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1、(10)申请公布号 CN 103074452 A (43)申请公布日 2013.05.01 CN 103074452 A *CN103074452A* (21)申请号 201310033314.7 (22)申请日 2013.01.25 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/93(2006.01) C12R 1/36(2006.01) C12R 1/46(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 海尔施生物医药股份有限公司 地址 315800 浙江省宁波市小港街道前进村 半港河。
2、西 159 号 (72)发明人 吴勇 黄迎彬 南丽 颜进 徐冰 (54) 发明名称 一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂 盒及其检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种同步检测十五种出血发 热病原体及其检测方法， 该试剂盒包括 DEPC 水、 5RT 缓冲液、 反转录引物、 反转录酶、 X 溶液、 10PCR 缓冲液、 PCR 引物、 25mM 氯化镁溶液、 DNA 聚合酶和阳性对照品， 特点是反转录引物包括九 种出血发热病原体与人 RNA 内参的 RT 扩增引物， 基因序列如 SEQ ID NO.1 NO.10 所示， PCR 引物 包括余下六种出血发热病原体、 人 DNA 内参和反 应。
3、内参的正反向 PCR 扩增引物以及上述九种出血 发热病原体与人RNA内参的PCR扩增引物， 基因序 列如 SEQ ID NO.10 NO.36 所示， 优点是特异性 强、 灵敏度高、 通量高、 可靠性强、 成本低、 无假阴 性结果。 (51)Int.Cl. 权利要求书 3 页 说明书 12 页 序列表 12 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书3页 说明书12页 序列表12页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103074452 A CN 103074452 A *CN103074452A* 1/3 页 2 1.一种同步检测十五种出血发热病。
4、原体的试剂盒， 包括DEPC水、 5RT缓冲液， 反转录 引物、 反转录酶、 X溶液、 10PCR缓冲液、 PCR引物、 25mM氯化镁溶液、 DNA聚合酶和阳性对照 品， 其特征在于所述的反转录引物包括以下表中九种出血发热病原体的 RT 扩增引物及人 RNA 内参的 RT 扩增引物， 所述的 PCR 引物包括表中余下六种出血发热病原体的正反向 PCR 扩增引物、 人 DNA 内参的正反向 PCR 扩增引物、 反应内参的正反向 PCR 扩增引物以及上述九 种出血发热病原体的 PCR 扩增引物及人 RNA 内参的 PCR 扩增引物， 基因序列如下表所示 ： 权 利 要 求 书 CN 103074。
5、452 A 2 2/3 页 3 2. 根据权利要求 1 所述的一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒， 其特征在 于 ： 所述的 X 溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物， 所述的通用引物正向扩增引物序 列为 AGGTGACACTATAGAATA ； 反向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA， 所述的通用引物 正向扩增引物带荧光标记。 3. 根据权利要求 1 所述的一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒， 其特征在 于 ： 所述的阳性对照品为连接有设计上述十五种出血发热病原体、 RNA 内参、 DNA 内参和反 应内参的引物的基因保守序列的 pMD18-T 的克隆载体。 。
6、4. 一种利用权利要求 1-3 中任一项所述的同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒 的检测出血发热病原体的方法， 其特征在于具体包括以下步骤 ： （1） 采集样本并提取核酸 权 利 要 求 书 CN 103074452 A 3 3/3 页 4 采集出血发热患者的血液或咽拭子的分离培养物， 从分离培养物中提取核酸 ； （2） 以患者核酸为模板进行 RT 反应 取5-20ng/ul的核酸样品RNA5L， DEPC水8L， 5RT缓冲液4L， RT引物溶液2L， RT 酶 1L 混匀后加入到 96 孔样品板上进行反转录， 反应条件 ： 48 C1 分钟 ； 42 C60 分钟 ； 95 C5 分钟 。
7、； 4 C 直至收取 RT 产物 ； 其中反转录引物溶液中各 RT 引物浓度均为 500nM， 所述的 RT 引物包括九种出血发热病原体与人 RNA 内参的 RT 扩增引物， 基因序列如 序列表中 SEQ ID NO.1 NO.10 所示 ； （3） 以反转录产物为模板进行 PCR 反应 取 RT 产物 8.6L， 10PCR 缓冲液 2L， 25mM 的氯化镁 4L， PCR 引物溶液 2L， DNA 聚合酶1.4L， X溶液2L混匀后加入到96孔样品板上进行PCR反应， 反应条件 ： 95C10 分钟 ； 94C30秒钟， 55C30秒钟， 70C1分钟， 循环35次 ； 70C1分钟 ；。
8、 4C直至收取 PCR 产物 ； 其中所述的 X 溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物， 所述的通用引物正向扩 增引物序列为 AGGTGACACTATAGAATA ； 反向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA， 所述的 通用引物正向扩增引物带荧光标记， PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM， PCR引物包 括包括余下六种出血发热病原体、 人 DNA 内参与反应内参的正反向 PCR 扩增引物以及上述 九种出血发热病原体与人 RNA 内参的 PCR 扩增引物， 基因序列如序列表中 SEQ ID NO.10 NO.36 所示 ； （4） GeXP 遗传分析仪毛细电泳分离样。
9、品 取 PCR 产物 1L， GeXP 遗传分析仪配套的上样缓冲液 38.75L， DNA Marker0.5L， 矿物油一滴混合均匀后加入到 96 孔分离液板上进行毛细电泳分离样品， 将 GeXP 遗传分析 仪的软件获得的图谱与标准图谱对比， 判断出血发热病原体的种类。 权 利 要 求 书 CN 103074452 A 4 1/12 页 5 一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方 法 技术领域 0001 本发明涉及出血发热病原体的检测试剂盒及其检测方法， 尤其是涉及一种基于 GeXP 多重基因表达遗传分析系统的同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒及其检测方 法。 背景技术 000。
10、2 发热伴出血是危害人类健康的重要传染病， 流行广， 病情危急， 病死率高， 危害极 大。由于该病有发热症状， 故常被误诊为上呼吸道感染。另外常规实验室检查如血液生化 检查、 血清学检测、 以及病毒分离等手段不能快速准确鉴别各种病原体， 造成延误治疗甚至 使疫情蔓延。因此急需一种高效的出血发热病原体诊断方法。 0003 目前， 我国出血发热病原体的传统检测方法主要包括以下几种 ： 0004 （1） 一般实验室检查 ： 发病早期检测是否存在蛋白尿、 血液转氨酶水平是否升高、 白细胞以及淋巴细胞细胞总数变化等。优点 ： 成本低 ； 对实验室硬件要求低。缺点 ： 初期判 断， 不能确诊。 0005 。
11、（2） 免疫学检查 ： 应用最广泛的是酶联免疫技术 （ELISA） ： 一般先用一抗与抗原发 生特异性结合， 然后用通用的酶标记的二抗与一抗发生特异性结合， 再将酶显色， 之后观察 结果。优点 ： 1） 样品通量较高 ： 利用 96 孔酶标板， 一块平板可完成多个样品的检测 ； 2） 较 敏感 ： 利用酶联的特性， 可将原来的抗原信号放大 ； 3） 快捷 ： 在时间上， 比传统的培养基微 生物培养检查法要缩短很多。但存在如下缺点 ： 1） 易出现假阳性 ： 由于洗涤和抗原包被的 操作， 或由于抗原表面决定簇类似而发生交叉反应， 故易出现假阳性 ； 2） 耗时耗力 ： 制作抗 体是非常耗时耗力的。
12、工作 ； 3） 灵敏度不确定 ： 实验的灵敏度取决于抗体的好坏， 而每个抗 体的好坏不一， 质量难以控制 ； 4） 无法检测多变异的病原体。 0006 （3） 病原体检查 ： 即直接做影像及活组织检查， 或病原体分离培养， 之后在显微镜、 电镜下观察， 做出诊断。优点 ： 成本低 ； 对实验室硬件要求低。缺点 ： 1） 耗时长 ： 一般需 3-5 天或更长 ； 2） 诊断效率低 ： 只能单菌纯培养 ； 对一些表型特征变异的病原体， 用形态学经验 很难辨别 ； 此外， 由于抗生素的滥用， 细菌在检测过程中生长受到抑制， 导致假阴性的结果 ； 3） 工作量巨大 ： 由于对每个抽检样品的每种菌都必须。
13、进行检测， 工作量非常巨大， 特别是部 分对培养环境要求较为苛刻的菌， 更加大了检测的工作量和难度。 0007 （4） 分子生物学PCR 检测方法 ： 目前经常应用的有实时荧光定量 PCR、 免疫 PCR、 反转录 PCR 等， 都是针对病原体的特异性靶基因进行检测。其中， 荧光定量 PCR 检测方 法最为成熟。荧光定量 PCR 技术的优点 ： 灵敏性高， 并可精确定量， 在对李氏杆菌、 沙门氏 菌、 肉毒杆菌、 大肠杆菌等的检测中都取得了良好效果。2004 年， 中国发布了实施荧光定量 PCR 检测禽流感 H7 亚型的国家标准。2009 年， 美国 FDA 批准了用荧光定量 PCR 检测猪流。
14、感 H1N1亚型的试剂盒。 但也存在如下缺点 ： 1） 通量低 ： 一次只能检测一个病原成分， 如需要检 测多种病原菌， 就需要多台 PCR 仪同时工作， 效率低， 周期长， 对大批量的多种病原污染的 说 明 书 CN 103074452 A 5 2/12 页 6 样品更是无从下手 ； 2） 成本相对较高 ： 因一次只能检测一个病原体， 当一个样品同时需要 检测多种病原菌时， 必须一个一个检测， 成本相对增高。 0008 （5） 分子生物学基因芯片法 ： 基因芯片是通过微加工技术， 将数以万计、 乃至 百万计的特定序列的 DNA 片段 （基因探针） ， 有规律地排列固定于硅片、 玻片等支持物上。
15、， 构 成的一个二维 DNA 探针阵列， 利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交， 可对样品的基因 表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。优点 ： 1） 高通量并行检测 ： 当一个样品同时需 要检测多种病原菌时， 一次实验即可得出全部结果 ； 2） 操作简便快速 ： 整个检测只需 4-8 小 时基本可以出结果 ； 但也存在如下缺点 ： 1） 技术成本昂贵、 复杂 ： 每个样品需要一个芯片， 成本大于￥1000/ 样品， 不利于大规模推广 ； 2） 探针的合成与固定比较复杂， 特别是制作高 密度的探针阵列， 是主要的限速步骤 ； 3） 不能精确定量， 重复性差 ； 4） 灵敏度较低 ： 芯片法 需。
16、核酸量较大， 一般须先做多重 PCR 扩增， 由于引物较多， 容易自身产生二聚体， 发夹结构， 或由于 Tm 值不同， 而导致扩增目的片段效率不同， 进而影响检测的灵敏度 ； 5） 由于芯片的 种类较多， 难以制定一个统一的质量控制标准。 0009 GenomeLabTMGeXP 多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳 分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成， 一束 8 道的毛细管陈列设计充分利用 了 96 孔板的排列特性， 降低了使用更大的陈列带来的花费和复杂性。采用多重 PCR 方法， 通过 Beckman Coulter 染色标记， 在同一个 EP 管中同时分析多个。
17、基因的表达， 能快速有效 地检测基因的表达状况， 克服了上述出血发热病原体的传统检测方法存在的缺陷， 具有以 下优点 ： 0010 1、 高通量 ： 本系统采用双 （96 孔） 板、 自动加样和样品追踪技术， 实现单个反应检 测 30-40 个位点， 可同时做 192 个反应 （如 192 个患者样品， 每个样品检测 30 种腹泻病毒， 30 个位点） ， 一天出结果 ； 对于交叉感染患者， 本方法可一次性给出准确报告， 避免漏检。 0011 2、 准确性强 ： GeXP 采用毛细管电泳对 PCR 产物进行分离检测， 可将非特异性扩增 产物、 引物二聚体和特异性扩增产物分离， 最大程度降低假阳。
18、性 ； 0012 3、 敏感性高， 结果重复性好 ： GeXP 系统克服了传统 PCR 扩增方法的不均等扩增造 成的偏差， 提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性， 采用激光诱导荧光 -PMT， 具有 超高灵敏度 ； 0013 4、 方法简便， 使用经济 ： GeXP 提供从试剂、 多重 PCR 引物设计、 结果及定量表达谱 分析等全套实验方案 ； 每个样品的检测成本少于￥50， 利于大规模推广 ； 0014 5、 精确定量、 灵活性强 ： 可精确定量病原体基因拷贝数， 可随时根据需求调整检测 的靶基因。 0015 6、 易于实现自动化 ： 就样品制备而言， Biomek 系列自动液体处理。
19、仪可以与 GeXP 分 析仪和 Ampligrid 扩增仪完全匹配， 集成的条形码阅读器保证了准确的样品追踪和结果报 告。 0016 目前， 国内外还没有关于基于 GeXP 多重基因表达遗传分析系统的同步检测十五 种出血发热病原体的试剂盒及其检测方法的相关研究报道。 发明内容 0017 本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性强、 灵敏度高、 通量高、 可靠性强、 说 明 书 CN 103074452 A 6 3/12 页 7 成本低、 无假阴性结果的基于 GeXP 多重基因表达遗传分析系统的同步检测十五种出血发 热病原体的试剂盒及其检测方法。 0018 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案。
20、为 ： 一种同步检测十五种出血发热病 原体的试剂盒， 包括DEPC水、 5RT缓冲液， 反转录引物、 反转录酶、 X溶液、 10PCR缓冲液、 PCR 引物、 25mM 氯化镁溶液、 DNA 聚合酶和阳性对照品， 所述的反转录引物包括以下表 1 中 九种出血发热病原体的 RT 扩增引物及人 RNA 内参的 RT 扩增引物， 所述的 PCR 引物包括表 1 中余下六种出血发热病原体的正反向 PCR 扩增引物、 人 DNA 内参的正反向 PCR 扩增引物、 反应内参的正反向 PCR 扩增引物以及上述九种出血发热病原体的 PCR 扩增引物及人 RNA 内 参的 PCR 扩增引物， 基因序列如下表 1。
21、 所示 ： 0019 表 1 0020 说 明 书 CN 103074452 A 7 4/12 页 8 0021 说 明 书 CN 103074452 A 8 5/12 页 9 0022 所述的 X 溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸 （dNTPs） 和通用引物， 所述的通用引物正 向扩增引物序列为 AGGTGACACTATAGAATA ； 反向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA， 所 述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。 0023 所述的阳性对照品为连接有设计上述十五种出血发热病原体、 RNA 内参、 DNA 内参 和反应内参的引物的基因保守序列的 pMD18-T 的克隆载体。 。
22、0024 一种利用同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒的检测出血发热病原体的方 法， 具体包括以下步骤 ： 0025 （1） 采集样本并提取核酸 0026 采集出血发热患者的血液或咽拭子的分离培养物， 从分离培养物中提取核酸 ； 0027 （2） 以患者核酸为模板进行 RT 反应 0028 取 5-20ng/ul 的核酸样品 RNA5L， DEPC 水 8L， 5RT 缓冲液 4L， RT 引物溶 液 2L， RT 酶 1L 混匀后加入到 96 孔样品板上进行反转录， 反应条件 ： 48 C1 分钟 ； 42 C60 分钟 ； 95 C5 分钟 ； 4 C 直至收取 RT 产物 ； 其中反转录。
23、引物溶液中各 RT 引物浓 度均为 500nM， 所述的 RT 引物包括九种出血发热病原体与人 RNA 内参的 RT 扩增引物， 基因 序列如序列表中 SEQ ID NO.1 NO.10 所示 ； 0029 （3） 以反转录产物为模板进行 PCR 反应 0030 取RT产物8.6L， 10PCR缓冲液2L， 25mM的氯化镁4L， PCR引物溶液2L， 说 明 书 CN 103074452 A 9 6/12 页 10 DNA 聚合酶 1.4L， X 溶液 2L 混匀后加入到 96 孔样品板上进行 PCR 反应， 反应条件 ： 95C10分钟 ； 94C30秒钟， 55C30秒钟， 70C1分钟。
24、， 循环35次 ； 70C1分钟 ； 4C直 至收取PCR产物 ； 其中所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物， 所述的通用引物 正向扩增引物序列为 AGGTGACACTATAGAATA ； 反向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA， 所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记， PCR引物溶液中各PCR引物浓度均为200nM， PCR 引物包括包括余下六种出血发热病原体、 人 DNA 内参与反应内参的正反向 PCR 扩增引物以 及上述九种出血发热病原体与人 RNA 内参的 PCR 扩增引物， 基因序列如序列表中 SEQ ID NO.10 NO.36 所示 ； 0031 （4。
25、） GeXP 遗传分析仪毛细电泳分离样品 0032 取 PCR 产 物 1L， GeXP 遗 传 分 析 仪 配 套 的 上 样 缓 冲 液 38.75L， DNA Marker0.5L， 矿物油一滴混合均匀后加入到 96 孔分离液板上进行毛细电泳分离样品， 将 GeXP 遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对比， 判断出血发热病原体的种类。 0033 与现有技术相比， 本发明的优点在于 ： 本发明一种同步检测十五种出血发热病原 体的试剂盒及其检测方法， 由于该试剂盒引入了针对汉坦病毒、 登革病毒、 新疆出血热病 毒、 埃博拉病毒、 新布尼亚病、 基孔肯雅病毒、 西尼罗河病毒、 黄热病病毒、 。
26、马尔堡病毒、 鼠疫 杆菌、 脑膜炎奈瑟菌、 猪链球菌、 化脓性链球菌、 钩端螺旋体、 立克次体 （恙虫病） 等等所设计 的特异性扩增引物， 可以同时针对 15 种出血发热病原体进行检测， 一天之内可完成 192 个 患者样品的检测， 既节约了生产成本和检测成本， 又提高了检测效率及缩短了时间 ； 人 DNA 和人 RNA 完整性的对照内参， 确保在检验过程中对样品质量的判断， 避免假阴性 ； 正常反应 对照内参 （RXN control） ： 监控PCR反应效率， 避免假阴性， 使得检测具有更好的灵敏度和特 异性， 从而避免了其他检测方法特异性不高的问题。 0034 综上所述， 本发明基于 G。
27、eXP 多重基因表达遗传分析系统的同步检测十五种出血 发热病原体的试剂盒及其检测方法， 可以同时针对 15 种出血发热病原体进行检测， 检测敏 感性高， 特异性好， 降低了常规 PCR 扩增的假阳性率， 还能够有效解决常规 PCR 的易污染问 题 ； 具有非竞争性内对照体系， 可靠性强， 无假阴性结果， 利用 GeXP 遗传分析系统灵敏、 准 确定量、 快速、 高通量的技术优势， 将为疾控中心、 医院及其它医疗机构提供一种灵敏、 准 确、 快速且低成本的多重基因检测方案。 附图说明 0035 图 1 为 GeXP 遗传分析仪的毛细电泳分离样品结果标准图谱。 具体实施方式 0036 以下结合附图。
28、实施例对本发明作进一步详细描述。 0037 具体实施例一 0038 本发明一种同步检测十五种出血发热病原体的试剂盒， 包括 DEPC 水 （无 RNA 酶 / DNA 酶超纯水） ， 5RT 缓冲液， 反转录引物 （RT primer mix） 、 RT 酶 （全称反转录酶 Reverse transcripatase） 、 X 溶液， 10PCR 缓冲液， PCR 引物 （PCR Primer Mix） ， 25mM 氯化镁溶液， DNA 聚合酶 （Taq DNA Polymerase） ， 阳性对照品 （各目标病原体克隆所得， 包含目标片段质 粒， 用于质控整个反应体系） ， 5RT 缓冲。
29、液， 10PCR 缓冲液、 25mM 氯化镁溶液、 DNA 聚合酶 说 明 书 CN 103074452 A 10 7/12 页 11 订于 sigma 公司。 0039 上述反转录引物包括以下表 1 中九种出血发热病原体的 RT 扩增引物及人 RNA 内 参的 RT 扩增引物， 上述 PCR 引物包括表 1 中余下六种出血发热病原体的正反向 PCR 扩增引 物、 人 DNA 内参的正反向 PCR 扩增引物、 反应内参的正反向 PCR 扩增引物以及上述九种出血 发热病原体的 PCR 扩增引物及人 RNA 内参的 PCR 扩增引物， 基因序列如表 1 所示 ： 0040 表 1 出血发热病原体多。
30、重基因检测寡核苷酸序列 0041 0042 说 明 书 CN 103074452 A 11 8/12 页 12 0043 说 明 书 CN 103074452 A 12 9/12 页 13 0044 上述 X 溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸 （dNTPs） 和通用引物， 该通用引物正向扩增 引物序列为 AGGTGACACTATAGAATA ； 反向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA， 通用引物 正向扩增引物带荧光标记。 0045 上述阳性对照品连接有设计上述十五种出血发热病原体、 RNA 内参、 DNA 内参和反 应内参的引物的基因保守序列的 pMD18-T 的克隆载体。 00。
31、46 上述针对人 DNA 的内参， 可检测样品中 DNA 提取的有效性。 0047 上述针对人 RNA 的内参， 可检测样品中 RNA 提取的有效性。 0048 上述以质粒 pcDNA3.1 为模板的反应内参， 用于监测 PCR 反应的正常进行。 0049 具体实施例二 0050 本发明一种同步检测十五种出血发热病原体的检测方法， 检测的出血发热病原体 汉坦病毒、 登革病毒、 新疆出血热病毒、 埃博拉病毒、 新布尼亚病、 基孔肯雅病毒、 西尼罗河 病毒、 黄热病病毒、 马尔堡病毒、 鼠疫杆菌、 脑膜炎奈瑟菌、 猪链球菌、 化脓性链球菌、 钩端螺 旋体、 立克次体 （恙虫病） 等 （见表 1） 。
32、， 采集患者样品 （血液、 咽拭子等） 提取核酸， 以患者核酸 为模板进行反转录和 PCR 反应， 最终用毛细电泳方法分离样品， 具体步骤如下 ： 0051 1、 生产基于 GeXP 多重基因表达遗传分析系统的同步检测十五种出血发热病原体 的试剂盒， 试剂盒中包括的组分同上述实施例 1 ； 0052 2、 采集样本并提取核酸 0053 采集患者的血液、 咽拭子等的分离培养物， 从分离培养物中提取核酸 ； 0054 3、 以患者核酸为模板进行反转录 （RT） 反应 0055 1） 按以下比例在 96 孔样品板上加入试剂和样品 （RT 板见表 2） ： 0056 表 2RT 反应试剂和样品混合比例。
33、 0057 0058 说 明 书 CN 103074452 A 13 10/12 页 14 0059 注 ： 在 RT 反应中加入阳性对照品， 阳性对照品做平行对照试验， 所述阳性对照品 为由各目标病原体克隆所得， 包含目标片段质粒。 0060 2） 混匀后按以下温度孵育 （见表 3） ： 0061 表 3RT 反应条件 0062 步骤温度时间 148 C 1 分钟 242 C 60 分钟 395 C 5 分钟 44 C 持续 : 直至收取 RT 产物 0063 4、 以反转录产物为模板进行 PCR 反应 0064 1） 按以下比例在 96 孔样品板上加入试剂和样品 （PCR 板见表 4） ：。
34、 0065 表 4PCR 反应试剂和样品混合比例 0066 PCR 反应试剂量 / 孔 10PCR 缓冲液2L 25mM MgCl24L PCR 引物2L DNA 聚合酶1.4L X 溶液2L RT 产物8.6L Total20L 0067 注 ： X 溶液包括三磷酸脱氧核苷酸 （dNTPs） 和通用引物， 通用引物正向扩增引物序 列为 AGGTGACACTATAGAATA， 反向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA， 通用引物正向扩 增引物带荧光标记。 0068 2） 混匀后按以下温度进行热循环反应 （见表 5） ： 0069 表 5PCR 反应条件 0070 步骤温度时间。
35、 195C 10 分钟 说 明 书 CN 103074452 A 14 11/12 页 15 294C 30 秒钟 355C 30 秒钟 470C 1 分钟 5N/A重复 2-4 步骤 34 次 （共 35 次） 670C 1 分钟 74 C 持续 : 直至收取 PCR 产物 0071 5、 GeXP 遗传分析仪毛细电泳分离样品 0072 1） 制备 GeXP 样品 （见表 6） ： 0073 表 6GeXP 样品混合比例 0074 GeXP 样品量 / 孔 上样缓冲液 （Beckman GeXP 系统配套试剂）38.75L DNA 大小标准 4000.5L PCR 产物1L 矿物油1 滴 0。
36、075 2） 毛细电泳分离样品 0076 将 GeXP 样品加入 96 孔毛细管电泳分离板上适当数目的孔中进行毛细管电泳分 离 ； 毛细管电泳分离是一类以毛细管为分离通道、 以高压直流电场为驱动力的新型液相分 离技术， 具体程序为 90变性 120 秒， 进样电压 2kv， 30 秒， 分离电压 6kv， 35 分钟。6、 结果 分析 （见 GenomeLab GeXP 遗传分析仪说明书） 0077 根据 GeXP 遗传分析仪自有软件上默认的参数对结果进行片段大小分析， 其横坐 标表示片段大小， 纵坐标为信号强弱。将 GeXP 遗传分析仪的软件获得的图谱与标准图谱对 比， 判断出血发热病原体的。
37、种类。标准图谱如图 1 所示， 其结果能准确检测出十五种出血发 热病原体， 各目标片段大小间隔适中， 且信号不至于过饱和， 各靶标间信号相对持平， 且没 有宽峰、 双峰等现象。 0078 具体实施例三 0079 检测试剂盒灵敏度、 特异性分析 0080 灵敏度分析 ： 将阳性对照按一定拷贝数倍比稀释后， 经 PCR 扩增和毛细管电泳检 测直至检测不到信号， 该拷贝数即为最低检测线， 也就是试剂盒的灵敏度。 最高灵敏度可检 测到 40 拷贝。 0081 特异性分析 ： 单重 PCR 扩增经毛细管电泳检测为目标片段大小的单峰。 0082 上述说明并非对本发明的限制， 本发明也并不限于上述举例。本技。
38、术领域的普通 说 明 书 CN 103074452 A 15 12/12 页 16 技术人员在本发明的实质范围内， 作出的变化、 改型、 添加或替换， 也应属于本发明的保护 范围。 说 明 书 CN 103074452 A 16 1/12 页 17 0001 0002 序 列 表 CN 103074452 A 17 2/12 页 18 0003 序 列 表 CN 103074452 A 18 3/12 页 19 0004 序 列 表 CN 103074452 A 19 4/12 页 20 0005 序 列 表 CN 103074452 A 20 5/12 页 21 0006 序 列 表 CN 。
39、103074452 A 21 6/12 页 22 0007 序 列 表 CN 103074452 A 22 7/12 页 23 0008 序 列 表 CN 103074452 A 23 8/12 页 24 0009 序 列 表 CN 103074452 A 24 9/12 页 25 0010 序 列 表 CN 103074452 A 25 10/12 页 26 0011 序 列 表 CN 103074452 A 26 11/12 页 27 0012 序 列 表 CN 103074452 A 27 12/12 页 28 序 列 表 CN 103074452 A 28 1/1 页 29 图 1 说 明 书 附 图 CN 103074452 A 29 。