紫菜多糖在制备肾脏疾病治疗药物或预防保健品中的应用 技术领域 本发明涉及紫菜多糖的制药用途， 特别涉及低分子量紫菜多糖在制备肾病治疗药 物和肾病预防类保健食品方面的用途。
背景技术 紫菜多糖是一种硫酸化的多糖， 广泛地存在于紫菜属的植物中， 占紫菜干重 的 20-40 ％。它的主要结构单元是→ 3)β-D- 半乳糖 -(1 → 4)-α-L-6- 硫酸基 - 半乳 糖 -(1 →， 其中部分 α-L-6- 硫酸基 - 半乳糖被 L-3， 6- 内醚半乳糖代替， 形成结构单元 (2) ： → 3-β-D- 半乳糖 -(1 → 4)-α-L-3， 6 内醚半乳糖 -(1 →。紫菜多糖具有抗凝血、 降血糖、 调血脂、 抗血栓、 抑制肿瘤及增强细胞免疫功能等多种生物活性， 广泛地用于食品和医药等 行业。自上世纪 50 年代以来， 研究人员就对紫菜多糖的化学组分和生物活性进行过大量的 研究。
肾脏是人体的重要排泄器官， 具有排泄体内代谢产物、 药物和毒物， 以及调节体内 水、 电解质、 酸碱平衡的功能， 它在维持人体内环境的稳定性中起着重要的作用。当各种病 因引起肾功能障碍时， 人体内环境就会发生紊乱， 导致糖尿病、 冠心病及以高血压等疾病的 产生。因此， 肾功能的保护显得尤为重要。
之前的研究表明， 硫酸化的褐藻类多糖由于具有 P- 选择素抑制作用、 抗氧化作 用、 抗肾间质纤维化作用以及延缓肾小球硬化的作用， 已被用于肾病的治疗。 而紫菜多糖在 肾病治疗中的应用尚无报道。
发明内容 本发明的目的是提供紫菜多糖制备肾病治疗药物及肾病预防类保健品方面的用 途。所述肾脏疾病包括急性肾功能衰竭、 慢性肾功能衰竭、 尿毒症、 肾病综合症和糖尿病肾 病。
本发明提供了含紫菜多糖的药物组合物。 所述组合物包含治疗上有效量的紫菜多 糖和至少一种药学上可接受的载体。 该组合物的给药方式可以是但不限于静脉注射、 口服、 肌肉、 皮下、 皮肤表面、 直肠骨、 局部注射等方式， 其剂型可以但不限于是注射液、 冻干粉针 剂、 注射微球、 脂质体、 片剂、 胶囊剂、 水剂、 散剂、 糊剂、 喷雾剂、 颗粒剂、 滴丸剂、 凝胶剂、 贴 片或膏剂。
本发明中的紫菜多糖包括从紫菜中提取得到的紫菜多糖及其降解产物——低分
子量的紫菜多糖和紫菜寡糖。多糖的降解方式可以是超声波降解、 微波降解、 辐照降解、 酸 降解及自由基氧化降解中的任意一种或几种。多糖的分子量范围可以是 1-2000kD， 优选是 1-10kDa。紫菜多糖的来源是红藻门红毛菜科紫菜属坛紫菜、 条斑紫菜、 甘紫菜等藻类的一 种或几种。
本发明的组合物中， 单位制剂中低分子量紫菜多糖的含量可以是 10-1000mg， 优选 是 10-100mg。
本发明中的紫菜多糖可按以下方法提取和纯化 ：
目前文献中常以热水法提取紫菜多糖， 也有以超声或微波辅助提取的报道。向提 取液中加入乙醇或季胺盐都可以使多糖沉淀出来。为减少蛋白及色素的溶出， 提取前可先 以高浓度的醇类或甲醛溶液处理藻体。 以水粗提得到的紫菜多糖中含有部分水溶性的盐类 及色素等， 需要进一步纯化。常采用透析或者超滤的方法除去小分子杂质。
将紫菜多糖降解从而制备低分子量的紫菜多糖或寡糖的方法可采用以下几种 ：
1. 酸降解法。 酸性溶液可以引起糖苷键的断裂， 从而获得分子量较低的紫菜多糖。 调节反应液中酸的浓度、 反应时间及反应温度可获得不同分子量大小的降解产物。
2. 物理降解法， 包括辐射法、 超声波和微波等方法。 物理法是通过超声波或微波等 引起分子链上化学键的断裂， 从而获得低分子量的产物。 3. 自由基氧化降解法。此法主要是利用羟自由基与糖环中碳上的氢原子反应， 即 氢抽提反应， 使糖苷键断裂。自由基氧化降解法可在酸性、 碱性及中性环境下进行， 通过调 控溶液 pH 值、 过氧化氢用量、 反应时间和温度以得到不同分子量的产物。
在本发明的一个具体实施方式中， 低分子量的紫菜多糖通过以下方法制备 ： 将干 紫菜剪碎后， 以高浓度的乙醇溶液反复回流。弃去乙醇后， 以沸水提取。提取液以硅藻土助 滤过滤， 滤液先以自来水流水透析一天， 然后以蒸馏水透析， 将透析液浓缩， 加乙醇沉淀， 沉 淀干燥得紫菜多糖。取适量多糖， 溶于硫酸溶液中， 在一定条件下搅拌反应。反应结束后加 入氢氧化钡以除去硫酸。离心后， 将上清液浓缩后， 冷冻干燥。
附图说明
图 1ARF 各实验组大鼠血清中尿素氮含量， * 与模型组 II 相比较， P ＜ 0.05**P ＜ 0.01 ；
图 2ARF 各 实 验 组 大 鼠 血 清 中 肌 酐 含 量， * 与 模 型 组 II 相 比 较， P ＜ 0.05**P ＜ 0.01 ；
图 3ARF 实验组 VI 皮细胞图 ；
图 4ARF 实验组 VI 髓质细胞图 ；
图 5ARF 实验组 VII 皮细胞图 ；
图 6ARF 实验组 VII 髓质细胞图 ；
图 7CRF 各实验组大鼠血清中尿素氮含量， * 与模型组 II 相比较， P ＜ 0.05**P ＜ 0.01 ；
图 8CRF 各 实 验 组 大 鼠 血 清 中 肌 酐 含 量， * 与 模 型 组 II 相 比 较， P ＜ 0.05**P ＜ 0.01。
以下将通过具体实施方式对本发明进行进一步的说明。具体实施方式
实施例 1 紫菜多糖的制备
将干的条斑紫菜剪碎后， 在质量浓度 90 ％的乙醇中回流 3h， 重复 3 次。弃去乙 醇后， 将紫菜在室温下晾干后， 置于高压锅中， 加水量为 40 倍紫菜重量， 以 120℃的沸水提 取 4h， 提取液以硅藻土过滤， 滤液浓缩后， 以自来水流水透析一天， 然后以蒸馏水透析一天， 将透析液浓缩， 加乙醇至其终质量浓度为 75％， 使紫菜多糖沉淀。干燥后得到紫菜多糖 P， 其重均分子量为 237KDa， 总糖含量为 79.8％， 3， 6- 内醚半乳糖含量为 7.46％， 硫酸基含量 17.2％。
低分子量紫菜多糖 LPA 的制备
称取紫菜多糖， 溶于蒸馏水中配成质量浓度为 1.5％的溶液 ； 向该溶液中加入抗 坏血酸和过氧化氢， 使它们的终浓度分别达到 30mmol/L， 混合均匀后， 室温下反应 2 小时， 反应完毕后， 透析， 以除去抗坏血酸和过氧化氢。 所得溶液浓缩后， 冷冻干燥， 得到低分子量 紫菜多糖 LP。经检测， 其数均分子量为 6.5kDa， 峰位分子量为 7.2kDa， 重均分子量为 8kDa。 化学组分分析结果 ： 总糖质量含量 81.2％， 硫酸基质量含量 17.3％ .
低分子量紫菜多糖 LPB 的制备
称取紫菜多糖， 溶于蒸馏水中配成质量浓度为 2.5％的溶液。向该溶液中加入浓 硫酸， 使其终浓度达到 0.5mol/L， 混合均匀， 在 80℃下搅拌反应 4 小时， 反应完毕后， 向反 应液中加入饱和氢氧化钡溶液至中性。离心除去沉淀， 浓缩上清液后， 冷冻干燥， 制得低分 子量的紫菜多糖 LB。经检测， 其数均分子量为 1.4KDa， 峰位分子量为 1.6KDa， 重均分子量 为 2KDa， 分子量范围为 1KDa-4KDa。化学组分分析结果为 ： 总糖含量 75.4 ％， 硫酸基含量 16.2％。
实施例 2 紫菜多糖胶囊的制备
取 紫 菜 多 糖 50g， 加 入 微 晶 纤 维 素 30g， ， 混 合， 装 胶 囊， 每粒胶囊汗紫菜多糖 50-100mg。
实施例 3 低分子量紫菜多糖注射剂的制备
取低分子量紫菜多糖 50g， 加入注射用水 500mL， 甘露醇 50g， 调 pH 至 7.0， 无菌过 滤后， 分装， 冷冻干燥。
实施例 4 紫菜多糖抗急性肾衰活性的测试实验
实验动物 ： 标准 SD 大鼠
动物模型 ： 甘油致 ARF 模型——SD 大鼠禁水 24h 后， 以甘油 ( 质量浓度 50％， 生理 盐水配制 )10ml/Kg 体重分别在两侧后肢肌肉注射， 之后实验动物自由进食和饮水， 48h 即 成稳定 ARF 模型， 可持续 1 周。
药物配制 ： 将未经降解的紫菜多糖 P( 实施例 1 制备 ) 低分子量紫菜多糖 (LP， 实 施例 2 制备 ) 以注射用水按 2mg/ml 和 6mg/ml 两种浓度各配制 100ml， 0.22μm 滤膜过滤除 菌后 4℃保存， 使用时 5ml/Kg 体重腹腔注射 (10mg/Kg 和 30mg/Kg 体重 ) ； 地塞米松以生理 盐水配制为 0.02mg/ml 100ml， 5ml/Kg 体重腹腔注射 (0.1mg/Kg 体重 )。
实验分组 ：
I： 空白对照组II ： 单纯 ARF 模型组
III ： ARF+ 地塞米松 (0.1mg/kg)
IV ： ARF+LP(10mg/Kg)
V： ARF+LP(30mg/Kg)
VI ： ARF+P(10mg/Kg)
VII ： ARF+P(30mg/Kg)
实验方法 ：
健康成年标准 SD 大鼠随即均分为 7 组， 每组 13 只。除 I 组 ( 注射生理盐水 10ml/ Kg) 外其余各组均用 10ml/Kg50％的甘油肌肉注射造 ARF 模型， IV-VII 组于 48h 时按分组 要求分别于腹腔注射 LP 各 1 次， 72h、 96h 和 120h 时分别重复注射提取物一次， I-II 组则在 相同时间点注射 5ml/Kg 生理盐水， III 组在相同时间点注射地塞米松 0.1mg/kg， 144h 时处 死动物取血和肾脏进行检测。
检测指标 ：
1. 动物死亡率， 尿量
2. 血生化 (BUN、 Scr、 白蛋白、 K+、 Na+、 Ca2+ 等 ) 检测 3. 形态学检查 ： 光镜肾脏结构检查 ( 石蜡包埋切片 2μm， 二甲苯脱腊和梯队酒精 水化后行 HE 染色 ： 苏木素 8min， 流水冲洗 1min， 蒸馏水浸 1min， 加伊红 5min， 流水冲洗 30s， 烤干， 透明后用中性树胶封片。)
实验结果 ：
血生化检测的结果见图 1、 2 及表 1， 模型组大鼠血清中肌酐和尿素氮的含量远高 于正常组。而 P 及 LP 治疗可有效地降低肌酐和尿素氮的含量。对肌酐含量的降低程度， P 组及 LP 组优于阳性对照组， 而 LP 组的效果更佳。而对于血清中尿素氮含量以及各离子的 影响， 给药组与阳性对照无显著性差异。
表 1 各实验组大鼠血液检测结果
实验组大鼠肾脏细胞的检测表明， 正常组大鼠肾脏皮髓质分界清楚， 肾小球、 肾小 管大致正常。 而模型组的大鼠的肾小球毛细血管攀扩张、 淤血， 皮、 髓质肾小管明显扩张， 部 分肾小管内可见蛋白管型， 间质血管扩张、 淤血伴少量淋巴细胞浸润。 阳性对照组及给药组 的大鼠虽有少量的肾小管扩张， 但肾脏皮髓质分界清楚， 肾小球大致正常 ( 见图 3-6)。
结论 ： 紫菜多糖 P 及 LP 对急性肾衰具有显著治疗作用， 可有效降低急性肾衰动物 血清肌酐和尿素氮含量， 对肾衰动物的肾脏病理学有明显改善作用。
实施例 5 紫菜多糖抗慢性肾衰活性的测试实验
实验动物 ： 成年 SPF 级雄性 Wisteria 大鼠
动物模型 ： 腺膘呤致 CRF 模型—— Wisteria 大鼠以普通饲料饲养并观察一周， 状 态良好后， 以腺嘌呤 300mg/Kg 体重灌胃给药， 每天一次， 连续 21 天即成稳定 CRF 模型。
实验分组 ：
I： 空白对照组
II ： 单纯 CRF 模型组
III ： CRF+ 海昆肾喜胶囊 (150mg/kg)
IV ： CRF+LP(50mg/Kg)
V： CRF+LP(150mg/Kg)
实验方法 ：
健康成年标准 Wisteria 大鼠随即均分为 5 组， 每组 10 只。 除 I 组 ( 注射生理盐水 10ml/Kg) 外其余各组均用腺嘌呤 300mg/Kg 体重灌胃给药造 CRF 模型， III、 IV 和 V 组称重 后按设计方法灌胃给药 28 天， 每天一次。 III 组则在相同时间点灌胃 5ml/Kg 生理盐水， III 组在相同时间以海昆肾喜胶囊 150mg/kg 灌胃。28 天结束后， 以 10％水合氯醛 4mL/kg 麻醉 后心脏穿刺采血 3mL。所得血液室温静置半小时自然凝血。之后以 30000rpm 离心 10min， 取血清 4℃保存， 用于测定生化指标。
取血后将大鼠处死， 摘取两侧肾脏， 除去肾上腺和其他非肾脏组织， 用生理盐水冲 洗， 医用纱布吸去表面水分， 称其湿重， 计算肾脏指数。同时观察肾脏体积， 颜色及质地变 化。
检测指标 ：
1. 大鼠生长状况的观察
2. 血生化 (BUN、 Scr) 检测
3. 肾脏形态学的观察
4. 大鼠体重及双湿肾重的称量
实验结果 ：
正常组大鼠生长良好， 活动正常， 体重也会逐日增加， 体毛有光泽。而其它组以腺 嘌呤灌胃后摄食量下降。造模期间， 大鼠逐渐消瘦， 精神萎靡， 背毛竖起， 干枯无光泽， 活动 减少， 耳廓略显苍白， 并伴有多饮、 多尿现象。 按照预定剂量给灌胃给药后， 各组大鼠体重逐 渐增加， 摄食量也渐增并和正常组近似， 精神和体毛状态均有所好转。
血生化检测的结果见图 7、 图 8， 模型组大鼠血清中肌酐和尿素氮的含量远高于正 常组。而 LP 治疗可有效地降低肌酐和尿素氮的含量。对肌酐和尿素氮含量的降低程度， LP 组优于阳性对照组。LP 组中两个样品对于血清肌酐和尿素氮的作用并没有剂量依赖性， 低 剂量组的活性近似于高剂量组。 正常组的肾脏体积较小， 呈暗红色， 质地坚实有光泽， 表面光滑， 剖面正常， 包膜不 易剥离 ； 模型组肾脏明显较大， 呈灰白色， 无光泽， 表面不平， 皮质髓质分界不清， 包膜易剥 离。治疗组的肾脏苍白程度较低， 剖面呈红色。
由表 2 可知， 模型组的大鼠体重最轻， LP 给药组的体重最重。 模型组的双湿肾重最 大， 治疗组的会稍小， 但都高于正常组。 而给肾重与体重比值是衡量大鼠肾脏健康程度的一 个指标。由表 2 知， 模型组大鼠的比值最大， 正常组最小， 可见腺嘌呤致大鼠慢性肾衰造成 肾脏肿大， 而治疗组的比值较小， 可见海昆肾喜和 LP 可在一定程度上缓解肾脏的损伤。从 数值上看， LP 的效果更佳。
表 2 各实验组大鼠体重、 双湿肾重及肾重与体重的比值
* 与模型组 II 相比较， P ＜ 0.05**P ＜ 0.01
结论说明 ：
1. 证明紫菜多糖可有效地降低慢性肾衰大鼠中血清尿素氮和肌酐含量， 对肾功能 具有显著改善作用。
2. 紫菜多糖可用于肾功能衰竭的预防和治疗。