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1、(10)申请公布号 CN 103141721 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103141721 A *CN103141721A* (21)申请号 201210323162.X (22)申请日 2012.09.04 100144786 2011.12.06 TW 101108579 2012.03.14 TW A23L 1/03(2006.01) A23C 20/02(2006.01) (71)申请人 财团法人食品工业发展研究所 地址 中国台湾新竹市 (72)发明人 赖进此 郑芳宜 何金柱 李福临 陈汉根 廖启成 (74)专利代理机构 隆天国际知识产权代理有限 公司 720。
2、03 代理人 吴小瑛 菅兴成 (54) 发明名称 臭卤水的制造方法及所使用的发酵培养基 (57) 摘要 本发明提供一种臭卤水的制造方法， 其包括 ： (i) 提供制造臭卤水的菌群 ； 以及 (ii) 将所述菌 群接种于发酵培养基， 进行培养、 发酵， 其中该发 酵培养基包含85153g/L的胰蛋白及1527g/L的 大豆蛋白。本发明还包括上述臭卤水的制造方法 中所使用的发酵培养基， 其包含 85153g/L 的胰 蛋白及1527g/L的大豆蛋白。 使用本发明方法所 制造的臭卤水可生产出与传统制造方法相似风味 的臭豆腐。而且本发明方法可维持稳定的生产质 量并方便控制卫生条件， 在大规模的连续式生。
3、产 上具有产业利用价值。 (30)优先权数据 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 14 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 附图14页 (10)申请公布号 CN 103141721 A CN 103141721 A *CN103141721A* 1/1 页 2 1. 一种臭卤水的制造方法， 包括下列步骤 ： (i) 提供制造臭卤水的菌群 ； 以及 (ii) 将所述菌群接种于发酵培养基， 进行培养、 发酵， 其中该发酵培养基包含 85153g/L 的胰蛋白及 1527g/L 的大豆蛋白， 优选地， 该发酵培养基。
4、中包含 122.4g/L 的胰 蛋白及 21.6g/L 的大豆蛋白。 2. 如权利要求 1 所述臭卤水的制造方法， 其中， 该发酵培养基还包含葡萄糖。 3. 如权利要求 2 所述臭卤水的制造方法， 其中， 葡萄糖的浓度为 5g/L 以下， 优选地， 葡 萄糖的浓度为 1.26g/L。 4. 如权利要求 1 所述臭卤水的制造方法， 其中， 该发酵培养基还包含氯化钠、 磷酸 氢二钾或它们的组合， 优选地， 氯化钠的使用浓度为 0.55g/L， 磷酸氢二钾的使用浓度为 0.252.5g/L， 更优选地， 氯化钠的使用浓度为 5g/L， 磷酸氢二钾的使用浓度为 2.5g/L。 5.如权利要求1至4任一。
5、项所述臭卤水的制造方法， 其中， 该制造臭卤水的菌群选自芽 孢杆菌 (Bacillus)、 肠球菌 (Enterococcus)、 乳酸菌 (Lactobacillus) 中的一种或它们的 组合。 6.如权利要求1至4任一项所述臭卤水的制造方法， 其中， 该制造臭卤水的菌群选自保 藏编号BCRC 980003(CCTCC M98023)、 BCRC 98004(CCTCC M98024)中的一种或它们的组合。 7. 如权利要求 1 至 4 任一项所述臭卤水的制造方法， 其中， 该菌群的密度为 OD 600 值 0.550.6。 8.如权利要求第1至4项任一项所述臭卤水的制造方法， 其中， 该菌。
6、群的接菌量为该发 酵培养基总体积的 15%。 9. 如权利要求 1 至 4 任一项所述臭卤水的制造方法， 其中， 于 3037下进行培养、 发 酵。 10. 如权利要求 1 至 4 任一项所述臭卤水的制造方法， 其中， 该发酵培养基发酵 1014 天。 11. 一种发酵培养基， 用于如权利要求 1 至 10 任一项所述臭卤水的制造方法， 该发酵 培养基包含 85153g/L 的胰蛋白及 1527g/L 的大豆蛋白， 优选地， 该发酵培养基中包含 122.4g/L 的胰蛋白及 21.6g/L 的大豆蛋白。 12. 如权利要求 11 所述发酵培养基， 其还包含葡萄糖。 13. 如权利要求 12 所。
7、述发酵培养基， 其中， 葡萄糖的浓度为 5g/L 以下， 优选地， 葡萄糖 的浓度为 1.26g/L。 14. 如权利要求 12 或 13 所述发酵培养基， 其还包含氯化钠、 磷酸氢二钾或它们的组 合， 优选地， 氯化钠的使用浓度为 0.55g/L， 磷酸氢二钾的使用浓度为 0.252.5g/L， 更优 选地， 氯化钠的使用浓度为 5g/L， 磷酸氢二钾的使用浓度为 2.5g/L。 权 利 要 求 书 CN 103141721 A 2 1/8 页 3 臭卤水的制造方法及所使用的发酵培养基 技术领域 0001 本发明关于用于制造生臭豆腐的臭卤水的制造方法， 特别是关于制造臭卤水的过 程中所使用的。
8、发酵培养基。 背景技术 0002 臭豆腐吸引食客的因素在于其独特的风味， 该独特的风味来自于臭卤水发酵后所 产生的气味。传统上， 臭豆腐的制造方法选用高丽菜、 竹笋、 豆腐、 带壳虾、 食盐等混合食材 作为臭卤水的原料， 暴露于空气中经过约一至数星期的发酵后， 再将豆腐浸泡于该发酵后 的臭卤水中约一天至数星期， 可得到具有独特气味的生臭豆腐。 0003 然而， 用于制造臭卤水的食材因为季节差异而使得每一次制造的臭卤水质量不稳 定。再者， 传统制造方法将臭卤水暴露于空气中数星期， 可能产生的卫生问题令人担忧。 0004 因此， 考虑使制造臭豆腐及臭卤水的方法标准化， 可解决质量不稳定及卫生等问 。
9、题。 0005 台湾专利 I496731 提出了一种制造生臭豆腐的方法， 包括使用特定的菌群接种于 由特定比例的高丽菜、 竹笋、 虾及食盐所组成的卤水中， 进行培养、 发酵， 再将豆腐以特定比 例浸泡于卤水中， 以获得质量一致的臭豆腐。 0006 另一方面， 中国专利 CN101147548 提供一种油炸臭豆腐的制作方法， 包括制备卤 水、 豆腐的制作、 豆腐卤水浸泡和油炸四个步骤。其中， 制备卤水所用配料及重量含量为 ： 苋菜梗 12-13%、 竹笋 12-13%、 鲜豆汁 4-6%、 雪菜 9-11%、 姜 2-3%、 甘草 2-3%、 花椒 0.2-0.3%、 黄酒 4-6%、 食盐 4。
10、-6% 及水， 加工方法为 ： 将苋菜梗、 竹笋、 鲜豆汁、 姜、 甘草、 花椒和水混合烧 煮， 冷却后加入黄酒、 食盐和雪菜， 然后置于容器内， 发酵四个月至一年， 以得到卤水。 0007 李淑芬等人也提出臭卤水的最适产氨条件探讨， 选用高丽菜、 竹笋、 豆腐、 带壳虾 及食盐， 采用菌群接种方式静置发酵 4-6 周 ( 李淑芬等人，“臭豆腐发酵液 - 臭卤水的最适 产氨条件探讨” ，台湾农业化学与食品科学 ， 2001 年 4 月， 39(2), 第 162-164 页 )。李淑芬 等人更进一步以 Nessler 法检测臭卤水发酵过程中氨氮浓度， 作为发酵程度量化指标。 0008 本发明人。
11、为寻求科学化的配方及方法以制造质量稳定且符合卫生标准的臭豆腐， 对于影响发酵风味的条件 （例如发酵培养基的配方和发酵时间等） 进行探讨， 进而完成本发 明。 发明内容 0009 本发明提供一种臭卤水的制造方法， 其包括下列步骤 ： (i) 提供制造臭卤水的 菌群 ； 以及 (ii) 将所述菌群接种于发酵培养基， 进行培养、 发酵， 其中该发酵培养基包含 85153g/L的胰蛋白及1527g/L的大豆蛋白。 优选地， 该发酵培养基中包含122.4g/L的胰 蛋白及 21.6g/L 的大豆蛋白。 0010 如上所述臭卤水的制造方法， 其中， 该发酵培养基还包含葡萄糖。 0011 如上所述臭卤水的制。
12、造方法， 其中， 该葡萄糖的浓度为 5g/L 以下。优选地， 葡萄糖 说 明 书 CN 103141721 A 3 2/8 页 4 的浓度为 1.26g/L。 0012 如上所述臭卤水的制造方法， 其中， 该发酵培养基还包含氯化钠、 磷酸氢二钾或它 们的组合， 优选地， 氯化钠的使用浓度为 0.55g/L， 磷酸氢二钾的使用浓度为 0.252.5g/ L。更优选地， 氯化钠的使用浓度为 5g/L， 磷酸氢二钾的使用浓度为 2.5g/L。 0013 如上所述臭卤水的制造方法， 其中， 该制造臭卤水的菌群选自芽孢杆菌 (Bacillus)、 肠球菌 (Enterococcus)、 乳酸菌 (Lac。
13、tobacillus) 中的一种或它们的组合。 0014 如上所述臭卤水的制造方法， 其中， 该制造臭卤水的菌群选自保藏编号 BCRC 980003(CCTCC M98023)、 BCRC 98004(CCTCC M98024) 中的一种或它们的组合。 0015 如上所述臭卤水的制造方法， 其中， 该菌群的密度为 OD 600 值 0.550.6。 0016 如上所述臭卤水的制造方法， 其中， 该菌群的接菌量为该发酵培养基总体积的 15%。 0017 如上所述臭卤水的制造方法， 其中， 于 3037下进行培养、 发酵。 0018 如上所述臭卤水的制造方法， 其中， 该发酵培养基发酵 1014 。
14、天。 0019 本发明还提供用于上述臭卤水制造方法中的发酵培养基， 其包含 85153g/L 的胰 蛋白及 1527g/L 的大豆蛋白。优选地， 该发酵培养基中包含 122.4g/L 的胰蛋白及 21.6g/ L 的大豆蛋白。 0020 如上所述发酵培养基， 还包含葡萄糖。 0021 如上所述发酵培养基， 其中， 该葡萄糖的浓度为 5g/L 以下。优选地， 葡萄糖的浓度 为 1.26g/L。 0022 如上所述发酵培养基， 还包含氯化钠、 磷酸氢二钾或它们的组合。优选地， 氯化钠 的使用浓度为 0.55g/L， 磷酸氢二钾的使用浓度为 0.252.5g/L。更优选地， 氯化钠的使用 浓度为 5。
15、g/L， 磷酸氢二钾的使用浓度为 2.5g/L。 附图说明 0023 图 1a 显示菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 在不同培养基配方中的生长情形 ； 0024 图 1b 显示菌群 BCRC 980004(CCTCC M 98024) 在不同培养基配方中的生长情形 ； 0025 图2a显示菌群BCRC 980003(CCTCC M 98023)在不同培养基配方中培养的氨氮浓 度变化 ； 0026 图2b显示菌群BCRC 980004(CCTCC M 98024)在不同培养基配方中培养的氨氮浓 度变化 ； 0027 图 3 显示菌群 BCRC 980003(CCTCC 。
16、M 98023) 及 BCRC 980004(CCTCC M 98024) 在 TSB 培养基中培养的生长曲线 ； 0028 图 4 显示菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 及 BCRC 980004(CCTCC M 98024) 在 TSB 培养基中培养的氨氮浓度变化 ； 0029 图 5 显示菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 及 BCRC 980004(CCTCC M 98024) 在 修饰的 TSB 培养基中的生长情形 ； 0030 图 6 显示菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 及 BCRC 980004(CCT。
17、CC M 98024) 在 修饰的 TSB 培养基中的氨氮浓度变化 ； 0031 图 7a 显示改变培养基配方中葡萄糖及胰蛋白与大豆蛋白的浓度倍数与氨氮浓度 说 明 书 CN 103141721 A 4 3/8 页 5 的关系， 横坐标表示胰蛋白与大豆蛋白的浓度倍数 (N 组 )， 各方格表示对应的葡萄糖的浓 度倍数 (C 0.2C 7.0) ； 0032 图 7b 显示改变培养基配方中葡萄糖及胰蛋白与大豆蛋白的浓度倍数与氨氮浓度 的关系， 横坐标表示葡萄糖的浓度倍数 (C 组 )， 各方格表示对应的胰蛋白与大豆蛋白的浓 度倍数 (N 0.2N 7.0) ； 0033 图 8 显示 C/N 比。
18、与氨氮浓度的关系 ； 0034 图 9 显示特定的 C/N 比与氨氮浓度的关系 ； 0035 图 10 显示 C/N 比与氨氮浓度的线性关系 ； 以及 0036 图 11 显示不含葡萄糖的不同修饰培养基 ( 以 C/N 表示 ) 与氨氮浓度的关系。 具体实施方式 0037 本发明一种实施方式为一种臭卤水的制造方法， 包括下列步骤 ： 0038 (i) 提供制造臭卤水的菌群 ； 以及 0039 (ii) 将所述菌群接种于发酵培养基， 进行培养、 发酵， 其中该发酵培养基包含 85153g/L 的胰蛋白及 1527g/L 的大豆蛋白。 0040 所述 “臭卤水” 是指使生豆腐转变为具有独特风味的臭。
19、豆腐的组合物。具体地说， 使生豆腐浸泡于臭卤水数小时至数天后， 生豆腐可转变为具有独特风味的臭豆腐。 亦即， 臭 豆腐的口感及气味来自于臭卤水 （亦可简称为 “卤水” ） 的组成及发酵过程。 0041 所述的 “制造臭卤水的菌群” 是指所有可用于制造臭卤水的菌群。具体地说，“制 造臭卤水的菌群” 可包括芽孢杆菌 (Bacillus sp.)、 肠球菌 (Enterococcus sp.)、 乳酸菌 (Lactobacillus sp.) 或它们的组合。 0042 在本发明一个实施例中， 选用保藏于台湾食品工业发展研究所， 保藏编号 BCRC 980003 的菌群， 保藏日期为 1998 年 1。
20、2 月 9 日。此菌群已于 2002 年 8 月 1 日审定公告于台 湾专利公告号 I496731， 为可自由分配的生物材料。同一菌群 （命名为菌组 A2） 亦保藏于中 国典型培养物保藏中心， 保藏编号 CCTCC M 98023， 保藏日期为 1998 年 12 月 8 日。此菌群 已在 2004 年 5 月 5 日公告于中国专利公告号 CN1148439C， 为已授权的生物材料。 0043 在本发明另一个实施例中， 选用保藏于台湾食品工业发展研究所， 保藏编号 BCRC 980004 的菌群， 保藏日期为 1998 年 12 月 9 日。此菌群已于 2002 年 8 月 1 日审定公告于台。
21、 湾专利公告号 I496731， 为可自由分配的生物材料。同一菌群 （命名为菌组 S3） 亦保藏于中 国典型培养物保藏中心， 保藏编号 CCTCC M 98024， 保藏日期为 1998 年 12 月 8 日。此菌群 已在 2005 年 12 月 14 日公告于中国专利公告号 CN1231576C， 为已授权的生物材料。 0044 所述保藏编号 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 及 BCRC 980004(CCTCC M 98024) 的菌群是收集自台湾各地的臭卤水样品， 将具有臭味的臭卤水样品稀释涂抹培养后再 进行平板接种， 筛选仍具有臭味的菌群所得到者。所述菌群经菌体脂。
22、肪酸组成鉴定系 统 (Miller,L.and Berger,J.,Bacteria Identification by Gas Chromatograph of Whole Cell Fatty Acids,HP Application Note.288.41(1985)， 依据微生物鉴定系 统 （Microbial ID System， 缩写为 “MIS” ) 的标准操作步骤及分析方法进行分析。菌群 BCRC 980003(CCTCC M98023) 被鉴定出含有球形芽孢杆菌 （Bacillus sphaericus） 以及 属于肠球菌 （Enterococcus sp.）及乳酸菌 （La。
23、ctobacillus sp.）的未命名的菌种。菌 说 明 书 CN 103141721 A 5 4/8 页 6 群 BCRC980004(CCTCC M 98024) 被鉴定出含有球形芽孢杆菌、 鸟肠球菌 （Enterococcus avium） 、 酪 黄 肠 球 菌 （Enterococcus casseliflavus）及 耐 久 肠 球 菌 （Enterococcus durans） 。 0045 然而， 本发明所使用的菌群并不限于菌群 BCRC 980003(CCTCC M98023) 或菌群 BCRC 980004(CCTCC M 98024)， 可包含所有可用于制造臭卤水的菌群。
24、， 亦包含这些菌群的 组合。 0046 根据本发明的制造方法， 在将上述制造臭卤水的菌群接种于发酵培养基之前， 该 菌群密度为 OD600 值 0.550.6 的范围内。OD600 是指以波长 600nm 的光照射通过菌液所得 到的光线通过量 ( 即， 吸光度 )。通过 OD600 吸光度可确认菌液中所含的细菌密度。 0047 在本发明中， 使欲接种的细菌密度达到 OD600 为 0.550.6 的方法没有特别限制， 可使用任何活化或增殖菌群的方法。在本发明一个实施例中， 将保藏于甘油保存管的上述 保藏编号 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 或 BCRC980004(CCT。
25、CC M 98024) 的菌群接种至胰 蛋白大豆蛋白培养基(Trypticase Soy Broth ； 以下简称TSB培养基)中培养， 使菌群活化、 增殖至 OD600 为 0.550.6 的细菌密度。 0048 TSB 培养基 (Trypticase Soy Broth) 为本领域公知的细菌培养基， 已知可用于大 肠杆菌(E.coli)、 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 肺炎双球菌(Streptococcus pneumoniae)、 枯草杆菌(Bacillus subtilis)、 绿脓杆菌(Pseudomonas aerugionas)、 鼠伤 寒杆菌(。
26、Salmonella typhimurium)等的培养。 已知常用的TSB培养基包含17.0g/L来自胰 蛋白的蛋白胨(peptone)、 3.0g/L来自大豆的蛋白胨(peptone)、 2.5g/L右旋葡萄糖、 5.0g/ L 氯化钠及 2.5g/L 磷酸氢二钾， pH 值为 7.30.2(25 )。 0049 本发明不限于以上述方法活化或增殖菌群， 可包含所有可活化或增殖菌群的方 法。另外， 本发明另一个实施例中， 当欲接种的菌群本身即具有 OD600 为 0.550.6 的菌群 密度时， 也可不经过活化或增殖步骤， 而直接接种于发酵培养基中， 进行培养、 发酵。 0050 本发明所述的。
27、菌群在具有菌群密度为 OD6000.550.6 的条件下， 接菌量可为发酵 培养基总体积的 1% 以上。接菌量是指将菌群接种至培养基的菌数， 通常以欲接种的培养基 的体积比来表示。本发明所述的接菌量除了为发酵培养基总体积的 1% 以上， 没有特别的限 制条件。但考虑操作方便性， 接菌量可为发酵培养基总体积的 1%5% 体积比。 0051 本发明所述的发酵培养基是指用于培养上述菌群并进行后续发酵过程的培养基。 经过本发明人的探讨， 发现本发明将上述菌群接种于所述发酵培养基进行培养和发酵而获 得的臭卤水可取代传统以高丽菜、 虾壳等食材发酵所制成的臭卤水， 得到具有与传统风味 相近的臭豆腐。 005。
28、2 本发明所述的发酵培养基是通过改良已知的 TSB 培养基配方以及对于接种菌群 后的氨氮浓度进行检测所获得。 臭卤水发酵后的氨氮浓度为形成臭豆腐气味的主要因素之 一。 0053 具体地说， 本发明所述的发酵培养基可包含 85153g/L 的胰蛋白及 1527g/L 的 大豆蛋白。相较于已知 TSB 培养基， 本发明所述的发酵培养基可不包含葡萄糖或含有少量 的葡萄糖。本发明人发现， 当含有过高的葡萄糖浓度 ( 约 25g/L) 时， 不利于菌群的生长及 进行脱氨反应， 因此在氨氮浓度的表现上较差， 产生的气味较弱。然而， 当适度地提高胰蛋 白及大豆蛋白时， 可促进菌群的脱氨反应， 其氨氮浓度与传。
29、统臭卤水相近， 产生的气味也雷 说 明 书 CN 103141721 A 6 5/8 页 7 同。因此， 本发明所述的发酵培养基配方可不含有葡萄糖。另外， 当本发明的发酵培养基配 方含有葡萄糖时， 葡萄糖的浓度可为 5g/L 以下， 优选为 0.52.5g/L。 0054 另一方面， 考虑培养基的渗透压对菌群生长的影响， 本发明所述的发酵培养基 还可包含氯化钠、 磷酸氢二钾或它们的组合。所述盐类的浓度， 基于发酵培养基， 可为 0.757.5g/L， 优选为氯化钠 0.55g/L， 磷酸氢二钾 0.252.5g/L。然而， 本发明所述的盐类 不限于此， 本领域普通技术人员可根据常规技术适当调整。
30、培养基中的盐类种类及含量。 0055 根据本发明的一种具体实施方式， 从保藏于保藏机构的甘油保存管中， 取出编号 为 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 及 BCRC 980004(CCTCC M98024) 的菌液各 0.51mL， 接种 至 100mL 的 TSB 培养基中， 于 30摇晃 (125rpm) 培养 48 小时， 使菌群活化、 增殖。之后取 1mL 活化后的菌液进行 OD600 分析， 稀释至 OD600 为 0.550.6 的范围。此稀释后的菌液 以体积比 15% 接种至 100mL 含有 85153g/L 胰蛋白、 1527g/L 大豆蛋白、 05g/L。
31、 葡萄糖、 0.55g/L氯化钠及0.252.5g/L磷酸氢二钾的发酵培养基中。 接种后的发酵培养基于30 摇晃 (125rpm) 培养 48 小时， 可得到臭卤水。所得的臭卤水可再于 3037发酵 1014 天， 以得到较传统臭卤水的氨氮浓度高的卤水。 0056 在臭卤水制造完成后， 可视需要将生豆腐浸泡于臭卤水中以获得臭豆腐。此述浸 泡生豆腐的步骤可在常温下开放或密闭的空间内进行约 48 小时。 0057 根据本发明所述的臭卤水的制造方法， 使用特定的菌群及科学化的配方， 可缩短 臭卤水的发酵时程， 并且生产与已知风味相似的臭豆腐。而且， 根据本发明， 可维持稳定的 生产质量以及方便控制卫。
32、生条件， 在大规模的连续式生产上具有产业利用价值。 0058 实施例 1 ： 不同培养基对臭卤水的专利菌群的影响 0059 取得保藏编号BCRC 980003(CCTCC M 98023)及BCRC 980004(CCTCC M 98024)的 甘油保存管， 分别以 35% 体积比接种于已知的海洋培养基 （Marine broth， MB） 、 酵母抽取 物培养基 （Yeast Extract & Malt Extract broth， YM） 、 营养液体培养基 （Nutrient broth， NB） 及 TSB 培养基 （Trypticase Soy broth， TSB） 。于 30、。
33、 125rpm 转速下培养， 记录各培 养基中菌群的生长情形与氨氮浓度变化。 0060 氨氮浓度的测定方法为， 将接菌后的培养基离心 12000rpm、 10 分钟后， 取上清液 稀释 1000 倍。之后， 取 25mL 的稀释后上清液加入矿物稳定剂 （mineral stabilizer,HACH Co.,Ltd.,Colorado,USA） 及 聚 乙 烯 醇 分 散 剂 （polyvinyl alcohol dispersing agent,HACH） 各 3 滴， 摇晃混合数秒， 再加入 1mL 的 Nessler 试剂 （HACH） 摇晃反应 1 分钟， 之后以分光光度计测定 425。
34、nm 的吸光值。 0061 结果如图1a1b及图2a2b所示， 其中图1a及2a分别表示接种BCRC980003(CCTCC M 98023) 的 菌 群 密 度 (OD600) 及 氨 氮 浓 度 变 化， 图 1b 及 2b 分 别 表 示 接 种 BCRC 980004(CCTCC M 98024) 的菌群密度 (OD 600) 及氨氮浓度变化。 0062 如图 1a1b 所示， 在不同培养基中， 菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 及 BCRC 980004(CCTCC M 98024) 在 TSB 培养基中的生长情形较佳。 0063 关于氨氮浓度的变化， 如图。
35、 2a2b 所示， 菌群 BCRC 980003(CCTCC M98023) 于 TSB 培养基中， 在第 12 天达到 600mg/L 的最高氨氮浓度， 而菌群 BCRC 980004(CCTCC M 98024) 于 TSB 培养基中， 在第 12 天达到近 1200mg/L 的最高氨氮浓度。 0064 实施例 2 ： 菌群于 TSB 培养基的生长与氨氮浓度变化 说 明 书 CN 103141721 A 7 6/8 页 8 0065 将菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 及 BCRC 980004(CCTCC M98024) 如实施例 1 所述步骤以 1% 体积比接。
36、菌量分别培养于 TSB 培养基中， 记录生长曲线与氨氮浓度变化。 0066 生长曲线如图 3 所示， 接菌后的三天内菌群迅速生长， 然后进入稳定期， 第 10 天 以后生长速率开始下降。菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 的生长情形较菌群 BCRC 980004(CCTCC M 98024) 为佳。 0067 氨氮浓度的变化如图 4 所示。整体来看， 氨氮浓度会随着培养时间增加， 两菌群的 氨氮浓度变化没有太大差异， 在第 10 天达到 1300mg/L。 0068 根据图 4 的结果， 相较于传统臭卤水发酵的氨氮浓度最高为 2400mg/L( 李淑芬等 人，“臭豆腐发。
37、酵液 - 臭卤水的最适产氨条件探讨” ，台湾农业化学与食品科学 ， 2001 年 4 月， 39(2), 第 162-164 页 )， 本实施例在发酵两周后的氨氮浓度较低。 0069 实施例 3 ： 菌群于发酵培养基的生长与氨氮浓度变化 0070 首先制备下列培养基 : 0071 a)10 倍 浓 缩 的 TSB 培 养 基 : 包 含 25g/L 葡 萄 糖 （dextrose） 、 170g/L 胰 蛋 白 （tryptone） 、 30g/L 大豆蛋白 （soytone） 、 5g/L 氯化钠 （NaCl） 、 2.5g/L 磷酸氢二钾 （K2HPO4） 。 0072 b) 低葡萄糖浓度。
38、的修饰 TSB 培养基 :12g/L 葡萄糖 （dextrose） 、 170g/L 胰蛋 白 （tryptone） 、 30g/L 大豆蛋白 （soytone） 、 5g/L 氯化钠 （NaCl）及 2.5g/L 磷酸氢二钾 （K2HPO4） 。 0073 接着， 将菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 及 BCRC 980004(CCTCC M 98024) 分 别以1%体积接菌量接种于上述a)培养基。 另一方面， 将菌群BCRC 980004(CCTCC M 98024) 以 1% 接菌量接种于上述 b) 培养基。 0074 结果如图 5 所示， 以 10 倍浓缩培。
39、养基培养上述两种菌群时， 生长情形较差。然而 在低浓度葡萄糖培养基中的菌群 BCRC 980004(CCTCC M 98024) 则生长情形较佳。此结果 推测为葡萄糖浓度过高的培养基可能影响制造臭卤水的菌群生长。 0075 另外， 检测上述培养基的氨氮浓度变化， 结果如图 6 所示。在低浓度葡萄糖培养基 中培养的菌群 BCRC 980004(CCTCC M 98024)， 于第 11 天可达 3500mg/L 氨氮浓度。然而， 在 10 倍浓缩 TSB 培养基中培养的菌群 BCRC980004(CCTCC M 98024)， 在第 3 天仍维持在 1000mg/L的氨氮浓度。 此结果可推测为，。
40、 过高的葡萄糖浓度不利菌群生长及进行脱氨反应， 但是， 相对增加胰蛋白、 大豆蛋白的含量可提高培养基中菌群的脱氨反应。 0076 实施例 4 ： 培养基配方对菌群氨氮浓度的影响 0077 首先调配培养基配方， 以 TSB 培养基为基础， 调整其中葡萄糖及胰蛋白与大豆蛋 白的组成比例 ： 2.5g/L葡萄糖、 17g/L胰蛋白、 3g/L大豆蛋白、 5g/L氯化钠及2.5g/L磷酸氢 二钾。 0078 以此培养基配方为基础， 其中所含的葡萄糖浓度调制为 0.2、 0.5、 1、 3、 5、 7 倍 ( 葡 萄糖浓度范围为 0.5-17.5g/L)， 以及其中的胰蛋白及大豆蛋白浓度调制为 0.2、。
41、 0.5、 1、 3、 5、 7 倍 ( 胰蛋白浓度范围为 3.4-119g/L， 大豆蛋白浓度范围为 0.6-21g/L)。组合上述两个 条件， 共计有 36 组实验组。 0079 接着， 将菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 以 1% 体积比接菌量分别接种于上述 培养基， 于 30摇晃 (125rpm) 培养 14 天。 0080 结果如图 7a7b 所示， 图 7a 横坐标 N 组代表胰蛋白及大豆蛋白的浓度倍数， 纵坐 说 明 书 CN 103141721 A 8 7/8 页 9 标表示氨氮浓度， 各方格表示葡萄糖的浓度倍数， 例如 “C 0.2” 表示葡萄糖浓度。
42、 0.2 倍的情 形。图 7b 横坐标 C 组代表葡萄糖的浓度倍数， 纵坐标表示氨氮浓度， 各方格表示胰蛋白及 大豆蛋白的浓度倍数， 例如 “N 0.2” 表示胰蛋白及大豆蛋白浓度 0.2 倍的情形。 0081 如图 7a 所示， 当胰蛋白及大豆蛋白浓度大于 5 倍 （即胰蛋白浓度 85g/L， 大豆蛋 白浓度 15g/L） 时， 呈现较佳的氨氮浓度。相反地， 当葡萄糖浓度小于 1 倍 （即葡萄糖浓度 2.5g/L） 时， 呈现较佳的氨氮浓度 ( 图 7b)。 0082 再进一步将上述葡萄糖调制倍数 (C 组 ) 与胰蛋白及大豆蛋白调制倍数 (N 组 ) 的 比值 (C/N) 作为横轴， 以氨。
43、氮浓度作为纵轴作图 （数据未显示） 。结果发现当 C/N 为 0.5/7 的情形， 氨氮浓度的表现明显增加。以下， 再进一步对于 C/N 比值与氨氮浓度的表现进行统 计分析。 0083 首先， 记录培养第 10、 11、 12 天后， C/N 比例与氨氮浓度的关系， 结果如图 8 所示。 根据图 8， 显示在相同的葡萄糖浓度下， 胰蛋白与大豆蛋白的浓度越高， 所产生的氨氮浓度 越高 （如 C/N 为 0.2/7、 0.2/5、 0.2/3、 0.2/2.5 的情形） 。 0084 另一方面， 根据上述结果， 分析不同 C/N 值对氨氮浓度的影响， 如图 9 所示。结果 显示 C/N 为 0.6。
44、3/9 时， 可以获得近 5500mg/L 的氨氮浓度。 0085 其次， 再根据上述培养基配方， 分析 0.04、 0.12、 0.2 及 0.5 倍的葡萄糖浓度。结果 如图 10 所示， C/N 比值与氨氮浓度的变化具有线性关系。此结果显示， 当葡萄糖浓度为零 （x=0） 时， 所得截距为最高氨氮浓度。此结果可推测菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 可 在极低葡萄糖浓度的条件下生长且不影响脱氨反应进行。 0086 实施例 5 ： 培养基中葡萄糖浓度对菌群生长及氨氮浓度的影响 0087 首先调配培养基配方， 以 TSB 培养基为基础， 调整其中葡萄糖及胰蛋白与大豆蛋 。
45、白的组成比例 ： 17g/L 胰蛋白、 3g/L 大豆蛋白、 5g/L 氯化钠及 2.5g/L 磷酸氢二钾 ( 不含葡 萄糖 )。 0088 以此培养基配方为基础， 对其中所含的胰蛋白及大豆蛋白浓度调整为 3、 7、 9、 12、 15 倍。对照组为实施例 4 所述的 C/N 为 0.63/9（葡萄糖浓度 1.575g/L， 胰蛋白浓度 153g/ L， 大豆蛋白浓度 27g/L） 的培养基配方。 0089 接着， 将菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 以 1% 体积比接菌量分别接种于上述 培养基， 于 30摇晃 (125rpm) 培养 14 天。记录培养过程中产生的氨。
46、氮浓度， 结果如图 11 所示。 0090 如图 11 所示， 葡萄糖缺乏的实验组 C/N=0:9 与 0:7 和添加葡萄糖的对照组 C/ N=0.63:9， 于 14 天培养、 发酵后， 氨氮浓度可达到约 5000mg/L。此结果说明菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 可于葡萄糖缺乏或低葡萄糖浓度的培养基中生长而不影响其氨氮 浓度的提升。 0091 实施例 6 ： 生产的臭豆腐的品评试验 0092 选择未浸泡的生豆腐、 随机购买的市售臭豆腐以及室温下浸泡于下述臭卤水 4 小 时的生豆腐 ( 以下简称为 “实验例” )， 以相同油温与油炸时间进行品评试验。 0093 臭。
47、卤水的制备 : 将菌群 BCRC 980003(CCTCC M 98023) 以 1% 体积比接菌量接种于 由1.26g/L葡萄糖、 122.4g/L胰蛋白、 21.6g/L大豆蛋白、 5g/L氯化钠及2.5g/L磷酸氢二钾 所组成的培养基配方， 于 30摇晃 (125rpm) 培养 14 天。 说 明 书 CN 103141721 A 9 8/8 页 10 0094 品评试验以九分制进行评分， 整体喜好度最差得 1 分， 最好得 9 分， 其评分结果如 表 1 所示。实验例的平均得分 （5.86） 介于炸生豆腐 （5.74） 与炸市售臭豆腐 （7.91） 之间。 此结果显示实验例在风味上虽然。
48、没有炸市售臭豆腐强烈， 但是具有的臭豆腐气味明显与一 般炸生豆腐有别， 为一般大众可接受的臭豆腐。 0095 表 1 ： 臭豆腐的品评试验结果 0096 0097 虽然已通过优选实施例揭露了本发明， 但是所述优选实施例并非用以限定本发 明。在不脱离本发明的精神和范围的情况下， 本领域普通技术人员可对其作些许改动与变 化。因此， 本发明的保护范围应以后附的权利要求书所界定的范围为准。 说 明 书 CN 103141721 A 10 1/14 页 11 图 1a 说 明 书 附 图 CN 103141721 A 11 2/14 页 12 图 1b 说 明 书 附 图 CN 103141721 A 。
49、12 3/14 页 13 图 2a 说 明 书 附 图 CN 103141721 A 13 4/14 页 14 图 2b 说 明 书 附 图 CN 103141721 A 14 5/14 页 15 图 3 说 明 书 附 图 CN 103141721 A 15 6/14 页 16 图 4 说 明 书 附 图 CN 103141721 A 16 7/14 页 17 图 5 说 明 书 附 图 CN 103141721 A 17 8/14 页 18 图 6 说 明 书 附 图 CN 103141721 A 18 9/14 页 19 图 7a 说 明 书 附 图 CN 103141721 A 19 10/14 页 20 图 7b 说 明 书 附 图 CN 。