含有苦参碱或其氧化衍生物的用于改善皮肤状况的组合物 本分案申请是基于申请号为 20088008614.9， 申请日为 2008 年 2 月 21 日， 发明名 称为 “含有苦参碱或其氧化衍生物的用于改善皮肤状况的组合物” 的中国专利申请的分案 申请。发明领域
本发明涉及含有苦参碱和氧化苦参碱作为活性成分的组合物， 对皮肤状况呈现出 极好的改善作用， 并具有稳定性和安全性。
相关技术的描述
皱纹由皮肤老化引起， 并且老化的皮肤是与老化过程相关的天然变化的结果。皮 肤老化可以宽泛地分成生理老化和光老化。 前者表示与整个皮肤表面老化相关的皮肤功能 和结构的变化， 而后者是由紫外线照射诱发的。
真皮的变化随着老化变得明显， 并且真皮萎缩是 70 岁后的代表性现象之一。成纤 维细胞的数量及其生物合成潜能两者的衰减导致胞外基质中具有大分子量的生物分子的 变化， 使得真皮变化开始出现。变化包括胶原蛋白束的分离、 粘多糖合成的降低、 胶原蛋白 和弹性蛋白的数量和直径的减少、 胶原蛋白和弹性蛋白的分解以及血管的扩张。
通常， 在几个复杂的诱因中， 如皮肤的含水量、 胶原蛋白含量和对极端环境的免疫 应答， 皱纹形成的主要因素涉及胶原酶的表达和活性， 胶原酶是减少胶原蛋白的合成和含 量的胶原蛋白降解酶。
同时， 人皮肤的颜色主要归因于黑色素的浓度和分布。黑色素是酚基高分子量生 物物质之一， 并且在防止由 UV 引发的皮肤损伤中起着重要作用。
已经报道了黑素细胞中存在的酪氨酸酶活性是黑色素生物合成的关键因素， 酪 氨酸酶通过将酪氨酸转化成 DOPA 和 DOPA- 醌在皮肤变黑过程中起着关键作用， DOPA 和 DOPA- 醌是黑色素聚合物产生的中间产物。
由于环境污染和汽车排出的废气， 激素不平衡变得日益恶化。鉴于此， 脱发的发 病率变得更高， 发病年龄降低， 并且由于诱导皮肤免疫系统的失调， 已经发生了各种皮肤疾 病， 如遗传性过敏症和牛皮癣。 此外， 由于膳食生活的变化， 如肉和方便食品集中的膳食， 年 轻肥胖症患者的数量快速增长。
因此， 深入地进行了研究以研发能够有效解决已经成为严重社会问题的几种现象 ( 即， 内在的老化和由 UV 引起的皱纹的发生， 黑素瘤或雀斑， 肥胖， 免疫不平衡或脱发 )。
贯穿本申请， 提及了几篇专利和出版物， 并且在括号中提供了引文。 将这些专利和 出版物的公开内容引入本申请中， 以便更全面地描述本发明和本发明所属领域的状况。
发明详述
本发明人已经进行了深入的研究来研发活性物质， 该活性物质在改善皱纹、 皮肤 增白、 UV 诱发的皮肤损伤以及防止脱发、 氧化和肥胖中具有活性， 并且具有高稳定性和安全 性， 对皮肤没有副作用。 因此， 本发明人发现了含有苦参碱或氧化苦参碱作为活性成分的组 合物可以提供用于改善皮肤状况、 抗氧化和抗肥胖的组合物， 具有极好的效果和安全性。因此， 本发明的目的是提供用于改善皮肤状况的组合物， 其中皮肤状况是皱纹、 增 白、 UV 诱发的皮肤损伤或头发生长。
本发明的另一个目的是提供用于抗氧化的组合物。
本发明的再一个目的是提供用于抗肥胖的组合物。
本发明的另一个目的是提供用于改善皮肤状况的方法。
本发明的再一个目的是提供用于防止氧化的方法。
本发明的另一个目的是提供用于抑制肥胖的方法。
本发明的其他目的和优点将从以下的详述并结合所附的权利要求和附图变得清 楚。
在本发明的一个方面中， 提供了含有苦参碱或氧化苦参碱作为活性成分的用于改 善皮肤状况的组合物， 其中皮肤状况是皱纹、 增白、 UV 诱发的皮肤损伤或头发生长。
在本发明的另一个方面中， 提供了用于改善皮肤状况的方法， 其包括将含有苦参 碱或氧化苦参碱作为活性成分的组合物施用于受试者。
在本发明的再一个方面中， 提供了苦参碱或氧化苦参碱用于制造改善皮肤状况的 组合物的用途。 在本发明的另一个方面中， 提供了用于抗氧化的含有苦参碱或氧化苦参碱作为活 性成分的组合物。
在本发明的再一个方面中， 提供了用于防止氧化的方法， 其包括将含有苦参碱或 氧化苦参碱作为活性成分的组合物施用于受试者。
在本发明的另一个方面中， 提供了苦参碱或氧化苦参碱用于制造抗氧化组合物的 用途。
在本发明的再一个方面中， 提供了用于抗肥胖的含有苦参碱或氧化苦参碱作为活 性成分的组合物。
在本发明的另一个方面中， 提供了用于抑制肥胖的方法， 其包括将含有苦参碱或 氧化苦参碱作为活性成分的组合物施用于受试者。
在本发明的再一个方面中， 提供了苦参碱或氧化苦参碱用于制造抗肥胖组合物的 用途。
本发明人已经进行了透彻的研究来研发活性物质， 该活性物质在改善皱纹、 皮肤 增白、 UV 诱发的皮肤损伤以及防止脱发、 氧化和肥胖中具有活性， 并且具有高稳定性和安全 性， 对皮肤没有副产。 因此， 本发明人发现了含有苦参碱或氧化苦参碱作为活性成分的组合 物可以提供用于改善皮肤状况、 抗氧化和抗肥胖的组合物， 具有极好的效果和安全性。
因 为 代 表 性 的 生 物 碱 物 质 主 要 在 槐 属 根 中 提 取 得 到， 因此也在日本山豆根 (Euchresta jsponica Benth) 中观察到本发明中用作活性成分的苦参碱和氧化苦参碱。 四 环 - 喹诺里西啶生物碱、 苦参碱和氧化苦参碱是源自植物的化合物， 由以下的通式 I 和 II 来表示。通常认为具有苦味的苦参碱和氧化苦参碱对癌症、 乙肝、 硬化、 细菌、 病毒、 心脏病 或皮肤疾病如牛皮癣或湿疹具有效果。
用作本发明组合物中活性成分的苦参碱和氧化苦参碱可以从天然来源提取， 天然 来源为槐属 (Sophora)， 如国槐 (Sophora japonica)、 苦参 (Sophora flavescens)、 日本山 豆根 (Euchresta japonica Benth)。详细地， 可以使用常规的各种提取方法来获得苦参碱 和氧化苦参碱。优选， 可以使用各种提取溶剂来获得苦参碱和氧化苦参碱， 例如， 在 0℃至 50℃的提取温度， 提取溶剂为 (a) 水， (b) 含有 1-4 个碳原子的无水或含水低级醇 ( 甲醇、 乙醇、 丙醇、 丁醇等 )， (c) 低级醇和水的混合物， (d) 丙酮， (e) 乙酸乙酯， (f) 氯仿或 (g)1， 3- 丁二醇。
如果需要， 可以对本发明中所用的苦参碱和氧化苦参碱进行用本领域公知方法的 附加纯化， 以及通过提取获得的那些。 例如， 可以得知使用各种附加纯化方法如使用限定分 子量截留值的超滤和各种色谱 ( 为根据大小、 电荷、 疏水性和亲和性纯化而设计的 ) 获得的 苦参碱和氧化苦参碱可以用于本发明中。
本发明的组合物具有改善皮肤皱纹的新用途。 本发明的组合物与用作抗皱剂的视 黄醇相比具有更低的细胞毒性， 并且在分子水平呈现出对胶原酶活性的抑制作用和对胶原 蛋白生物合成的促进作用， 并且作为结果， 呈现出改善皮肤皱纹的极好效果。 在以下所述的 实施例中证明了这样的作用和功效。 将认识到皮肤皱纹的改善涵盖了皮肤保护的一般用途 ( 例如， 防止皮肤皱纹、 除去皮肤皱纹和防止皮肤老化 )。
此外， 本发明用于改善皮肤状况的组合物具有皮肤增白的新用途。在此所用的术 语 “增白” 指的是防止由黑色素沉着诱发的皮肤黑化病的皮肤问题的改善。
在本发明用于皮肤增白的组合物中， 苦参碱和氧化苦参碱通过抑制胞内酪氨酸酶 活性呈现出对黑色素产生的抑制作用， 并且作为结果， 呈现出极好的皮肤增白效果。 苦参碱 和氧化苦参碱显示出高稳定性并且几乎没有副作用， 如皮肤过敏诱发。 此外， 组合物中的苦 参碱和氧化苦参碱的含量保持恒定。在以下所述的实施例中证明了这样的作用和功效。
此外， 本发明用于改善皮肤状况的组合物对 UV 诱发的皮肤损伤具有缓解、 改善、 预防或治疗作用。
本发明用于改善皮肤状况的组合物能非常有效地预防脱发或促进头发生长。 在此 所用的术语 “脱发预防” 和 “头发生长促进” 具有相同的意思。
作为本发明组合物的活性成分的苦参碱和氧化苦参碱通过消除自由基呈现出抗
氧化作用。
本发明用于抗氧化的组合物可以用于通过抑制或消除氧化情况而能够预防或治 疗的各种疾病、 失调或异常情况。通过本发明治疗的与抗氧化相关的疾病包括但不限于 神经变性失调， 如动脉粥样硬化、 冠心病、 再狭窄、 再灌注损伤、 帕金森氏症或阿病、 中风、 癌 症、 老化、 心血管障碍、 骨质疏松、 中枢神经系统障碍、 外周血管疾病和呼吸困难。 最优选， 本 发明用于抗氧化的组合物用于预防或治疗老化。 已经概括地报道了各种失调与自由基损伤 之间的关联， 并且包括酶、 离子通道、 结构蛋白和膜脂质的各种细胞的成分是对抗反应性自 由基物质的潜在目标 (Rice-Evans C， Mol Aspects of Med 13(1) ： 1-111(1992))。潜在目 标和自由基的反应削弱了特定范围的细胞功能， 诱发病理变化并最终使细胞死亡。美国专 利 US 5750351 ； US 5773209 ； US 5773231 和 US 5846959 中公开了由生理氧化引起的各种 疾病。
本发明用于抗氧化的组合物通过对消除自由基的极好效果来保护 DNA、 蛋白质 ( 包括脂蛋白 ) 和膜脂质免受氧化性损伤。
此外， 作为本发明活性成分的苦参碱和氧化苦参碱具有极好的抗肥胖作用。
本领域技术人员清楚由通式 I 和 II 表示的苦参碱和氧化苦参碱包括使用取代基 通过本领域技术人员通常进行的化学方法获得的衍生物。 衍生物通过促进胶原蛋白合成和 / 或抑制胶原酶 (MMP-1) 活性显示出皱纹改善作用， 或皮肤增白、 UV 诱发皮肤损伤改善、 皮 肤生长促进或防止脱发、 抗氧化和抗肥胖作用。 更特别地， 用作本发明活性成分的苦参碱和 氧化苦参碱包括通式 I 和 II 的衍生物以及通式 I 和 II 的化合物。使用本领域公知的各种 取代基通过方法获得具有与通式 I 和 II 核相同的结构核的衍生物。 例如， 提出通过将羟基、 卤素、 硝基或 C1-4 烷基连接通式 I 和 II 的环碳形成的衍生物预期发挥与苦参碱和氧化苦 参碱相同或相似的作用。这些取代的衍生物也落入本发明的范围内。
根 据 优 选 的 实 施 方 案， 本发明中的苦参碱或氧化苦参碱活性成分以 0.00001-15.0wt ％的含量存在， 更优选， 0.0001-10wt ％， 最优选， 0.0001-5wt ％， 基于组合 物的总重。 如果苦参碱或氧化苦参碱活性成分的含量低于 0.00001wt％， 组合物的作用是微 不足道的 ； 在超过 15.0wt％的情况中， 非常可能发生一些副作用， 如皮肤刺激和制剂的不 稳定性。
根据优选的实施方案， 本发明的组合物是化妆品组合物。
本发明的化妆品组合物除了作为活性成分的苦参碱或氧化苦参碱外， 可以含有助 剂以及载体。助剂的非限制性实例包括抗氧化剂、 稳定剂、 增溶剂、 维生素、 着色剂、 臭味改 善剂或这些成分的混合物。 此外， 化妆品组合物可以另外含有促进皮肤吸收的物质， 以增强 效果。
本发明的化妆品组合物可以配制成各种形式， 对于非限制性实例， 包括溶液、 悬浮 液、 乳液、 糊剂、 凝胶、 霜剂、 化妆水、 粉末、 皂、 含表面活性剂的清洁剂、 油、 粉底、 粉底乳、 粉 底蜡和喷雾。详细地， 可以以皮肤软化剂 ( 润肤液 )、 营养乳液 ( 奶液 )、 营养霜、 按摩霜、 香 精、 眼霜、 洁面霜、 洁面泡沫、 洁面水、 面膜、 喷雾剂或粉末的形式来提供本发明的化妆品组 合物。
本发明化妆品组合物中含有的化妆品可接受载体可以根据制剂的类型而改变。 例 如， 糊剂、 霜或凝胶的制剂可以含有动物和植物脂肪、 蜡、 石蜡、 淀粉、 黄蓍胶、 纤维素衍生物、 聚乙二醇、 硅氧烷、 膨润土、 二氧化硅、 滑石、 氧化锌或这些成分的混合物。
在粉末或喷雾的制剂中， 可以含有乳糖、 滑石、 二氧化硅、 氢氧化铝、 硅酸钙、 聚酰 胺粉末或这些成分的混合物。喷雾剂可以另外含有常规的推进剂， 例如， 氟氯烃、 丙烷 / 丁 烷或二甲醚。
溶液和乳液的制剂可以含有溶剂、 增溶剂或乳化剂， 例如， 水、 乙醇、 异丙醇、 碳酸 乙酯、 醋酸乙酯、 苯甲醇、 苯甲酸苄酯、 丙二醇、 1， 3- 丁二醇油、 甘油脂肪酸酯、 聚乙二醇、 山 梨聚糖的脂肪酸酯或这些成分的混合物。
悬浮液的制剂可以含有液体稀释剂， 例如， 水、 乙醇或丙二醇， 悬浮剂， 例如， 乙 氧基化异硬脂醇、 聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯山梨聚糖酯、 微晶体纤维素、 偏氢氧化 (metahydroxide) 铝、 膨润土、 琼脂和黄蓍胶或这些成分的混合物。
含有表面活性剂的清洁组合物的制剂可以含有脂肪醇硫酸盐、 脂肪醇醚硫酸盐、 磺基琥珀酸单酯、 isothinate、 咪唑衍生物、 甲基牛磺酸盐、 肌氨酸盐、 脂肪酰胺醚硫酸盐、 烷基氨基甜菜碱、 脂肪醇、 脂肪酸甘油酯、 脂肪酸二乙醇酰胺、 植物油、 羊毛脂衍生物、 乙氧 基化甘油脂肪酸酯或这些成分的混合物。
可以将本发明的组合物制成药物组合物， 并且药物组合物中含有药物学上可接受 的载体以及活性成分。通常用于药物制剂中的药物学上可接受的载体包括但不限于乳糖、 葡萄糖、 蔗糖、 山梨糖醇、 甘露醇、 淀粉、 rubber arable、 磷酸钾、 arginate、 明胶、 硅酸钾、 微 晶体纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮、 纤维素、 水、 糖浆、 甲基纤维素、 甲基羟基苯甲酸酯、 丙基羟基 苯甲酸酯、 滑石、 硬脂酸镁和矿物油。根据本发明的药物组合物可以进一步包括润滑剂、 润 湿剂、 甜味剂、 调味剂、 乳化剂、 悬浮剂和防腐剂。 合适的药物学上可接受的载体和制剂的详 细内容可以在 Remington’ s Pharmaceutical Sciences( 第 19 版， 1995) 中找到。 可以通过各种途径将本发明的药物组合物给药于哺乳动物， 如大鼠、 小鼠、 家畜和 人， 给药途径例如为口服、 直肠给药或静脉内注射、 肌内注射、 皮下注射、 子宫内注射或脑室 内注射， 优选皮下注射， 更优选局部施用。
本发明药物组合物的合适剂量可以根据药物配制方法、 给药方法、 患者的年龄、 体 重、 性别、 发病状况、 饮食、 给药时间、 给药途径、 排泄率和对所用药物组合物的敏感度而改 变， 并且本领域普通医师可以决定用于所需治疗的药物组合物的有效量。在口服制剂的情 况中， 一天给药一次至几次合适的单位剂量， 基于成人为 0.001-100mg/kg。 在外用制剂的情 况中， 可以通过一天施用一次至五次来给予合适的单位剂量， 基于成人为 1.0 至 3.0ml 的含 量， 并且最好使用超过 1 个月。然而， 单位剂量没有限制本发明的范围。
根据本领域技术人员已知的常规技术， 本发明的药物组合物可以与如上所述的药 物学上可接受的载体和 / 或介质一起配制， 最终提供单位剂型和多剂量形式的几种形式。 制剂的非限制性实例包括但不限于口服制剂， 如粉末、 颗粒、 片剂、 胶囊、 悬浮液、 乳液、 糖浆 和气雾剂， 外用制剂， 如膏剂和霜剂、 栓剂和无菌注射液， 可以进一步含有分散剂或稳定剂。
本发明的组合物可以制成食品组合物。 本发明的食品组合物可以含有用于制备食 品组合物的常规添加剂， 例如， 蛋白质、 碳水化合物、 脂质、 营养物质和调味剂。
上述碳水化合物的非限制性实例包括但不限于单糖 ( 例如， 葡萄糖和果糖 ) ； 双糖 ( 例如， 麦芽糖、 蔗糖和寡糖 ) 和多糖 ( 例如， 糊精和环糊精 ) ； 以及糖醇 ( 例如， 木糖醇、 山 梨糖醇和赤藓醇 )。调味剂的非限制性实例包括但不限于天然调味剂 [ 竹芋蛋白和蜜叶糖
的提取物 ( 例如， 甜叶菊甙 A 和甘草甜素 )] 和合成调味剂 ( 例如， 糖精和阿斯巴甜 )。
例如， 在作为饮料提供本发明的食品组合物的情况中， 可以进一步含有柠檬酸、 液 体果糖、 蔗糖、 葡萄糖、 醋酸、 苹果酸、 果汁、 杜仲提取物、 枣提取物或甘草提取物。
同时， 累积的皮肤刺激的实验结果说明作为天然物质的苦参碱和氧化苦参碱对本 发明的特定实施例中对人体是无害的。 因此， 由于几乎不具有毒性和副作用， 本发明的苦参 碱和氧化苦参碱有把握可以长期使用， 特别可以用于化妆品、 药物和食品组合物中， 如上所 述具有安全性。
本发明的特征和优点的概述如下 ：
(i) 本发明的组合物含有苦参碱和氧化苦参碱作为活性成分。
(ii) 苦参碱和氧化苦参碱具有比用作抗皱剂的视黄醇具有更低的细胞毒性， 并在 分子水平呈现出对胶原酶活性的抑制作用和对胶原蛋白生物合成的促进作用， 具有改善皮 肤皱纹的良好功效。此外， 苦参碱和氧化苦参碱两者都通过抑制胞内酪氨酸酶活性呈现出 对黑色素产生的抑制， UV 诱发的皮肤损伤的改善效果和促进皮肤生长或防止脱发。因此， 苦参碱和氧化苦参碱对皮肤状况具有极好的改善作用。
(iii) 此外， 苦参碱和氧化苦参碱具有极好的抗肥胖和抗氧化作用。
(iv) 本发明的组合物可以用于化妆品、 药物和食品组合物， 没有细胞毒性和副作用。 附图简述
图 1 是显示了作为活性成分的苦参碱和氧化苦参碱与 RA 相比较对抗人成纤维细 胞具有更低细胞毒性的图。RA 表示视黄酸。RA、 苦参碱和氧化苦参碱各自以 1μM、 10μM 和 50μM 的含量来处理。
图 2 是显示出苦参碱和氧化苦参碱对胶原蛋白 (1 型胶原蛋白 ) 的促进作用的图。 RA 以 1μM 的含量来处理。
图 3 表示作为本发明活性成分的苦参碱和氧化苦参碱对胶原酶 (MMP-1) 的抑制作 用。MMP-1 和 PMA 各自表示 1 型胶原酶和佛波醇肉豆蔻酸醋酸盐。PMA 以 100nM 的含量来 处理。
现在通过实施例来进一步详细描述本发明。 本领域人员将清楚这些实施例是用来 更具体地说明， 而所附权利要求中列出的本发明的范围不限于这些实施例或不受这些实施 例所限。
实施例 实施例 1 ： 苦参碱和氧化苦参碱对皱纹改善作用的测量
通常可以通过胶原蛋白生物合成能力、 胶原酶降解抑制能力和人临床测试来测量 皱纹改善作用的测试。
将人成纤维细胞 ( 通常获自 pacific) 接种于 6- 孔平板 (2×105 细胞 / 孔 ) 并将 细胞平板在 5％ CO2 培养箱中在 37℃孵育 24 小时。24 小时后， 除去每个孔中的培养基并用 各种浓度处理样品， 接着再次孵育 24 小时。孵育后， 收集细胞培养基并用作样品。为了测 量样品对成纤维细胞的细胞毒性， 以剩余培养基体积的 1/10 倍将 MTT 试剂 (1mg/ml) 加入 每个孔中， 孵育 3 小时， 并除去培养基。将培养基溶解于 DMSO 中并测量其在 540nm 处的吸
光度。 通过使用 I 型原骨胶原 C- 肽 EIA 试剂盒 (MK101， Takara， 京都， 日本 ) 测量细胞 培养基中的 I 型原骨胶原 C- 肽 (PICP) 含量来测定胶原蛋白合成的程度。根据制造商的实 验方案来进行该方法。
作为测量胶原酶 ( 分解胶原蛋白的酶 ) 活性的方法， 使用了针对胶原酶的抗体。 作 为诱导胶原酶活性的材料， 处理了 PMA( 佛波醇肉豆蔻酸醋酸酯， Sigma)。为了测量胶原酶 活性， 使用了 1 型胶原酶测试试剂盒 (Amersham Biosciences， RPN2629)， 并使用 ELISA 阅 TM 读器 (Bio-Tek ELx808 系列超微平板阅读器， U.K) 测量吸光度。将测量的平均值表示为 平均 ± 标准偏差。进行使用 SPSS/PC+ 的 T- 检验来确定显著性， 并且结果显示于表 1 中。
表1
如表 1 中所示的， 苦参碱和氧化苦参碱以浓度依赖性方式提高了胶原蛋白合成并 抑制了胶原酶活性。同时， 发现了苦参碱对胶原蛋白合成和胶原酶活性抑制的作用比氧化 苦参碱更好。
因此， 这些结果证明苦参碱和氧化苦参碱具有皱纹改善的作用。
制备实施例 A 和比较制备实施例 ： 营养霜的制备
按照表 2 中所示的制备含有苦参碱和氧化苦参碱的营养霜 ( 制备实施例 A)。将 包括纯水、 三乙醇胺和丙二醇的水相以及包括脂肪酸、 油成分、 乳化剂和防腐剂的油相加热 至 70℃并混合乳化。乳化完成后， 将乳液冷却至 45℃。加入苦参碱、 氧化苦参碱和香料并 分散， 然后冷却至 30℃。相反， 以与制备实施例 A 相似的方式制备比较制备实施例， 除了使 用纯水替代苦参碱或氧化苦参碱。
表 2 含有苦参碱或氧化苦参碱的营养霜的成分和含量
成分 苦参碱或氧化苦参碱 荷荷巴油 液体石蜡 棕榈醇 甲基葡萄糖二硬脂酸聚甘油 -3 酯 硬脂酸甘油酯 含量 (wt％ ) 1.00 或 5.00 5.0 7.0 2.0 2.0 0.59102423312 A CN 102423317 角鲨烯 丙二醇 甘油 三乙醇胺 羧基乙烯聚合物 醋酸生育酚 防腐剂， 香料 纯水 总计
说明书3.0 4.0 5.0 0.3 0.3 0.2 微量 添加至 100 1008/16 页实施例 2 ： 含有苦参碱和氧化苦参碱的化妆品对皱纹改善作用的测量
在临床证明中测量了含有苦参碱和氧化苦参碱的化妆品对皱纹改善的作用。 使用 了制备实施例 A( 含有含量各自为 1％和 5％的苦参碱和氧化苦参碱的营养霜 ) 和比较制备 实施例 ( 含有纯水的营养霜 ) 中制备的营养霜。
通过测量皮肤弹性的变化来评价皱纹改善作用。在 24℃至 26℃的稳定环境温度 和 38％至 40％的湿度下对 30 名健康女性测试者 ( 年龄 25 至 35) 进行测量。一天两次将 制备实施例 A 的 4 种营养霜和比较制备实施例的营养霜施用至测试者面部皮肤 3 个月后， 使用 Cutometer SEM474(Courage+Khazaka， Cologne， 德国 ) 测量弹性。对皮肤弹性设定从 零至 5 范围内的相对级别， 零为没有弹性， 5 为测量的最高弹性， 并且结果显示于表 3 中。
表3
如表 3 所示， 本发明的制备实施例 A 与比较制备实施例相比， 显示出对皱纹改善明 显更好的作用， 并且皮肤弹性随着苦参碱和氧化苦参碱浓度的提高而提高。
实施例 3 ： 苦参碱和氧化苦参碱对黑色素产生的抑制作用的测量
使用 B16 小鼠黑素瘤细胞 ( 韩国细胞系库 ) 测量苦参碱和氧化苦参碱对黑色素产 生的抑制后， 将测量值与熊果苷对黑色素产生的抑制相比较， 熊果苷是已知的黑色素产生 抑制剂。
将 B16 小鼠黑素瘤细胞 F10( 韩国细胞系库 ) 接种于 6- 孔平板每个孔 (1×105 细 胞 / 孔 ) 中含有 10 ％ FBS( 胎牛血清 ) 的 DMEM(Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 ) 中， 并通 过在 37℃和 5.0％ CO2 的条件下在 CO2 培养箱中孵育将细胞培养至约超过 80％汇合。培养 后， 除去培养基并将样品重新放入以合适浓度稀释的培养基中， 接着在 37℃和 5.0％ CO2 的 条件下孵育 3 天。 测定 10μM、 100μM 和 500μM 的苦参碱和氧化苦参碱的浓度， 没显示出细 胞毒性。用 PBS( 磷酸盐缓冲盐水 ) 洗涤除去培养基的细胞并用胰蛋白酶处理来收集细胞。 使用血细胞计数器 (Tiefe Depth Profondeur 0.100mm， Paul Marienfeld GmbH & Co.KG， D.E) 计算收集细胞的数目， 在 5,000 至 10,000rpm 离心 10 分钟并除去上清液， 因此获得沉 淀物。将该细胞沉淀物在 60℃干燥， 加入 100μl 含有 1M NaOH 的 10％ DMSO， 并在 60℃的 培养箱中获得胞内黑色素。然后， 使用微平板阅读器 (Bio-Tek ELx8081U， U.S) 测量细胞溶 液在 490nm 处的吸光度， 并且估算黑色素含量 / 细胞常数。实验结果概括于表 4 中。
表4
如表 4 中所示， 苦参碱和氧化苦参碱以浓度依赖性方式抑制黑色素产生。此外， 发 现了苦参碱和氧化苦参碱与熊果苷相比， 显示出对黑色素产生的抑制作用明显更好。
实施例 4 ： 苦参碱和氧化苦参碱对酪氨酸酶活性的抑制作用
使用 B16 小鼠黑素瘤细胞 ( 韩国细胞系库 ) 测量苦参碱和氧化苦参碱对黑色素产 生的抑制后， 将测量值与熊果苷对胞内酪氨酸酶活性的抑制相比较， 熊果苷是已知的黑色 素产生抑制剂。
将鼠黑素瘤 (B-16F1) 细胞接种于 6- 孔平板每个孔 (1×105 细胞 / 孔 ) 中含有 10％ FBS( 胎牛血清 ) 的 DMEM 中， 并通过在 37℃和 5.0％ CO2 的条件下在 CO2 培养箱中孵育 将细胞培养至约超过 80％粘附。培养后， 除去培养基并将样品重新放入以合适浓度稀释的 培养基中， 接着在 37℃和 5.0％ CO2 的条件下孵育 3 天。测定 10μM、 100μM 和 500μM 的 苦参碱和氧化苦参碱的浓度， 没显示出细胞毒性。用 PBS( 磷酸盐缓冲盐水 ) 洗涤除去培养 基的细胞并用胰蛋白酶处理来收集细胞。 使用血细胞计数器计算收集细胞的数目， 在 5,000 至 10,000rpm 离心 10 分钟并除去上清液， 因此获得沉淀物。使用裂解缓冲液将该细胞沉淀 物裂解， 在 12,000rpm 离心 10 分钟， 并收集上清液。然后， 使用微平板阅读器测量细胞溶液 在 492nm 处的吸光度， 并且估算酪氨酸酶活性 / 细胞常数。实验结果概括于表 5 中。
表5
如表 5 中所示， 结果证明苦参碱和氧化苦参碱比熊果苷对胞内酪氨酸酶活性的抑 制作用明显更高。实施例 5 ： 动物水平中皮肤增白作用的评价
使用棕色豚鼠 (Charles River Laboratories， Inc.) 测量苦参碱和氧化苦参碱的 增白作用， 已知豚鼠暴露于紫外线时与人一样能增加其色素沉着。
为了引起棕色豚鼠中由紫外线 (UV) 引起的色素沉着， 将带有 3×3cm2 方格的铝箔 粘在棕色豚鼠除去毛发的腹部皮肤， 然后使用 SE 灯 ( 波长 290-320nm， Toshiba) 对其上照 2 射 UV 光 ( 总照射能量＝ 1350mJ/cm )。UV 照射后， 除去铝箔， 并按照以下的方法施用样品 ( 苦参碱、 氧化苦参碱或熊果苷 )。在 UV 照射后第 2 天或第 3 天观察到提高的色素沉着， 并 且在约 2 周后达到最大。从最大开始， 施用样品。施用一天进行一次或两次， 持续 50 天。将 样品溶解或稀释于特定溶剂中 ( 丙二醇∶乙醇∶水＝ 5 ∶ 3 ∶ 2) 并通过棉签施用。只含 有溶剂的对照施用至另一部位。还检查了累积刺激的发生。
使用色度测量计 (CR2002， MINOLTA， JP) 测定皮肤色素沉着的程度来评估所用样 * * * 品的作用。结果显示于以下的表 6 中。使用 L a b 比色体系将颜色分级并且将 L* 值用作本 发明中的标准。使用白板标准校正 L* 值， 并且在一个部位重复测量超过五次。色素沉着均 匀分布。 获得施用最初点和施用最终点之间的肤色差异 (ΔL*)， 然后使用这些值， 计算施用 样品的作用。 等式 1
ΔL* ＝施用后 00 天时的 L* 值 - 施用开始那天的 L* 值
在样品施用部位和对照施用部位都获得 ΔL* 值并比较， 由此可以评价增白物质的 作用。这些实验结果概括于以下的表 6 中。
表6
如表 6 中所述， 苦参碱和氧化苦参碱以浓度依赖性方式呈现出增白作用。此外， 苦 参碱和氧化苦参碱比熊果苷显示出更好的增白作用， 并且还具有安全性， 因为没有观察到 累积刺激的发生。
实施例 6 ： 苦参碱和氧化苦参碱对人皮肤的安全性测试
为了确定苦参碱和氧化苦参碱对用于人皮肤上是否安全， 进行了皮肤安全性测 试。为此合适的是累积皮肤刺激测试。
将含有 1％、 5％和 10％含量苦参碱和氧化苦参碱的角鲨烯基制剂在贴剂中施用 于 30 名健康成人的上臂 9 次， 每人一天一次， 持续 24 小时的总时间段。进行这 24- 小时累 积贴剂测试来测定苦参碱和氧化苦参碱是否刺激了皮肤。
选择芬兰室 (Epitest 有限公司， 芬兰 ) 作为贴敷方法。将以上用于外用于皮肤上 的制剂以 15μl 的含量滴入每个室中， 并施用贴剂。使用以下的等式 1 将每个测试皮肤上 的反应水平评分， 并且结果显示于表 7 中。
等式 2
平均反应水平＝ [{( 反应指数 × 反应水平 )/ 测试患者的数目 × 最大点 (4 点 )}×100]÷ 测试的数目 (9 次 )
根据反应水平来标记点， 例如， ± 表示 1 点， + 表示 2 点， 而 ++ 表示四点。如果平 均反应水平低于 3， 可以认为组合物是安全的。
表7
在表 7 中， 人的数目各自为零、 1、 2、 零、 2 和 2， 对于测试 1、 2、 3、 4、 5 和 6 中所有的 ±、 + 和 ++， 计算平均反应水平不超过 3。因为平均反应水平低于 3， 证明苦参碱和氧化苦参 碱对于人皮肤是安全物质， 没有显示出任何明显的累积刺激。
实施例 7 ： 抗氧化作用
已知超氧化物岐化酶 (SOD) 是抗氧化催化酶， 其将超氧化物阴离子转化成 H2O2 和 O2。该实验通过观察除去由黄嘌呤氧化酶产生的超氧化物阴离子来评价样品的抗氧化活 性。使用购自 Dojindo(JP) 的试剂盒 (SOD 测试试剂盒 -WST) 根据制造商的实验方案来进 行实验。实验结果概括于表 8 中。
表8
如表 8 中所示， 本发明的苦参碱和氧化苦参碱以浓度依赖性方式发挥抗氧化作 用。同时， 氧化苦参碱相对于苦参碱显示出略微更好的抗氧化作用。
实施例 8 ： 抗炎作用的评价
为了测定苦参碱和氧化苦参碱是否具有抗炎作用， 使用人单核细胞 THP-1 细胞 ( 韩国细胞系库 ) 根据常规方法进行 COX( 环氧合酶 ) 抑制能力的实验。根据 F.J.Van de Ouderaaa 和 Muytenhek 公开的 Methods in Enzymology( 酶学方法 )43 ： 9(1994) 测量 COX 活性。培养 THP-1 细胞系并等分至 24 孔平板中。将孵育体积 / 孔调节至 500μl， 分别加 入以下表 9 中所述的溶解于脂多糖 (1μg/ml， Sigma) 中的 2μl 样品化合物和溶剂， 并在相 同条件下培养 24-48 小时。24-48 小时后， 将钙离子载体 (Sigma) 和 [1-14C] 花生四烯酸 Sigma) 加入每个孔中， 并在相同条件下培养 10 分钟。培养后， 1μl(EtOH 中， 0.1μCi/ml， 将柠檬酸加入每个孔中， 用于调节至 pH 3.5， 振荡， 从平板中取出每 500μl 培养溶液等分 至微离心管中， 将 700μl 乙酸乙酯加入其中， 并将溶液振荡提取 10 分钟。使用速度真空干 燥器将 500μl 乙酸乙酯层浓缩 20 分钟， 将 20μl 残余物溶解于乙酸乙酯中， 并在含有可信 标准品的 TLC 平板中使用所得物。 通过类二十烷酸可信标准品来鉴定放射性条带， 使用 BAS 2000 生物图像分析仪 (Fuji， JP) 来测量所鉴定条带的放射性 ( 表 9)。
表9
如表 9 中所述的， 结果提出苦参碱和氧化苦参碱随着处理浓度提高有效地抑制了 COX 活性。从这些结果， 发现了苦参碱和氧化苦参碱具有炎症抑制作用。
实施例 9 ： 免疫抑制作用的评价
为了检测该实施例中所用的样品是否抑制与炎症相关的免疫应答， 进行了白细胞 间介素 -2 荧光素酶报告子活性的实验。报道了保细胞间介素 -2 启动子在炎症相关的细胞 因子的产生中起着重要作用。使用以下方法测量了白细胞间介素 -2 荧光素酶的活性 ： 将 6 人 T 淋巴细胞系， 1×10 个 Jurkat 细胞 ( 韩国细胞系库 ) 等分至 6- 孔的每个孔中， 使用 superfect 转染试剂 (In vitrogen) 转染 IL-2 荧光素酶报告子质粒 DNA(Stratagene)。转 染后 24 小时， 处理 PHA( 植物血球凝集素， Sigma)(100ng/ml) 来激活 Jurkat 细胞， 并且用 不同的浓度来处理每种样品。24 小时后， 收集细胞并使用光度计 (Berthold Technologies GmbH&Co.KG， 德国 ) 测量荧光素酶活性。结果概括于表 10 中。
表 10
样品 PHA(100ng/ml) PHA(100ng/ml)+ 苦参碱 (10μM) PHA(100ng/ml)+ 苦参碱 (100μM) PHA(100ng/ml)+ 苦参碱 (500μM) IL-2 荧光素酶活性 100 92 77 6816102423312 A CN 102423317说明书95 78 6215/16 页PHA(100ng/ml)+ 氧化苦参碱 (10μM) PHA(100ng/ml)+ 氧化苦参碱 (100μM) PHA(100ng/ml)+ 氧化苦参碱 (500μM)
如表 10 中所示， 结果提出苦参碱和氧化苦参碱随着处理浓度提高通过抑制 IL-2 表达而具有免疫调节活性。
实施例 10 ： 抗肥胖作用
使用公知的动物通过以下方法来进行肥胖抑制测试。表 11 显示了结果。
测定肥胖抑制活性的方法如下 ：
Crj ： 将 7 周大的 ICR 雄性小鼠 ( 获自 Charles River Japan Ltd) 初步喂养 1 周， 然后分成 7 组， 每组 7 只动物， 并接受测试。 将动物在每天 12 小时光照下饲养在热 - 湿度恒 定器中， 温度 23±1℃， 湿度 55±5％。给它们喂养饲料 Labo MR( 由 Nippon Nosan 制造 )， 并使它们自由饮水。将苦参碱以 5％卵磷脂中的脂质体形式变成 0.1％和 1％。调节每个样 品溶液的浓度， 使得给予 0.1ml 溶液 /10g 小鼠体重。所用的剂量为 1.5g/kg 和 1g/kg。对 于对照组， 给予 5％卵磷脂乳液。使小鼠禁食后， 在第二天强迫给予样品一次。在 2 周的测 试阶段过程中， 监控体重和一般情况。
表 11
如表 11 中所示的， 在苦参碱和氧化苦参碱中， 体重增加得到抑制。观察到按照给 药的浓度， 作用的优点很高。
实施例 11 ： 预防脱发和促进头发生长的作用
为了测量预防脱发和促进头发生长的作用， 制备只含有粘度增强剂和防腐剂的水 凝胶基形式的样品， 并进行测试。将为促进头发生长制备的每 3cc 外用液体施用至 10 名脱 发患者的脱发部位， 一天两次， 持续 3 个月。结果， 含有样品的液体显示出极好的作用， 如8 名脱发患者产生了发根。实验结果如下。对照组使用购自 Hanmi pharmaceutical 的米诺 地尔 (moxidil)。
表 12
17102423312 A CN 102423317
未处理组
说米诺地尔 ++明书苦参碱 ++ 氧化苦参碱 ++16/16 页如表 12 中所示的， 结果证明本发明的苦参碱和氧化苦参碱发挥出与作为头发生 长制剂的可购得的米诺地尔相似的头发生长效果。
如上所述， 本发明提供了含有苦参碱和氧化苦参碱作为活性成分的用于改善皮肤 状况的组合物。苦参碱和氧化苦参碱与用作抗皱剂的视黄醇相比具有更低的细胞毒性， 并 在分子水平上呈现出对胶原酶活性的抑制作用和对胶原蛋白生物合成的促进作用， 并且作 为结果， 呈现出极好的改善皮肤皱纹的功效。 此外， 苦参碱和氧化苦参碱通过抑制胞内酪氨 酸酶活性呈现出对黑色素产生的抑制作用， 改善 UV 诱发的皮肤损伤的作用和促进皮肤生 长或预防脱发。因此， 苦参碱和氧化苦参碱具有极好的抗肥胖和抗氧化作用。由于不具有 细胞毒性和副作用， 本发明的组合物可以用于化妆品、 药物和食品组合物中。
已经描述了本发明的优选实施方案， 应当理解落入本发明精神内的变化和改变是 本领域技术人员显而易见的， 并且本发明的范围由所附权利要求及其等价物来确定。