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核桃楸皮提取物及其制备方法
    【技术领域】
     本发明涉及一种中药， 具体是涉及一种核桃楸皮提取物 - 楸皮素及其制备方法。背景技术 核桃楸 (Juglans mandshurica Maxim) 为胡桃科胡桃属落叶乔木， 是东北阔叶红 松林的重要伴生树种， 也是东北著名的三大硬阔之一， 主要分布于我国东北地区。 核桃楸是 我国珍惜保护植物。
     近年来， 肝病发病率占各种传染病法定报告第一位。全球携带乙肝病毒的人数超 过 2.8 亿。我国是肝病高发区， 乙肝病毒携带者超过 0.93 亿， 患者人数超过 1000 万， 其中 25-40％以上发展为肝硬化或肝癌， 世界卫生组织把肝炎、 癌症、 爱滋病列为威胁人类生存 的三大 “杀手” 。
     目前， 西医治疗肝病的方法主要有两种 ： 一种是使用能抑制病毒复制的药物， 如干 扰素、 拉米夫定等， 这些物药对症性强， 治疗效果明显， 但停药后易复发， 甚至有时会转为不 可逆的严重后果。另一种方法就是手术， 这主要是针对癌症患者。术后化疗， 对患者伤害更 大。由于西医西药在这方面没有更理想的方法， 人们把目光投向中医中药。
     发明内容
     本发明的目的， 是提供一种用于治疗肝病， 特别是肝癌的核桃楸皮提取物 - 楸皮 素。
     本发明的另一目的， 是提供一种核桃楸皮提取物楸皮素的生产方法。
     技术方案是 ：
     核桃楸皮提取物的中药用活性成分主要有 ： 8- 羟 基 -9， 10- 蒽 醌 -1- 羧 酸、 regiolone、 4， 5， 8- 三 羟 基 -α- 萘 酮 -3-O-β-D- 吡 喃 葡 萄 糖 苷、 4， 5， 8- 三 羟 基 -α- 萘 酮 -3-O-(6 ′ -O- 没食子酰基 )-β-D- 吡喃葡萄糖苷、 1-(4’ - 羟基苯基 )-7-(3” - 甲氧 基 -4” - 羟 基 苯 基 ) 庚 烷 -3- 醇、 4- 羟 基 -2， 6- 二 甲 氧 基 苯 酚 -1-O-β-D- 吡 喃 葡 萄 糖 苷、 4- 羟基 -2， 6- 二甲氧基苯酚 -1-O-(6 ′ -O- 没食子酰基 )-β-D- 吡喃葡萄糖苷、 香草 酸 -4-O-(6′ -O- 没食子酰基 )-β-D- 吡喃葡萄糖苷、 香草醛、 香草酸、 没食子酸、 丁香酸、 山 萘酚、 槲皮素、 杨梅普和槲皮苷。
     核桃楸皮提取物的用途 ：
     民间常用核桃楸皮煮水喝， 用以治疗胸胁涨满， 口苦咽干等症状。在这个基础上， 我们对核桃楸皮的提取物进行研究， 确定化学成份和药理实验。
     对核桃楸皮提取物进行动物实验表明 ： 与模型对照组相比， 参试药物 (15mg·kg-1) 对小鼠 S180 肉瘤的生长有显著的抑制作用， 抑制率达到 40％以上， 给药组瘤量均有减轻， 与 模型对照组相比有显著差异 (P ＜ 0.05 或 P ＜ 0.01)。经过长时间反复多次实验， 不仅具有 肿瘤的抑制作用， 提示与化疗药物希罗达比较， CLI 在整体动物抑瘤试验中， 未发现发挥抑 瘤作用的剂量对外周白细胞数有显著影响。通过药理实验重点研究核桃楸皮提取物时， 肝癌 H22 荷瘤小鼠的瘤体增长有显著的抑制作用。 体外试验表明， 该药对肝癌细胞有直接杀伤 作用， 而对正常细胞没有损伤。
     核桃楸皮提取物可制成胶囊剂、 片剂、 丸剂、 针剂及其粉针剂， 使用方便， 治疗肝病 及其癌症， 疗效确切。
     服用方法 ：
     口服， 每日两次， 每次 2 片 / 粒 / 丸 ( 针剂每次 1 针 / 瓶 )， 含楸皮素 7-15mg。
     核桃楸皮提取物的制备方法， 是取核桃楸皮 100kg 粉成粗粉 ( 或破碎成小块 )， 加 入 6-8 倍量溶剂 ： 乙醇 ( 或水 )， 乙醇质量浓度为 70-95 ％ ( 水为饮用水 )， 加热回流三次 ( 水提为加热提取 )， 加热温度为 80-90℃ ( 水提 100℃ )， 每次 1 小时 ( 水提 3 小时 )， 过滤， 50-60℃减压浓缩至每 1ml 含药材 0.5-1g 的母液， 经大孔吸附树脂分离纯化后， 得棕黄色油 状物 200-300mg， 收率为 2‰ -3‰。 具体实施方式
     实施例一
     核桃楸皮提取物的制备方法， 是取核桃楸皮 100kg 磨成 50-60 目粗粉 ( 或破碎成 小块 )， 加入 6-8 倍饮用水， 加热提取三次， 温度为 100℃， 每次 3 小时， 过滤， 50-60℃减压浓 缩至每 1ml 含药材 0.5-1g 的母液， 经大孔吸附树脂分离纯化后， 得棕黄色核桃楸皮提取物 油状物 200mg， 收率为 2‰。 实施例二
     核桃楸皮提取物的制备方法， 是取核桃楸皮 100kg 磨成 40-50 目粗粉 ( 或破碎成 小块 )， 加入 6 倍量乙醇， 乙醇浓度为 70％， 加热回流三次， 加热温度为 80-90℃， 每次 1 小 时， 过滤， 50-60℃减压浓缩至每 1ml 含药材 0.5-1g 的母液， 经大孔吸附树脂分离纯化后， 得 棕黄色核桃楸皮提取物油状物 200mg， 收率为 2‰。
     实施例三
     核桃楸皮提取物的制备方法， 是取核桃楸皮 100kg 磨成粗粉 ( 或破碎成小块 )， 加 入 7 倍量乙醇， 乙醇浓度为 80％， 加热回流三次， 加热温度为 80-90℃， 每次 1 小时， 过滤， 50-60℃减压浓缩至每 1ml 含药材 0.5-1g 的母液， 经大孔吸附树脂分离纯化后， 得棕黄色核 桃楸皮提取物油状物 250mg， 收率为 2.5‰。
     实施例四
     核桃楸皮提取物的制备方法， 是取核桃楸皮 100kg 粉成粗粉 ( 或破碎成小块 )， 加 入 8 倍量乙醇， 乙醇浓度为 95％， 加热回流三次， 加热温度为 80-90℃， 每次 1 小时， 过滤， 50-60℃减压浓缩至每 1ml 含药材 0.5-1g 的母液， 经大孔吸附树脂分离纯化后， 得棕黄色核 桃楸皮提取物油状物 300mg， 收率为 3‰。
     核桃楸皮提取物化学成分组成
     经溶剂分步萃取， 反复硅胶柱色谱， 聚酰胺柱色谱， ODS， Sephadex LH-20， 制备 薄层和反复重结晶等手段得到 18 个化合物， 通过理化常数测定和光谱数据分析等手段鉴 定其中的 16 个化合物的结构， 分别为 ： (1)8- 羟基 -9， 10- 蒽醒 -1- 羧酸、 (2)regiolone、 (3)4， 5， 8- 三 羟 基 -α- 萘 酮 -3-O-β-D- 吡 喃 葡 萄 糖 苷、 (4)4， 5， 8- 三 羟 基 -α- 萘 酮 -3-O-(6′ -O- 没食子酰基 )-β-D- 吡喃葡萄糖苷、 (5)1-(4’ - 羟基苯基 )-7-(3” - 甲氧
     基 -4” - 羟基苯基 ) 庚烷 -3- 醇、 (6)4- 羟基 -2， 6- 二甲氧基苯酚 -1-O-β-D- 吡喃葡萄糖 苷、 (7)4- 羟基 -2， 6- 二甲氧基苯酚 -1-O-(6′ -O- 没食子酰基 )-β-D- 吡喃葡萄糖苷、 (8) 香草酸 -4-O-(6′ -O- 没食子酰基 )-β-D- 吡喃葡萄糖苷、 (9) 香草醛、 (10) 香草酸、 (11) 没食子酸、 (12) 丁香酸、 (13) 山萘酚、 (14) 槲皮素、 (15) 杨梅普和 (16) 槲皮苷。其中化合 物 1 为一新天然产物， 其中化合物 6， 7 和 8 为属内首次分离得到， 2， 9， 12， 13 和 14 为本植物 内首次分离得到。鉴别情况如下 ：
     化合物 1， 8-hydroxy-9， 10-anthraquinone-1-carboxylic acid 1
     黄色针晶 (EtOH-H2O)， H-NMR 和 13C-NMR。
     化合物 2， regiolone
     白色结晶， 10 ％硫酸 - 乙醇显色为绿色斑点 ( 薄层硅胶 )， 365nm 下为明显的绿 色荧光。UVλmax(MeOH， nm) ： 222， 260， 340。UVλmax(MeCN， nm) ： 222， 260， 340。CD， Δε(λ 0.1mg/ml， MeCN) ： Δε ＝ +1600(219nm)， Δε ＝ +400(260nm)， Δε ＝ +50(340nm)。 max， 1 H-NMR(300MHz， DMSO-d6)， δ： 12.42(1H， s， OH-8)， 7.55(1H， t， H-6)， 7.08(1H， d， J ＝ 7.5Hz， H-5)， 6.85(1H， d， J ＝ 8.2Hz， H-7)， 5.64(1H， d， J ＝ 5.8Hz， OH-4)， 4.76(1H， m， H-4)， 2.76 13 (2H， m， CH2-2)， 2.2(1H， dddd， H-3β)， 2.0(1H， dddd， H-3α)。 C-NMR， δ205.4(C-1)， 161.6(C-8) ， 148.8(C-4a) ， 136.9(C-6) ， 117.5(C-5) ， 115.9(C-7) ， 115.1(C-8a) ， 66.1(C-4)， 35.4(C-2)， 31.6(C-3)。
     化合物 3， 4， 5， 8-trihydroxy-α-tetralone-5-O-β-D-glucopyranoside
     无定形粉末， 365nm 下呈亮黄色荧光， 10 ％硫酸 - 乙醇显色为绿色斑点 ( 薄层硅 胶 )。
     ESI-MS ： 354.9[M-H]-， 391.0[M+Cl]-， 379.1[M+Na]+。UVλmax(MeOH， nm) ： 230， 263， 356。CD， Δε(λmax， 0.01mg/ml， MeOH) ： Δε ＝ -25(225nm)， Δε ＝ -5(260nm)， Δε 1 13 ＝ -3(355nm)。 H-NMR 和 C-NMR。
     化 合 物 4， 4， 5， 8-trihydroxy-α-tetralone-5-O-β-D-(6’ -O-galloyl) glucopyranoside
     无定形粉末， 365nm 下呈亮黄色荧光， 10 ％硫酸 - 乙醇显色为绿色斑点 ( 薄层硅 胶 )。
     ESI-MS ： 507.0[M-H]-， 542.9[M+Cl]-， 531.1[M+Na]+。1H-NMR 和 13C-NMR。
     化 合 物 5， 1-(4’ -hydroxyphenyl)-7-(3” -methoxy-4” -hydroxyphenyl) hepta-3-ol
     黄 色 油 状 固 体， ESI-MS ： 329.0[M-H]-， 353.2[M+Na]+， 354.2[M+Na+H]+ ； 329.0[M-H]- 的二级负离子 ： 313.9， 286.9， 220.8， 206.8， 192.9， 134.8 ； 353.2[M+Na]+ 的二 级正离子 ： 337.2， 313.2， 219.1， 189.1， 137.0， 121.0。1H-NMR 和 13C-NMR。 。
     化合物 6， 4-hydroxy-2， 6-dimethoxyphenol1-O-β-D-glucopyranoside 1
     无色结晶 (MeOH-H2O)， ESI-MS ： 330.9[M-H]-， 366.9[M+Cl]-， 355.1[M+Na]+ ； H-NMR 13 和 C-NMR。
     化 合 物 7， 4-hydroxy-2 ， 6-dimethoxyphenol-1- β -D-(6’ -O-galloyl) glucopyranoside
     无 色 针 晶 (MeOH-H2O)， ESI-MS ： 483.0[M-H]-， 518.9[M+Cl]-， 485.1[M+H]+，507.1[M+Na]+。 1H-NMR 和 13C-NMR。
     化合物 8， Vanillic acid-4-O-β-D-(6’ -O-galloyl)glucopyranoside
     无色结晶 (MeOH)， ESI-MS ： 481.0[M-H] ， 505.1[M+Na]+。1H-NMR 和 13C-NMR。
     化合物 9， Vanillin
     白色针晶 (MeOH)， 三氯化铁 - 铁氰化钾反应阳性。1H-NMR， δ10.23(1H， br.s， OH-4)， 9.77(1H， s， CHO)， 7.43(1H， dd， J ＝ 8.0， 1.8Hz， H-6)， 7.38(1H， d， J ＝ 1.8Hz， H-5)， 13 6.95(1H， d， J ＝ 8.0Hz， H-2)， 3.83(3H， s， OCH3). C-NMR， δ191.1(CHO)， 153.1(C-4)， 148.2(C-3)， 128.7(C-1)， 126.2(C-2)， 115.5(C-6)， 110.7(C-5)， 55.7(OCH3)。
     化合物 10， Vanillic acid
     白 色 针 晶 (MeOH)。 三 氯 化 铁 - 铁 氰 化 钾 反 应 阳 性， 溴 酚 蓝 反 应 阳 性。 1 H-NMR(DMSO-d6)δ ： 12.50(1H， brs， COOH)， 9.85(1H， brs， OH-4)， 7.44(1H， dd， J ＝ 8.7Hz， 1.8Hz， H-6)， 7.43(1H， d， J ＝ 1.8Hz， H-2)， 6.84(1H， d， J ＝ 8.7Hz， H-5)， 3.81(3H， s， OCH3-3)。
     化合物 11， Gallic acid
     无色针晶， 三氯化铁 - 铁氰化钾反应阳性， 溴甲酚绿反应阳性。1H-NMR(DMSO-d6) δ： 12.30(1H， br.s， COOH)， 9.20(3H， br.s， OH-3， 4， 5)， 6.91(2H， s， H-2， 6)。 化 合 物 12， Syringic acid
     无色针晶， 三氯化铁 - 铁氰化钾反应阳性， 溴酚蓝反应阳性。1H-NMR(DMSO-d6)δ ： 12.40(1H， br.s， COOH)， 9.12(1H， br.s， OH-4)， 7.20(2H， s， H-2， 6)， 3.80(6H， s， OCH3-3， 13 5)。 C-NMR， δ168.0(COOH)， 122.6(C-1)， 106.8(C-2， 6)， 147.3(C-3， 5)， 139.5(C-4)， 55.9(OCH3-3， 5)。
     化合物 13， Kaempferol
     淡 黄 色 粉 末， 三 氯 化 铁 - 铁 氰 化 钾 反 应 阳 性， 盐 酸 镁 粉 反 应 阳 性。1H-NMR， δ12.49(1H， br.s， OH-5)， 10.70(1H， br.s， OH-7)， 10.11(1H， br.s， OH-4’ )， 9.42(1H， br.s， OH-3)， 8.05(2H， d， J ＝ 8.7Hz， H-2’ ， 6’ )， 6.92(2H， d， J ＝ 8.7Hz， H-3’ ， 5’ )， 6.44(1H， s， H-8)， 6.19(1H， s， H-6)。
     化合物 14， Quercetin
     黄绿色粉末， 三氯化铁 - 铁氰化钾反应阳性， 盐酸镁粉反应阳性。1H-NMR(DMSO-d 12.51(1H， brs， OH-5)， 10.09(1H， brs， OH-7)， 9.37(3H， brs， OH-3， 3′， 4′ )， 7.68(1H， 6)δ ： d， J ＝ 1.9Hz， H-2′ )， 7.55(1H， dd， J ＝ 8.5Hz， 1.9Hz， H-6′ )， 6.92(1H， d， J ＝ 8.5Hz， H-5′ )， 6.41(1H， d， J ＝ 1.7Hz， H-8)， 6.19(1H， d， J ＝ 1.7Hz， H-6)。
     化合物 15， Myricitrin
     淡黄色粉末， 三氯化铁 - 铁氰化钾反应阳性， 三氯化铝反应在紫外下荧光加强。 1 H-NMR， δ12.67(1H， s， OH-5)， 8-10(several protons， p-OH)， 6.96(2H， s， H-2’ ， 6’ )， 6.36(1H， d， J ＝ 1.9Hz， H-8)， 6.20(1H， d， J ＝ 1.9Hz， H-6)， 5.19(1H， s， H-1” )， 3-5(several 3 13 protons， H-2” -4” )， 0.84(3H， d， J ＝ 6Hz， CH -5” )。 C-NMR， δ157.5(C-2)， 134.3(C-3)， 177.8(C-4)， 161.4(C-5)， 98.7(C-6)， 164.3(C-7)， 93.5(C-8)， 156.5(C-9)， 104.0(C-10)， 119.6(C-1’ )， 107.9(C-2’ )， 145.8(C-3’ )， 136.5(C-4’ )， 145.8(C-5’ )， 107.9(C-6’ )， 102.0(C-1” )， 70.5(C-2” )， 70.6(C-3” )， 71.3(C-4” )， 70.1(C-5” )， 17.6(C-6” )。化合物 16， Quercitrin
     淡黄色粉末， 三氯化铁 - 铁氰化钾反应阳性， 三氯化铝反应在紫外下荧光加强。 1 H-NMR， δ12.65(1H， s， OH-5)， 7.26(1H， br.s， H-2′ )， 7.22(1H， br.d， J ＝ 8.0Hz， H-6′ )， 6.82(1H， br.d， J ＝ 8.0Hz)， 6.41(1H， br.d， H-8)， 6.19(1H， br.d， H-6)， 5.25(1H， s， H-1” )， 13 3-5(several protons， H-2” -4” )， 0.81(3H， d， J ＝ 5.7Hz， CH3-5” )。 C-NMR， δ156.5(C-2)， 133.8(C-3)， 177.0(C-4)， 161.1(C-5)， 99.3(C-6)， 164.0(C-7)， 93.8(C-8)， 156.6(C-9)， 104.0(C-10)， 120.9(C-1’ )， 115.2(C-2’ )， 146.0(C-3’ )， 115.2(C-4’ )， 149.0(C-5’ )， 120.9(C-6’ )， 101.7(C-1” )， 70.3(C-2” )， 70.4(C-3” )， 71.2(C-4” )， 70.0(C-5” )， 17.4(C-6” )。
     核桃楸皮提取物楸皮素药效学
     通过制备小鼠肉瘤 S180、 肝癌 H22、 肝癌 Hca-F 瘤株荷瘤小鼠模型， 分别考察楸皮素 -1 不同剂量对荷瘤小鼠的抑瘤作用， 结果表明 ： 楸皮素 7.5、 15mg·kg 连续灌胃给药 7 天对 小鼠肉瘤 S180、 小鼠肝癌 Hca-F 荷瘤小鼠均有显著抑瘤作用 ； 且抑瘤作用呈现量效关系。楸 -1 皮素 15mg·kg 对小鼠肝癌 H22 荷瘤小鼠有显著的抑瘤作用， 3.75、 7.5mg·kg-1 对其有一定 的抑瘤作用趋势， 但无统计学意义。 通过与环磷酰胺联合用药发现， 与楸皮素单独用药时比 -1 较， 楸皮素 3.75、 7.5、 15mg· kg 连续灌胃给药 7 天与 CTX 联合应用时， 对肉瘤 S180 模型小鼠 抑瘤率均有一定提高作用， 且 15mg· kg-1 与 CTX 联合应用时， 抑瘤呈现相加作用。通过体外 制备 Hela 细胞 ( 人宫颈癌细胞 )、 7402BEL( 人肝癌细胞 ) 和 Hca-F 细胞 ( 小鼠腹水型肝癌 细胞 )， 应用 MTT 检测方法分别对待测药物组、 阳性药对照组和正常对照组 (1640 培养液 ) 进行抑制肿瘤细胞能力的观察。试验结果显示 ： 在所选择的剂量范围内， 楸皮素对 Hela 细 胞、 7402BEL 细胞及 Hca-F 细胞均具有显著抑制作用。研究还发现， 楸皮素 15mg·kg-1 连续 灌胃给药 7 天对小鼠肉瘤 S180 荷瘤小鼠外周血白细胞数有显著升高作用， 3.75、 7.5mg·kg-1 有一定的升高作用趋势， 但无统计学意义。提示楸皮素在所选剂量范围内连续用药未发现 对荷瘤小鼠骨髓有抑制作用。楸皮素 15mg· kg-1 连续灌胃给药 7 天可显著提高环磷酰胺致 免疫功能低下小鼠脾脏脏器系数和碳粒廓清指数， 由此可见， 楸皮素在体内抗肿瘤的同时， 对网状内皮系统的吞噬功能影响较小， 不损伤小鼠的非特异免疫功能。
     一、 抗肿瘤作用
     ( 一 ) 整体动物试验
     试验目的考察核桃楸皮提取物楸皮素的体内抗肿瘤作用和联合化疗药物用药是 否产生协同抗肿瘤作用。
     试验方法与结果
     1. 对小鼠肉瘤 S180 的抑制作用
     试验方法
     体外复苏小鼠肉瘤 S180 瘤株细胞， 复苏三代， 用无菌生理盐水稀释， 选取 健康小 鼠， 每只用上述细胞悬液 0.2ml 腹腔注射， 约一周后接种小鼠腹部明显涨大， 抽取腹水， 在 7 无菌试管中用无菌生理盐水稀释瘤细胞数浓度为 2×10 个 /ml。用上述腹水稀释液对购进 昆明种小鼠进行接种， 于腋窝处消毒皮肤后每只皮下接种 0.2ml， 建立小鼠肉瘤 S180 荷瘤模 [1][2][3] 型 。
     将荷瘤小鼠随机分组， 每组 10 只， 分别为模型对照组， 楸皮素低、 中、 高给药组(3.75、 7.5、 15mg·kg-1)， 参一胶囊组 (10mg·kg-1)， 复方木鸡合剂组 (10ml·kg-1)， 希罗达 -1 组 (1000mg·kg )。自造模 24 小时后连续灌胃给药 7 天， 每日 1 次， 给药容积 20ml·kg-1[4] [5] 。
     本次给药 24h 后， 颈椎脱臼法处死动物， 解剖剥离瘤块， 电子天平称瘤重。根据下 面公式计算抑瘤率 ：
     抑瘤率＝ (1- 给药组平均瘤重 / 对照组平均瘤重 )×100％
     实验数据以平均值 ± 标准差表示。试验结果
     与模型对照组比较， 楸皮素 7.5、 15mg·kg-1 连续灌胃给药 7 天对小鼠肉瘤 S180 荷 瘤小鼠有显著的抑瘤作用 ： 楸皮素 3.75mg·kg-1 有一定的抑瘤作用趋势， 但无统计学意义。 实验共做 3 次， 高剂量组抑制率均达到 30％以上。结果见表 1。
     表 1 楸皮素对小鼠肉瘤 S180 的抑制作用
     ** 与模型组比较 *P ＜ 0.05， P ＜ 0.01
     2. 对小鼠肝癌 Hca-F 的抑制作用
     试验方法
     体外常规复苏小鼠肝癌 Hca-F 瘤株细胞， 其它同上。
     试验结果
     与模型对照组比较， 楸皮素 7.5、 15mg·kg-1 连续灌胃给药 7 天对小鼠肝癌 Hca-F 荷瘤小鼠有显著的抑瘤作用 ； 楸皮素 3.75mg·kg-1 有一定的抑瘤作用趋势， 但无统计学意 义。实验共做 3 次， 高剂量组抑瘤率均达 30％以上。结果见表 2
     表 2 楸皮素对小鼠肝癌 Hca-F 的抑制作用
     ** 与模型组比较 *P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 3. 对小鼠肝癌 H22 的抑制作用 试验方法 体外常规复苏小鼠肝癌 H22 瘤株细胞， 其它同上。试验结果
     与模型对照组比较， 楸皮素 7.5、 15mg· kg-1 连续灌胃给药 7 天对小鼠肝癌 H22 荷瘤 小鼠有显著的抑瘤作用 ； 3.75mg·kg-1 有一定的抑瘤作用趋势， 但无统计学意义。实验共做 3 次， 高剂量组抑瘤率均达 30％以上。结果见表 3。
     表 3 楸皮素对小鼠肝癌 H22 的抑制作用
     ** 与模型组比较 *P ＜ 0.05， P ＜ 0.01 4. 与化疗药物环磷酰胺 (CTX) 联合应用对小鼠肉瘤 S180 荷瘤小鼠的抑瘤作用试验方法
     将接种 24h 后小鼠肉瘤 S180 荷瘤小鼠随机分为 8 组， 每组 10 只。即模型对 照组、 -1 CTX(10mg·kg )、 楸皮素低、 中、 高剂量组 (3.75、 7.5、 15mg·kg-1)、 楸皮素低 +CTX、 中 +CTX、 -1 高 +CTX 剂量组， 剂量分别为 (3.75+10、 7.5+10、 15+10mg·kg )。其中， CTX 组于接种后 24 小时后起第 1、 3、 5、 7 天腹腔注射给药， 给药容积为 0.1ml/10g， 每天给药 1 次， 共给药 4 次。 楸皮素于瘤株接种后 24 小时起开始灌胃给药， 每天给药 1 次， 连续给药 7 天。楸皮素各剂量合并 CTX 组于接种后 24 小时起按上述给药方法灌胃给各剂量楸皮素和腹腔注射 CTX。 第 8 天处死动物， 剥取瘤块称重， 根据公式 (1)、 (2) 分别计算抑瘤率、 Q 值。根据 Q 值来判断联 合用药疗效， Q ＜ 0.85 为拮抗， Q 介于 0.85 ～ 1.5 之间为相加， Q ＞ 1.15 为协同 [6][7]。
     (1) 抑瘤率＝ (1 一给药组平均瘤重 / 对照组平均瘤重 )×100％
     (2)Q 值＝ E(A+B)/[EA+EB(1-EA)]， ( 其中 EA、 EB、 E(A+B) 分别表示受试药物组、 CTX 组及 [7] 联合用药组的抑瘤率 ) 。
     试验结果
     与楸皮素单独用药时比较， 楸皮素各剂量与 CTX 联合应用时， 联合应用对肉瘤 S180 荷瘤小鼠抑瘤率均有一定提高作用， 且高剂量与 CTX 联合用药时， Q ＝ 0.86， 抑瘤呈相加作 用。结果见表 4
     表 4 楸皮素与环磷酰胺 (CTX) 联合用药对小鼠肉瘤 S180 荷瘤小鼠的抑瘤作用
     与模型组比较 *P ＜ 0.05**P ＜ 0.01
     Q 低＝ 0.65， Q 中＝ 0.76， Q 高＝ 0.86
     ( 二 ) 体外试验
     试验目的考察受试物在体外对 Hela 细胞、 7402BEL 细胞和 Hca-F 细胞增殖的影响。
     试验方法和结果 ：
     1. 分组及细胞制备 ：
     1.1 分组
     楸 皮 素 ( 剂 量： 100μg/ml、 50μg/ml、 25μg/ml、 12.5μg/ml、 6.25μg/ml、 3.125μg/ml、 1.56μg/ml) 阳 性 药 组 ( 甘 迪 克 )( 剂 量 ： 100μg/ml、 50μg/ml、 25μg/ml、 12.5μg/ml、 6.25μg/ml、
     3.125μg/ml、 1.56μg/ml)
     二甲基亚砜组 (50％、 25％、 12.5％、 6.25％、 3.125％、 1.56％ )
     1.2 细胞株制备 ：
     1.2.1Hela 细胞及 7402BEL 细胞 ( 人肝癌细胞 ) 的制备
     1) 取对数生长期的 Hela 细胞及 7402BEL 细胞， 0.125％胰蛋白酶消化。用培养液 5 调整细胞浓度至 2×10 /ml。
     2) 取 96 孔培养板， 每孔加入 100μl 细胞悬液， 置 37℃， 5％ CO2 孵育 24h。
     1.2.2Hca-F 细胞 ( 小鼠腹水型肝癌细胞 ) 的制备
     1) 无菌抽取小鼠腹水， 生理盐水洗涤离心。 用培养液调整细胞浓度至 1×106/ml。
     2) 取 96 孔培养板， 每孔加入 100μl 细胞悬液， 置 37℃， 5％ CO2 孵育 24h。
     2. 检测方法及结果分析 ：
     2.1MTT 法
     1) 倍比稀释待测样品及阳性药。吸去细胞培养上清， 每孔分别加入 100μl 待测 样品及阳性药， 各设 3 个复孔， 对照孔加 1640 生长液， 并设空白对照组， 37℃， 5％ CO2 孵育 24h， 见表 5
     表5
     楸皮素 μg/ml 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.56 1640 对照
     阳性药 μg/ml 100 50 25 12.5 6.25 3.125 1.56 二甲基亚砜％ 50 25 12.5 6.25 3.125 1.56 0.78 空白对照注： 每个浓度设 3 个复孔。
     培养 20h 后， 每孔加入 MYY10μl(MTT 浓度， 5mg/ml， 用 PBS 配制 )， 继续培养 4h。 1000r/min 离心 10min， 弃上清， 每孔加入二甲基亚砜 10μl， 在微量震荡器上缓慢振荡 10min， 用酶标仪测定波长 570mm 处的 OD 值。
     2.2 数据处理与结果分析 ：
     抑瘤率＝ ( 对照孔 OD 值 - 实验孔 OD 值 )/ 对照孔 OD 值肿瘤细胞对药物的抑制敏 感度见表 6-8( 为三次相同试验结果之一 )。
     表 6 待测药物对 Hela 细胞的抑制作用
     注： 细胞数为 2×105/ml， 每个浓度设 3 个复孔。 表 7 待测药物对 Hca-F 细胞的抑制作用
     注： 细胞数为 1×106/ml， 每个浓度设 3 个复孔。 表 8 待测药物对 7402BEL 细胞的抑制作用注： 细胞数为 2×105/ml， 每个浓度设 3 个复孔。
     试验结论 ：
     楸皮素在 100μg/ml、 50μg/ml 剂量时对 Hela 细胞具有一定的抑制作用 ( 中度敏 感)； 在 1.56μg/ml 剂量时对 7402BEL 细胞具有一定的抑制作用 ( 中度敏感 ) ；在 50μg/ ml、 25μg/ml、 12.5μg/ml、 6.25μg/ml、 3.125μg/ml、 1.56μg/ml 剂量时对 Hca-F 细胞具 有显著的抑制作用 ( 敏感 )。
     二、 升白作用
     试验目的考察核桃楸皮提取物楸皮素在发挥治疗作用同时， 对荷瘤小鼠外周血白 细胞数的影响。
     试验方法
     小鼠肉瘤 S180 复苏、 接种同前， 将小鼠肉瘤 S180 荷瘤小鼠随机分 8 组， 每组 10 只。 -1 分别为正常对照组、 模型对照组， 楸皮素低、 中、 高剂量组 (3.75、 7.5、 15mg·kg )， 参一胶囊 -1 -1 -1 组 (10mg·kg )， 复方木鸡合剂组 (10ml·kg )， 希罗达组 (1000mg·kg )。其中， 希罗达组 自造模 24h 后起第 1、 3、 5、 7 天给药， 其余自造模 24h 后连续给药 7 天， 每日一次。给药途径 均为灌胃给药。 于末次给药 24h 后各组小鼠眼眶后静脉丛采血 20μl， 在 OLYMPLS-BH2 显微 [8][9] 镜下用常规血白细胞计数法进行计数 。
     试验结果
     与模型组比较 ： 楸皮素 15mg· kg-1 连续灌胃给药 7 天， 对小鼠肉瘤 S180 荷瘤小鼠外 -1 周血白细胞数有显著提高作用 ； 3.75、 7.5mg·kg 对外周血白细胞数有一定升高作用趋势， 但无统计学意义。结果见表 9。
     表 9 楸皮素对小鼠肉瘤 S180 荷瘤小鼠外周血白细胞的影响
     ## ### 与正常组比较 #P ＜ 0.05， P ＜ 0.01， P ＜ 0.001 * ** ***
     与模型组比较 P ＜ 0.05， P ＜ 0.01， P ＜ 0.001
     三、 对机体非特异性免疫功能的影响
     试验目的考察核桃楸皮提取物楸皮素对机体非特异性免疫功能的影响。
     试验方法
     选取健康昆明种小鼠 70 只， 随机分为 7 组， 每组 10 只。分别为正常对照组， 模型 -1 对照组， 楸皮素低、 中、 高剂量给药组 (3.75、 7.5、 15mg·kg )， 参一 胶囊组 (10mg·kg-1)， 复方木鸡合剂组 (10m1·kg-1)。接种第二天开始除正常对照组外， 各组连续灌胃给药 7 天。
     于给药第 5 天开始， 其余各组荷瘤小鼠腹腔注射环磷酰胺 (CTX50mg·kg-1)， 每日一次， 连续 给药 3 天。末次给药后 1h， 每只鼠尾静脉注射印度墨汁 (1 ∶ 4 生理盐水稀释 )0.1ml/10g， 分别于注射墨汁后 2min、 12min 后于眼眶后静脉丛采血 20μl， 立刻吹入 0.1％ Na2CO3 溶液 2ml 中， 摇匀， 680nm 测吸光度。 脱臼处死动物， 取胸腺、 肝脏和脾脏称重， 计算脏器指数 (mg/ g)， 按下式计算廓清指数 K 和吞噬指数 α ：
     K ＝ (logA1-logA2)/(T2-T1)
     α ＝ 3 √ K× 体重 /( 肝重 + 脾重 )
     ( 其中 A1 为第 1 次采血的吸光度， A2 为第 2 次采血的吸光度， T1 为第 1 次采血的 时间， T2 为第 2 次采血的时间 )
     试验结果
     结果显示， 模型对照组与正常对照组比较， 廊清指数 K 和吞噬指数 α 显著下降， 胸 腺、 脾脏系数显著减小， 表明造模后细胞非特异免疫水平降低。与模型对照组比较， 楸皮素 -1 7.5、 15mg·kg 剂量组脾脏系数显著升高， 胸腺系数呈现一定的升高作用趋势。提示与化 疗药物比较， 楸皮素在体内抗肿瘤的同时， 对网状内皮系统的吞噬功能影响较小， 不损伤小 鼠的细胞非特异免疫功能。结果见表 10。
     表 10 楸皮素对免疫功能低下小鼠碳粒廓清和免疫器官指数的影响
     △△△ 与正常组比较△ P ＜ 0.05， P ＜ 0.001 * **
     与模型组比较 P ＜ 0.05， P ＜ 0.01
     试验结论
     1 与模型组比较， 楸皮素 7.5、 15mg·kg-1 连续灌胃给 7 天对小鼠肉瘤 S180、 小鼠肝 -1 癌 Hca-F 荷瘤小鼠均有显著抑瘤作用 ； 且抑瘤作用呈现量效关系。3.75·kg 有一定的抑 制作用趋势， 但无统计学意义。
     2. 与模型组比较， 15mg· kg-1 连续灌胃给药 7 天对小鼠肝癌 H22 荷瘤小鼠有显著抑 瘤作用 ； 3.75、 7.5mg·kg-1 有一定的抑制作用趋势， 但无统计学意义。
     3. 与 溶 剂 对 照 组 比 较， 楸皮素 ( 剂量均为 ： 100μg/ml、 50μg/ml、 25μg/ml、 12.5μg/ml、 6.25μg/ml、 3.125μg/ml、 1.56μg/ml) 在体外对 Hela 细胞、 7402BEL 细胞及 Hca-F 细胞增殖均具有显著抑制作用。
     4. 与楸皮素单独用药时比较， 楸皮素 3.75、 7.5、 15mg·kg-1 连续灌胃给药 7 天与 CTX 联合应用时， 对肉瘤 S180 模型小鼠抑瘤率均有一定提高作用， 且高剂量组抑瘤呈现相加 作用。
     5. 与模型组比较， 楸皮素 15mg·kg-1 连续灌胃给药 7 天对小鼠肉瘤 Sl80 荷瘤小鼠 外周血白细胞数有显著升高作用， 提示楸皮素在所选剂量范围内连续用药未发现对荷瘤小 鼠骨髓有抑制作用。
     6. 楸皮素 7.5、 15mg·kg-1 连续灌胃给药 7 天可显著提高环磷酰胺致免疫功能低 下小鼠脾脏系数， 并显著提高碳廓清指数 ； 对胸腺系数有一定的升高作用趋势， 但无统计学 意义。
     药效学比较研究显示 ： 对荷瘤动物模型， 多种细胞瘤株模型进行体内外抗肿瘤效 研究， 抑瘤率在 30％ -42.7 之间， 抗癌效果比复方木鸡合剂和目前市场上抗癌新药参一胶 囊均高， 与抗癌化药希罗达效果相当。
     ※ 粗粉 ： 指能全部通过二号筛， 但混有能通过四号筛不超过 40％的粉末 ( 二号筛 24 目， 四号筛 65 目 )。
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