桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法及所得产品和应用 【技术领域】
本发明涉及桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法及所得产品和应用。背景技术 桑叶和 / 或桑枝属于桑科桑属植物桑 (Morus alba L.)。桑原产于中国和朝鲜， 全球约有 16 种， 分布于北温带、 亚洲热带和非洲热带及美洲地区 ； 我国约有 11 种， 分布于 全国大部分地区， 以长江流域尤其江浙一带为多。桑树在我国已有 4000 多年的栽培历史， 我国现有近千万亩桑园， 是世界上最大的桑树种植国， 资源极其丰富， 但传统的桑叶只用于 养蚕， 用途单一， 出现了大量桑叶过剩现象， 因此开发桑叶功效活性成分无疑具有很好的前 景。
在我国桑叶用于美白已有悠久的历史， 民间有人通过饮用桑树叶煎煮的汤剂或将 新鲜桑叶捣碎敷脸来治疗色斑和青春痘。 研究证明， 黄酮类物质是一种天然的强抗氧化剂， 能够清除人体中超氧离子自由基、 羟自由基、 脂质过氧化物、 过氧化氢等， 桑叶黄酮类物质 可以通过抑制酪氨酸酶活性可有效减少黑色素生成， 将其添制于护肤品中可达到美白的效 果， 因此， 桑叶备受美白产品的青睐， 这些活性物质协同对皮肤有营养、 保湿及修复作用， 可 以增加弹性， 消除色素沉着， 防止皮肤粗糙。
自古以来， 中医就将桑叶作为治疗消渴症的中药应用于临床 ； 日本古书 《吃茶养生 记》 也有记载桑叶有改善 “饮水病” ( 即糖尿病 ) 的作用 ； 近代医家也常将桑叶配伍于中药 复方中应用于临床。 国内外研究资料证实， 生物碱和多糖是桑叶中主要的降血糖活性成分 ； 大量研究表明桑叶的降血糖作用是通过两个方面实现的 ： 一是通过生物碱 DNJ 对二糖类分 解酶活性产生抑制作用， 从而抑制小肠对双糖的吸收， 降低餐后血糖的高峰值 ； 二是桑叶生 物碱 (Fagomine) 及桑叶多糖促进 β 细胞分泌胰岛素， 而胰岛素可以促进细胞对糖的利用、 肝糖原合成以及改善糖代谢， 最终达到降血糖的效果。因此， 提取桑叶中的降糖功效成分， 开发降糖新降糖药和功能性食品前景十分广阔。
目前关于桑叶功效成分的研究较多， 但仅是对桑叶中某一组分进行单独研究， 尤 其是涉及提取工艺的研究， 往往是针对一种功效成分的提取工艺， 这对于工业化大生产无 疑是很大的浪费。 杨虎等 ( 杨虎， 马燮等， 桑叶中黄酮类化合物的提取工艺研究 [J]， 应用化 工， 2008， 37(5) ： 520 ～ 522) 报道桑叶中黄酮类化合物的提取工艺研究， 该研究通过正交试 验确定了桑叶黄酮的最佳提取工艺 ： 回流提取时间 1.5h， 提取 3 次， 乙醇浓度 80％， 料液质 量比 1 ∶ 30， 其提取率为 0.723％。王芳 ( 王芳， 桑叶中酪氨酸酶抑制成分的研究 [D]， 浙江 工商大学， 2008) 对桑叶中酪氨酸酶活性抑制成分的研究， 确定桑叶中酪氨酸酶抑制剂主要 是黄酮类物质， 并对对桑叶中黄酮类物质的提取工艺进行了优化， 确定了超声波辅助提取 法效果最好 ： 优化条件为 70％乙醇提取溶剂、 1 ∶ 20 料液比、 200W 功率超声预处理 10min、 70℃浸提 1.5h， 桑叶黄酮提取得率为 28.8mg/g。应之 ( 应芝， 桑叶多糖提取分离、 结构鉴定 及其降血糖活性的初步研究 [D]， 浙江工商大学， 2009) 采用响应面分析法优化了三种不同 方法 ( 包括普通水提法、 微波辅助提取法和超声波辅助提取法 ) 提取桑叶多糖工艺， 结果表
明， 相比普通水提法的多糖得率， 微波辅助提取多糖得率提高了 104％， 超声波辅助提取多 糖得率提高了 131％ ； 并通过注射四氧嘧啶建立糖尿病小鼠模型， 研究了桑叶多糖降血糖活 性， 研究结果表明桑叶多糖具有降血糖作用。马静 ( 马静， 桑叶中 1- 脱氧野尻霉素 (DNJ) 的提取分离及其活性的研究 [D]， 陕西科技大学， 2007) 以 DNJ 含量为指标， 通过正交试验优 选其提取工艺的最佳条件， 确定酸水提取法的最佳工艺条件 ： 物料粒度 60 目、 pH 为 3 的盐 酸溶液、 料液比 1 ∶ 20、 超声功率 150W， 超声温度 60℃， 超声时间 25min， 提取 2 次， DNJ 得 率 0.083％， 纯度 26.3％。并以与人体接近的动物小肠 ( 猪小肠 ) 内的蔗糖酶为对象， 对桑 叶中提取出来的 DNJ 进行了体外活性的研究， 结果表明 ： DNJ 对蔗糖酶的抑制作用类型为竞 争性抑制。由上述可见现有技术中对桑叶和 / 或桑枝提取获得提取物的方法获得的提取物 收率及产品纯度仍不够理想， 却只针对一种功效成分进行提取工艺， 造成资源浪费。 发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服了现有桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法往 往能够只能针对其中一种成分进行提取， 并且获得提取物的收率和纯度仍然不够理想的缺 陷， 提供了桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法及所得产品和应用。该方法充分利用原料资 源， 能够同时有效提取多种有效成分， 操作步骤简单方便， 工艺合理， 获得的产品的收率和 纯度显著提高， 产品用于美白或降血糖功效显著， 达到产值最大化的目的， 具有一定的经济 和社会效益。 本发明目的之一是提供一种桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法， 包括如下步骤 ：
(1) 将桑叶和 / 或桑枝用体积百分比为 40％～ 90％的乙醇水溶液提取， 之后固液 分离， 得提取液 A 与滤渣 ；
(2) 将步骤 (1) 的滤渣用纯水提取， 之后固液分离， 得提取液 B ；
(3) 将提取液 A 与提取液 B 合并， 然后除去乙醇， 浓缩， 静置， 之后过滤， 得桑叶和 / 或桑枝粗提液 ；
(4) 将桑叶和 / 或桑枝粗提液上弱极性或非极性大孔吸附树脂柱吸附， 之后用纯 水洗脱至洗脱液无多糖为止， 收集的流出液和纯水洗脱液即为桑叶和 / 或桑枝提取物 I。
下面， 进一步的对本发明的桑叶和 / 或桑枝提取物 I 的制备方法进行详细介绍 ：
本发明中， 所述的桑叶和 / 或桑枝为使用原料， 桑叶与桑枝的有效成分基本相同， 因而本发明可单独以桑叶或桑枝为原料， 也可以两者任意比例的混合物为原料 ； 进一步地， 所述桑叶或桑枝各自经提取后， 提取物可分别利用， 也可混合后利用。 所述桑叶与桑枝作为 原料的使用方式没有特殊要求。其中所述的桑叶和 / 或桑枝大小没有限定只要不影响提取 即可， 工业上一般不对桑叶和 / 或桑枝进行另行粉碎处理。
本发明中， 所述步骤 (1) 的提取操作可为本领域常规操作和条件。
其中， 步骤 (1) 中， 所述乙醇水溶液与桑叶和 / 或桑枝的质量比较佳的为 2 ∶ 1 ～ 10 ∶ 1。
其中， 步骤 (1) 中， 所述提取温度较佳的为 60℃～ 90℃。
其中， 步骤 (1) 中， 所述提取时间较佳的为 1h ～ 3h。
其中， 步骤 (1) 中， 所述提取次数较佳的为 1 ～ 3 次 ； 当提取次数多于 1 次时， 合并 提取液。
其中， 步骤 (1) 中， 所述固液分离为本领域常规操作， 一般过滤即可。
本发明中， 所述步骤 (2) 的提取操作可为本领域常规操作和条件。
其中， 步骤 (2) 中， 所述纯水与步骤 (1) 的滤渣的质量比较佳的为 2 ∶ 1 ～ 10 ∶ 1。
其中， 步骤 (2) 中， 所述提取温度较佳的为 60℃～ 90℃。
其中， 步骤 (2) 中， 所述提取时间较佳的为 1h ～ 3h。
其中， 步骤 (2) 中， 所述提取次数较佳的为 1 ～ 3 次， 较佳的 1 次 ； 当提取次数多于 1 次时， 合并提取液。
其中， 步骤 (2) 中， 所述固液分离为本领域常规操作， 一般过滤即可。
本发明中， 所述步骤 (3) 中除去乙醇的方式为本领域常规方式， 较佳的为减压蒸 馏。所述的乙醇较佳的回收利用。
本发明中， 所述步骤 (3) 中浓缩为本领域常规操作。所述浓缩较佳的为浓缩至浓 缩液中乙醇体积百分比≤ 5％。 所述浓缩的方式较佳的为减压浓缩。 其中， 所述减压浓缩的 条件较佳的为真空度 -0.08mpa ～ -0.1mpa， 温度 55℃～ 65℃。
本发明中， 所述步骤 (3) 中静置的温度较佳的为 0℃～ 5℃， 静置的时间较佳的为 8 小时以上。其中， 所述的静置为控制温度一般在冷藏箱中进行。 本发明中， 所述步骤 (4) 中桑叶和 / 或桑枝粗提液与大孔吸附树脂柱的用量及吸 附时间本领域技术人员可根据具体使用的大孔吸附树脂合理选择。所述步骤 (4) 中桑叶和 / 或桑枝粗提液的吸附流速较佳的为 1BV/h ～ 3BV/h， 更佳的为 1BV/h。
本发明中， 所述步骤 (4) 中弱极性或非极性大孔吸附树脂的型号较佳的为 D101、 NKA-9、 AB-8、 ADS-7 或 ADS-17。其中， 所述的弱极性大孔吸附树脂以及非极性大孔吸附树脂 为本领域常规技术术语， 是大孔吸附树脂根据分子结构及极性大小进行的分类。
本发明中， 所述步骤 (4) 中纯水洗脱速度较佳的为 1BV/h ～ 3BV/h， 更佳的为 1BV/ h。
本发明中， 所述步骤 (4) 中纯水洗脱至洗脱液无多糖的检测方式较佳的为 α- 萘 酚法和 / 或菲林试剂法。所述 α- 萘酚法与菲林试剂法均属于本领域常规方法。
本发明中， 所述步骤 (4) 中的流出液是指桑叶和 / 或桑枝粗提液流经树脂后的收 集液。所述步骤 (4) 中的流出液和纯水洗脱液， 可按本领域常规方法经除水， 干燥， 即得桑 叶和 / 或桑枝提取物 I 成品。其中， 所述除水方式较佳的为减压浓缩。所述干燥方式较佳 的为真空干燥、 热风干燥、 冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明目的之二是提供一种桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法， 包括如下步骤 ：
①同前述桑叶和 / 或桑枝提取物 I 的制备方法的步骤 (1) ～ (3) ；
②将桑叶和 / 或桑枝粗提液上弱极性或非极性大孔吸附树脂柱吸附， 之后用纯水 洗脱至无多糖， 然后以体积百分比为 30％～ 90％的乙醇水溶液继续洗脱至洗脱液无黄酮， 收集的乙醇水溶液洗脱液即为桑叶和 / 或桑枝提取物 II。
下面， 进一步的对本发明的桑叶和 / 或桑枝提取物 II 的制备方法进行详细介绍 ：
本发明中， 所述步骤①的各条件以及步骤②中将桑叶和 / 或桑枝粗提液上弱极性 或非极性大孔吸附树脂柱吸附， 之后用纯水洗脱至无多糖的各步骤条件均如前所述。
本发明中， 所述步骤②乙醇水溶液洗脱速度较佳的为 1BV/h ～ 3BV/h。
本发明中， 所述步骤②中乙醇水溶液洗脱至洗脱液无黄酮的检测方式较佳的为盐
酸 - 镁粉显色法。所述盐酸 - 镁粉比色法属于本领域常规测定黄酮方法。
本发明中， 所述步骤②中的乙醇水溶液洗脱液， 可按本领域常规方法除乙醇， 经除 水干燥， 即得桑叶和 / 或桑枝提取物 II 干燥成品。其中， 所述除乙醇的方式为本领域常规 方式， 较佳的为减压蒸馏。所述乙醇较佳的可回收利用。所述除水方式较佳的为浓缩。所 述干燥方式较佳的为真空干燥、 热风干燥、 冷冻干燥或喷雾干燥。
本发明目的之三是提供一种桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法， 包括如下步骤 ：
(a) 同前述桑叶和 / 或桑枝提取物 I 的制备方法的步骤 (1) ～ (3) ；
(b) 然后将桑叶和 / 或桑枝粗提液上弱极性或非极性大孔吸附树脂柱吸附， 之后 用纯水洗脱至无多糖为止， 收集的纯水洗脱液即为桑叶和 / 或桑枝提取物 I ；
(c) 之后再以体积百分比为 30％～ 90％的乙醇水溶液洗脱至洗脱液无黄酮， 收集 的乙醇水溶液洗脱液即为桑叶和 / 或桑枝提取物 II。
本发明中， 所述步骤 (a) ～ (c) 中涉及各步骤具体条件均如前所述。
本发明目的之四是提供由本发明桑叶和 / 或桑枝提取物制备方法制得的桑叶和 / 或桑枝提取物 I， 其含有多糖类物质和生物碱 DNJ， 总多糖含量为 10％～ 50％， DNJ 含量为 0.5％～ 90％， 百分比为多糖类物质或生物碱 DNJ 占提取物总量的质量百分比。 本发明中， 所述桑叶和 / 或桑枝提取物 I 对 α- 葡萄糖苷酶抑制率的 IC50 为 10ppm ～ 2000ppm。
本发明中， 所述总多糖的测定方法为 ： 以葡萄糖为标准品， 纯水溶解， 配制标准溶 液。取适量葡萄糖标准溶液， 加入 6％苯酚溶液， 加入浓硫酸， 静置 10min， 摇匀， 在一定条件 下进行显色反应， 反应结束， 在波长 490nm 处测定吸光度值， 以水按同样显色操作为空白对 照。以吸光度值为纵坐标， 葡萄糖含量为横坐标， 绘制标准曲线。准确称取提取物， 纯水溶 解， 作为待测液， 取适量待测液， 按标准曲线检测方法操作， 测定其在 490nm 处的吸光度值， 根据标准曲线计算提取物中总多糖含量， 表示为总多糖含量 ( 以葡萄糖计 )。
本 发 明 中， 所 述 生 物 碱 DNJ 的 检 测 方 法 为 ： 采 用 高 效 液 相 色 谱 法， 色谱柱 ： Inertsil NH2， 5um， 4.6*250mm ； 流动相为乙睛∶水 (8 ∶ 2) ； 流速 ： 0.8mL/min ； 柱温 ： 40℃ ； 检测器 ： ELSD ； 以 DNJ 标准品按 100％， 采用归一化法计算样品中 DNJ 含量。
本发明目的之五是提供本发明桑叶和 / 或桑枝提取物制备方法制得的桑叶和 / 或 桑枝提取物 II， 其含有桑叶和 / 或桑枝黄酮类物质， 总黄酮含量为 10％～ 50％， 百分比为总 黄酮占提取物总量的质量百分比。
本发明中， 所述桑叶和 / 或桑枝提取物 II 对酪氨酸酶抑制率的 IC50 为 10ppm ～ 2000ppm， 对 DPPH 自由基清除效果的 IC50 为 10ppm ～ 2000ppm。
本发明中， 所述总黄酮的测定方法为 ： 以芦丁为标准品， 30％体积浓度乙醇超声溶 解， 配制标准溶液 ； 取适量标准溶液， 加入 5％质量浓度 NaNO2 水溶液， 静置 5min， 加入 10％ 质量浓度 Al(NO3)3 的水溶液， 静置 6min， 加入浓度 1mol/L 的 NaOH， 加入 30％体积浓度的乙 醇， 80℃水浴 10min， 同时以不加 10％质量浓度 Al(NO3)3 的反应体系作为空白对照， 以调节 分光光度计零点， 待反应结束后， 在 510nm 处测定吸光度值， 以吸光度值为纵坐标， 芦丁含 量为横坐标， 绘制标准曲线。准确称取提取物， 30％乙醇溶解， 作为待测液， 取适量待测液， 按标准曲线检测方法操作， 测定其在 510nm 处的吸光度值， 根据标准曲线计算提取物中总 黄酮含量。
本发明目的之六是提供本发明的桑叶和 / 或桑枝提取物制备方法制得的桑叶和 / 或桑枝提取物 I 在制备降血糖食品中的应用。
本发明目的之七是提供本发明的桑叶和 / 或桑枝提取物制备方法制得的桑叶和 / 或桑枝提取物 II 在制备美白化妆品中的应用。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
在符合本领域常识的基础上， 本发明中上述的各技术特征优选条件可以任意组合 得到较佳实例。
本发明的积极进步效果在于 ： 本发明桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法充分利 用桑叶和 / 或桑枝原料资源， 能够同时有效提取多种有效成分， 操作步骤简单方便， 工艺合 理， 获得的产品的收率和纯度显著提高， 产品用于美白或降血糖功效显著， 达到产值最大化 的目的， 具有一定的经济和社会效益。 具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明， 但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。
下述实施例中， 除特殊说明外， 百分比均为质量百分比。
实施例 1
桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法 ：
取粉碎的桑叶 400g， 加入 800mL 体积百分比 40％的乙醇水溶液， 90℃保温提取， 提 取 1 次， 每次 1h， 合并提取液， 过滤， 得提取液 A 与滤渣 ；
向滤渣中加入 800mL 纯水， 90℃保温提取， 提取 1h， 过滤， 得提取液 B， 将提取液 A 与提取液 B 合并， 减压蒸馏回收乙醇， 浓缩至浓缩液中乙醇体积百分比≤ 5％以下 ( 减压浓 缩条件为 ： 真空度 -0.08mpa ～ -0.1mpa， 浓缩温度 55℃～ 65℃ ) ； 浓缩液置于冷藏箱中 0℃ 冷藏， 静置 8h， 过滤， 滤液澄清， 得桑叶和 / 或桑枝粗提液 ；
取桑叶和 / 或桑枝粗提液上 ADS-7 大孔吸附树脂柱， 粗提液全部通过大孔树脂吸 附柱后 ( 吸附速度为 1BV/h)， 用纯水冲洗大孔吸附树脂柱， 洗脱速度为 1BV/h， 至菲林试剂 法检测洗脱液中无多糖止 ( 即生成砖红色沉淀， 下同 )， 收集流出液和纯水洗脱液， 减压浓 缩， 真空干燥 ( 干燥温度 70℃， 真空度 -0.08mpa ～ -0.1mpa)， 得桑叶和 / 或桑枝提取物 I 成品 ；
纯水洗脱结束， 继续以体积百分比 30％的乙醇水溶液洗脱 ( 洗脱速度 1BV/h) 至 盐酸 - 镁粉显色法检测洗脱液中无黄酮 ( 即洗脱液呈紫红色， 下同 )， 收集乙醇水溶液洗脱 液， 回收乙醇， 真空干燥 ( 干燥温度 70℃， 真空度 -0.08mpa ～ -0.1mpa)， 得桑叶和 / 或桑枝 提取物 II 成品。
本实施例制得桑叶和 / 或桑枝提取物 I 的得率为 13.3 ％， 其中总多糖含量为 42.59％， DNJ 含量为 4.62％ ； 制得桑叶和 / 或桑枝提取物 II 的得率为 3.5％， 其中总黄酮 含量为 35.62％。
实施例 2
桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法 ：
取粉碎的桑枝 400g， 加入 2400mL 体积百分比 70％的乙醇水溶液， 60℃保温提取，提取 2 次， 每次 2.0h， 合并提取液， 过滤， 得提取液 A 与滤渣 ；
向滤渣中加入 2400mL 纯水， 60℃保温提取， 提取 2h， 过滤， 得提取液 B， 将提取液 A 与提取液 B 合并， 减压蒸馏回收乙醇， 浓缩至浓缩液中乙醇体积百分比≤ 5％以下 ( 减压浓 缩条件为 ： 真空度 -0.08mpa ～ -0.1mpa， 浓缩温度 55℃～ 65℃ ) ； 浓缩液置于冷藏箱中 2℃ 冷藏， 静置 12h， 过滤， 滤液澄清， 得桑叶和 / 或桑枝粗提液 ；
取桑叶和 / 或桑枝粗提液上 D101 大孔吸附树脂柱， 粗提液全部通过大孔树脂 吸附柱后 ( 吸附速度为 2BV/h)， 用纯水冲洗大孔吸附树脂柱， 洗脱速度为 2BV/h， 至菲林 试剂法检测洗脱液中无多糖止， 收集流出液和纯水洗脱液， 减压浓缩， 冷冻干燥 ( 干燥温 度 -40℃ )， 得桑叶和 / 或桑枝提取物 I 成品 ；
纯水洗脱结束， 继续以体积百分比 70 ％的乙醇水溶液 (2BV/h) 洗脱至盐酸 - 镁 粉显色法检测洗脱液中无黄酮， 收集乙醇水溶液洗脱液， 回收乙醇， 冷冻干燥 ( 干燥温 度 -40℃ )， 得桑叶和 / 或桑枝提取物 II 成品。
本实施例制得桑叶和 / 或桑枝提取物 I 的得率为 13.1 ％， 其中总多糖含量为 40.05％， DNJ 含量为 5.67％ ； 桑叶和 / 或桑枝提取物 II 的得率为 2.9％， 其中总黄酮含量 为 37.79％。 实施例 3
桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法 ：
取粉碎的桑枝 200g， 粉碎的桑叶 200g， 混合， 加入 4000mL 体积百分比 90％的乙醇 水溶液， 70℃保温提取， 提取 3 次， 每次 3h， 合并提取液， 过滤， 得提取液 A 与滤渣 ；
向滤渣中加入 4000mL 纯水， 70℃保温提取， 提取 3h， 过滤， 得提取液 B， 将提取液 A 与提取液 B 合并， 减压蒸馏回收乙醇， 浓缩至浓缩液中乙醇体积百分比≤ 5％以下 ( 减压浓 缩条件为 ： 真空度 -0.08mpa ～ -0.1mpa， 浓缩温度 55℃～ 65℃ ) ； 浓缩液置于冷藏箱中 5℃ 冷藏， 静置 16h， 过滤， 滤液澄清， 得桑叶和 / 或桑枝粗提液 ；
取桑叶和 / 或桑枝粗提液上 ADS-17 大孔吸附树脂柱， 粗提液全部通过大孔树脂 吸附柱后 ( 吸附速度为 3BV/h)， 用纯水冲洗大孔吸附树脂柱， 洗脱速度为 3BV/h， 至菲林 试剂法检测洗脱液中无多糖止， 收集流出液和纯水洗脱液， 减压浓缩， 喷雾干燥 ( 进风温度 200℃， 出风温度 80℃ )， 得桑叶和 / 或桑枝提取物 I 成品 ；
纯水洗脱结束， 继续以体积百分比 90％的乙醇水溶液 (3BV/h) 洗脱， 盐酸 - 镁粉显 色法检测洗脱液中无黄酮， 收集乙醇水溶液洗脱液， 回收乙醇， 喷雾干燥 ( 进风温度 200℃， 出风温度 80℃ )， 得桑叶和 / 或桑枝提取物 II 成品。
本实施例制得桑叶和 / 或桑枝提取物 I 的得率为 12.5 ％， 其中总多糖含量为 36.72％， DNJ 含量为 3.97％ ； 桑叶和 / 或桑枝提取物 II 的得率为 3.1％， 其中总黄酮含量 为 35.79％。
实施例 4
桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法 ：
取粉碎的桑叶 400g， 加入 800mL 体积百分比 40％的乙醇水溶液， 90℃保温提取， 提 取 1 次， 每次 1h， 合并提取液， 过滤， 得提取液 A 与滤渣 ；
向滤渣中加入 800mL 纯水， 90℃保温提取， 提取 1h， 过滤， 得提取液 B， 将提取液 A 与提取液 B 合并， 减压蒸馏回收乙醇， 浓缩至浓缩液中乙醇体积百分比≤ 5％以下 ( 减压浓
缩条件为 ： 真空度 -0.08mpa ～ -0.1mpa， 浓缩温度 55℃～ 65℃ ) ； 浓缩液置于冷藏箱中 0℃ 冷藏， 静置 8h， 过滤， 滤液澄清， 得桑叶和 / 或桑枝粗提液 ；
取桑叶和 / 或桑枝粗提液上 ADS-7 大孔吸附树脂柱， 粗提液全部通过大孔树脂吸 附柱后 ( 吸附速度为 1BV/h)， 用纯水冲洗大孔吸附树脂柱， 洗脱速度为 1BV/h， 至菲林试剂 法检测洗脱液中无多糖止 ( 即生成砖红色沉淀 )， 收集流出液和纯水洗脱液， 减压浓缩， 真 空干燥 ( 干燥温度 70℃， 真空度 -0.08mpa ～ -0.1mpa)， 得桑叶和 / 或桑枝提取物 I 成品。
本实施例制得桑叶和 / 或桑枝提取物 I 的得率为 13.3 ％， 其中总多糖含量为 42.59％， DNJ 含量为 4.62％。
实施例 5
桑叶和 / 或桑枝提取物的制备方法 ：
取粉碎的桑枝 400g， 加入 2400mL 体积百分比 70％的乙醇水溶液， 60℃保温提取， 提取 2 次， 每次 2.0h， 合并提取液， 过滤， 得提取液 A 与滤渣 ；
向滤渣中加入 2400mL 纯水， 60℃保温提取， 提取 2h， 过滤， 得提取液 B， 将提取液 A 与提取液 B 合并， 减压蒸馏回收乙醇， 浓缩至浓缩液中乙醇体积百分比≤ 5％以下 ( 减压浓 缩条件为 ： 真空度 -0.08mpa ～ -0.1mpa， 浓缩温度 55℃～ 65℃ ) ； 浓缩液置于冷藏箱中 2℃ 冷藏， 静置 12h， 过滤， 滤液澄清， 得桑叶和 / 或桑枝粗提液 ； 取桑叶和 / 或桑枝粗提液上 D101 大孔吸附树脂柱， 粗提液全部通过大孔树脂吸附 柱后 ( 吸附速度为 1BV/h)， 用纯水冲洗大孔吸附树脂柱， 洗脱速度为 2BV/h， 至菲林试剂法 检测洗脱液中无多糖 ； 纯水洗脱结束， 继续以体积百分比 70％的乙醇水溶液 2BV/h 洗脱至 盐酸 - 镁粉法检测洗脱液中无黄酮， 收集乙醇水溶液洗脱液， 回收乙醇， 冷冻干燥 ( 干燥温 度 -40℃ )， 得桑叶和 / 或桑枝提取物 II 成品。
本实施例制得桑叶和 / 或桑枝提取物 II 的得率为 2.9 ％， 其中总黄酮含量为 37.79％。
效果实施例 1 抑制 α- 葡萄糖苷酶活性功效试验
1、 试验试剂
pH 6.81 磷酸盐缓冲溶液 ： 1/15mol/L Na2HPO4 水溶液和 1/15mol/LKH2PO4 等体积 混合 ；
α- 葡萄糖苷酶溶液的配制 ： 取 α- 葡萄糖苷酶原液用 pH 6.81 磷酸盐缓冲溶液 稀释定容， 配制为 0.08U/mL 的酶液 ；
PNPG 底物的配制 ： 称取 0.0301g PNPG， 用 pH 6.81 磷酸盐缓冲溶液溶解稀释至 100mL， 配制为 1umol/mL 的溶液 ；
Na2CO3 溶液 ： 准确称取 26.4975g Na2CO3 用纯水溶解稀释至 500mL， 配制为 0.5mol/ mL 的溶液 ；
样品的配制 ： 准 确 称 取 样 品 150mg， 用 pH 6.81 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 稀 释 定 容 至 50mL( 母液 ) ；
样品稀释液 ： 分别取母液用缓冲溶液稀释至不同浓度， 备用。
2、 试验方法
分别吸取不同浓度的样品稀释液 0.4mL， 加入 0.4mL PNPG 溶液， 摇匀， 冰水浴冷却 5min， 再加入 0.2mL α- 葡萄糖苷酶溶液， 摇匀， 37℃水浴 20min， 加入 3mL Na2CO3 溶液， 终
止反应， 摇匀， 于 400nm 处测定吸光度值 AS， 每个稀释度的样品以不加 α- 葡萄糖苷酶溶液 的体系为对照， 消除样品颜色的影响， 测定吸光度值 A0 ； 再以不加抑制剂的体系作为对照， 测定吸光度值 AC， 各管均以空白体系作为调零管， 按照式 (1) 计算抑制率 ：
以样品浓度为横坐标， 抑制率为纵坐标， 作对数回归曲线， 查找样品对 α- 葡萄糖 苷酶抑制效果的 IC50。
3、 试验结果
本发明实施例 1 ～ 3 所得的桑叶和 / 或桑枝提取物 I 对 α- 葡萄糖苷酶的抑制效 果见表 1 ：
表 1 桑叶和 / 或桑枝提取物 I 的功效评价
编号 实施例 1 实施例 2 实施例 3
α- 葡萄糖苷酶活性抑制率 (IC50) 956ppm 603ppm 426ppm效果实施例 2 抑制酪氨酸酶活性功效试验 1、 试验试剂 pH 6.81 磷酸盐缓冲溶液 ： 1/15mol/L Na2HPO4 水溶液和 1/15mol/LKH2PO4 等体积混合 ； 酪氨酸酶溶液的配制 ： 取 α- 葡萄糖苷酶原液用 pH 6.81 磷酸盐缓冲溶液稀释定 容， 配制为 1081.58U/mL 的酶液 ；
L- 酪氨酸底物的配制 ： 称取 35mg L- 酪氨酸， 用 pH 6.81 磷酸盐缓冲溶液溶解稀 释至 100mL ；
样品的配制 ： 准 确 称 取 样 品 150mg， 用 pH 6.81 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 稀 释 定 容 至 50mL( 母液 ) ；
样品稀释液 ： 分别取母液用缓冲溶液稀释至不同浓度， 备用。
2、 试验方法
分别吸取不同浓度的样品稀释液 0.2mL， 加入 0.3mL L- 酪氨酸溶液， 再加入缓冲 溶液 2mL， 摇匀， 冰水浴冷却 5min， 加入 0.1mL 酪氨酸酶溶液， 摇匀， 37℃水浴 40min， 放置冰 水浴 10min， 于 470nm 处测定吸光度值 AS， 每个稀释度的样品以不加酪氨酸酶溶液的体系为 对照， 消除样品颜色的影响， 测定吸光度值 A0 ； 再以不加抑制剂的体系作为对照， 测定吸光 度值 AC， 各管均以空白体系作为调零管， 按照式 (2) 计算抑制率 ：
以样品浓度为横坐标， 抑制率为纵坐标， 作对数回归曲线， 查找样品对酪氨酸酶抑 制效果的 IC50。
3、 试验结果
本发明实施例 1 ～ 3 所得的桑叶和 / 或桑枝提取物 II 对酪氨酸酶的抑制效果见 表2：
表 2 桑叶和 / 或桑枝提取物 II 的功效评价
编号 实施例 1 实施例 2 实施例 3
酪氨酸活性抑制率 (IC50) 256ppm 679ppm 845ppm效果实施例 3 清除 DPPH 自由基功效试验
1、 试验试剂
DPPH 溶液配制 ： 准确称取 1， 1- 联苯 -β- 苦基苯肼 (DPPH) 标准品 20mg， 用乙醇定 容至 250mL， 得浓度为 0.08mg/mL 的溶液， 备用 ；
缓冲溶液的配制 ： 3.02g Tris 溶于 250mL 水， 用 10％ HCl 调节 pH 为 7.4 ；
样品的配制 ： 准确称取样品 150mg， 用 50％的乙醇溶液稀释定容至 50mL( 母液 ) ；
样品稀释液 ： 分别取母液用缓冲溶液稀释至不同浓度， 备用。
2、 试验方法
分别吸取不同浓度的样品稀释液 0.2mL， 加入 2mL 缓冲溶液， 再加入 2.0mL DPPH 溶液， 混匀， 阴暗处静置 20min， 以乙醇溶液调零， 于 520nm 处测定吸光度 AS ； 每个稀释度的 样品以不加 DPPH 溶液的体系为对照， 消除样品颜色的影响， 测定吸光度值 A0， 再以空白加入 2.0mL 浓度为 DPPH 溶液， 立即混匀， 静置 20min 后， 测得吸光度值 Ac， 作为对照， 由式 (3) 计 算 DPPH 清除率 ：
以样品浓度为横坐标， 清除率为纵坐标， 作对数回归曲线， 查找样品对 DPPH·自由 基清除效果的 IC50。
3、 试验结果
本发明实施例 1 ～ 3 所得的桑叶和 / 或桑枝提取物 II 对 DPPH·自由基清除效果 见表 3 ：
表 3 桑叶和 / 或桑枝提取物 II 的功效评价
DPPH·自由基清除率 (IC50) 506ppm 205ppm 379ppm结论 ： 由上述实验结果可知， 本发明桑叶和 / 或桑枝提取物 I 具有良好的辅助降血 糖功效， 桑叶和 / 或桑枝提取物 II 具有良好的美白功效。14