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1、(10)申请公布号 CN 103088004 A (43)申请公布日 2013.05.08 CN 103088004 A *CN103088004A* (21)申请号 201110347162.9 (22)申请日 2011.11.07 C12N 9/42(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人 天津强微特生物科技有限公司 地址 300384 天津市南开区华苑产业园区工 房时代二期 C 座 331 室 (72)发明人 郑春阳 聂立影 原素英 王燕 徐彬 (54) 发明名称 一种重组耐热的 -1,4 内切纤维素酶的纯 化方法 (57) 摘要 本发明提供了一种重组耐热。
2、的 -1， 4 内切 纤维素酶的纯化方法， 主要步骤为破菌、 热处理、 离心、 金属螯合亲和层析、 盐析。本发明具有纯度 高、 比活高、 收率高、 生产成本低、 有利于工业化生 产的特点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103088004 A CN 103088004 A *CN103088004A* 1/1 页 2 1. 一种重组耐热的 -1， 4 内切纤维素酶的纯化方法， 其特征在于 ： 由以下步骤组成 ： 1) 破菌 发酵。
3、获得表达重组耐热 -1， 4 内切纤维素酶的菌体， 离心后向菌体沉淀加入破菌缓 冲液， 使菌体和破菌缓冲液的比例为 1 5 20， 搅拌 10 20 分钟使之混合均匀， 通过超 声或高压均质的方法裂解菌体， 使之破碎 ； 2) 热处理 将破菌处理后的溶液放入水浴中保温搅拌， 温度为 70 85， 搅拌速度控制在 100 200rpm， 处理时间为 15 40 分钟 ； 3) 离心 将热处理后的溶液放入离心机中离心， 离心力 10000 20000g， 时间 10 20 分钟， 取上清液， 加入 1 2M MgCl2至终浓度为 10mM 20mM， 经 0.45m 的滤膜过滤 ； 4) 金属螯合。
4、亲和层析 金属螯合层析首先用缓冲液 I 平衡色谱柱， 用量为 3 5CV， 上样后冲洗， 用量为 5 10CV， 使 UV280 吸收降至基线， 然后用缓冲液 II 洗脱杂蛋白， 用量为 5 10CV， 使 UV280 吸 收降至基线， 最后用缓冲液 III 洗脱目的蛋白， 收集 UV280 吸收大于 100mAu 组分， 加入固体 硫酸铵至饱和浓度 60 70进行沉淀， 得到呈混悬状态的蛋白产品置于 4长期保存 ； 其中破菌缓冲液为2050mM Tris-HCl， pH7.58.5、 0.15mMEDTA、 0.51M NaCl、 5 10甘油、 溶菌酶 0.5 2mg/ml、 5 10mM。
5、 咪唑、 0.02 1mM PMSF ； 缓冲液 I 为 20 50mM Tris-HCl， pH7.5 8.5、 0.5 1M NaCl、 5 10甘油、 5 10mM 咪唑 ； 缓冲液 II 为 20 50mM Tris-HCl， pH7.5 8.5、 0.5 1M NaCl、 5 10甘油、 50 70mM 咪唑 ； 缓冲 液 III 为 20 50mM Tris-HCl， pH7.5 8.5、 0.5 1M NaCl、 5 10甘油、 200 300mM 咪唑。 2. 根据权利要求 1 所述的纯化方法， 其特征在于 ： 所述破菌步骤中破菌法选自高压均 质法。 3. 根据权利要求 2 所。
6、述的纯化方法， 其特征在于 ： 所述均质法是指将菌体和破菌缓冲 液的混合液放入高压均质机中， 控温 10 30、 工作压力为 500 800bar， 均质 2 3 遍。 4. 根据权利要求 1 所述的纯化方法， 其特征在于 ： 所述热处理步骤中， 温度为 75 80， 处理时间为 20 30 分钟。 5. 根据权利要求 1 所述的纯化方法， 其特征在于 ： 所述金属螯合亲和层析步骤中介质 配基为亚氨基二乙酸 (IDA) 或次氮基三乙酸 (NTA)。 6. 根据权利要求 6 所述的纯化方法， 其特征在于 ： 所述金属螯合亲和层析步骤中介质 配基为亚氨基二乙酸 (IDA)。 7. 根据权利要求 1。
7、 所述的纯化方法， 其特征在于 ： 所述金属螯合亲和层析步骤中柱高 为 5 15cm， 上样线性流速为 30 120cm/h， 洗脱线性流速为 100 300cm/h， 上样量为每 ml 填料上样菌体蛋白 100 300mg。 8. 根据权利要求 8 所述的纯化方法， 其特征在于 ： 所述金属螯合亲和层析步骤中上样 线性流速为 60 100cm/h， 洗脱线性流速为 100 150cm/h， 上样量为每 ml 填料上样菌体 蛋白 100 200mg。 权 利 要 求 书 CN 103088004 A 2 1/7 页 3 一种重组耐热的 -1， 4 内切纤维素酶的纯化方法 技术领域 0001 本。
8、发明涉及一种生物酶的纯化方法， 特别涉及一种重组耐热纤维素酶的纯化方 法。 背景技术 0002 纤维素是地球上含量最丰富的多糖， 也是最丰富的有机可再生资源。纤维素酶 是分解纤维素的一类酶， 根据功能的不同， 分为外切 - 葡聚糖酶、 内切 - 葡聚糖酶和 - 葡萄糖苷酶， 它能将纤维素分解成为葡萄糖， 一种机理是 ： 内切葡聚糖酶首先将纤维素 的非结晶区切开， 产生大量的非还原端， 作为纤维二糖水解酶底物， 依次从非还原端切下纤 维二糖， 被葡萄糖苷酶水解成葡萄糖。 0003 目前工业上使用的纤维素酶大多来源于真菌发酵产物， 只能在中温条件下发挥作 用， 限制了酶的应用， 而耐热纤维素酶因具。
9、有极好的高温反应活性和稳定性， 在能源、 化工、 食品和医药等行业展现出越来越广阔的应用潜力。 0004 来源于 Euryarchaeota 门热球菌目的热球菌高度嗜热， 产生的耐热纤维素酶， 由 于具有较高的酶活力和热稳定性， 日益被人们所关注， 成为纤维素酶基础研究和开发新型 纤维素酶制剂的热点。许多研究者构建表达了来自热球菌的耐热纤维素酶， 例如国际专利 PCT/DK98/00039， 论文 Kengen 1993 和 Bauer 1999， 表达的耐热纤维酶的反应最适温度都 在 90以上， 但是存在工艺步骤多、 表达量低、 纯度差、 比活低、 难以放大用于生产的情况。 0005 200。
10、4 年学者 Yasuhiro Kashima(Extremophiles.9 ： 37-43) 从 Pyrococcus horikoshii 古细菌中克隆了 -1， 4 内切纤维素酶基因， 去除其 C 端的 411 459 位氨基 酸， 获得了改构的耐热-1， 4内切纤维素酶(PH1171)， 分子量约为45000， 使蛋白表达量提 高了 60 倍， 且活性不损失。但其纯化步骤包括破菌、 85热处理 30 分钟、 Q 阴离子交换层 析、 Phenyl 疏水层析、 S-200 凝胶过滤层析等， 步骤繁琐， 比活较低， 而且其使用的 S-200 凝 胶过滤层析限制了放大应用。 0006 在PCT。
11、/DK98/00039专利报道中， 利用芽孢杆菌表达了耐热-1， 4内切纤维素酶， 纯化步骤包括 ： 调 pH、 阴离子、 阳离子两种絮凝剂沉淀菌体、 滤纸过滤、 DEAE 阴离子交换层 析、 Butyl 疏水层析等， 步骤繁琐， 收率较低， 仅为 50 60， 并且局限于实验室水平， 难以 放大。 0007 因此， 建立一种简便、 快捷、 低成本、 可放大的耐热 -1， 4 内切纤维素酶的纯化方 法， 具有非常重要的意义。 发明内容 0008 鉴于此， 我们构建表达了耐热-1， 4内切纤维素酶(PH1171)蛋白， 本发明的目的 是提供了一种 PH1171 的纯化方法， 具有纯度高、 比活高。
12、、 收率高、 生产成本低、 有利于工业 化生产的特点。 0009 本发明采用以下的技术方案 ： 说 明 书 CN 103088004 A 3 2/7 页 4 0010 一种重组耐热的 -1， 4 内切纤维素酶的纯化方法， 由以下步骤组成 ： 0011 1) 破菌 0012 发酵获得表达重组耐热 -1， 4 内切纤维素酶的菌体， 离心后向菌体沉淀加入破 菌缓冲液， 使菌体和破菌缓冲液的比例为 1 5 20， 搅拌 10 20 分钟使之混合均匀， 通过超声或高压均质的方法裂解菌体 ； 其中破菌缓冲液为 20 50mM Tris-HCl， pH7.5 8.5、 0.1 5mMEDTA、 0.5 1M。
13、 NaCl、 5 10甘油、 溶菌酶 0.5 2mg/ml、 5 10mM 咪唑、 0.021mM PMSF ； 破菌缓冲液中的EDTA和甘油经试验证实对活性稳定十分重要， 确保菌体 在破菌、 热处理过程中活性损失减少， 咪唑的添加是避免金属螯合层析过度吸附含色氨酸、 半胱氨酸和少量组氨酸的非组氨酸标签的杂蛋白。菌体和破菌液的比例选择是为了方便 超声或高压均质机高效破碎菌体， 破菌过程中需要适度降温， 避免超过 30， 防止酶活的损 失。破菌时间以菌液不再粘稠、 流动性良好为准 ； 0013 2) 热处理 0014 将破菌处理后的溶液放入水浴中保温搅拌， 温度为 70 85， 搅拌速度控制在 。
14、100 200rpm， 处理时间为 15 40 分钟 ； 0015 3) 离心 0016 将热处理后的溶液放入离心机中离心， 离心力1000020000g， 时间1020分 钟， 取上清液， 加入 1 2M MgCl2至浓度 10mM 20mM， 经 0.45m 的滤膜过滤 ； 0017 在上述步骤中发酵菌体破碎后直接进行热处理， 使细胞碎片和杂蛋白大量沉淀， 较低离心力 10000g 左右即可充分分离沉淀， 获得澄清的蛋白粗纯液。热处理后蛋白纯度 明显提高， 由于目标蛋白的耐热 性和破菌缓冲液的甘油、 EDTA 等保护剂， 活性此步损失小 于 10。离心上清补加 MgCl2的作用是占据 ED。
15、TA 的金属螯合位点， 确保样品上样时不会因 EDTA 剥离 Ni 离子， 导致载量、 收率下降 ； 0018 4) 金属螯合亲和层析 0019 金属螯合层析用缓冲液 I 平衡色谱柱， 用量为 3 5CV， 上样后冲洗冲洗用量为 510CV， 使UV280吸收降至基线。 然后用缓冲液II洗脱杂蛋白， 用量为510CV， 使UV280 吸收降至基线。最后用缓冲液 III 洗脱目的蛋白， 收集 UV280 吸收大于 100mAu 组分， 加入 固体硫酸铵至饱和度 60 70进行沉淀， 呈混悬状态的蛋白产品置于 4长期保存， 活性 1 年内未见明显衰减。其中缓冲液 I 为 20 50mMTris-H。
16、Cl， PH7.5 8.5、 0.5 1M NaCl、 5 10甘油、 5 10mM 咪唑 ； 缓冲液 II 为 20 50mM Tris-HCl， PH7.5 8.5、 0.5 1M NaCl、 5 10甘油、 50 70mM 咪唑 ； 缓冲液 III 为 20 50mM Tris-HCl， PH7.5 8.5、 0.5 1M NaCl、 5 10甘油、 200 300mM 咪唑。 0020 所述破菌步骤中破菌法选择高压均质法， 是指将菌体和破菌缓冲液的混合液放入 高压均质机， 在 10 30、 工作压力为 500 800bar 时均质 2 3 遍。所述破菌步骤也可 以采用超声法， 方法为放。
17、入超声设备中， 超声 5 10 秒， 停 10 20 秒， 共超声 10 20 分 钟， 此超声方法建议体积小于 0.5L 时使用。 0021 所述热处理步骤中， 温度为 75 80， 处理时间为 20 30 分钟。 0022 所述金属螯合亲和层析步骤中介质配基为亚氨基二乙酸 (IDA) 或次氮基三乙酸 (NTA)， 优选为亚氨基二乙酸 (IDA)。由于 NTA 的载量相对较低， 所以使用 IDA 更经济， GE 公 司生产的 Ni Sepharose HP、 Ni Sepharose FF 可重复使用， Ni 离子脱落较少， 选择性高， 广 说 明 书 CN 103088004 A 4 3/。
18、7 页 5 泛用 于组氨酸标签蛋白的纯化， 其中Ni Sepharose HP填料颗粒平均34m， 分辨率略高于 Ni Sepharose FF， 且流速反压与 Ni Sepharose FF 无明显差异， 对纯度要求较高时使用 Ni Sepharose HP 较理想， 反之使用 Ni Sepharose FF 即可， 同时可以降低成本。 0023 所述金属螯合亲和层析步骤中柱高为 5 15cm， 柱床过高， 柱压明显， 影响上样、 洗脱流速， 过低影响分离效果 ； 上样线性流速为 30 120cm/h， 优选为 60 100cm/h， 这样 可以确保蛋白与填料的充分吸附 ； 洗脱线性流速为1。
19、00300cm/h， 优选为100150cm/h， 这样可以确保蛋白与填料充分解吸附， 上样、 洗脱时色谱柱压力控制在 0.4MPa 以下， 防止 色谱柱床压塌 ； 上样量为每 ml 填料上样菌体蛋白 100 300mg(Bradford 法检测 )， 优选为 100 200mg， 上样量过高会降低分辨率， 导致目的蛋白穿透， 收率降低。 0024 本发明与文献中提到的方法相比， 具有以下优点 ： 0025 (1) 优化了破菌液、 Ni 柱洗脱缓冲液成分， 使纯化过程中蛋白活性基本不变 ； 0026 (2)所用层析方法均可简单线性放大， 50ml Ni离子亲和柱即可以进行1批发酵液 (5L) 。
20、的纯化， 不使用凝胶层析， 工艺放大方便， 亲和层析的选择性高， 一步纯化后目的蛋白 纯度大于 90 ； 0027 (3) 收获蛋白浓度大于 10mg/ml， 体积小， 方便下一步盐析操作， 便于大规模生产 ； 0028 (4) 酶以盐析沉淀方式在 4 度长时间保持活性， 简化制剂过程， 酶活更稳定 ； 0029 (5) 工艺简单， 用时短 (1 天 )， 成本低。 附图说明 0030 图 1 是本发明实施例 1 的 PH1171 Ni 柱亲和层析色谱图 ； 0031 图 2 是本发明实施例 1 的 PH1171 纯化过程 SDS-PAGE 电泳图。 具体实施方式 0032 本发明所述纯化菌体。
21、来源于 ： 0033 ( 一 ) 古细菌 Pyrococcus horikoshii OT3 0034 目的基因获得 ： 0035 1、 使用上下游引物从古细菌Pyrococcus horikoshii OT3基因组中用PCR技术获 得目的片段 ； 0036 2、 用 NdeI 及 BamHI 双酶切目的基因片段及 pET11a 质粒载体 ； 0037 3、 连接载体及目的基因、 转入大肠杆菌 DH5 菌株。 0038 基因的改构 ： 0039 去掉 N-terminal 的 28 个氨基酸残基及 C-terminal 的 42 个氨基酸残基， 并对 SD 序列进行密码子偏好性突变， 使用以下。
22、引物构建亚克隆。 0040 表格左边为引物名称， 右边为引物序列。 0041 DSF CCAGTACATATGGAAAATACAACATATCAAACACCG DSCR TGGGATCCTCAAGAACTTTTGGAACAACTATC SD2MF CGCTTGGTGGGGTGGTAATCTAATG SD2MR CATTAGATTACCACCCCACCAAGCG 0042 构建方法 ： 说 明 书 CN 103088004 A 5 4/7 页 6 0043 1、 使用 DSF 及 SD2MR 引物用 PCR 获得目的基因片段 1 ； 0044 2、 使用 DSCR 及 SD2MF 引物用 PCR。
23、 获得目的基因片段 2 ； 0045 3、 将片段 1 及片段 2 等摩尔比混合， 不加引物进行 PCR 反应 10 个循环来拼接 ； 0046 4、 酶切拼接的目的基因及 pET11a 质粒载体 ； 0047 5、 连接载体及目的基因、 转入大肠杆菌 DH5 菌株 ； 0048 6、 测序正确后提取质粒转入表达载体大肠杆菌 BL21(DE3) 进行诱导表达， 表达成 功后进行大规模发酵。 0049 ( 二 ) 发酵 ： 0050 大肠杆菌 BL21(DE3)pET11a-1171 菌种发酵采用三级发酵一级种子培养基 (LB) ： 0051 0052 原始菌种接种过夜培养 0053 培养条件 。
24、： 温度为 37， 220rpm 0054 二级种子培养基 (LB) 0055 0056 1 -10接种培养至 OD600 为 0.5-1.0 0057 发酵培养基 ： 0058 0059 补料成分 ： 说 明 书 CN 103088004 A 6 5/7 页 7 0060 0061 按 5 10接种， 温度为 37， pH 控制在 7.0， 通过搅拌， 通气和灌压控制溶氧 保持在 30 60， 后期通过补料控制溶氧保持在 30 60， 当 OD600 为 10 20 开始 诱导， 加入 IPTG 至终浓度为 0.2 0.5mM， 诱导时间 3 5h， 诱导温度为 23 28， 可获得 发酵液。
25、， 在 5000rpm 离心 20 分钟， 收获菌体 180 250g。 0062 结合具体实施例进行说明。 0063 实施例 1 0064 将经过发酵液离心获得的菌体 180g 收集， 保持温度为 10， 加入破菌缓冲液 900ml( 菌体和破菌缓冲液的比例为 1 5)， 其中破菌缓冲液为 20mM Tris-HCl， pH7.5、 0.1mM EDTA、 0.5M NaCl、 5甘油、 溶菌酶 0.5mg/ml、 5mM 咪唑、 0.02mM PMSF， 搅拌 10 分钟 使之混合均匀， 通过高压均质的方法裂解菌体， 即将混合液体进行高压匀质机， 在 600bar， 10下匀质 2 遍， 。
26、使之不再粘稠 ； 然后将混合液体放入水浴中保温搅拌， 温度为 70， 搅拌 速度控制在100rpm， 不断搅拌15分钟后进行离心， 在10000g和10下离心10分钟， 取上清 液， 加入 1M MgCl2至终浓度 2mM， 经 0.45m 滤膜过滤， 获得 1052ml 滤液 ； 金属螯合层析的 介质配基是Ni2+-IDA， 为GE公司生产的NiSepharose HP， 金属螯合层析用缓冲液I平衡色谱 柱， 用量 3CV， 上样后冲洗用量为 5CV， UV280 吸收洗至基线， 其中缓冲液 I 为 20mMTris-HCl， PH7.5、 0.5M NaCl、 5甘油、 5mM 咪唑 ； 。
27、用缓冲液 II 洗脱杂蛋白， 用量 8CV， UV280 吸收洗至 基线， 其中缓冲液 II 为 20mMTris-HCl， PH7.5、 0.5M NaCl、 5甘油、 50mM 咪唑 ； 用缓冲液 III 洗脱目的蛋白， 收集 UV280 吸收大于 100mAu 组分， 其中缓冲液 III 为 20mMTris-HCl， PH7.5、 0.5M NaCl、 5甘油、 200mM 咪唑 ； 在金属螯合层析过程中柱高为 5cm， 上样线性流速 为 60cm/h， 洗脱线性流速为 100cm/h， 上样量为每 ml 填料上样菌体蛋白 100mg(Bradford 法 检测 )。收集的目的蛋白加入。
28、固体硫酸铵至饱和度 60进行沉淀， 呈混悬状态的蛋白产品 置于 4长期保存 ； 0065 本实施例中的 a. 金属螯合亲和层析色谱图为 ： 0066 PH1171 Ni 柱亲和层析色谱图， 见图 1 ； 0067 b. 纯化过程 SDS-PAGE 电泳结果图为 ： 0068 PH1171 纯化过程 SDS-PAGE 电泳图， 见图 2， 其中图 2 的标号为 ： 0069 1、 P11771 Ni 柱上样前 ( 热处理后破菌液 ) 0070 2、 PH1171 Ni 柱穿透蛋白 0071 3、 PH1171 Ni 柱洗脱峰 5 号 0072 4、 PH1171 Ni 柱洗脱峰 7 号 0073。
29、 5、 PH1171 Ni 柱洗脱峰 9 号 0074 6、 PH1171 Ni 柱洗脱峰 10 号 说 明 书 CN 103088004 A 7 6/7 页 8 0075 7、 PH7171 Ni 柱洗脱峰 12 号 0076 重复 Yasuhiro Kashima 和专利 PCT/DK98/00039 中纯化纤维素酶的方法， 将这两 种方法与此实施例采用的纯化方法生产蛋白的纯度、 比活、 活性回收率、 用时进行比较， 具 有如下特点 ： 0077 YasuhiroKashima 产品 专利 PCT/DK98/00039 产品 本发明产品 终产品纯度 90.2 86.4 96.8 比活 (U。
30、/mg) 42 34 62 活性回收率 40.7 54.2 74.8 工艺用时 60h 40h 8h 0078 实施例 2 0079 将经过发酵液离心获得的菌体 200g 收集， 保持温度为 20， 加入破菌缓冲液 2000ml( 菌体和破菌缓冲液的比例为 1 10)， 其中破菌缓冲液为 30mM Tris-HCl， PH8.0、 2mM EDTA、 0.8M NaCl、 8甘油、 溶菌酶 1mg/ml、 8mM 咪唑、 0.1mM PMSF， 搅拌 15 分钟使之混 合均匀， 通过超声的方法裂解菌体， 即将混合液体放入超声机中超声10秒， 停止20秒， 重复 循环， 共超声 10 分钟， 使。
31、之不再粘稠 ； 然后将混合液体放入水浴中保温搅拌， 温度为 80， 搅拌速度控制在 150rpm， 不断搅拌 30 分钟后离心， 在 15000g 和 25下离心 15 分钟， 取上 清液， 加入 2M MgCl2至终浓度为 10mM， 经 0.45m 滤膜过滤， 获得 2110ml 滤液 ； 金属螯合 层析的介质配基是 Ni2+-NDA(Qiagen 生产 )， 金属螯合层析用缓冲液 I 平衡色谱柱， 用量为 4CV， 上样后冲洗用量为 8CV， UV280 吸收洗至基线， 其中缓冲液 I 为 40mM Tris-HCl， PH8.0、 0.8MNaCl、 8甘油、 8mM 咪唑 ； 用缓冲。
32、液 II 洗脱杂蛋白， 用量为 7CV， UV280 吸收洗至基线， 其中缓冲液II为40mM Tris-HCl， PH8.0、 0.8M NaCl、 8甘油、 60mM咪唑 ； 用缓冲液III洗脱 目的蛋白， 收集UV280吸收大于100mAu组分， 其中缓冲液III为40mM Tris-HCl， PH8.0、 0.8M NaCl、 8甘油、 250mM 咪唑 ； 在金属螯合层析过程中柱高为 10cm， 上样线性流速为 80cm/h， 洗脱线性流速为 200cm/h， 上样量为每 ml 填料上样菌体蛋白 150mg(Bradford 法检测 )。收 集的目的蛋白加入固体硫酸铵至 65饱和度进。
33、行沉淀， 呈混悬状态的蛋白产品置于 4长 期保存。 重复Yasuhiro Kashima和专利PCT/DK98/00039中纯化纤维素酶的方法， 将这两种 方法与此实施例采用的纯化方法生产蛋白的纯度、 比活、 活性回收率、 工艺用时进行比较， 具有如下特点 ： 0080 YasuhiroKashima 产品 专利 PCT/DK98/00039 产品 本发明产品 终产品纯度 90.2 86.4 95.3 比活 (U/mg) 42 34 56 活性回收率 40.7 54.2 72.4 工艺用时 60h 40h 8h 0081 实施例 3 0082 将经过发酵液离心获得的菌体 250g 收集， 保持。
34、温度为 30， 加入破菌缓冲液 5000ml( 菌体和破菌缓冲液的比例为 1 20)， 其中破菌 缓冲液为 50mM Tris-HCl， PH8.5、 5mM EDTA、 1MNaCl、 10甘油、 溶菌酶2mg/ml、 10mM咪唑、 1mM PMSF， 搅拌40分钟使之混合均 匀， 通过高压均质的方法裂解菌体， 即将混合液体放入高压匀质机中， 在 800bar， 20下匀 质 3 遍， 使之不再粘稠 ； 然后将混合液体放入水浴中保温搅拌， 温度为 85， 搅拌速度控制 说 明 书 CN 103088004 A 8 7/7 页 9 在 200rpm， 不断搅拌 40 分钟后进行离心， 在 2。
35、0000g 和 20下离心 20 分钟， 取上清液， 加入 5M MgCl2至溶液浓度 20mM， 经 0.45m 滤膜过滤， 获得 8360ml 滤液 ； 金属螯合层析的介质 配基是 Ni2+-IDA， 为 GE 公司生产的 Ni Sepharose FF， 金属螯合层析用缓冲液 I 平衡色谱 柱， 用量 5CV， 上样后冲洗用量 10CV， UV280 吸收洗至基线， 其中缓冲液 I 为 50mM Tris-HCl PH8.5、 1M NaCl、 10甘油、 10mM 咪唑 ； 用缓冲液 II 洗脱杂蛋白， 用量 10CV， UV280 吸收洗 至基线， 其中缓冲液 II 为 50mM T。
36、ris-HCl， PH8.5、 1M NaCl、 10甘油、 70mM 咪唑 ； 用缓冲液 III 洗脱目的蛋白， 收集 UV280 吸收大于 100mAu 组分， 其中缓冲液 III 为 50mM Tris-HCl， PH8.5、 1M NaCl、 10甘油、 300mM 咪唑 ； 在金属螯合层析过程中柱高为 15cm， 上样线性流速 为 120cm/h， 洗脱线性流速为 300cm/h， 上样量为每 ml 填料上样菌体蛋白 300mg(Bradford 法检测 )。收集的目的蛋白加入固体硫酸铵至 70饱和度进行沉淀， 呈混悬状态的蛋白产 品置于 4长期保存。 0083 重复 Yasuhir。
37、o Kashima 和专利 PCT/DK98/00039 中纯化纤维素酶的方法， 将这两 种方法与此实施例采用的纯化方法生产蛋白的纯度、 比活、 活性回收率进行比较， 具有如下 特点 ： 0084 YasuhiroKashima 产品 专利 PCT/DK98/00039 产品 本发明产品 终产品纯度 90.2 86.4 93.5 比活 (U/mg) 42 34 52 活性回收率 40.7 54.2 70.4 工艺用时 60h 40h 8h 0085 以上所述仅为本发明的优选实施例而已， 并不用于限制本发明， 对于本领域的技 术人员来说， 本发明可以有各种更改和变化。 凡在本发明的精神和原则之内， 所作的任何修 改、 等同替换、 改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 103088004 A 9 1/1 页 10 说 明 书 附 图 CN 103088004 A 10 。