一种荚膜红细菌HEMA基因的胞内高活性表达方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201310449211.9

申请日:

2013.09.27

公开号:

CN103468736A

公开日:

2013.12.25

当前法律状态:

驳回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):C12N 15/70申请公布日:20131225|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/70申请日:20130927|||公开

IPC分类号:

C12N15/70; C12N15/54; C12N9/10

主分类号:

C12N15/70

申请人:

浙江大学

发明人:

林建平; 漏佳伟; 朱力; 吴绵斌; 杨立荣; 岑沛霖

地址:

310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号

优先权:

专利代理机构:

杭州求是专利事务所有限公司 33200

代理人:

周烽

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内容摘要

本发明公开了一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法,该方法以荚膜红细菌(DSMNo.1710)基因组DNA为模板,扩增得到编码ALA合成酶的含有较多大肠杆菌稀有密码子的hemA基因,将其克隆到表达载体pET28a上,并利用E.coliRosetta(DE3)表达上述重组质粒,首次实现该荚膜红细菌hemA基因在E.coliRosetta(DE3)胞内高活性表达。本发明工程菌有非常高的可溶ALA合成酶表达,获得的ALA合成酶比活力高达198.2nmol-1•min-1•mgofprotein-1。将其应用于生产,所得胞外ALA产量高达8.61g/L,具有非常好的工业化前景。

权利要求书

权利要求书
1.  一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法,其特征在于,该方法利用E.coli Rosetta(DE3)表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌hemA基因。

2.  根据权利要求1所述的荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达,其特征在于,该方法包括以下步骤:
(1)从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组DNA;
(2)PCR扩增ALA合成酶基因hemA;
(3)采用双酶切法,将扩增得到的ALA合成酶基因与质粒pET28a连接,并转化至DH5α,筛选得到含有重组质粒pET28a-R.C.hemA的阳性克隆;
(4)将重组质粒pET28a-R.C.hemA转化至宿主菌Rosetta(DE3)中,筛选得到工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA;
(5)发酵培养工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA,使其胞内高活性表达荚膜红细菌hemA基因。

说明书

说明书一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法
技术领域
本发明属于基因工程和发酵工程领域,尤其涉及一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法。 
背景技术
5-氨基乙酰丙酸(5-amino1evulinic acid, ALA)广泛存在于生物体中,是生物体内四吡咯类化合物(如血红素、卟啉和维生素B12等)的共同前体。5-氨基乙酰丙酸在农业上可用作光合作用促进剂、抗逆剂、落叶剂和除草剂等,用途广泛、对人畜无毒性,是极具发展前途的无公害绿色农用化学品。在医学领域,5-氨基乙酰丙酸作为新一代光动力学药物,在脑瘤、皮肤癌、膀胱癌和结肠癌等疾病的诊断和治疗方面有着极大的应用价值。基于ALA广阔的应用前景,其合成已引起广泛的重视。 
ALA的生产主要有化学合成法和生物合成法。前者步骤繁琐、副产物多且产率低;后者克服了前者的弊端,主要通过生物诱变法或基因工程法来实现。生物诱变法主要是优化类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)突变株,但其培养周期长,成本较高;基因工程法主要是构建含有ALA合成酶基因的工程菌,至今报道的ALA合成酶基因来源主要有类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris) 等。 
本发明利用E.coli Rosetta(DE3)表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatushemA基因,通过胞内高活性表达ALA合成酶,进一步提高5-氨基乙酰丙酸的产量。 
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法。 
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:本发明的荚膜红细菌hemA基因胞内高活性表达的方法是利用E.coli Rosetta(DE3),表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌hemA基因。 
上述荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法,包括以下步骤: 
(1)从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组DNA;
(2)PCR扩增ALA合成酶基因;
(3)采用双酶切法,将扩增得到的ALA合成酶基因与质粒pET28a连接,并转化至DH5α,筛选得到含有重组质粒pET28a-R.C.hemA的阳性克隆;
(4)将重组质粒pET28a-R.C.hemA转化至宿主菌Rosetta(DE3)中,筛选得到工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA。
(5)发酵培养工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA,使其胞内高活性表达荚膜红细菌hemA基因。 
本发明的有益效果是,本发明将一种含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌hemA基因接入表达载体pET28a获得的重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3),在诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作用下,实现胞内高活性可溶表达ALA合成酶。表达的ALA合成酶比活力高达198.2 nmol-1min-1mg of protein-1,比现已投入工业化生产的含放射形土壤杆菌hemA基因的工程菌获得的ALA合成酶(151.1 nmol-1min-1mg of protein-1)提高31.2%。经初步优化后,将其应用于生产,胞外ALA产量高达8.61 g/L,处于国际化领先水平。 
附图说明
图1是重组质粒pET28a-R.C.hemA的构建图;图中,R.C.hemA为荚膜红细菌hemA基因,kana+为卡那霉素抗性基因,HindⅢ和NdeI为限制性内切酶位点。 
图2是工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA发酵、诱导表达、纯化得到的ALA合成酶的电泳图。 
具体实施方式
以下结合实施例进一步说明本发明,本发明的目的和效果将更加明显。 
实施例1:构建本发明的工程菌,包括以下步骤: 
1.从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组DNA,该步骤由以下子步骤来实现:
1.1、将荚膜红细菌培养至菌液OD600大于1,收集备用;
1.2、按AxyPrep细菌基因组DNA小量试剂盒的标准步骤,提取基因组DNA;
可以取5 μl提取得到的基因组DNA,加1 μl 6×loading buffer,用1%(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.PCR扩增得到ALA合成酶基因,该步骤由以下子步骤来实现: 
2.1、设计引物Primer1(SEQ ID NO.1:5’-GGGAATTCCATATGGACTACAATCT CGCGCTC-3’)和Primer2(SEQ ID NO.2:5’-CCCAAGCTTAGGCCTCGGCGCGATT CAC-3’),合成,两种引物分别溶于不含RNase(核糖核酸酶,Ribonuclease)的水中,配制成两个浓度均为10 μM的溶液;
2.2、取2 μl步骤1提取的基因组DNA至PCR管,加入步骤2.1配制的两种引物各2 μl、10 μl 的5× PrimeSTAR GXL Buffer、4 μl的dNTP Mixture(2.5 mM each)、1 μl 的PrimeSTAR GXL DNA Polymerase,最后用灭菌蒸馏水补足至50 μl,得反应液;
2.3、将上述50 μl反应液放入PCR仪中,反应条件为:首先98℃预变性10 min,然后98℃变性10 s,58℃退火15 s,72℃延伸1.2 min,共30个循环,最后72℃延伸10 min,得PCR扩增产物;
2.4、在上述PCR扩增产物中加入5 μl的10×loading buffer,混匀,经1%琼脂糖凝胶电泳,鉴定出一条约1.2kb的条带。
2.5、用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)回收上述条带,即得到ALA合成酶基因hemA。 
2.6、对上述ALA合成酶hemA基因进行DNA测序,得到SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。该序列含有较多的大肠杆菌稀有密码子,见附表1; 
表1

 3.采用双酶切法,将扩增得到的ALA合成酶基因hemA与质粒pET28a连接,并转化至DH5α,筛选得到含有重组质粒pET28a-R.C.hemA的阳性克隆,该步骤由以下子步骤来实现:
3.1、取上述ALA合成酶基因和pET28a质粒各24 μl,分别加入限制性内切酶HindⅢ和NdeI(TaKaRa)各1.5 μl,10×K buffer 3 μl;
3.2、将上述两个双酶切反应体系置于37℃水浴中反应3 h,加入3 μl 10×loading buffer停止反应,经1%琼脂糖凝胶电泳,并用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)回收,分别得到ALA合成酶和pET28a质粒的双酶切产物;
3.3、根据电泳条带的亮度以及片段的大小,确定连接时目的片段与载体的体积比为2:3。分别取上述ALA合成酶和pET28a的酶切产物2 μl和3 μl,与5 μl Solution I(TaKaRa)混匀;
3.4、将上述10 μl连接体系置于16℃,连接过夜,得到的连接产物转化感受态细胞DH5α;
3.5、经卡那霉素抗性平板筛选出阳性克隆,挑取6个单菌落进行培养,并用AxyPrep质粒小量制备试剂盒提取重组质粒;
3.6、将上述6个重组质粒双酶切(HindⅢ和NdeI),其中5个分别在5kb和1.2kb处有条带,认为连接成功,命名为重组质粒pET28a-R.C.hemA;另外一个只有在5kb处有条带,说明目的基因没有连接上;
4.将重组质粒pET28a-R.C.hemA转化至宿主菌Rosetta(DE3)中,筛选得到含有上述重组质粒的工程菌,命名为Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA,即为本发明的工程菌。
实施例2:荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达 
1、将本发明工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA接种至含50 ml LB培养基的250 ml摇瓶,置于37℃、200 rpm摇床,培养2 h后降温至28℃,用25 μl 0.1M异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,继续培养6 h。
2、取2 ml菌液至离心管,4℃、12000 rpm离心1 min,弃上清液; 
3、用1 ml 50 mM Tris-HCl(pH7.5)重悬,4℃、12000 rpm离心1 min,弃上清液;
4、用1 ml 50mM Tris-HCl(pH7.5)重悬后进行超声破胞,其条件为:200 W,工作5 s,间歇7 s,重复10次;
5、4℃、12000 rpm离心10 min,取上清液进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;
6、根据电泳结果,在47kDa附近有蛋白条带(见图2),此蛋白即为5-氨基乙酰丙酸合成酶融合蛋白。
实施例3:5-氨基乙酰丙酸合成酶的纯化和比活力测定 
1、将实施例2中的菌液破胞,离心后得到的上清液即为ALA合成酶的粗酶;
2、将上述粗酶通过QIAGEN Ni-NTA亲和层析和Sephadex G-25凝胶过滤层析,纯化得到ALA合成酶的纯酶;
3、用BCA Protein Assay Kit测定上述纯酶的蛋白浓度;
4、将上述纯酶稀释至蛋白浓度为0.1 mg/ml,加入终浓度为50 mM的Tris-HCl(pH7.5)、0.1 M的甘氨酸、0.27 mM的磷酸吡哆醛、0.2 mM的琥珀酰辅酶A,配成500 μl反应体系,于37℃振荡反应10 min,加入150 μl 10%三氯乙酸终止反应;
5、取300 μl上述反应液与400 μl 1 M乙酸盐缓冲液(pH4.6)和35 μl乙酰丙酮混匀,沸水浴反应15 min;
6、待其冷却后取200 μl,加入200 μl新配制的Ehrlich试剂,显色30 min,用紫外分光光度计测量其在554 nm处的吸光度,ALA的浓度(mg/L)=14.251×OD554-0.2808(R2=0.9998);
7、计算得到5-氨基乙酰丙酸合成酶纯酶的比活力为198.2 nmol-1min-1mg of protein-1(一个酶活力单位定义为在37℃条件下,每分钟产生1 nmol 5-氨基乙酰丙酸所需的酶量;比活力为每毫克蛋白所含的酶单位)。
8、按照上述步骤1-7,用CN101063105所述的工程菌代替本发明的工程菌,进行5-氨基乙酰丙酸合成酶的纯化和比活力测定,得到CN101063105所述的工程菌表达的5-氨基乙酰丙酸合成酶比活力为151.1 nmol-1min-1mg of protein-1。 
该实施例说明本发明的工程菌能高活性表达ALA合成酶,其比活力比CN101063105所述的工程菌(已投入工业化生产)提高31.2%。 
实施例4:工程菌发酵生产5-氨基乙酰丙酸 
按照CN101063105所述的方法,利用本发明的工程菌Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA发酵生产5-氨基乙酰丙酸。经过28.5 h的发酵,5-氨基乙酰丙酸的产量高达8.61 g/L。
上述实施例用来解释说明本发明,而不是对本发明进行限制,在本发明的精神和权利要求的保护范围内,对本发明作出的任何修改和改变,都落入本发明的保护范围。 
<110>  浙江大学
 
<120>  一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法
 
<160>  3    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  32
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
gggaattcca tatggactac aatctcgcgc tc                                   32
 
 
<210>  2
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<400>  2
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<210>  3
<211>  1207
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
atggactaca atctcgcgct cgacaaagcg atccagaagc tccacgacga gggacgttac     60
 
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1、(10)申请公布号 CN 103468736 A (43)申请公布日 2013.12.25 CN 103468736 A *CN103468736A* (21)申请号 201310449211.9 (22)申请日 2013.09.27 C12N 15/70(2006.01) C12N 15/54(2006.01) C12N 9/10(2006.01) (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路 866 号 (72)发明人 林建平 漏佳伟 朱力 吴绵斌 杨立荣 岑沛霖 (74)专利代理机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 代理人 周烽 (54) 发明名称 。

2、一种荚膜红细菌 hemA 基因的胞内高活性表 达方法 (57) 摘要 本发明公开了一种荚膜红细菌hemA 基因 的胞内高活性表达方法, 该方法以荚膜红细菌 (DSMNo.1710)基因组 DNA 为模板, 扩增得到编 码 ALA 合成酶的含有较多大肠杆菌稀有密码子的 hemA 基因, 将其克隆到表达载体 pET28a 上, 并利 用E.coliRosetta(DE3) 表达上述重组质粒, 首次 实现该荚膜红细菌hemA 基因在E.coliRosetta (DE3) 胞内高活性表达。本发明工程菌有非常高 的可溶ALA合成酶表达, 获得的ALA合成酶比活力 高达198.2nmol-1min-1mg。

3、ofprotein-1。 将其应用 于生产, 所得胞外 ALA 产量高达 8.61g/L, 具有非 常好的工业化前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 序列表 2 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103468736 A CN 103468736 A *CN103468736A* 1/1 页 2 1.一种荚膜红细菌hemA基因的胞内高活性表达方法, 其特征在于, 该方法利用E.coli Rosetta(DE3) 表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜。

4、红细菌hemA 基因。 2. 根据权利要求 1 所述的荚膜红细菌hemA 基因的胞内高活性表达, 其特征在于, 该方 法包括以下步骤 : (1) 从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组 DNA ; (2) PCR 扩增 ALA 合成酶基因hemA ; (3) 采用双酶切法, 将扩增得到的ALA合成酶基因与质粒pET28a连接, 并转化至DH5, 筛选得到含有重组质粒 pET28a-R.C.hemA 的阳性克隆 ; (4)将重组质粒 pET28a-R.C.hemA 转化至宿主菌 Rosetta(DE3) 中, 筛选得到工程菌 Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA ; (5) 发酵培。

5、养工程菌 Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA, 使其胞内高活性表达荚膜红细 菌hemA 基因。 权 利 要 求 书 CN 103468736 A 2 1/4 页 3 一种荚膜红细菌hemA 基因的胞内高活性表达方法 技术领域 0001 本发明属于基因工程和发酵工程领域, 尤其涉及一种荚膜红细菌hemA 基因的胞 内高活性表达方法。 背景技术 0002 5- 氨基乙酰丙酸 (5-amino1evulinic acid, ALA) 广泛存在于生物体中, 是生物 体内四吡咯类化合物 (如血红素、 卟啉和维生素 B12等) 的共同前体。5- 氨基乙酰丙酸在农 业上可用作光合作用促。

6、进剂、 抗逆剂、 落叶剂和除草剂等, 用途广泛、 对人畜无毒性, 是极具 发展前途的无公害绿色农用化学品。在医学领域, 5- 氨基乙酰丙酸作为新一代光动力学药 物, 在脑瘤、 皮肤癌、 膀胱癌和结肠癌等疾病的诊断和治疗方面有着极大的应用价值。基于 ALA 广阔的应用前景, 其合成已引起广泛的重视。 0003 ALA 的生产主要有化学合成法和生物合成法。前者步骤繁琐、 副产物多且产率低 ; 后者克服了前者的弊端, 主要通过生物诱变法或基因工程法来实现。生物诱变法主要是优 化类球红细菌 (Rhodobacter sphaeroides) 突变株, 但其培养周期长, 成本较高 ; 基因工程 法主要是。

7、构建含有 ALA 合成酶基因的工程菌, 至今报道的 ALA 合成酶基因来源主要有类球 红细菌(Rhodobacter sphaeroides)、 大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、 沼泽红假 单胞菌 (Rhodopseudomonas palustris) 等。 0004 本发明利用E.coli Rosetta(DE3)表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细 菌 (Rhodobacter capsulatus) hemA 基因, 通过胞内高活性表达 ALA 合成酶, 进一步提高 5- 氨基乙酰丙酸的产量。 发明内容 0005 本发明的目的在于针对现有技术的不足,。

8、 提供一种荚膜红细菌hemA 基因的胞内 高活性表达方法。 0006 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 : 本发明的荚膜红细菌hemA 基因胞 内高活性表达的方法是利用E.coli Rosetta(DE3), 表达含有较多大肠杆菌稀有密码子的 荚膜红细菌hemA 基因。 0007 上述荚膜红细菌hemA 基因的胞内高活性表达方法, 包括以下步骤 : (1) 从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组 DNA ; (2) PCR 扩增 ALA 合成酶基因 ; (3) 采用双酶切法, 将扩增得到的ALA合成酶基因与质粒pET28a连接, 并转化至DH5, 筛选得到含有重组质粒 pET28a-R.C.h。

9、emA 的阳性克隆 ; (4)将重组质粒 pET28a-R.C.hemA 转化至宿主菌 Rosetta(DE3) 中, 筛选得到工程菌 Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA。 0008 (5) 发酵培养工程菌 Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA, 使其胞内高活性表达荚膜 红细菌hemA 基因。 说 明 书 CN 103468736 A 3 2/4 页 4 0009 本发明的有益效果是, 本发明将一种含有较多大肠杆菌稀有密码子的荚膜红细菌 hemA基因接入表达载体pET28a获得的重组质粒转化E.coli Rosetta(DE3), 在诱导剂异丙 基 -。

10、D- 硫代半乳糖苷 (IPTG) 作用下, 实现胞内高活性可溶表达 ALA 合成酶。表达的 ALA 合成酶比活力高达 198.2 nmol-1min-1mg of protein-1, 比现已投入工业化生产的含放射形 土壤杆菌hemA 基因的工程菌获得的 ALA 合成酶 (151.1 nmol-1min-1mg of protein-1) 提高 31.2%。经初步优化后, 将其应用于生产, 胞外 ALA 产量高达 8.61 g/L, 处于国际化领先水 平。 附图说明 0010 图 1 是重组质粒 pET28a-R.C.hemA 的构建图 ; 图中, R.C.hemA 为荚膜红细菌hemA 基因。

11、, kana+ 为卡那霉素抗性基因, Hind 和 NdeI 为限制性内切酶位点。 0011 图 2 是工程菌 Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA 发酵、 诱导表达、 纯化得到的 ALA 合成酶的电泳图。 具体实施方式 0012 以下结合实施例进一步说明本发明, 本发明的目的和效果将更加明显。 0013 实施例 1 : 构建本发明的工程菌, 包括以下步骤 : 1从荚膜红细菌的菌液中提取总基因组 DNA, 该步骤由以下子步骤来实现 : 1.1、 将荚膜红细菌培养至菌液 OD600大于 1, 收集备用 ; 1.2、 按 AxyPrep 细菌基因组 DNA 小量试剂盒的标准步骤。

12、, 提取基因组 DNA ; 可以取 5 l 提取得到的基因组 DNA, 加 1 l 6loading buffer, 用 1%(w/v) 琼脂糖 凝胶电泳鉴定。 0014 2PCR 扩增得到 ALA 合成酶基因, 该步骤由以下子步骤来实现 : 2.1、 设计引物 Primer1(SEQ ID NO.1 : 5 -GGGAATTCCATATGGACTACAATCT CGCGCTC-3 ) 和 Primer2(SEQ ID NO.2 : 5 -CCCAAGCTTAGGCCTCGGCGCGATT CAC-3 ) , 合成, 两种引物分别 溶于不含 RNase(核糖核酸酶, Ribonuclease)。

13、 的水中, 配制成两个浓度均为 10 M 的溶液 ; 2.2、 取 2 l 步骤 1 提取的基因组 DNA 至 PCR 管, 加入步骤 2.1 配制的两种引物各 2 l、 10 l 的 5 PrimeSTAR GXL Buffer、 4 l 的 dNTP Mixture(2.5 mM each) 、 1 l 的 PrimeSTAR GXL DNA Polymerase, 最后用灭菌蒸馏水补足至 50 l, 得反应液 ; 2.3、 将上述 50 l 反应液放入 PCR 仪中, 反应条件为 : 首先 98预变性 10 min, 然后 98变性 10 s, 58退火 15 s, 72延伸 1.2 m。

14、in, 共 30 个循环, 最后 72延伸 10 min, 得 PCR 扩增产物 ; 2.4、 在上述PCR扩增产物中加入5 l的10loading buffer, 混匀, 经1%琼脂糖凝胶 电泳, 鉴定出一条约 1.2kb 的条带。 0015 2.5、 用 SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒 (上海生工) 回收上述条带, 即得到 ALA 合 成酶基因hemA。 0016 2.6、 对上述 ALA 合成酶hemA 基因进行 DNA 测序, 得到 SEQ ID NO.3 所示的核苷酸 序列。该序列含有较多的大肠杆菌稀有密码子, 见附表 1 ; 表 1 说 明 书 CN 103468736。

15、 A 4 3/4 页 5 3采用双酶切法, 将扩增得到的 ALA 合成酶基因hemA 与质粒 pET28a 连接, 并转化 至 DH5, 筛选得到含有重组质粒 pET28a-R.C.hemA 的阳性克隆, 该步骤由以下子步骤来实 现 : 3.1、 取上述ALA合成酶基因和pET28a质粒各24 l, 分别加入限制性内切酶Hind和 NdeI(TaKaRa) 各 1.5 l, 10K buffer 3 l ; 3.2、 将上述两个双酶切反应体系置于 37水浴中反应 3 h, 加入 3 l 10loading buffer 停止反应, 经 1% 琼脂糖凝胶电泳, 并用 SanPrep 柱式 DNA。

16、 胶回收试剂盒 (上海生工) 回收, 分别得到 ALA 合成酶和 pET28a 质粒的双酶切产物 ; 3.3、 根据电泳条带的亮度以及片段的大小, 确定连接时目的片段与载体的体积比为 2:3。分别取上述 ALA 合成酶和 pET28a 的酶切产物 2 l 和 3 l, 与 5 l Solution I (TaKaRa) 混匀 ; 3.4、 将上述 10 l 连接体系置于 16, 连接过夜, 得到的连接产物转化感受态细胞 DH5 ; 3.5、 经卡那霉素抗性平板筛选出阳性克隆, 挑取6个单菌落进行培养, 并用AxyPrep质 粒小量制备试剂盒提取重组质粒 ; 3.6、 将上述 6 个重组质粒双酶。

17、切 (Hind 和 NdeI) , 其中 5 个分别在 5kb 和 1.2kb 处有 条带, 认为连接成功, 命名为重组质粒 pET28a-R.C.hemA ; 另外一个只有在 5kb 处有条带, 说 明目的基因没有连接上 ; 4将重组质粒 pET28a-R.C.hemA 转化至宿主菌 Rosetta(DE3) 中, 筛选得到含有上述 重组质粒的工程菌, 命名为 Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA, 即为本发明的工程菌。 0017 实施例 2 : 荚膜红细菌hemA 基因的胞内高活性表达 1、 将本发明工程菌 Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA 接种。

18、至含 50 ml LB 培养基的 250 ml摇瓶, 置于37、 200 rpm摇床, 培养2 h后降温至28, 用25 l 0.1M异丙基-D-硫 代半乳糖苷 (IPTG) 诱导, 继续培养 6 h。 0018 2、 取 2 ml 菌液至离心管, 4、 12000 rpm 离心 1 min, 弃上清液 ; 3、 用 1 ml 50 mM Tris-HCl(pH7.5) 重悬, 4、 12000 rpm 离心 1 min, 弃上清液 ; 4、 用 1 ml 50mM Tris-HCl(pH7.5) 重悬后进行超声破胞, 其条件为 : 200 W, 工作 5 s, 间歇 7 s, 重复 10 次。

19、 ; 5、 4、 12000 rpm 离心 10 min, 取上清液进行 10%SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ; 6、 根据电泳结果, 在47kDa附近有蛋白条带 (见图2) , 此蛋白即为5-氨基乙酰丙酸合成 酶融合蛋白。 说 明 书 CN 103468736 A 5 4/4 页 6 0019 实施例 3 : 5- 氨基乙酰丙酸合成酶的纯化和比活力测定 1、 将实施例 2 中的菌液破胞, 离心后得到的上清液即为 ALA 合成酶的粗酶 ; 2、 将上述粗酶通过 QIAGEN Ni-NTA 亲和层析和 Sephadex G-25 凝胶过滤层析, 纯化得 到 ALA 合成酶的纯酶 ; 3、 用 B。

20、CA Protein Assay Kit 测定上述纯酶的蛋白浓度 ; 4、 将上述纯酶稀释至蛋白浓度为 0.1 mg/ml, 加入终浓度为 50 mM 的 Tris-HCl (pH7.5) 、 0.1 M 的甘氨酸、 0.27 mM 的磷酸吡哆醛、 0.2 mM 的琥珀酰辅酶 A, 配成 500 l 反 应体系, 于 37振荡反应 10 min, 加入 150 l 10% 三氯乙酸终止反应 ; 5、 取300 l上述反应液与400 l 1 M乙酸盐缓冲液 (pH4.6) 和35 l乙酰丙酮混匀, 沸水浴反应 15 min ; 6、 待其冷却后取 200 l, 加入 200 l 新配制的 Ehr。

21、lich 试剂, 显色 30 min, 用紫 外分光光度计测量其在 554 nm 处的吸光度, ALA 的浓度 (mg/L) =14.251OD554-0.2808 (R2=0.9998) ; 7、 计算得到 5- 氨基乙酰丙酸合成酶纯酶的比活力为 198.2 nmol-1min-1mg of protein-1(一个酶活力单位定义为在 37条件下, 每分钟产生 1 nmol 5- 氨基乙酰丙酸所 需的酶量 ; 比活力为每毫克蛋白所含的酶单位) 。 0020 8、 按照上述步骤 1-7, 用 CN101063105 所述的工程菌代替本发明的工程菌, 进行 5-氨基乙酰丙酸合成酶的纯化和比活力测。

22、定, 得到CN101063105所述的工程菌表达的5-氨 基乙酰丙酸合成酶比活力为 151.1 nmol-1min-1mg of protein-1。 0021 该 实 施 例 说 明 本 发 明 的 工 程 菌 能 高 活 性 表 达 ALA 合 成 酶, 其 比 活 力 比 CN101063105 所述的工程菌 (已投入工业化生产) 提高 31.2%。 0022 实施例 4 : 工程菌发酵生产 5- 氨基乙酰丙酸 按照 CN101063105 所述的方法, 利用本发明的工程菌 Rosetta(DE3)/pET28a-R.C.hemA 发酵生产 5- 氨基乙酰丙酸。经过 28.5 h 的发酵。

23、, 5- 氨基乙酰丙酸的产量高达 8.61 g/L。 0023 上述实施例用来解释说明本发明, 而不是对本发明进行限制, 在本发明的精神和 权利要求的保护范围内, 对本发明作出的任何修改和改变, 都落入本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103468736 A 6 1/2 页 7 浙江大学 一种荚膜红细菌 hemA 基因的胞内高活性表达方法 3 PatentIn version 3.3 1 32 DNA 人工序列 1 gggaattcca tatggactac aatctcgcgc tc 32 2 28 DNA 人工序列 2 cccaagctta ggcctcggcg cgattcac 28。

24、 3 1207 DNA 人工序列 3 atggactaca atctcgcgct cgacaaagcg atccagaagc tccacgacga gggacgttac 60 cgcacgttca tcgacatcga acgcgagaag ggcgccttcc ccaaggcgca gtggaaccgc 120 cccgatggcg gcaagcagga catcaccgtc tggtgcggca acgactatct gggcatgggc 180 序 列 表 CN 103468736 A 7 2/2 页 8 cagcacccgg tcgttctggc cgcgatgcat gaggcgct。

25、gg aagcggtcgg ggccgggtcg 240 ggtggcaccc gcaacatctc gggcaccacg gcctatcacc gccgccttga ggccgagatc 300 gccgatctgc accagaaaga agccgcgctg gtcttttcct cggcctacaa cgccaatgac 360 gccacgcttt cgaccctgcg cgtgctcttc cccggcctga tcatctattc cgacagcctg 420 aaccacgcct cgatgatcga ggggatcaag cgcaatgccg ggccgaagcg gatctt。

26、ccgt 480 cacaatgacg tcgcgcatct gcgcgagctg atcgccgccg atgatccggc cgcgccgaag 540 ctgatcgcct tcgaatcggt ctattcgatg gatggcgact tcggcccgat caaggaaatc 600 tgcgacatcg ccgaggaatt cggcgcgctg acctatatcg acgaagtcca tgccgtcggc 660 atgtatggcc cccgcggcgc gggcgtggcg gaacgcgacg gtctgatgca tcgcatcgac 720 atcttcaacg 。

27、gcacgctggc gaaagcctac ggcgtcttcg gcggctatat cgccgcttcg 780 gcgcggatgg tcgatgccgt gcgctcctat gcgccgggct tcatcttctc gacctcgctg 840 ccgccggcga tcgccgcggg cgcgcaggcc tcgatcgcct tcctgaaaac cgccgaaggg 900 cagaagctgc gcgacgcgca acagatgcac gccaaggttc tcaagatgcg gctcaaggcg 960 ctcggcatgc cgatcatcga ccacggcag。

28、c cacatcgttc cggtggtcat cggcgacccc 1020 gtgcacacca aggcggtgtc ggacatgctc ttgtcggatt acggcgttta cgtgcagccg 1080 atcaacttcc cgacggtgcc gcgcggcacc gaacggctgc gcttcacccc ctcgccggtg 1140 catgatctca agcagatcga cgggctcgtt catgccatgg atctgctctg ggcgcgctgt 1200 gcgctga 1207 序 列 表 CN 103468736 A 8 1/2 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 103468736 A 9 2/2 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 103468736 A 10 。

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