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1、(10)申请公布号 CN 103146643 A (43)申请公布日 2013.06.12 CN 103146643 A *CN103146643A* (21)申请号 201310092117.2 (22)申请日 2013.03.22 C12N 5/075(2010.01) (71)申请人 孔凡锋 地址 273500 山东省邹城市平阳东路 589 号 邹城第二中学 (72)发明人 孔凡锋 (54) 发明名称 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法 (57) 摘要 本发明提供一种体外人卵母细胞腔前卵泡培 养方法， 其特征在于培养方法的具体步骤包括 ： 1) 将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并 进。
2、行液氮低温贮存的体外人卵母细胞解冻后复苏 培养 ； 2) 将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离 提取后放入含有卵泡雌激素 FSH 的营养液中进行 腔前培养。体外人卵母细胞腔前卵泡培养需要 FSH 的支持， FSH 不仅能促进卵泡的生长， 增加其 存活天数， 还能促进颗粒细胞增殖， 促进卵母细胞 成熟， 是卵泡生长发育调控的重要因子。 曲古柳菌 素 A 可有效抑制肿瘤细胞增殖， 可为调控细胞周 期进程进而诱导肿瘤细胞凋亡， 从而保证细胞成 活质量， 该方法对于试管婴儿方面的研究具有重 要意义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识。
3、产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103146643 A CN 103146643 A *CN103146643A* 1/1 页 2 1. 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法， 其特征在于培养方法的具体步骤包括 ： 1) 将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并进行液氮低温贮存的体外人卵母细胞 解冻后复苏培养。 2) 将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素 FSH 的营养液 中进行腔前培养。 2. 根据权利要求 1 所述的体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法， 其特征在于在进行培养 过程中加入一定量的曲古柳菌素 A(TSA。
4、)。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法， 其特征在于步骤 2) 的具体方法是 ： 配置营养液， 在基本营养液 HamsF 10 中加入青霉素 110IU/ml， 链霉素 60g/ml， 并添加 17的脐带血清 FCS， 并加入浓度为 2.3IU/ml 的卵泡雌激素 FSH ； 将获取 的体外人卵母细胞在含 17的 FCS 的 Ham sF 10 清洗后移入营养液微滴中， 微滴上覆矿 物油， 在 37、 5 CO2、 饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养， 并每 24 小时换液一次。 4. 根据权利要求 1-3 所述的体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法， 其特征在于。
5、加入的曲 古柳菌素 A(TSA) 在营养液中的浓度为 200g/1。 权 利 要 求 书 CN 103146643 A 2 1/3 页 3 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法 技术领域 0001 本发明属于生物医学技术领域， 为一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法。 背景技术 0002 近年来， 随着有关胚胎工程技术尤其是试管婴儿技术的的不断发展， 对卵母细胞 的需求日益增加， 单纯利用体内成熟的卵母细胞已不能满足医学需求， 人们开始着眼于研 究具有巨大卵母细胞来源潜力的腔前卵泡的开发和利用。 但常规的腔前卵泡培养时颗粒细 胞增生分化不足从而导致卵泡发育存在缺陷， 卵泡在营养液中的存活天数很短，。
6、 培养难度 大、 成功率低且不稳定， 使得腔前卵泡培养达不到预期的效果而影响其进一步的研究。 发明内容 0003 本发明的目的是这样实现的 ： 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法， 其具体 步骤包括 ： 1) 将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并进行液氮低温贮存的体外人卵 母细胞解冻后复苏培养 ； 2) 将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡 雌激素 FSH 的营养液中进行腔前培养。在在进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素 A(TSA)。步骤 2) 的具体方法是 ： 配置营养液， 在基本营养液 HamsF-10 中加入青霉素 110IU/ml， 链霉素60g/ml， 并添加17。
7、的脐带血清FCS， 并加入浓度为2.3IU/ml的卵泡雌 激素 FSH ； 将获取的体外人卵母细胞在含 17的 FCS 的 Ham sF-10 清洗后移入营养液微滴 中， 微滴上覆矿物油， 在 37、 5 CO2、 饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养， 并每 24 小 时换液一次。加入的曲古柳菌素 A(TSA) 在营养液中的浓度为 200g/1。 0004 通过低温贮存能够提高体外人卵母细胞冻存后的存活率及减数分裂等各项功能 的恢复， 提高复速率。而卵泡刺激素 (FSH) 是垂体分泌的一种糖蛋白激素， 其主要作用是促 进颗粒细胞增生分化， 调节卵泡的发育。体外人卵母细胞腔前卵泡培养需要 FSH。
8、 的支持， FSH 不仅能促进卵泡的生长， 增加其存活天数， 能促进颗粒细胞增殖， 促进卵母细胞成熟， 是 卵泡生长发育调控的重要因子。曲古柳菌素 A 可有效抑制肿瘤细胞增殖， 可为调控细胞周 期进程进而诱导肿瘤细胞凋亡， 从而保证细胞成活质量， 该方法对于试管婴儿方面的研究 具有重要意义。 附图说明 0005 图 1 是贮体外人卵母细胞贮存方法流程示意图 ； 0006 图中， 1 为 ： 冷冻浸泡预处理 ； 2 为程序降温冷冻和低温贮存 ； 3 为快速升温解冻 ； 4 为复苏后培养 ； 0007 图 2 是体外人卵母细胞腔前培养图 ； 0008 图 3 是加入曲古柳菌素 A(TSA) 的细胞。
9、分组柱状图。 具体实施方式 说 明 书 CN 103146643 A 3 2/3 页 4 0009 实施例 1 0010 一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法， 其特征在于培养方法的具体步骤包括 ： 0011 1) 将放在含蔗糖和丙二醇的冷冻保护液中的并进行液氮低温贮存的体外人卵母 细胞解冻后复苏培养 ； 0012 2) 将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素 FSH 的营 养液中进行腔前培养。 0013 优选地， 进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素 A(TSA)。 0014 优选地， 步骤 2) 的具体方法是 ： 配置营养液， 在基本营养液 HamsF-10 中加入青 霉。
10、素 110IU/ml， 链霉素 60g/ml， 并添加 17的脐带血清 FCS， 并加入浓度为 2.3IU/ml 的 卵泡雌激素 FSH ； 将获取的体外人卵母细胞在含 17的 FCS 的 Ham sF-10 清洗后移入营养 液微滴中， 微滴上覆矿物油， 在 37、 5 CO2、 饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养， 并 每 24 小时换液一次。 0015 优选地， 加入的曲古柳菌素 A(TSA) 在营养液中的浓度为 200g/1。 0016 参见图 1， 本发明是一种体外人卵母细胞腔前卵泡培养方法， 首先是将体外人卵母 细胞贮存在含蔗糖和丙二醇的冷冻液里进行浸泡冷冻预处理 1， 再进行程序化。
11、的缓慢降温 冷冻， 然后低温贮存于液氮中， 即降温冷冻和低温贮存 2 ； 在需要使用时， 先使该体外人卵 母细胞快速升温解冻 3， 使之复苏， 再将已解冻复苏的该体外人卵母细胞放入序贯培养液 中， 置于 370.2、 5 6 CO2 浓度的孵箱进行培养 4， 以供体外受精。 0017 将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵泡雌激素 FSH 的营养 液中进行腔前培养。配置营养液， 在基本营养液 HamsF-10 中加入青霉素 110IU/ml， 链霉 素60g/ml， 并添加17的脐带血清FCS， 并加入浓度为2.3IU/ml的卵泡雌激素FSH ； 在进 行培养过程中加入一定量的曲古。
12、柳菌素 A(TSA)， 曲古柳菌素 A(TSA) 在营养液中的浓度为 200g/1。将获取的体外人卵母细胞在含 17的 FCS 的 Ham sF-10 清洗后移入营养液微 滴中， 微滴上覆矿物油， 在 37、 5 CO2、 饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养， 并每 24 小时换液一次。 0018 实施例 2 0019 贮存方法同实施例 1。将复苏培养获取的体外人卵母细胞分离提取后放入含有卵 泡雌激素 FSH 的营养液中进行腔前培养。配置营养液， 在基本营养液 Ham sF-10 中加入青 霉素 100IU/ml， 链霉素 50g/ml， 并添加 15的脐带血清 FCS， 并加入浓度为 1IU。
13、/ml 的卵 泡雌激素 FSH ； 在进行培养过程中加入一定量的曲古柳菌素 A(TSA)， 曲古柳菌素 A(TSA) 在 营养液中的浓度为 100g/1。将获取的体外人卵母细胞在含 15的 FCS 的 Ham sF-10 清 洗后移入营养液微滴中， 微滴上覆矿物油， 在 37、 5 CO2、 饱和湿度的二氧化碳培养箱中 进行培养， 并每 24 小时换液一次。试验结果如下 ： 0020 不同浓度 FSH 对人腔前卵泡体外生长天数的影响， 见表 1 ： 0021 表 1 0022 说 明 书 CN 103146643 A 4 3/3 页 5 组别例数生产天数 ( 平均天数 xs) 对照组102.8。
14、01.69a I 组145.360.63b II 组155.472.50c III 组168.134.19d 0023 注 ： 经 t 检验 a 与 dp 0.001 ； a 与 cp 0.01 ； a 与 b、 b 与 d、 d 与 cp 0.05 ； b 与 cp 0.05 0024 不同浓度曲古柳菌素 A(TSA) 对细胞周期的影响， 见表 2 ： 0025 表 2 0026 细胞周期对照组50g/L100g/L200g/L400g/L G1/G035.751.8436.842.2341.132.1526.942.4522.613.62 S28.873.1219.613.5825.233。
15、.4214.212.4622.824.24 G2/M20.132.5618.562.7618.492.2820.702.6421.591.83 Sub-G12.030.213.041.202.281.0214.742.0417.631.25 0027 由此可见， 根据实施例 1 得出的结果表面试验效果最佳。根据本发明所述的体外 人卵母细胞腔前培养方法可促进颗粒细胞增生分化， 调节卵泡的发育， 增加其存活天数， 可 有效抑制肿瘤细胞增殖， 可为调控细胞周期进程进而诱导肿瘤细胞凋亡， 从而保证细胞成 活质量， 该方法对于试管婴儿方面的研究具有重要意义。 0028 在此说明的是实施例中涉及的数值范围。
16、均是经过多次实验所得， 每一个点都可以 实现， 不局限在端点或者终点， 篇幅所限， 在此不进行一一列举。 0029 最后应说明的是 ： 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案， 而非对其限制 ； 尽 管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明， 本领域的普通技术人员应当理解 ： 其依然 可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改， 或者对其中部分技术特征进行等同替 换 ； 而这些修改或者替换， 并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精 神和范围。 说 明 书 CN 103146643 A 5 1/2 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103146643 A 6 2/2 页 7 图 3 说 明 书 附 图 CN 103146643 A 7 。