一种同种异体骨的化学处理方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201010231771.3

申请日:

2010.07.20

公开号:

CN102335458A

公开日:

2012.02.01

当前法律状态:

撤回

有效性:

无权

法律详情:

发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):A61L 27/36申请公布日:20120201|||公开

IPC分类号:

A61L27/36

主分类号:

A61L27/36

申请人:

上海安久生物科技有限公司

发明人:

汤亭亭; 楼伟

地址:

201108 上海市闵行区金都路4299号

优先权:

专利代理机构:

上海三和万国知识产权代理事务所 31230

代理人:

刘立平

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内容摘要

本发明提供了一种同种异体骨的化学处理方法,包括骨的切割和深低温冷冻。该方法是将骨材料切割后用纯化水洗净,再依次用丙酮、草酸、酒精处理,最后脱水后在-40℃下的环境中冷冻干燥15-25小时,并在-70℃下深低温冷冻,辐照灭菌后得到同种异体骨成品。本发明采用丙酮、草酸和酒精联合处理,可以失活或去除骨髓内的细胞和脂肪成分,同时通过冻干处理和深低温冷冻,可以进一步去除同种异体骨的免疫原性,同时保持有较佳的成骨能力和生物力学性能。此外,本发明设计的处理步骤简便易行,便于规模化生产操作。

权利要求书

1: 一种同种异体骨的化学处理方法, 包括骨的切割和深低温冷冻, 其特征在于, 该方法 按以下步骤进行 : (1) 将切割后的同种异体骨材料用纯化水清洗, 除去骨髓 ; (2) 用化学纯的丙酮与骨材料按 4-8 ∶ 1 的体积混合, 震动脱脂, 直至溶液无明显浮油 脂为止 ; (3) 将步骤 (2) 所得的骨材料用草酸浸泡 2-6 小时 ; (4) 用质量浓度为 75-85%的酒精浸泡步骤 (3) 所得到的骨材料 ; (5) 脱水后放入 -40℃下的环境中冷冻干燥 15-25 小时 ; (6) 将步骤 (5) 得到的骨材料在 -70℃深低温冷冻、 辐照灭菌。
2: 根据权利要求 1 所述的同种异体骨的化学处理方法, 其特征在于, 所述震动脱脂的 温度是 20-30℃。
3: 根据权利要求 1 所述的同种异体骨的化学处理方法, 其特征在于, 所述草酸溶液的 浓度为 0.5-1mol/L。
4: 根据权利要求 1 所述的同种异体骨的化学处理方法, 其特征在于, 所述酒精浸泡时 间为 4-6 小时。
5: 根据权利要求 1 所述的同种异体骨的化学处理方法, 其特征在于, 所述深低温冷冻 的时间为 70-100 天。
6: 根据权利要求 1 所述的同种异体骨的化学处理方法, 其特征在于, 所述辐照灭菌的 剂量为 20-30kGy。

说明书


一种同种异体骨的化学处理方法

    【技术领域】
     本发明涉及生物材料领域, 具体涉及一种植入性生物材料的处理方法。背景技术 骨折外伤、 肿瘤等会导致骨的缺损和结构破坏。已有的技术中常常应用自体骨或 人工骨材料等来修复骨的缺损。 但是, 自体骨的取材有限, 同时取材时也加重了病人的创伤 并增加了并发症的风险。 而陶瓷等人工骨材料等用于骨的修复时, 其生物力学性能较差, 骨 生物活性也有待提高。同种异体骨技术是采用合法捐献的人类合格供体骨组织, 经加工处 理后, 作为充填材料植入体内, 是自体骨移植的代用材料。
     同种异体骨是目前临床上应用最为广泛的骨替代材料。它具有来源丰富、 不受形 态、 大小限制、 具有较好的骨生物活性等优点, 在临床上有较好的应用前景。新鲜的同种异 体骨具有较强的免疫原性, 植入体内后会诱发排斥反应。虽然同种异体骨移植诱发的宿主 免疫排异反应一般不会引起危及生命的严重后果, 但是免疫排异反应往往干扰移植骨的愈 合, 并可导致移植骨的过度吸收或骨不连、 深部感染等, 影响治疗效果。 骨组织由矿物质、 胶 原、 非胶原蛋白和细胞成分组成。骨骼中的矿物质不具有抗原性, 胶原和非胶原蛋白仅是 弱抗原, 同种异体骨移植的抗原刺激主要来自其骨髓内的造血细胞、 血管内皮细胞、 树突细 胞、 巨噬细胞和骨系细胞。 为了降低或消除异体骨的排斥反应, 目前国际上普遍采用的是冷 冻干燥或深度冷冻的处理方法, 消毒则利用 r 射线照线或环氧乙烷来进行。这些处理方法 已经成为国际上的一些权威机构, 如美国组织库和欧洲组织库的产品生产标准。
     目前临床上使用最多的同种异体骨是以下两类 : 深低温冷冻辐照灭菌骨及冷冻干 燥辐照灭菌骨。 但单纯采用深低温冷冻及冷冻干燥的方法并不能完全消除同种异体骨的免 疫原性方面, 需要采用其它的方法进一步降低骨的免疫原性。
     发明内容
     因此, 本发明的目的在于提供一种可以规模化生产的用化学法处理同种异体骨的方法。 本发明的技术方案是 : 一种同种异体骨的化学处理方法, 包括骨的切割和深低温 冷冻, 其中, 该方法按以下步骤进行 :
     (1) 将切割后的同种异体骨材料用纯化水清洗, 除去骨髓 ;
     (2) 用化学纯的丙酮与骨材料按 4-8 ∶ 1 的体积混合, 震动脱脂, 直至溶液无明显 浮油脂为止 ;
     (3) 将步骤 (2) 所得的骨材料用草酸浸泡 2-6 小时 ;
     (4) 用质量浓度为 75-85%的酒精浸泡步骤 (3) 所得到的骨材料 ;
     (5) 脱水后放入 -40℃下的环境中冷冻干燥 15-25 小时 ;
     (6) 将步骤 (5) 得到的骨材料在 -70℃深低温冷冻、 辐照灭菌。
     根据本发明的同种异体骨的化学处理方法, 较好的是, 所述震动脱脂的温度是
     20-30℃。
     上述步骤 (3) 中草酸溶液的浓度为 0.5-1mol/L。
     根据本发明的同种异体骨的化学处理方法, 在一个优选的实施方案中, 所述酒精 浸泡时间为 4-6 小时。
     根据本发明的同种异体骨的化学处理方法, 较好的是, 所述深低温冷冻的时间为 70-100 天。
     本发明采用的深低温冷冻时间经过反复试验, 可进一步去除骨材料的免疫原性, 同时保持了较佳的成骨能力。
     根据本发明的同种异体骨的化学处理方法, 较好的是, 所述辐照灭菌的剂量为 20-30kGy。
     本发明的技术原理是 : 通过化学方法使异体骨细胞失活, 使细胞表面蛋白成分分 解, 就能达到消除或减弱抗原性的目的, 从而减弱异体骨移植引起的免疫排斥反应。 本发明 通过清洗骨髓、 脱脂、 草酸和酒精浸泡等处理, 能消化残存的细胞膜、 完全去掉细胞基质, 使 植入的同种异体骨能为宿主细胞所适应, 并使免疫原性大大降低, 免疫排斥基本消失。
     本发明的有益效果是, 本发明采用适宜的丙酮比例, 可使脱脂完全, 不用重复更换 丙酮, 简化了操作步骤 ; 采用丙酮、 草酸和酒精联合处理, 可以消化残存的细胞膜喝细胞基 质, 大大降低同种异体骨的免疫原性, 同时通过冻干处理和深低温冷冻, 可以进一步去除同 种异体骨的免疫原性, 同时保持有较佳的成骨能力和生物力学性能。 此外, 本发明设计的处 理步骤简便易行, 便于规模化生产操作。 具体实施方式 下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
     实施例 1
     将同种异体骨材料切割成骨颗粒, 将切割后的同种异体骨材料用纯化水清洗, 除 去骨髓 ; 用化学纯的丙酮与骨材料按 4 ∶ 1 的体积混合, 在 20-30℃下震动脱脂, 直至溶液 无明显浮油脂为止。
     将上述所得的骨材料用 0.5-1mol/L 的草酸溶液浸泡 2 小时 ; 再用质量浓度为 75-85%的酒精浸泡上一步所得到的骨材料, 浸泡时间为 4 小时。将用酒精浸泡后的骨材料 脱水后, 放入 -40℃下的环境中冷冻干燥 16 小时。最后将冷冻干燥后的骨材料在 -70℃深 低温冷冻 70 天, 并在 20kGy 剂量的钴 -60 下辐照灭菌。
     实施例 2
     将同种异体骨材料切割成骨段, 将切割后的同种异体骨材料用纯化水清洗, 除去 骨髓 ; 用化学纯的丙酮与骨材料按 5 ∶ 1 的体积混合, 在 20-30℃下震动脱脂, 直至溶液无 明显浮油脂为止。
     将上述所得的骨材料用 0.5-1mol/L 的草酸溶液浸泡 3.5 小时 ; 再用质量浓度为 75-85%的酒精浸泡上一步所得到的骨材料, 浸泡时间为 5 小时。将用酒精浸泡后的骨材料 脱水后, 放入 -40℃下的环境中冷冻干燥 20 小时。最后将冷冻干燥后的骨材料在 -70℃深 低温冷冻 82 天, 并在 15kGy 剂量的钴 -60 下辐照灭菌。
     实施例 3
     将同种异体骨材料切割成骨段, 将切割后的同种异体骨材料用纯化水清洗, 除去 骨髓 ; 用化学纯的丙酮与骨材料按 7 ∶ 1 的体积混合, 在 20-30℃下震动脱脂, 直至溶液无 明显浮油脂为止。
     将上述所得的骨材料用 0.5-1mol/L 的草酸溶液浸泡 5 小时 ; 再用质量浓度为 75-85%的酒精浸泡上一步所得到的骨材料, 浸泡时间为 6 小时。将用酒精浸泡后的骨材料 脱水后, 放入 -40℃下的环境中冷冻干燥 22 小时。最后将冷冻干燥后的骨材料在 -70℃深 低温冷冻 90 天, 并在 10kGy 剂量的钴 -60 下辐照灭菌。
     实施例 4
     将同种异体骨材料切割成骨块, 将切割后的同种异体骨材料用纯化水清洗, 除去 骨髓 ; 用化学纯的丙酮与骨材料按 8 ∶ 1 的体积混合, 在 20-30℃下震动脱脂, 直至溶液无 明显浮油脂为止。
     将上述所得的骨材料用 0.5-1mol/L 的草酸溶液浸泡 6 小时 ; 再用质量浓度为 75-85%的酒精浸泡上一步所得到的骨材料, 浸泡时间为 5 小时。将用酒精浸泡后的骨材料 脱水后, 放入 -40℃下的环境中冷冻干燥 25 小时。最后将冷冻干燥后的骨材料在 -70℃深 低温冷冻 100 天, 并在 15kGy 剂量的钴 -60 下辐照灭菌。
     本发明采用丙酮、 草酸和酒精联合处理, 可以失活或去除骨髓内的细胞和脂肪成 分, 大大降低同种异体骨的免疫原性, 同时通过冻干处理和深低温冷冻, 可以进一步去除同 种异体骨的免疫原性, 同时保持有较佳的成骨能力和生物力学性能。 此外, 本发明设计的处 理步骤简便易行, 便于规模化生产操作。5

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1、10申请公布号CN102335458A43申请公布日20120201CN102335458ACN102335458A21申请号201010231771322申请日20100720A61L27/3620060171申请人上海安久生物科技有限公司地址201108上海市闵行区金都路4299号72发明人汤亭亭楼伟74专利代理机构上海三和万国知识产权代理事务所31230代理人刘立平54发明名称一种同种异体骨的化学处理方法57摘要本发明提供了一种同种异体骨的化学处理方法,包括骨的切割和深低温冷冻。该方法是将骨材料切割后用纯化水洗净,再依次用丙酮、草酸、酒精处理,最后脱水后在40下的环境中冷冻干燥1525小。

2、时,并在70下深低温冷冻,辐照灭菌后得到同种异体骨成品。本发明采用丙酮、草酸和酒精联合处理,可以失活或去除骨髓内的细胞和脂肪成分,同时通过冻干处理和深低温冷冻,可以进一步去除同种异体骨的免疫原性,同时保持有较佳的成骨能力和生物力学性能。此外,本发明设计的处理步骤简便易行,便于规模化生产操作。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页CN102335467A1/1页21一种同种异体骨的化学处理方法,包括骨的切割和深低温冷冻,其特征在于,该方法按以下步骤进行1将切割后的同种异体骨材料用纯化水清洗,除去骨髓;2用化学纯的丙酮与骨材料按481的体积混合,震动。

3、脱脂,直至溶液无明显浮油脂为止;3将步骤2所得的骨材料用草酸浸泡26小时;4用质量浓度为7585的酒精浸泡步骤3所得到的骨材料;5脱水后放入40下的环境中冷冻干燥1525小时;6将步骤5得到的骨材料在70深低温冷冻、辐照灭菌。2根据权利要求1所述的同种异体骨的化学处理方法,其特征在于,所述震动脱脂的温度是2030。3根据权利要求1所述的同种异体骨的化学处理方法,其特征在于,所述草酸溶液的浓度为051MOL/L。4根据权利要求1所述的同种异体骨的化学处理方法,其特征在于,所述酒精浸泡时间为46小时。5根据权利要求1所述的同种异体骨的化学处理方法,其特征在于,所述深低温冷冻的时间为70100天。6。

4、根据权利要求1所述的同种异体骨的化学处理方法,其特征在于,所述辐照灭菌的剂量为2030KGY。权利要求书CN102335458ACN102335467A1/3页3一种同种异体骨的化学处理方法技术领域0001本发明涉及生物材料领域,具体涉及一种植入性生物材料的处理方法。背景技术0002骨折外伤、肿瘤等会导致骨的缺损和结构破坏。已有的技术中常常应用自体骨或人工骨材料等来修复骨的缺损。但是,自体骨的取材有限,同时取材时也加重了病人的创伤并增加了并发症的风险。而陶瓷等人工骨材料等用于骨的修复时,其生物力学性能较差,骨生物活性也有待提高。同种异体骨技术是采用合法捐献的人类合格供体骨组织,经加工处理后,作。

5、为充填材料植入体内,是自体骨移植的代用材料。0003同种异体骨是目前临床上应用最为广泛的骨替代材料。它具有来源丰富、不受形态、大小限制、具有较好的骨生物活性等优点,在临床上有较好的应用前景。新鲜的同种异体骨具有较强的免疫原性,植入体内后会诱发排斥反应。虽然同种异体骨移植诱发的宿主免疫排异反应一般不会引起危及生命的严重后果,但是免疫排异反应往往干扰移植骨的愈合,并可导致移植骨的过度吸收或骨不连、深部感染等,影响治疗效果。骨组织由矿物质、胶原、非胶原蛋白和细胞成分组成。骨骼中的矿物质不具有抗原性,胶原和非胶原蛋白仅是弱抗原,同种异体骨移植的抗原刺激主要来自其骨髓内的造血细胞、血管内皮细胞、树突细胞。

6、、巨噬细胞和骨系细胞。为了降低或消除异体骨的排斥反应,目前国际上普遍采用的是冷冻干燥或深度冷冻的处理方法,消毒则利用R射线照线或环氧乙烷来进行。这些处理方法已经成为国际上的一些权威机构,如美国组织库和欧洲组织库的产品生产标准。0004目前临床上使用最多的同种异体骨是以下两类深低温冷冻辐照灭菌骨及冷冻干燥辐照灭菌骨。但单纯采用深低温冷冻及冷冻干燥的方法并不能完全消除同种异体骨的免疫原性方面,需要采用其它的方法进一步降低骨的免疫原性。发明内容0005因此,本发明的目的在于提供一种可以规模化生产的用化学法处理同种异体骨的方法。0006本发明的技术方案是一种同种异体骨的化学处理方法,包括骨的切割和深低。

7、温冷冻,其中,该方法按以下步骤进行00071将切割后的同种异体骨材料用纯化水清洗,除去骨髓;00082用化学纯的丙酮与骨材料按481的体积混合,震动脱脂,直至溶液无明显浮油脂为止;00093将步骤2所得的骨材料用草酸浸泡26小时;00104用质量浓度为7585的酒精浸泡步骤3所得到的骨材料;00115脱水后放入40下的环境中冷冻干燥1525小时;00126将步骤5得到的骨材料在70深低温冷冻、辐照灭菌。0013根据本发明的同种异体骨的化学处理方法,较好的是,所述震动脱脂的温度是说明书CN102335458ACN102335467A2/3页42030。0014上述步骤3中草酸溶液的浓度为051M。

8、OL/L。0015根据本发明的同种异体骨的化学处理方法,在一个优选的实施方案中,所述酒精浸泡时间为46小时。0016根据本发明的同种异体骨的化学处理方法,较好的是,所述深低温冷冻的时间为70100天。0017本发明采用的深低温冷冻时间经过反复试验,可进一步去除骨材料的免疫原性,同时保持了较佳的成骨能力。0018根据本发明的同种异体骨的化学处理方法,较好的是,所述辐照灭菌的剂量为2030KGY。0019本发明的技术原理是通过化学方法使异体骨细胞失活,使细胞表面蛋白成分分解,就能达到消除或减弱抗原性的目的,从而减弱异体骨移植引起的免疫排斥反应。本发明通过清洗骨髓、脱脂、草酸和酒精浸泡等处理,能消化。

9、残存的细胞膜、完全去掉细胞基质,使植入的同种异体骨能为宿主细胞所适应,并使免疫原性大大降低,免疫排斥基本消失。0020本发明的有益效果是,本发明采用适宜的丙酮比例,可使脱脂完全,不用重复更换丙酮,简化了操作步骤;采用丙酮、草酸和酒精联合处理,可以消化残存的细胞膜喝细胞基质,大大降低同种异体骨的免疫原性,同时通过冻干处理和深低温冷冻,可以进一步去除同种异体骨的免疫原性,同时保持有较佳的成骨能力和生物力学性能。此外,本发明设计的处理步骤简便易行,便于规模化生产操作。具体实施方式0021下面结合具体实施例进一步阐述本发明。0022实施例10023将同种异体骨材料切割成骨颗粒,将切割后的同种异体骨材料。

10、用纯化水清洗,除去骨髓;用化学纯的丙酮与骨材料按41的体积混合,在2030下震动脱脂,直至溶液无明显浮油脂为止。0024将上述所得的骨材料用051MOL/L的草酸溶液浸泡2小时;再用质量浓度为7585的酒精浸泡上一步所得到的骨材料,浸泡时间为4小时。将用酒精浸泡后的骨材料脱水后,放入40下的环境中冷冻干燥16小时。最后将冷冻干燥后的骨材料在70深低温冷冻70天,并在20KGY剂量的钴60下辐照灭菌。0025实施例20026将同种异体骨材料切割成骨段,将切割后的同种异体骨材料用纯化水清洗,除去骨髓;用化学纯的丙酮与骨材料按51的体积混合,在2030下震动脱脂,直至溶液无明显浮油脂为止。0027将。

11、上述所得的骨材料用051MOL/L的草酸溶液浸泡35小时;再用质量浓度为7585的酒精浸泡上一步所得到的骨材料,浸泡时间为5小时。将用酒精浸泡后的骨材料脱水后,放入40下的环境中冷冻干燥20小时。最后将冷冻干燥后的骨材料在70深低温冷冻82天,并在15KGY剂量的钴60下辐照灭菌。0028实施例3说明书CN102335458ACN102335467A3/3页50029将同种异体骨材料切割成骨段,将切割后的同种异体骨材料用纯化水清洗,除去骨髓;用化学纯的丙酮与骨材料按71的体积混合,在2030下震动脱脂,直至溶液无明显浮油脂为止。0030将上述所得的骨材料用051MOL/L的草酸溶液浸泡5小时;。

12、再用质量浓度为7585的酒精浸泡上一步所得到的骨材料,浸泡时间为6小时。将用酒精浸泡后的骨材料脱水后,放入40下的环境中冷冻干燥22小时。最后将冷冻干燥后的骨材料在70深低温冷冻90天,并在10KGY剂量的钴60下辐照灭菌。0031实施例40032将同种异体骨材料切割成骨块,将切割后的同种异体骨材料用纯化水清洗,除去骨髓;用化学纯的丙酮与骨材料按81的体积混合,在2030下震动脱脂,直至溶液无明显浮油脂为止。0033将上述所得的骨材料用051MOL/L的草酸溶液浸泡6小时;再用质量浓度为7585的酒精浸泡上一步所得到的骨材料,浸泡时间为5小时。将用酒精浸泡后的骨材料脱水后,放入40下的环境中冷冻干燥25小时。最后将冷冻干燥后的骨材料在70深低温冷冻100天,并在15KGY剂量的钴60下辐照灭菌。0034本发明采用丙酮、草酸和酒精联合处理,可以失活或去除骨髓内的细胞和脂肪成分,大大降低同种异体骨的免疫原性,同时通过冻干处理和深低温冷冻,可以进一步去除同种异体骨的免疫原性,同时保持有较佳的成骨能力和生物力学性能。此外,本发明设计的处理步骤简便易行,便于规模化生产操作。说明书CN102335458A。

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