从羊肚菌粗多糖中提取单一多糖的方法及其产品 本发明涉及一种利用离子交换柱层析和凝胶柱层析方法，从羊肚菌粗多糖中提取具有生物活性的一定分子量，官能团结构确定的单一多糖的方法及其产品。
羊肚菌目前被誉为世界上最名贵的食用菌，属于低温型大型食药兼用菌，早在我国《广菌谱》和《本草纲目》中被列入“菜部”中，称为羊肚菜。其肉质脆嫩，香甜可口，是食用菌中的珍品之一。现代医学临床表明羊肚菌中含有抗癌的有效成份，具有增强免疫力，抗肿瘤，防衰老等方面的作用而越来越被世人重视。食用菌多糖具有独特的生物学特性而日益受到人们亲睐，如：香菇多糖，槐耳多糖等被用于增强免疫功能，治疗肝炎和肿瘤。由于羊肚菌中多糖的复杂性以及分离和分析方法的种种限制，羊肚菌多糖的种类至今尚未探明，其结构也未完全确定，对羊肚菌多糖的结构与它的药理作用关系的报导也很少。人们对羊肚菌地认识和使用上还停留在原汁原味的剂量大，携带和食用均不方便的营养原液阶段，目前，对羊肚菌的分离提纯，拿到有效生物活性的杂多糖，是现代医药学研究的一个问题。
本发明的目的就是利用离子交换柱层析方法和凝胶柱层析等方法，从羊肚菌营养液中提取具有生物活性的一定分子量，官能团结构确定的纯多糖。
本发明的技术方案是这样的：采用去离子水和含有Cl-的溶液为洗脱液，通过纤维素离子交换柱及凝胶柱，将从羊肚菌营养液中超滤得到的分子量为1-10万的粗多糖进行纯化分离得到两种单一纯多糖，它们是由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖(摩尔比为1.75∶4.13∶0.71∶0.68)缩合而成，具有α-吡喃糖苷键分子量为23000的杂多糖和由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、木糖(摩尔比为3.85∶14.9∶51.3∶0.528∶1.77∶3.58)缩合而成，具有β-吡喃糖苷键、分子量为44000的杂多糖。首先装填离子交换纤维素柱，取一定量的DE-52纤维素，将其在分析纯的三(羟甲基)氨基甲烷和盐酸混配的缓冲液中浸泡，使之pH值为9.6，使离子交换纤维素变为OH-型。将浸泡过的DE-52纤维素搅拌、振荡均匀填入玻璃柱中，用蠕动泵输入三(羟甲基)氨基甲烷和盐酸混配的缓冲液，pH值9.6，平衡适当的时间。第二步将用超滤方法从羊肚菌培养液中提取的分子量为1-10万的粗多糖溶于去离子水中，去离子水用量以充分溶解粗多糖为准，将溶解液直接慢慢上样于柱头。用蠕动泵将去离子水注入离子交换纤维素柱，流速为0.8-1.2ml/min，时间为8-10小时，充分洗脱完全后，用0.05-0.4M的Cl-水溶液继续洗脱6-10小时，流速为0.8-1.2ml/min，温度为室温，收集洗脱液，将收集的洗脱液用苯酚-硫酸法测定多糖峰位，合并单一多糖将测定在490nm有最大吸收高峰的洗脱液收集。用0.5-1.0M的Cl-水溶液继续洗脱DE-52纤维素柱中的羊肚菌粗多糖溶液，时间为6-10小时，流速0.8-1.2ml/min，收集洗脱液，将收集的洗脱液用苯酚-硫酸法测定多糖峰位，合并单一峰多糖将测定在490nm有最大吸收高峰的洗脱液收集。分别将两种单一多糖冷冻干燥得到两种白色粉末状单一多糖，将这两种单一多糖分别溶于蒸馏水中，蒸馏水用量以充分溶解单一多糖为准。然后分别上样于SepHarose CL-6B凝胶柱，用蒸馏水充分洗涤、收集，将收集液再经过苯酚-硫酸法检测多糖峰位，分别收集在490nm高吸收峰位的收集液，将收集液进行脱盐处理后，冷冻干燥，得到两种白色棉絮状单一多糖成品。
分别将两种单一多糖经KBr压片，按常规测定红外光谱，随后做核磁共振波谱分析。
1.纯度鉴定及分子量测定
本实验用高效液相色谱法鉴定多糖纯度并测定其分子量。高效液相色谱仪为Waters 600，Ultrahydrogel 2000和Ultrahydrogel 500色谱柱串联，Waters 410型示差折光检测器。流动相为0.1mol/L磷酸盐缓冲液，流速为0.6ml/min。
测得两种单一多糖分子量分别为23000和44000，
测得各单一多糖在Waters HPLC上洗脱为单一峰。
2.高效毛细管电泳分析
分别取两种单一多糖10mg溶于1ml 1mol/L硫酸中，封管水解10h，中和，离心，上清液与α-萘胺衍生后进行HPCE分析。混和单糖标准采用同样方法衍生后进行分析。高效毛细管电泳实验条件：电压18KV，电流46μA，紫外检测波长254nm，硼砂缓冲液100mmol/L，pH10.0。测定第一次洗脱出的单一多糖含有葡萄糖，甘露糖，阿拉伯糖，半乳糖四种单糖。第二次洗脱出的单一多糖含有阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、六种单糖。
3.对第一种单一多糖进行紫外光谱显示，在260nm和280nm处未见蛋白质及核酸的特征吸收峰。元素分析结果为含碳39.68％，含氢为6.2％，不含氮。红外光谱显示在4000cm-1-650cm-1区内具有多糖类物质的一般特征。在3500-3300cm-1的吸收峰是游离OH的伸缩振动峰，在1026cm-1和1078cm-1为吡喃糖环的醚键C-O-C振动吸收峰；在890cm-1附近没有β-糖苷键的特征吸收峰，而在840cm-1处有α-糖苷键的特征吸收峰，而在810cm-1处的振动吸收峰表明有甘露糖的存在。13C-NMR无呋喃糖基化学位移，主要为吡喃糖基(δ102.97ppm)化学位移。由于在99-110ppm共振范围清楚呈现四个共振信号，说明此单一糖为四个不同单糖残基的重复单位组成的杂多糖。在1H-NMR中δ5.47及5.15ppm的共振信号，即C1质子区的信号峰在5.0ppm以上，进一步证明糖苷键为α型。经过以上测试证明，提取出的第一种单一多糖为由葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖缩合而成的，具有α-吡喃糖苷键的分子量为23000的杂多糖。
对获得的第二种单一多糖，进行与第一种单一多糖同样的紫外光谱和红外光谱测定，结果相同，只是在890cm-1附近有β-糖苷键的特征吸收峰，而在840cm-1处没有α-糖苷键的特征吸收峰。在1H-NMR中δ4.80ppm的共振信号，即C1质子区的信号峰在5.0ppm以下，进一步证明糖苷键为β型。从以上实验证明，本发明获得的第二种单一多糖为由木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、果糖缩合而成的，具有β-吡喃糖苷键的分子量为44000的杂多糖。
用DE-52纤维素离子交换柱和SepHarose CL-6B柱，用去离子水洗脱完全后以含有不同浓度的Cl-的水作为洗脱液，对羊肚菌粗糖进行纯化分离分别得到四种单糖(葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖，甘露糖)残基为重复单元缩合而成的，其分子量为23000，具有α-吡喃糖苷键的杂多糖和六种单糖(木糖，果糖、葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖，甘露糖)残基为重复单元缩合而成的，其分子量为44000，具有β-吡喃糖苷键的杂多糖，工艺简单，操作方便，可以得到具有生物活性的一定分子量，官能团结构确定的纯多糖，为下一步研究羊肚菌多糖生物活性和走向更高层次的生化市场打下基础。
图1羊肚菌多糖在DE-52上洗脱曲线。
图2羊肚菌多糖在SepHarose CL-6B上洗脱曲线。
图3高效液相色谱对两种单一多糖的分子量测定。
图4高效毛细管电泳图。
图中：2、4.甘露糖、3.葡萄糖、5.阿拉伯糖、6.半乳糖
图5水解物的气相色谱图。
图中：1.阿拉伯糖、2.木糖、3、4、5.果糖、6.半乳糖、7.葡萄糖、8.大甘露糖。
图6两种单一多糖的红外谱图。
实施例1
首先装填DE-52纤维素柱，取足够的DE-52纤维素，将其浸泡在分析纯的三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液中，用HCl将其pH值调至9.6，使DE-52纤维素变为OH-型。然后将浸泡好的DE-52纤维素装填入一根Ф2.6×90cm的玻璃柱中，用蠕动泵输入三(羟甲基)氨基甲烷，pH9.6的缓冲溶液对柱中填料平衡二天。通过超滤从羊肚菌培养液中提取分子量为1-10万的粗多糖100毫克，溶于1ml的去离子水中溶解，将其直接上样于DE-52纤维素玻璃柱头，用蠕动泵将去离子水注入DE-52纤维素柱，用去离子水洗10小时，洗脱完全后，用0.1M NaCl洗10小时，流速为0.93ml/min，用馏分收集器将洗脱液以每5分钟收集一管收集起来，用日本岛津UV2501PC紫外分光光度计对收集液进行苯酚-硫酸法检测其多糖峰位，收集在490nm有最大吸收高峰的洗脱液，将其冷冻干燥后，得到白色粉末的单一多糖，再将此单一多糖白色粉末溶于1ml蒸馏水中，将溶液直接上样于SepHarose CL-6B凝胶柱头，(凝胶柱为Ф1.6×80cm)，过柱，收集。用苯酚-硫酸法检测洗脱液的多糖峰位，收集在490nm高吸收值峰位的洗脱液，进行脱盐处理后，冷冻干燥，得到一种白色棉絮状单一多糖20.9mg。配备0.5M的NaCl将留在DE-52纤维素柱中的羊肚菌粗多糖再次进行洗脱，时间为10小时，流速为0.93ml/min，用馏分收集器将洗脱液以每5分钟收集一管收集起来。用日本岛津UV2501PC紫外分光光度计对收集液进行苯酚-硫酸法检测其多糖峰位，收集在490nm有最大吸收高峰的洗脱液，合并单一多糖，将收集液冷冻干燥后，得到另一种白色粉末的单一多糖，再将此单一多糖粉末溶于1ml蒸馏水中，将溶解液装入SepHarose CL-6B凝胶柱中，过柱，收集，用苯酚-硫酸法检测洗脱液的多糖峰位，收集高吸收峰位的洗脱液，进行脱盐处理后，冷冻干燥，得到一种白色棉絮状的单一多糖15.1mg。将两种单一多糖分别经KBr压片，按常规测定红外光谱，核磁共振波谱分析，两种产品分别为由葡萄糖，甘露糖，阿拉伯糖，半乳糖缩合而成的具有α-吡喃糖苷键的分子量为23000的杂多糖和由木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、果糖、半乳糖缩合而成的具有β-吡喃糖苷键的分子量为44000的杂多糖。
实施例2
用实施例1同样的方法获得1g羊肚菌粗多糖，将其溶于8ml的去离子水中，并上柱于DE-52纤维素柱。此离子交换柱处理方法同实施例1。用去离子水洗脱8小时，洗脱完全后，用0.4M KCl溶液继续洗脱6小时，流速为1.15ml/min，经过与实施例1同样的方法得到一种白色棉絮状的单一多糖209mg。用1.0M KCl继续洗脱DE-52纤维素柱中的剩余羊肚菌多糖，时间为6小时，流速为1.15ml/min，经过与实施例1同样的方法获得第二种单一多糖151mg，将两种产品分别经KBr压片，按常规测定红外光谱，核磁共振波谱分析，两种产品分别为由葡萄糖，甘露糖，阿拉伯糖，半乳糖缩合而成的具有α-吡喃糖苷键的分子量为23000的杂多糖和由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和木糖缩合而成的具有β-吡喃糖苷键的分子量为44000的杂多糖。
实施例3
用实施例1同样的工艺方法从羊肚菌粗多糖中分别提取甘露糖，葡萄糖，阿拉伯糖，半乳糖缩合而成的具有α-吡喃糖苷键的分子量为23000的杂多糖和由葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、果糖和木糖缩合而成的具有β-吡喃糖苷键的分子量为44000的杂多糖。取羊肚菌粗多糖1000g，DE-52纤维素柱为Ф0.5×2m，分别用0.05M的MgCl2和0.75M的NaCl溶液洗脱8小时，流速为0.97ml/min，SepHarose CL-6B凝胶柱适当按比例增加体积。最后得到两种单一多糖，重量分别为209g和151g。经KBr压片，按常规进行红外光谱，核磁共振波谱分析，此白色棉絮状单一多糖为提取物。