染的细胞。这样的靶 定部分也可用于实现抗与病毒相关或由病毒引起的病毒感染的消除性免疫。 在一些实施方 式中， 所述靶定部分可包含 gp120/gp41 靶定部分。在这种情况下， 含有所述脂质颗粒的组 合物可优选地用于治疗和 / 或预防 HIV-1 感染。所述 gp120/gp41 靶定部分可包含 sCD4 分 子或单克隆抗体， 例如 IgG 2F5 或 IgG b12 抗体。在一些实施方式中， 所述靶定部分可包含 E1 或 E2 靶定部分， 例如来自 HCV 的 E1 或 E2 蛋白。在这种情况下， 含有所述脂质颗粒的组 合物可优选地用于治疗和 / 或预防 HCV 感染。在一些情况下， 靶定部分也可以是可靶定 E1
和 / 或 E2 蛋白的分子 ( 例如这些蛋白质的特异性抗体 ) 以及细胞受体的可溶性部分 ( 例 如可溶性 CD81 或 SR-BI 分子 )。
活性剂
在一些实施方式中， 诸如治疗剂或显像剂之类的至少一种药剂可被包封在所述脂 质颗粒的内部。这样的药剂可以是例如水溶性分子、 肽或氨基酸。
在一些实施方式中， 包封在所述脂质颗粒内部的药剂可以是 α- 葡糖苷酶抑制 剂。在一些实施方式中， 所述 α- 葡糖苷酶抑制剂可以是 ER α- 葡糖苷酶抑制剂， 所述 ER α- 葡糖苷酶抑制剂可以是 I 型 ER α- 葡糖苷酶抑制剂或 II 型 ER α- 葡糖苷酶抑制剂。 一般来说， 依赖于与钙联结蛋白和 / 或钙网织蛋白的相互作用进行病毒的包膜糖蛋白的正 确折叠的任何病毒可被 ER α- 葡糖苷酶抑制剂靶定。
所述 α- 葡糖苷酶抑制剂可以是抑制宿主 α- 葡糖苷酶的酶活性的药剂， 与不存 在所述药剂的条件下的 α- 葡糖苷酶的酶活性相比， 所述 α- 葡糖苷酶抑制剂抑制至少 约 10％、 至少约 15％、 至少约 20％、 至少约 25％、 至少约 30％、 至少约 35％、 至少约 40％、 至少约 50％、 至少约 60％、 至少约 70％、 至少约 80％、 至少约 90％或更高的酶活性。术语 “α- 葡糖苷酶抑制剂” 包含天然生成的抑制宿主 α- 葡糖苷酶活性的药剂和合成的抑制宿 主 α- 葡糖苷酶活性的药剂。
合适的 α- 葡糖苷酶抑制剂可包括但不限于 ： 脱氧野尻霉素和 N- 取代脱氧野尻霉 素， 例如式 I 的化合物及其药学上可接受的盐 ：其中， R1 选自 ： 取代或未取代的烷基， 所述烷基可以是支链或直链烷基 ； 取代或未 取代的环烷基 ； 取代或未取代的芳基 ； 取代或未取代的氧杂烷基 ； 取代或未取代的芳基烷 基， 环烷基烷基， 并且， 其中， W、 X、 Y、 Z 分别独立地选自氢、 烷酰基、 芳酰基和卤代烷酰基。
在一些实施方式中， R1 可选自 ： C1-C20 烷基或 C3-C20 烷基。
在一些实施方式中， R1 可选自 ： 乙基、 丙基、 异丙基、 丁基、 异丁基、 叔丁基、 戊基、 新 戊基、 异戊基、 n- 己基、 庚基、 n- 辛基、 n- 壬基和 n- 癸基。在一些实施方式中， R1 可以是丁 基或壬基。
在一些实施方式中， R1 可以是烷氧基 (oxalkyl)， R1 可以是 C1-C20 烷基或 C3-C12 烷基， R1 还可包括 1 至 5 个或 1 至 3 个或 1 至 2 个氧原子。烷氧基的例子包括 -(CH2)2O(CH -(CH2)2O(CH2)6CH3、 -(CH2)6OCH2CH3 和 -(CH2)2OCH2CH2CH3。 2)5CH3、
在一些实施方式中， R1 可以是芳基烷基。芳基烷基的例子包括 C1-C12-Ph 基团， 例 如， C3-Ph、 C4-Ph、 C5-Ph、 C6-Ph 和 C7-Ph。
在一些实施方式中， 式 I 的化合物可选自但不限于 ： N-(n- 己基 -)-1， 5- 双脱
氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(n- 庚基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(n- 辛基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(n- 辛基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(n- 壬基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 四丁酸酯 ； N-(n- 癸基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(n- 十一烷 基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(n- 壬基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(n- 癸基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(n- 十一 烷基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(n- 十二烷基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚 氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(2- 乙基己基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(4- 乙基 己基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(5- 甲基己基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨 基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(3- 丙基己基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(1- 戊基戊 基己基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(1- 丁基丁基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚 氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(7- 甲基辛基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(8- 甲 基壬基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(9- 甲基癸基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(10- 甲基十一烷基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(6- 环己基己基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(4- 环己基丁基 )-1， 5- 双 脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(2- 环己基乙基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄 糖醇 ； N-(1- 环己基甲基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(1- 苯基甲基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(3- 苯基丙基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡 萄糖醇 ； N-(3-(4- 甲基 )- 苯基丙基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(6- 苯 基己基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇 ； N-(n- 壬基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚 氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(n- 癸基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁 酸酯 ； N-(n- 十一烷基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(n- 十二烷 基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(2- 乙基己基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(4- 乙基己基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖 醇四丁酸酯 ； N-(5- 甲基己基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(3- 丙 基己基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(1- 戊基戊基己基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(1- 丁基丁基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨 基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(7- 甲基辛基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四 丁酸酯 ； N-(8- 甲基壬基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(9- 甲基 癸基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(10- 甲基十一烷基 )-1， 5- 双 脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(6- 环己基己基 -)-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨 基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(4- 环己基丁基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四 丁酸酯 ； N-(2- 环己基乙基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(1- 环己 基甲基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(1- 苯基甲基 )-1， 5- 双脱 氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； N-(3- 苯基丙基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡 萄糖醇四丁酸酯 ； N-(3-(4- 甲基 )- 苯基丙基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四 丁酸酯 ； N-(6- 苯基己基 )-1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 葡萄糖醇四丁酸酯 ； 其药学上可 接受的盐 ； 及其任何两个或两个以上的混合物。N- 取代的脱氧野尻霉素对其有效的疾病 和病症在下列专利文献中公开， 美国专利第 4,849,430 号、 第 4,876,268 号、 第 5,411,970号、 第 5,472,969 号、 第 5,643,888 号、 第 6,225,325 号、 第 6,465,487 号、 第 6,465,488 号、 第 6,515,028 号、 第 6,689,759 号、 第 6,809,083 号、 第 6,583,158 号、 第 6589,964 号、 第 6,599,919 号、 第 6,916,829 号、 第 7,141,582 号、 2010 年 2 月 22 日提交的美国专利申请第 12/656,993 号、 2010 年 2 月 22 日提交的美国专利申请第 12/656,992 号、 2010 年 2 月 22 日 提交的美国临时专利申请第 61/282,507 号、 2009 年 9 月 4 日提交的美国临时专利申请第 61/272,253 号、 2009 年 9 月 4 日提交的美国临时专利申请第 61/272,252 号、 2009 年 6 月 12 日提交的美国临时专利申请第 61/186,614 号、 2010 年 2 月 22 日提交的美国临时专利申 请第 61/282,508 号、 2009 年 9 月 4 日提交的美国临时专利申请第 61/272,254 号。N- 取代 的脱氧野尻霉素对其有效的疾病和病症包括但不限于 ： HIV 感染、 包括丙型肝炎感染和乙 型肝炎感染在内的肝炎感染、 包括泰 - 萨氏病、 戈谢病、 克拉伯病和法布里病在内的溶酶体 脂质储存疾病以及囊性纤维化。 N- 取代的脱氧野尻霉素对其有效的疾病和病症还包括由登 革病毒引起的或与登革病毒有关的病毒感染， 由属于砂粒病毒科家族的病毒 ( 例如皮钦德 病毒或胡宁病毒 ) 引起的或与属于砂粒病毒科家族的病毒 ( 例如皮钦德病毒或胡宁病毒 ) 有关的病毒感染， 由属于痘病毒科家族的病毒 ( 例如牛痘病毒 ) 引起的或与属于痘病毒科 家族的病毒 ( 例如牛痘病毒 ) 有关的病毒感染， 由属于丝状病毒科家族的病毒 ( 例如埃博 拉病毒和马尔堡病毒 ) 引起的或与属于丝状病毒科家族的病毒 ( 例如埃博拉病毒和马尔堡 病毒 ) 有关的病毒感染， 由属于本扬病毒科家族的病毒 ( 例如裂谷热病毒 ) 引起的或与属 于本扬病毒科家族的病毒 ( 例如裂谷热病毒 ) 有关的病毒感染， 由属于披膜病毒科家族的 病毒 ( 例如基孔肯亚病毒和委内瑞拉马脑膜炎病毒 ) 引起的或与属于披膜病毒科家族的病 毒 ( 例如基孔肯亚病毒和委内瑞拉马脑膜炎病毒 ) 有关的病毒感染， 由属于正黏液病毒科 家族的病毒 ( 例如 A 型流感病毒 ) 引起的或与属于正黏液病毒科家族的病毒 ( 例如 A 型流 感病毒 ) 有关的病毒感染， 所述 A 型流感病毒包括 H1N1 和 H3N2 亚型。
在一些实施方式中， 所述 α- 葡糖苷酶抑制剂可以是 N- 氧杂烷基化的脱氧野尻霉 素或 N- 烷氧基脱氧野尻霉素， 例如， 美国专利第 4,639,436 号中描述的 N- 羟基乙基 DNJ( 米 格列醇 (Miglitol) 或 Glyset )。
在一些实施方式中， 所述 α- 葡糖苷酶抑制剂可以是栗精胺和 / 或栗精胺衍生物， 例如美国专利申请第 2006/0194835 号中公开的式 (I) 的化合物及其药学上可接受的盐， 包 括 6-O- 丁酰基栗精胺 ( 西戈斯韦 ) 和 PCT 公开 WO01054692 中公开的式 II 的化合物及其 药学上可接受的盐。
栗精胺及其衍生物对其有效的疾病和病症在下列专利文献中公开， 美国专利 第 4,792,558 号、 第 4,837,237 号、 第 4,925,796 号、 第 4,952,585 号、 第 5,004,746 号、 第 5,214,050 号、 第 5,264,356 号、 第 5,385,911 号、 第 5,643,888 号、 第 5,691,346 号、 第 5,750,648 号、 第 5,837,709 号、 第 5,908,867 号、 第 6,136,820 号、 第 6,583,158 号、 第 6,589,964 号、 第 6,656,912 号以及美国专利公开第 20020006909 号、 第 20020188011 号、 第 20060093577 号、 第 20060194835 号、 第 20080131398 号。栗精胺及其衍生物对其有效的疾 病和病症包括但不限于 ： 包括 HIV 感染在内的逆转录酶病毒感染 ； 脑型疟疾 ； 包括乙型肝炎 感染和丙型肝炎感染在内的肝炎感染 ； 糖尿病以及溶酶体储存疾病。
在一些实施方式中， 所述 α- 葡糖苷酶抑制剂可以是阿卡波糖 (O-4， 6- 双脱 氧 -4-[[(1S， 4R， 5S， 6S)-4， 5， 6- 三羟基 -3-( 羟基甲基 )-2- 环己 -1- 基 ] 氨基 ]-α-D- 吡喃葡萄糖基 -(1 → 4)-O- → -D- 吡喃葡萄糖基 -(1 → 4)-D- 葡萄糖 ) 或 Precose 阿卡 波糖在美国专利第 4,904,769 号中公开。在一些实施方式中， 所述 α- 葡糖苷酶抑制剂可 以是阿卡波糖的高度纯化的形式 ( 参见， 例如， 美国专利第 4,904,769 号 )。
在一些实施方式中， 包封在脂质体内部的药剂可以是离子通道抑制剂。在一些实 施方式中， 所述离子通道抑制剂可以是抑制 HCVp7 蛋白质活性的药剂。离子通道抑制剂及 其识别方法在美国专利公开第 2004/0110795 中详细描述。合适的离子通道抑制剂包括式 I 的化合物及其药学上可接受的盐， 包括 N-(7- 氧杂 - 壬基 )-1， 5， 6- 三脱氧 -1， 5- 亚氨 基 -D- 半乳糖醇 (N-7- 氧杂 - 壬基 6-MeDGJ 或 UT231B) 和 N-10- 氧杂十一烷基 -6-MeDGJ。 合适的离子通道抑制剂还包括但不限于 ： N- 壬基脱氧野尻霉素、 N- 壬基脱氧半乳糖野尻霉 素和 N- 氧杂壬基脱氧半乳糖野尻霉素。
在一些实施方式中， 包封在脂质体内部的药剂可以是亚氨基糖。合适的亚氨基糖 包括天然生成的亚氨基糖和合成的亚氨基糖。在一些实施方式中， 所述亚氨基糖可以是脱 氧野尻霉素或 N- 取代的脱氧野尻霉素的衍生物。合适的 N- 取代的脱氧野尻霉素的衍生物 的例子包括但不限于本申请式 II 的化合物， 美国专利第 6,545,021 号中的式 I 的化合物 以及 N- 氧杂烷基化的脱氧野尻霉素， 例如美国专利第 4,639,436 号中描述的 N- 羟基乙基 DNJ( 米格列醇或 Glyset )。
在一些实施方式中， 所述亚氨基糖可以是栗精胺或栗精胺的衍生物。合适的栗精 胺衍生物包括但不限于 ： 美国专利申请第 2006/0194835 号中公开的式 (I) 的化合物及其 药学上可接受的盐以及 PCT 公开 WO01054692 中公开的式 II 的化合物及其药学上可接受的 盐。
在一些实施方式中， 所述亚氨基糖可以是脱氧半乳糖野尻霉素或其 N- 取代的衍 生物， 例如在 PCT 公开 WO99/24401 和 WO01/10429 中所公开的那些。合适的 N- 取代脱氧半 乳糖野尻霉素衍生物的例子包括但不限于 ： N- 烷基化的脱氧半乳糖野尻霉素 (N- 烷基 -1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 半乳糖醇 )( 例如 N- 壬基脱氧半乳糖野尻霉素 ) 和 N- 氧杂 - 烷 基化的脱氧半乳糖野尻霉素 (N- 氧杂 - 烷基 -1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 半乳糖醇 )( 例 如， N-7- 氧杂壬基脱氧半乳糖野尻霉素 )。
在一些实施方式中， 所述亚氨基糖可以是 N- 取代的 1， 5， 6- 三脱氧 -1， 5- 亚氨 基 -D- 半乳糖醇 (N- 取代的 MeDGJ)， 包括但不限于式 II 的化合物 ：
其中， R 选自 ： 取代或未取代的烷基， 取代或未取代的环烷基， 取代或未取代的杂 环基， 或者取代或未取代的氧杂烷基。在一些实施方式中， 取代或未取代的烷基和 / 或取代 或未取代的氧杂烷基包含 1 至 16 个碳原子或 4 至 12 个碳原子或 8 至 10 个碳原子。在一 些实施方式中， 取代或未取代的烷基和 / 或取代或未取代的氧杂烷基包含 1 至 4 个氧原子，
以及在其他实施方式中， 取代或未取代的烷基和 / 或取代或未取代的氧杂烷基包含 1 至 2 个氧原子。在其他实施方式中， 取代或未取代的烷基和 / 或取代或未取代的氧杂烷基包含 1 至 16 个碳原子和 1 至 4 个氧原子。因此， 在一些实施方式中， R 选自但不限于 ： -(CH2)6OCH -(CH2)6OCH2CH3、 -(CH2)6O(CH2)2CH3、 -(CH2)6O(CH2)3CH3、 -(CH2)2O(CH2)5CH3、 -(CH2)2O(CH2)6CH3 3、 和 -(CH2)2O(CH2)7CH3。N- 取代 MeDGJ 在例如 PCT 公开 WO01/10429 中公开。
在一些实施方式中， 包封在脂质体内部的药剂可包括具有式 III 的含氮化合物或 其药学上可接受的盐 ：
其中， R12 是烷基， 例如 C1-C20 或 C1-C6 或 C7-C12 或 C8-C16 并且还可含有 1 至 5 个或 12 1 至 3 个或 1 至 2 个氧， R 可以是氧取代的烷基衍生物。氧取代的烷基衍生物的例子包括 3- 氧杂壬基、 3- 氧杂癸基、 7- 氧杂壬基和 7- 氧杂癸基。 R2 是氢， R3 是羧基或 C1-C4 烷氧基羰基或 R2 和 R3 连在一起为 或 -(CXY)n-，
其中， n 为 3 或 4， X 分别独立地为氢、 羟基、 氨基、 羧基、 C1-C4 烷基羧基、 C1-C4 烷基、 C1-C4 烷 氧基、 C1-C4 羟基烷基、 C1-C6 酰氧基或芳酰氧基， 以及， Y 分别独立地为氢、 羟基、 氨基、 羧基、 C1-C4 烷基羧基、 C1-C4 烷基、 C1-C4 烷氧基、 C1-C4 羟基烷基、 C1-C6 酰氧基、 芳酰氧基或缺失 ( 即， 不存在 ) ；
R4 为氢或缺失 ( 即， 不存在 ) ； 并且
R5 为氢、 羟基、 氨基、 取代氨基、 羧基、 烷氧基羰基、 氨基羰基、 烷基、 芳基、 芳烷基、 3 5 4 烷氧基、 羟基烷基、 酰氧基或芳酰氧基或者 R 和 R 连在一起形成苯基且 R 缺失 ( 即， 不存 在 )。
在一些实施方式中， 所述含氮化合物具有下列化学式 ：
其中， R6-R10 中的每一个独立地选自 ： 氢、 羟基、 氨基、 羧基、 C1-C4 烷基羧基、 C1-C4 烷 11 基、 C1-C4 烷氧基、 C1-C4 羟基烷基、 C1-C4 酰氧基和芳酰氧基 ； 并且 R 是氢或 C1-C6 烷基。含 氮化合物可以是 N- 烷基化的哌啶， N- 氧杂 - 烷基化哌啶， N- 烷基化吡咯烷， N- 氧杂 - 烷 基化吡咯烷， N- 烷基化苯胺， N- 氧杂 - 烷基化苯胺， N- 烷基化吡啶， N- 氧杂 - 烷基化吡啶， N- 烷基化吡咯， N- 氧杂 - 烷基化吡咯， N- 烷基化氨基酸或 N- 氧杂 - 烷基化氨基酸。在一 些实施方式中， N- 烷基化哌啶， N- 氧杂 - 烷基化哌啶， N- 烷基化吡咯烷或 N- 氧杂 - 烷基化 吡咯烷化合物可以是亚氨基糖。 例如， 在一些实施方式中， 所述含氮化合物可以是具有如下 化学式的 N- 烷基 -1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 半乳糖醇 (N- 烷基 -DGJ) 或 N- 氧杂 - 烷 基 -1， 5- 双脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 半乳糖醇 (N- 氧杂 - 烷基 -DGJ) ；
或者是具有如下化学式的 N- 烷基 -1， 5， 6- 三脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 半乳糖醇 (N- 烷基 -MeDGJ) 或 N- 氧杂 - 烷基 -1， 5， 6- 三脱氧 -1， 5- 亚氨基 -D- 半乳糖醇 (N- 氧杂 - 烷 基 -MeDGJ)。
除非明确指明碳原子的数目， 本文所使用的基团具有如下特征。烷基具有 1 至 20 个碳原子并且为直链或支链的， 取代或未取代的。烷氧基具有 1 至 16 个碳原子并且为直链 或支链的， 取代或未取代的。烷氧基羰基为具有 2 至 16 个碳原子的酯基。烯氧基具有 2 至 16 个碳原子， 1 至 6 个双键并且为直链或支链的， 取代或未取代的。炔氧基具有 2 至 16 个 碳原子， 1 至 3 个三键并且为直链或支链的， 取代或未取代的。芳基具有 6 至 14 个碳原子 ( 例如， 苯基 ) 并且为取代或未取代的。芳烷氧基 ( 例如， 苄氧基 ) 和芳酰氧基 ( 例如， 苯甲 酰氧基 ) 具有 7 至 15 个碳原子并且为取代或未取代的。
氨基可以是一级氨基， 二级氨基， 三级氨基或季胺基 ( 即， 取代的氨基 )。 氨基羰基 为具有 1 至 32 个碳原子的酰胺基 ( 例如， 取代的氨基 )。取代的基团可包括选自卤素、 羟 基、 C1-10 烷基、 C2-10 烯基、 C1-10 酰基或 C1-10 烷氧基的取代基。
N- 烷基化的氨基酸可以是 N- 烷基化的天然生成的氨基酸， 例如 N- 烷基化的 α- 氨基酸。天然生成的氨基酸是 20 种常见 α- 氨基酸 (Gly， Ala， Val， Leu， Ile， Ser， Thr， Asp， Asn， Lys， Glu， Gln， Arg， His， Phe， Cys， Trp， Tyr， Met， 和 Pro) 中的一种以及其 他氨基酸， 所述其他氨基酸是天然产物， 例如， 正亮氨酸， 乙基甘氨酸， 鸟氨酸， 甲基丁烯 5 基 - 甲基苏氨酸和苯基甘氨酸。氨基酸侧链 ( 例如， R ) 的例子包括 H( 甘氨酸 )， 甲基 ( 丙 氨酸 )， -CH2C(O)NH2( 天冬氨酸 )， -CH2-SH( 半胱氨酸 )， 以及 -CH(OH)CH3( 苏氨酸 )。
N- 烷基化的化合物可以通过氨基 ( 或亚氨基 ) 化合物的还原烷基化作用来制备。 例如， 氨基或亚氨基化合物可与还原剂 ( 例如， 氰基硼氢化钠 ) 一同暴露于醛， 从而对胺进 行 N- 烷基化。类似地， N- 氧杂 - 烷基化化合物可通过氨基 ( 或亚氨基 ) 化合物的还原烷 基化作用来制备。例如， 氨基或亚氨基化合物可与还原剂 ( 例如， 氰基硼氢化钠 ) 一同暴露
于氧杂 - 醛， 从而对胺进行 N- 氧杂 - 烷基化。
所述含氮化合物可包括一种或一种以上保护基团。 本领域技术人员熟知各种保护 基团。一般来说， 保护基团的种类并不是关键性的， 只要保护基团对在化合物的其他位置 上的任何后续反应的条件稳定并且可在合适的时间点除去， 而不会不利地影响分子的其他 部分。此外， 保护基团可在实质性的合成转化完成之后被另一基团取代。明显地， 如果化 合物与本文公开的化合物的区别仅在于所公开的化合物的一个或一个以上保护基团已被 不同的保护基团取代， 那么化合物在本发明的范围内。在 Greene， Protective Groups in st nd Organic Chemistry， (1 Ed.， 1981， Greene & Wuts， 2 Ed.， 1991) 中发现进一步的例子和 条件。
所述含氮化合物可例如通过结晶或色谱法来纯化。 所述化合物可使用立体特异性 氨基或亚氨基化合物作为起始物质以立体特异性方式来合成。
在长链 N- 烷基化的化合物的制备中用作起始物质的氨基和亚氨基化合物是商售 的 (Sigma， 圣路易斯， MO ； 剑桥研究生物化学品， 诺维奇， 柴郡， 英国 ； 多伦多研究化学品， 安 大略， 加拿大 ) 或可通过已知的合成方法制备。 例如， 所述化合物可以是 N- 烷基化的亚氨基 糖化合物或其氧取代衍生物。例如， 所述亚氨基糖可以是脱氧半乳糖野尻霉素 (DGJ)， 1- 甲 基 -1- 脱氧半乳糖野尻霉素 (MeDGJ)， 脱氧野尻霉素 (DNJ)， altrostatin， 2R， 5R- 二羟基甲 基 -3R， 4R- 二羟基吡咯烷 (DMDP)， 或其衍生物， 对映异构体或立体异构体。
在一些实施方式中， 包封在脂质颗粒内部的药剂可以是式 IV 或式 V 的化合物 ：
其中， R是：
R’ 为：R1 是取代或未取代的烷基 ； R2 是取代或未取代的烷基 ； W1-4 独立地选自 ： 氢， 取代 或未取代的烷基， 取代或未取代的卤代烷基， 取代或未取代的烷酰基， 取代或未取代的芳酰 基， 或者取代或未取代的卤代烷酰基 ； X1-5 独立地选自 ： H， NO2， N3 或 NH2 ； Y 缺失或为取代或 未取代的 C1- 烷基 ( 不同于羰基 )， Z 选自化学键或 NH， 条件是当 Z 为化学键时， Y 缺失， 当 Z 为 NH 时， Y 为取代或未取代的 C1- 烷基 ( 不同于羰基 ) ； 并且 Z’ 为化学键或 NH。
式 IV 和式 V 的化合物及其合成方法在例如美国专利公开 US2007/0275998 中公 开。式 IV 和式 V 的化合物的非限定性的例子包括 N-(N’ -(4’ 叠氮 -2’ - 硝基苯基 )-6- 氨 基己基 )- 脱氧野尻霉素 (NAP-DNJ) 和 N-(N’ -(2， 4- 二硝基苯基 )-6- 氨基己基 )- 脱氧野 尻霉素 (NDP-DNJ)。
已描述了多种亚氨基糖化合物的合成方法。例如， 已知 DNJ 衍生物的合成方法 并 且 在 美 国 专 利 第 5,622,972 号、 第 5,401,645 号、 第 5,200,523 号、 第 5,043,273 号、 第 4,994,572 号、 第 4,246,345 号、 第 4,266,025 号、 第 4,405,714 号 和 第 4,806,650 号 中描述了 DNJ 衍生物的合成方法。已知其他亚氨基糖衍生物的合成方法并且在美国专利 第 4,861,892 号、 第 4,894,388 号、 第 4,910,310 号、 第 4,996,329 号、 第 5,011,929 号、 第 5,013,842 号、 第 5,017,704 号、 第 5,580,884 号、 第 5,286,877 号和第 5,100,797 号以及 PCT 公开 WO 01/10429 中描述了其他亚氨基糖衍生物的合成方法。 2R， 5R- 二羟基甲基 -3R， 4R- 二 羟 基 吡 咯 烷 (DMDP) 的 光 学 异 构 体 的 合 成 在 Fleet&Smith(Terahedron Lett.26 ： 1469-1472， 1985) 中描述。
显像剂可以是标记的或荧光水性物质 ( 例如， 钙黄绿素 ) 或者荧光标记的分子 ( 例如 siRNA， 抗体 ) 或者其他小分子抑制剂。标记的亲脂性物质也可加至掺入细胞膜中的 脂质颗粒中， 例如， 用于使脂质体在细胞内显现的 rh-PE 脂质和其他具有用于显现作用或 纯化作用的标签的类似脂质。 这也可包括用荧光部分或用于显现作用和纯化作用的其他标 签标记的亲脂性蛋白质或药物。
在一些实施方式中， 包封的活性剂可以是逆转录酶病毒剂， 所述逆转录酶病毒剂 可以是例如， 核苷逆转录酶 (RT) 抑制剂， 非核苷 RT 抑制剂， 蛋白酶抑制剂或其组合， 所 述核苷逆转录酶 (RT) 抑制剂例如， (-)-2’ - 脱氧 -3’ - 巯基胞苷 -5’ - 三膦酸盐 (3TC) ； (-)- 顺式 -5- 氟代 -1-[2-( 羟基 - 甲基 )-[1， 3- 氧杂四氢硫杂茂 -5- 基 ] 胞嘧啶 (FTC) ； 3’ - 叠氮 -3’ - 脱氧胸苷 (AZT) 和双脱氧 - 肌苷 (ddI) ； 所述非核苷 RT 抑制剂例如 N11- 环 丙 基 -4- 甲 基 -5， 11- 二 氢 -6H- 双 吡 啶 并 [3， 2-b:2’ 3’ -e]-[1， 4] 二 氮 杂 卓 -6- 酮 (Neviparine)、 蛋白酶抑制剂或其组合。
插入的部分
在一些实施方式中， 脂质颗粒可包括一个或一个以上插入所述脂质颗粒的脂质层 或脂质双层中的部分。插入的部分的例子包括但不限于 ： 跨膜蛋白， 蛋白脂质结合物， 标记
的脂质， 亲脂性化合物或其任何组合。 在一些实施方式中， 所述插入的部分可包括脂质 -PEG 结合物。这样的共轭物可增加脂质颗粒的体内稳定性和 / 或增加所述脂质颗粒的循环时 间。在一些实施方式中， 所述插入的部分可包括长烷基链亚氨基糖， 例如， C7-C16 烷基或氧 杂烷基取代的 N- 脱氧野尻霉素 (DNJ) 或 C7-C16 烷基或氧杂烷基取代的脱氧半乳糖野尻霉 素 (DGJ)。长烷基链亚氨基糖的非限定性的例子包括 N- 壬基 DNJ 和 N- 壬基 DGJ。在一些 实施方式中， 所述插入的部分可包括荧光体 - 脂质共轭物， 所述荧光体 - 脂质共轭物可用于 标记与脂质双层颗粒接触的细胞的 ER 膜。这种标记可有用于活细胞和 / 或被固定的细胞 在真核细胞中成像。脂质颗粒的使用可导致将所述插入的部分递送进入细胞的 ER 膜。
应用
能够抑制胆固醇的脂质颗粒可直接用于治疗和 / 或预防由胆固醇水平增加引起 的或与胆固醇水平增加有关的疾病或病症。这些疾病 / 病症的例子包括但不限于动脉粥样 硬化和冠状动脉疾病。在一些实施方式中， 能够抑制胆固醇的脂质颗粒可用于治疗或预防 受免疫缺陷病毒感染的受治者中的由胆固醇水平增加引起的或与胆固醇水平增加有关的 疾病或病症， 所述受治者可以是感染了 HIV 的人类。在这样的受治者体内胆固醇水平的增 加可以是由感染引起的。免疫缺陷感染可与细胞胆固醇累积有关， 从而导致产生动脉粥样 硬化和 / 或 CAD， 脂质颗粒可通过靶定分子靶定免疫缺陷病毒感染的细胞。 在一些实施方式 中， 所述脂质颗粒可包封一种或一种以上抗逆转录酶病毒剂。这些脂质颗粒可将抗逆转录 酶病毒剂递送至免疫缺陷病毒感染的细胞并且同时降低细胞胆固醇水平， 预防动脉粥样硬 化和 / 或 CAD。
能够抑制胆固醇的脂质颗粒可用于治疗和 / 或预防由病毒引起的或与病毒有关 的疾病或病症， 所述病毒依赖于胆固醇进行病毒复制。 在一些情况下， 所述疾病或病症可以 是病毒感染。 这些病毒的例子包括但不限于 ： 单纯疱疹病毒， 流感病毒， 鼠白血病病毒， 牛痘 病毒， 多瘤病毒， 艾伯斯坦 - 巴尔病毒， 西门利克森林病毒， 埃博拉病毒， 马尔堡病毒， 登革 病毒， 麻疹病毒， HIV， 丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒。当所述脂质颗粒用于由病毒引起的 或与病毒有关的疾病或病症时， 所述脂质颗粒可包含一种或一种以上抗所述病毒的抗病毒 剂。可选地， 所述脂质颗粒可通过作为这些病毒 ( 例如， HCV) 的形态发生抑制剂起作用直 接用作药物或前药。
给药
含有所述脂质颗粒的组合物可给药于受治者， 目标是降低所述受治者体内的细胞 胆固醇。在所述给药之前， 胆固醇的起始水平可以是正常的或增加的。
在一些实施方式中， 所述受治者可以是细胞。含有脂质颗粒的组合物可降低各种 细胞类型中的细胞胆固醇水平， 所述各种细胞类型包括但不限于 ： 外周血单核细胞 (PBMC) 和人类肝细胞瘤细胞系， 所述外周血单核细胞包括巨噬细胞， 所述人类肝细胞瘤细胞系例 如 Huh 7.5 细胞。
在一些情况下， 所述细胞可以是受病毒感染的细胞， 所述病毒可以是依赖胆固醇 进行病毒复制的病毒。在这种情况下， 所述脂质颗粒对胆固醇的抑制作用可导致抑制病毒 复制， 抑制病毒组装和分泌， 在病毒包膜中生成具有降低的胆固醇水平的非感染性病毒颗 粒和 / 或在用于病毒进入的细胞表面上错误定位细胞受体。在一些实施方式中， 含有脂质 颗粒的组合物可给药于温血动物， 例如， 哺乳动物或鸟类。在许多情况下， 所述受治者可以是人类。在一些实施方式中， 含有脂质颗粒的组合物可通过静脉注射给药。而在一些实施 方式中， 含有脂质颗粒的组合物可通过不同于静脉注射的肠胃外途径给药， 所述途径例如， 腹膜内， 皮下， 皮肤内， 表皮内， 肌肉内或透皮途径。而在一些实施方式中， 含有脂质颗粒的 组合物可通过粘膜表面给药， 所述粘膜表面例如， 眼部， 鼻内， 肺部， 肠部， 直肠或尿道表面。 含有脂质的组合物 ( 例如， 脂质体组合物 ) 的给药途径在例如 A.S.Ulrich， Biophysical Aspects of Using Liposomes as Delivery Vehicles， Bioscience Reports， Volume 22， Issue 2， Apr 2002， 129-150 中公开。
在一些情况下， 脂质颗粒的皮下注射可以是优选的， 因为这样的给药可导致脂质 颗粒在巨噬细胞中累积， 从而防止形成泡沫细胞， 并且因此预防早期动脉粥样硬化。 本发明 通过下列实施例进一步举例说明， 但不限于下面这些实施例。 实施例 用脂质体处理的细胞的蛋白质组分析已表现出该处理下调了细胞胆固醇生物合 成中所涉及的一个关键酶 (3- 羟基 -3- 甲基戊二酰基 (HMG)-CoA 合成酶 )， 所述脂质体是水 溶性小分子进入靶细胞的细胞内腔室的有效载体。 进一步的实验已表明这种下调可导致处 理过的细胞内的胆固醇 ( 游离的或酯化的胆固醇 ) 水平降低。因为早期的动脉粥样硬化和 冠状动脉疾病由泡沫细胞的形成开始， 所述泡沫细胞是富胆固醇巨噬细胞， 并且因为在例 如皮下注射之后脂质体在巨噬细胞中累积， 脂质体治疗可以是用于这些疾病的新的靶向治 疗方法。
而且， 已显示出许多病毒依赖于正常至增加的细胞胆固醇水平， 因此， 除了有效递 送抗病毒药物至靶细胞之外， 降低胆固醇水平的组合会是新的、 更加有效的抗病毒疗法。
1. 脂质体制备
1.1 脂质体制备方法
制备新鲜的脂质体用于所描述的所有分析。 将脂质的氯仿溶液置于玻璃管内并且 在氮气流下蒸发溶剂。除非另有说明， 在 1x PBS 缓冲液中通过涡旋震荡使脂质膜水合至最 终脂质浓度为 5mM。使用 Mini-Extruder 设备通过孔径为 100nm 的聚碳酸酯过滤器挤压得 到的多层囊泡 11 次。使用 0.22μm 过滤器单元过滤灭菌脂质体。图 2A 至图 2F 举例说明 了在这些研究中使用的脂质 ： A.22:6PE ； B.22:6PC ； C.PI ； D.PS ； E.DOPE ； F.CHEMS。
2. 用多不饱和 ER 脂质体处理的细胞中的 HMG CoA 合成酶 (HMGCS) 蛋白质降低
用 pH 敏感脂质体 ( 即， 含有 PE 和 CHEMS 脂质但不含 PI 或 PS 脂质的脂质体 ) 和 ER 脂质体 ( 即， 含有 PE 脂质和 PI 或 PS 脂质中的至少一种的脂质体 ) 处理 5 天的细胞用 于蛋白质组分析以确定细胞中所有可检测的蛋白质的增加或减少。由 pH 敏感脂质体处理 和靶定 ER 的脂质体处理导致一种蛋白质降低， 所述蛋白质是酶 HMG-CoA 合成酶 (HMGCS)。 HMGCS 催化甲羟戊酸 - 类异戊二烯途径中的第一步， 所述第一步是从乙酰基 -CoA 通过乙酰 乙酰基 CoA 合成 HMG-CoA。为了确定 22:6 多不饱和 (pu)ER 脂质体处理的 Huh 7.5 细胞在 HMG-CoA 合成酶中是否导致类似的降低， 在全部细胞溶解以及蛋白质印迹分析之前用各种 浓度的脂质体处理细胞 4 天， 所述蛋白质印迹用于特异性地识别 HMGCS。
2.1 通过蛋白质印迹识别 HMGCS 和肌动蛋白的方法
在用 puER 脂质体 (22:6PE:22:6PC:PI:PS， 1.5:1.5:1:1) 处理之后， 培养基中的最
终浓度为 1μM 至 100μM 的条件下， 在 1x PBS 中清洗 Huh 7.5 细胞两次， 重悬于 1x PBS/1％ Triton X-100 至最终蛋白质浓度为 1mg/ml。通过 Bradford 分析 (Bio-Rad)， 使用 BSA 标准 来确定蛋白质浓度。 通过在 4％至 12％ bis-tris NuPAGE 凝胶 (Invitrogen) 中装载 10μg/ 孔的蛋白质进行 SDS-PAGE， 并且根据生产商的推荐使用 NuPAGE MES SDS 缓冲液进行分离。 根据生产商的操作规程， 将蛋白质转移至硝化纤维素膜并且使用 WesternBreeze 抗 - 山 羊 AP 化学发光试剂盒 (Invitrogen) 进行免疫印迹法， 所述试剂盒具有 1 ∶ 100 稀释的一 级山羊抗 - 人 HMGCoA 合成酶和抗 - 人肌动蛋白抗体 (Santa Cruz)。
2.2 用 puER 脂质体处理的 HMGCS 的下调
如主要由 18:1 脂质 (18:1PE:18:1PC:PI:PS， 1.5:1.7:1.5:0.3) 构成的 ER 脂质体 所示， 用 22:6ER 脂质体处理也使 HMGCoA- 合成酶的量以剂量依赖的方式降低 ( 图 3)。
图 3 表示使用抗肌动蛋白和抗 -HMGCS 抗体的 22:6ER 脂质体处理的、 JC-1 感染的 Huh 7.5 细胞 (MOI ＝ 0.5) 的蛋白质印迹分析结果。在各种浓度条件下， 用 22:6ER 脂质体 处理细胞 4 天， 在第四天时， 收获细胞并通过在 1％ Triton X-100/1x PBS 中重悬来破坏细 胞。分析细胞溶解物的蛋白质含量， 并每孔加载 30μg 总蛋白质， 接着通过 SDS-PAGE 进行 分离。显示了来自单个实验的代表性的图像。独立地重复实验三次。 3. 用 puER 脂质体处理细胞使细胞胆固醇水平降低 ：
因为脂质体处理已表现出降低细胞内 HMGCS 的水平， 就抑制胆固醇的生物合成而 言， 进行分析以确定这些细胞中游离胆固醇和酯化胆固醇的水平， 从而对这种抑制作用进 行定量。定量 22:6ER 脂质体和 22:6PEG-ER 脂质体处理的 Huh 7.5 细胞中的总胆固醇水平 和游离胆固醇水平。通过计算总胆固醇值和游离胆固醇值之间的差值来确定酯化胆固醇。
3.1 定量细胞中总胆固醇和游离胆固醇的方法 ：
处理之后， 在 1x PBS 中清洗 Huh 7.5 细胞或 PBMC 两次， 并且重悬于 1xPBS/1 ％ Triton X-100 至最终蛋白质浓度为 1mg/ml。通过 Bradford 分析 (Bio-Rad)， 使用 BSA 标准 确定蛋白质浓度。在相当于 10μg 总蛋白质的细胞溶解产物上进行胆固醇分析。根据生产 商的操作规程， 使用 Amplex Red 胆固醇分析试剂盒 (Invitrogen) 在存在或不存在胆固 醇酯酶的条件下， 分别定量总胆固醇水平和游离胆固醇水平。
3.2 定量用 puER 脂质体和 PEG 化的 puER 脂质体处理之后的 Huh 7.5 细胞和 PBMC 中的总胆固醇水平和游离胆固醇水平
定量 22:6ER 脂质体和 22:6PEG-ER 脂质体处理的 Huh 7.5 细胞中的总胆固醇水平 和游离胆固醇水平。酯化胆固醇水平通过计算总胆固醇值和游离胆固醇值之间的差值来 确定。结果表明总胆固醇水平以剂量依赖的方式降低 ( 图 4)， 并且 PEG-ER 脂质体处理与 非 -PEG 化的组合物具有类似的作用， 这说明 PEG 化作用并不影响 ER 脂质体对胆固醇生物 合成的抑制作用。与未处理的对照相比， 在 50μM 22:6ER 脂质体处理的样品中总胆固醇水 平显著降低 (56％， SD ＝ 2.7％ )， 并且大多数这种降低可能是由于细胞内游离胆固醇水平 SD ＝ 1.1％ ) 降低。 (47％的未处理值， SD ＝ 2.5％ ) 相对于酯化胆固醇 (75％的未处理值，
图 4 显示了来自 22:6PE:22:6PC:PI:PS 处理的、 JC 1- 感染的 Huh 7.5 细胞 (MOI ＝ 0.5) 的游离胆固醇和总胆固醇的定量结果。 在各种浓度条件下， 用脂质体处理细胞 4 天， 所述脂质体包括 PEG 化的 22:6ER 脂质体。 培养之后， 收获细胞并用 1％ Triton X-100/1x PBS 破坏细胞， 10μg 各个样品分别用于在存在和不存在胆固醇酯酶的条件下的胆固醇分
析以定量细胞中的总胆固醇和游离胆固醇。酯化胆固醇计算为两个值的差值。结果代表 来自三个独立的实验的一式三份样品的平均值 ( 和 SD)。数据表示为相对于未处理的对照 (100％ )， 并且该值的显著差异表示为 *(P ＜ 0.05) 或 **(P ＜ 0.001)。
植物红血球凝集素 (PHA)- 刺激的 PBMC 用 22:6ER 脂质体培养， 并且在培养 4 天之 后定量游离胆固醇水平和酯化胆固醇水平。如图 5 所示， 未处理的 PBMC 含有 78％ (SD ＝ 5.9％ ) 游离胆固醇和 22％ (SD ＝ 3.8％ ) 酯化胆固醇。用 50μM 22:6ER 脂质体处理导致 细胞胆固醇全部降低 28％ (SD ＝ 6.5％ )。游离胆固醇水平显著降低 33％ (SD ＝ 6.3％， P ＜ 0.001)， 但是相对于未处理的对照， 在该浓度下酯化胆固醇并没有显著降低。PEG 化的 22:6ER 脂质体也使游离胆固醇水平降低了 29％ (SD ＝ 3.9， P ＜ 0.001)， 但对酯化胆固醇 水平没有显著作用。
图 5 显示了用 22:6ER 脂质体处理 PHA- 刺激的 PBMC 持续 4 天的实验结果。收获 细胞并且通过重悬于 1％ Triton X-100/1x PBS 破坏细胞， 10μg 各个样品分别用于在存 在和不存在胆固醇酯酶的条件下的胆固醇分析以定量细胞中的总胆固醇和游离胆固醇。 酯 化胆固醇计算为两个值的差值。 数据代表来自三个独立的实验的一式三份样品的平均值和 SD。 所有值表示为相对于未处理的对照 (100％ ) 的百分数， 并且该值的显著差异表示为 *(P ＜ 0.05) 或 **(P ＜ 0.001)。
4. 降低的细胞内胆固醇对 HCV 具有抗病毒作用 ：
HCV 已表现出依赖于细胞胆固醇水平进行有效的病毒复制。此外， ER 脂质体通过 与病毒竞争细胞受体已表现出对 HCV 是抗病毒的。为了监测 puER 脂质体和 PEG 化的 puER 脂质体对 HCV 的组合抗病毒活性， 在存在脂质体的条件下培养病毒 16 天 (4 轮 4 天处理 )。 抗病毒活性通过定量细胞中的病毒感染以及整个处理中病毒的分泌和分泌的病毒粒子的 感染性来监测。还测量处理的细胞中的细胞胆固醇水平。
4.1 HCV 细胞培养的方法以及对病毒感染和分泌进行定量的方法
JC-1 HCV 细胞培养 (HCVcc) ： 已知感染滴定度 ( 病灶形成单位 (ffu)/ml) 的病毒 原液用于感染所述的所有分析中的原初 Huh 7.5 细胞。对于脂质体处理分析而言， JC1- 感 5 染的 Huh 7.5 细胞以在完全 DMEM/10％ FBS 中 3x 10 个细胞 / 孔的密度接种于 6 孔平板 中并静置培养 4 天， 所述完全 DMEM/10 ％ FBS 含有或不含有总体积为 2ml/ 孔的脂质体。 培养之后， 收获上清液用于 HCV RNA 定量。用 1x PBS 清洗细胞一次， 在 0.5％胰蛋白酶 / EDTA(Invitrogen) 中分离细胞， 计数并冷冻在 -20℃， 待进一步分析。对于多路分析而言， 5 用台盼蓝进行细胞计数之后， 将 3x 10 个细胞再次接种在 6 孔平板内用于所描述的另一轮 处理。
通过 RT-PCR 定量 HCV ： 根据生产商的操作规程， 使用 QIAGEN QIAamp 病毒 RNA 纯 化试剂盒从 500μl 上清液中提取病毒 RNA， 通过对提取的病毒 RNA 进行定量 PCR 来进行病 毒分泌分析。首先使用 Centricon 浓缩器 ( 切断 10,000KDa MW， Millipore) 将 500μl 上清液浓缩至 140μl。通过下述步骤对分泌的病毒 RNA 进行定量 ： 首先使用具有引物 RC21(5’ -CTCCCGGGGCACTCGCAAGC-3’ ) 的逆转录酶反应 (TaqMan ABI) 将分离的 RNA 转 化为 cDNA， 接着使用 SyBr 绿色混合物 (QIAGEN) 以及针对 HCVcDNA 的 RC21 和 RC1 引物 (5’ -ATGCCATGGCGTTAGTA-3’ ) 进行实时 PCR。确定相对于由 HCV JC-1cDNA 的连续稀释液 构成的标准曲线的 HCV 转录水平。4.2 用于测量病毒感染性的 HCV 核心免疫荧光 ：
处理的 JC-1 感染的 Huh 7.5 细胞的上清液中分泌的 HCV 病毒粒子的感染性通过 感染原初 Huh 7.5 细胞来测定。原初 Huh 7.5 细胞以 5x 104 个细胞 / 孔的密度接种在 48 孔平板上并静置以粘附过夜， 接着用 200μl 样品上清液替换培养基。将上清液静置以感 染原初 Huh 7.5 细胞 1 小时， 接着用 1x PBS 清洗细胞两次， 然后在 500μl 完全 DMEM/10％ FCS 中培养两天。培养两天之后， 用 1x PBS 清洗细胞两次， 在甲醇 / 丙酮 (1 ∶ 1， vol/vol) 中固定 10 分钟， 在 1x PBS/0.1％ Tween -20 中清洗两次。然后在含有 3μg/ml 小鼠抗 HCV 核心抗体 ( 亲和性生物试剂 ) 的 1x PBS/0.1％ Tween -20 中培养细胞 1 小时， 在 1x PBS/0.1％ Tween -20 中清洗两次， 在 1x PBS/0.1％ Tween -20/1 ∶ 1000 FITC 标记的 抗小鼠二抗 (Sigma) 中培养， 清洗两次以上， 并用 DAPI 染色。
使用 Nikon Eclipse TE2000-U 显微镜拍摄荧光图像。感染的细胞的百分数通过 计数的 HCV 感染的细胞总数 ( 由抗 -HCV 抗体检测 ) 除以分析中的细胞总数 ( 由 DAPI 染色 来检测 ) 来计算。
4.3 用 puER 脂质体和 PEG 化的 puER 脂质体长期处理 HCVcc- 感染的 Huh 7.5 细 胞：
用 ER 脂质体处理 JC-1HCVcc 感染的 Huh 7.5 细胞持续 16 天的时间段 (4 轮处理 )。 每四天将细胞传代至含有处理物的新鲜培养基中， 并且定量细胞中的病毒感染、 HCVcc 分泌 以及分泌的颗粒的感染性。在 MOI ＝ 0.02 的条件下感染细胞并且一旦细胞中的感染水平 达到总细胞的 30％至 40％ ( 通过核心蛋白质免疫荧光测定 ) 就开始处理。图 6a 显示了 22:6ER 脂质体的不同处理的 16 天处理过程中细胞中的 HCVcc 感染水平。所有脂质体处理 防止了 Huh 7.5 细胞中病毒感染的扩散并且导致在仅仅 4 天处理之后感染的细胞总数以剂 量依赖的方式降低。在用 50μM 22:6ER 脂质体处理 16 天之后在培养基中没有观察到感染 的细胞。在整个 16 天处理过程中的 HCV 分泌结果 ( 图 6b) 说明了类似的趋势， 其中， HCV 分 泌相对于未处理的样品以剂量依赖的方式降低。在一轮处理之后， 浓度为 50μM 的 22:6ER 脂质体表现出使 HCV 分泌显著降低了 27％ (SD ＝ 11.3％ ) ； 在用 50μM 的 22:6PEG-ER 脂 质体处理中也观察到了类似的降低 (23％， SD ＝ 6.6％ )。当通过 RT-PCT 定量时， 与未处理 的样品相比， 50μM 22:6ER 脂质体处理的细胞的第 16 天的上清液含有少于 1％的 HCV RNA。 虽然本发明不受任何理论的限制， 该结果可说明在该时间点感染可能还未清除 (RNA 水平 显著高于背景水平 ) ； 然而， 脂质体处理成功地使病毒分泌降低了两个数量级。在每个阶段 测定分泌的病毒颗粒的感染性， 并且结果在图 6c 中显示。ER 脂质体对病毒感染性所起的 作用最大， 通过用 50μM 22:6ER 脂质体处理 16 天使所述病毒感染性降低至 0( 或低于任何 检测限 )。然而， 在 50μM 22:6ER 脂质体仅仅一轮处理之后， HCV 感染性降低了 91％ (SD ＝ 2.2％ )。甚至测试的最低浓度 (1μM) 的 22:6ER 脂质体也使感染性降低了 52％ (SD ＝ 5.3％ )， 这说明 ER 脂质体是病毒感染性的有效抑制剂。
在整个处理过程中， 还对处理的 Huh 7.5 细胞中的游离胆固醇水平和酯化胆固醇 水平进行了定量 ( 图 6d 和图 6e)。有趣地是， 虽然仅仅一轮处理之后游离胆固醇的水平降 低， 但是该水平在以后几轮处理中并没有显著降低。相反， 在处理第 4 天至第 12 天观察到 酯化胆固醇的水平以剂量依赖的方式逐渐降低， 在处理的第 4 天至第 12 天的酯化胆固醇水 平好像在整个处理中处于稳定水平。如在这些分析中所检测的， 在未处理的细胞中游离胆固醇与酯化胆固醇的正常比例为约 2 ∶ 1， 并且虽然 50μM 22:6ER 脂质体处理 4 天使该比 例降低至 1.3 ∶ 1， 但是， 在处理的第 12 天， 所有测试的样品中恢复了 2 ∶ 1 的比例。
图 6A 至图 6E 表示了用 22:6ER 脂质体处理 JC-1 感染的 Huh 7.5 细胞 (MOI ＝ 0.02)16 天的实验结果。(A) 整个处理中 Huh 7.5 细胞中 JC-1 HCVcc 感染水平。(B)JC-1 HCVcc 分泌。(C) 分泌的 JC-1 HCVcc 颗粒的感染性。(D) 细胞中游离的胆固醇水平。(E) 细胞中酯化的胆固醇水平。数据代表来自两个独立的实验的一式三份样品的平均值。先 前已说明了病毒粒子相关胆固醇的高水平是病毒感染性必需的 (Aizaki， Morikawa 等人， 2008)。因此， 由 ER 脂质体处理引起病毒感染性降低可能是由分泌的颗粒的病毒膜中胆固 醇降低引起的。为了测试这种可能性， 用游离胆固醇培养 50μM 22:6ER 脂质体处理的、 50μM 22:6PEG-ER 脂质体处理的以及未处理的细胞中分泌的 HCVcc， 试图恢复病毒感染 性。
4.4 用游离胆固醇培养 HCVcc 的方法
如先前所描述的， 通过 RT-PCR 对培养 4 天之后的未处理的和 50μM 脂质体处理的 Huh 7.5 细胞中分泌的 HCVcc 颗粒的 RNA 进行定量。 通过在完全 DMEM/10％ FBS 中稀释至最 低浓度， 将样品进行标准化。如先前所描述的 (Aizaki， Morikawa 等人， 2008)， 用游离胆固 醇 (Sigma) 在 37℃条件下培养 HCVcc 一小时， 并且， 将培养的 HCVcc 用于感染原初 Huh 7.5 细胞， 用于上述 HCV 核心蛋白质免疫荧光感染性分析。
4.5 用游离胆固醇培养 puER 脂质体和 PEG 化的 puER 脂质体处理的 HCVcc 之后的 结果 ：
通过 RT-PCR 对 50μM 22:6ER 脂质体处理的、 50μM 22:6PEG-ER 脂质体处理的和 未处理的细胞中分泌的 HCVcc 进行定量并且将定量结果标准化至 2x104RNA 拷贝数 /ml。如 先前所描述的 (Aizaki， Morikawa 等人， 2008)， 在 37℃条件下， 用最终浓度为 15μg/ml 或 150μg/ml 的胆固醇预培养标准化的病毒上清液或者静置未处理的病毒上清液 1 小时， 然 后， 将病毒上清液用于感染原初 Huh 7.5 细胞。
如图 7 所示， 当与未处理的 HCVcc 比较时， 用外源性胆固醇预培养时， 所有 HCVcc 上清液表现出感染性增加 ； 然而， 在胆固醇浓度为 15μg/ml 条件下， ER 脂质体处理的细胞 中的 HCVcc 导致病毒感染性较大提高 ( 分别为未由胆固醇处理的对照的 282％和 138％ )。 虽然向 ER 脂质体处理的 HCVcc 中添加外源性胆固醇恢复了很大百分比的病毒感染性， 但是 水平与那些未处理的病毒粒子中观察到的水平没有可比性， 这可说明 ER 脂质体处理的细 胞中分泌的 HCVcc 颗粒中可能存在额外的缺陷， 所述缺陷降低病毒感染性。
图 7 表示用外源性胆固醇 ( 胆固醇的最终浓度为 15μg/ml 和 150μg/ml) 处理 的 22:6ER 脂质体处理的 JC-1HCVcc、 PEG 化的 22:6ER 脂质体处理的 JC-1HCVcc 和未处理的 JC-1HCVcc 的感染性。 从在存在脂质体的条件下培养 4 天的培养物中取出病毒样品， 将该样 品标准化至 JC-1 RNA 的最低浓度 ( 通过定量 PCR 来测定 )， 并且在 37℃下， 用胆固醇预处 理 1 小时。在加入胆固醇之后， 将病毒样品用于感染原初 Huh 7.5 细胞并且如先前所描述 的， 对这些样品的感染性进行定量。结果代表来自三个独立的实验的一式三份样品的平均 值 ( 和 SD)。
研 究 已 表 明 降 低 的 细 胞 胆 固 醇 水 平 降 低 了 HCVcc 感 染 细 胞 的 能 力 (Aizaki， Morikawa 等人， 2008)。该作用可能是由于如下事实 ： HCV 的两个主要细胞受体 CD81 和SR-BI 会需要脂筏形式的胆固醇以定位于质膜 (Soldaini， Wack 等人 2003 ； Cherukuri， Shoham 等人 2004 ； Rhainds， Bourgeois 等人 2004)， 上述定位于质膜的过程是 HCV 感染必需 的 (Kapadia， Barth 等人 2007)。为了研究 ER 脂质体是否可通过降低细胞胆固醇水平来预 防 HCVcc 感染， 用 22:6ER 脂质体预处理原初 Huh 7.5 细胞 4 天， 接着用未处理的 JC-1HCVcc 感染。
4.6 用 puER 脂质体和 PEG 化的 puER 脂质体预处理 Huh 7.5 细胞并且用 HCVcc 感 染之后的结果
图 8 确认了 ER 脂质体预处理导致 HCVcc 对原初细胞的感染能力以剂量依赖的 方式降低 ； 用 50μM 22:6ER 脂质体处理观察到了最大作用， 病毒感染降低了 89％ (SD ＝ 1.9％ )。
图 8 表 示 了 用 22:6ER 脂 质 体 处 理 未 感 染 的 Huh 7.5 细 胞 4 天， 接着用 JC-1HCVcc(MOI ＝ 0.5) 感染的实验结果。如先前所述对病毒感染性进行定量。结果代表 来自三个独立的实验的一式三份样品的平均值 ( 和 SD)。数据表示为相对于未处理的对照 (100％ ) 并且该值中的显著性差异表示为 *(P ＜ 0.05) 或 **(P ＜ 0.001)。
5. 降低的细胞内胆固醇对 HIV 具有抗病毒作用 ：
HIV 的正确组装和感染性也已表现出分别依赖于细胞胆固醇 ( 脂筏 ) 和病毒相关 胆固醇。 为了研究 ER 脂质体是否可作为 HIV-1 抗病毒剂起作用， 在 TCID50 ＝ 100 的条件下， 用 3HIV-1 初级分离物 (LAI， 93UG067 和 93RW024) 感染 PBMC， 并且在感染之后用 puER 脂质 体和 PEG 化的 puER 脂质体处理 4 天。通过 p24ELISA 对细胞上清液中的 HIV 分泌和感染性 进行定量。
5.1 puER 脂质体和 PEG 化的 puER 脂质体处理之后定量 HIV 分泌和感染性的方法 ：
HIV-1 初 级 分 离 物 的 细 胞 培 养 ： 为 了 感 染 细 胞， 将 4x 105PHA 活 化 的 PBMC 和 TCID50(50％组织培养感染剂量 ) 为 100 的初级分离物原液加至 96 孔平板的每个孔。16 小 时过夜培养之后， 用完全 RPMI 培养基清洗细胞三次， 并且重悬于具有或不具有脂质体的完 全 RPMI/IL2 中。在第 5 天， 收集含有细胞分泌的 HIV 病毒粒子的上清液并且通过 p24 捕获 ELISA 对每个上清液的 p24 浓度进行定量。
定量 p24ELISA ： 在 p24 分析之前， 用 1％ Empigen(vol/vol) 灭活 HIV 样品。使用 抗 -p24 D7320 抗体 (Aalto 生物试剂， Dublin， U.K.) 捕获处理的上清液中的 p24 进行 ELISA 以定量 p24， 并且， 根据生产商的操作规程， 使用抗 p24 的二抗 BC1071-AP(Aalto 生物试剂 ) 检测 ELISA 以定量 p24。根据生产商的操作规程， 使用 AMPAKTM ELISA 试剂盒 (Dako， Ely， U.K.) 测量碱性磷酸酶活性。使用重组 p24 蛋白 (Aalto 生物试剂 ) 标准化样品。
HIV 感染性分析 ： 从用脂质体处理的 PBMC 中分泌的 HIV 病毒粒子的感染性使用含 有从脂质体处理的细胞中分泌的 HIV 病毒粒子的上清液测定。 所有上清液在完全 RPMI/IL2 中稀释至 p24 最终浓度为 10ng/ml， 并将 100μl 上清液加至 4x 105PHA 活化的 PBMC 中， 并 且在 100μl 培养基中稀释至 p24 最终浓度为 5ng/ml， 静置培养过夜。 第二天如所述的清洗 细胞， 重悬于 200μl 新鲜的 RPMI/IL2 中， 并且静置培养 4 天， 接着收集上清液并且通过捕 获 ELISA 分析 p24 的含量。
5.2 用 puER 脂质体和 PEG 化的 puER 脂质体处理 HIV-1 感染的 PBMC 之后的结果 ：
4 天处理之后， 通过 p24ELISA 定量细胞上清液中的 HIV 分泌， 并且结果表明 HIV分泌和分泌的颗粒的感染性均以剂量依赖的方式降低 ( 图 9a 和图 9b)。如 HCVcc 所示， 抗 病毒活性的主要机制看起来是通过降低感染性病毒粒子的形成 ： 观察到用 50μM 22:6ER 脂质体处理的分泌的 HIV 的感染性降低了 50％ (SD ＝ 4.6％ )， 然而， 病毒分泌仅仅降低了 22％ (SD ＝ 4.6％ )。
图 9A 显示了在用 22:6ER 脂质体处理 4 天的过程中 HIV-1 的三种基因上不同的 初级分离物 (LAI， 93UG067 和 93RW024) 的平均分泌。HIV-1 分泌通过使用捕获 ELISA 定量 HIV-1p24 基质蛋白来测量。图 9B 显示了 22:6ER 脂质体处理的 PBMC 中分泌的 HIV-1 的感 染性。 通过使用上清液感染原初 PBMC， 接着通过 p24ELISA 监测感染后的分泌来测定分泌的 病毒粒子的感染性。数据代表三个独立的实验的一式三份的平均值和 SD。所有值表示为 相对于未处理的对照 (100％ ) 的百分数， 并且该值的显著差异表示为 *(P ＜ 0.05) 或 **(P ＜ 0.001)。
6. 多不饱和 ER 脂质体与 HCVcc 竞争结合至细胞表面脂蛋白受体 ：
低密度脂蛋白受体 (LDLr) 是一种膜糖蛋白， 所述膜糖蛋白可控制胆固醇进入细 胞的主要途径， 通过所述途径， 胆固醇经由网格蛋白介导的 VLDL 衍生的脂蛋白颗粒的内吞 作用， 进入细胞。基于下述发现， LDLr 也是候选的 HCV 受体 ： HCV 与脂蛋白有关且所培养的 细胞对病毒颗粒的摄取与 LDLr 表达有关。 为了观察摄取脂质体进入细胞是否使用了 LDLr， 将已表现出分别上调和下调 Huh 7 细胞中的 LDLr、 角鲨抑素和 25- 羟基胆固醇的表达的药 物用于观察在存在 JC-1 HCVcc 感染的条件下对 Huh7.5 细胞中的 ER 脂质体摄取的任何作 用。 6.1 在存在上调和下调 Huh 7.5 细胞中的 LDLr 表达的药物的条件下监测脂质体摄 取的方法 ：
如美国专利公开第 20090252785 号中所描述的制备脂质体并且所述脂质体包括 1％ ( 总摩尔数 )rh-PE 用于监测细胞中这些脂质体的摄取。将 JC-1 感染的 (MOI ＝ 0.5) 或未感染的 Huh 7.5 细胞以在 2ml 完全 DMEM/10％ FCS 培养基中的 3x 105 个细胞 / 孔的 密度接种在 6 孔平板中。细胞用 1μM 和 10μM 角鲨抑素 (SQ， Sigma) 或 25- 羟基胆固醇 (25-HC， Sigma) 在无血清完全 DMEM 中预处理 24 小时或不进行预处理。 24 小时预培养之后， 加入 rh- 标记的脂质体以使最终脂质浓度为 50μM， 并且静置再培养 24 小时。培养时间之 后， 在 1x PBS 中清洗细胞两次， 分离， 计数并且重悬于 200μl 1x PBS/1％ Triton X-100 中， 接着转移至 96 孔平板以在荧光分光光度计中在 λex ＝ 550nm， λem ＝ 590nm 读数。
6.2 在存在角鲨抑素和 25- 羟基胆固醇的条件下脂质体摄取进入 Huh 7.5 细胞中 的结果 ：
在存在 SQ 或 25-HC 的条件下培养细胞 24 小时 ( 两者的最终浓度为 10μM 和 1μM)， 接着加入若丹明标记的 22:6ER 脂质体持续 24 小时。用 10μM 25-HC 处理细胞导致 脂质体摄取降低了 69％ (SD ＝ 4.9％ )， 然而， 10μM SQ 使脂质体摄取显著提高至 117％ (SD ＝ 10.7％ )， 这表明摄取 ER 脂质体进入 Huh7.5 细胞依赖于 LDLr( 图 10)。
图 10 表示在存在用于上调和下调脂蛋白受体的表达的药物 ( 分别是 SQ 和 25-HC) 的条件下在无血清完全 DMEM 中培养未感染的 Huh 7.5 细胞 24 小时的实验结果。将脂质双 层中的 1％ rh-PE 标记的 22:6ER 脂质体 ( 最终脂质浓度 50μM) 加至细胞中并静置再培养 24 小时。然后， 收获细胞， 计数， 在 λex ＝ 550nm， λem ＝ 590nm 测量 rh-PE 的荧光。所有
数据代表来自三个独立的实验的一式三份的平均值和 SD。 数据表示为相对于未处理的对照 * ** (100％ ) 并且该值的显著性差异表示为 (P ＜ 0.05) 或 (P ＜ 0.001)。
因为可认为 HCV 使用 LDLr 作为细胞受体， ER 脂质体也可通过直接与病毒竞争内 在化作用所必需的细胞受体来降低 HCVcc 的感染性。为了测试这个假设， 将 22:6ER 脂质体 与 JC-1 HCVcc 混合并用于感染原初 Huh 7.5 细胞。结果表明使用高于 5μM 的脂质浓度， ER 脂质体可中和超过 50％的 Huh7.5 的 HCVcc 感染 ( 图 11)。添加 ER 脂质体至最终浓度 为 50μM 观察到了最大作用， 其中， 病毒感染性降低了 87％ (SD ＝ 2.9％ )。重复该实验， 将 病毒和脂质体预培养 1 小时， 接着加至原初细胞中用于感染， 结果与那些所显示的结果实 际一致 ( 未显示数据 )。虽然本发明不受任何理论的限制， 该结果可说明脂质体不直接与 HCVcc 颗粒相互作用， 而仅仅与细胞受体相互作用。
图 11 显示了在感染 Huh 7.5 细胞的 1 小时过程中将 22:6puER 脂质体加至 HCVcc 病毒原液中的实验结果。 在各种浓度条件下， 将脂质体加至病毒原液中并用于感染原初 Huh 7.5 细胞。puER 脂质体中和 HCVcc 感染的能力通过使用 HCV 核心蛋白免疫荧光分析， 对培 养两天之后的感染的细胞的数目进行定量来监测。 所有数据代表来自三个独立的实验的一 式三份的平均值和 SD。数据表示为相对于未处理的对照 (100％ ) 并且该值的显著性差异 表示为 *(P ＜ 0.05) 或 **(P ＜ 0.001)。
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