紫菜多糖在制备肾脏疾病治疗药物或预防保健品中的应用.pdf

1、10申请公布号CN102319256A43申请公布日20120118CN102319256ACN102319256A21申请号201110211132522申请日20110722A61K31/737200601A61P13/12200601A61P13/00200601A61P3/10200601A23L1/3020060171申请人中国科学院海洋研究所地址266071山东省青岛市南海路七号72发明人张全斌侯赟王晶金维华张虹牛锡珍74专利代理机构沈阳科苑专利商标代理有限公司21002代理人马驰54发明名称紫菜多糖在制备肾脏疾病治疗药物或预防保健品中的应用57摘要本发明公开了一种分子量范围在12

2、000KDA的紫菜多糖在制备肾病治疗药物及肾病预防保健品方面的作用。本发明中的紫菜多糖可以从红藻门红毛菜科紫菜属坛紫菜、条斑紫菜、甘紫菜等藻类的一种或几种提取得到，也可以是上述提取物的降解产物。该紫菜多糖可有效地降低血液中尿素氮含量和肌酐含量。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图4页CN102319259A1/1页21紫菜多糖在制备肾脏疾病治疗药物或肾脏疾病预防保健品中的应用。2根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述紫菜多糖中包含有如下结构的二糖单元的多糖，即3D半乳糖14L6硫酸基半乳糖13根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述紫

3、菜多糖中还包含有如下两种结构单元组成的多糖；结构单元13D半乳糖14L6硫酸基半乳糖1；结构单元23D半乳糖14L3，6内醚半乳糖14根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述肾脏疾病包括急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、尿毒症、肾病综合症或糖尿病肾病；紫菜多糖作为活性成份应用于制备肾脏疾病治疗药物或肾脏疾病预防保健品中。5根据权利要求14中任一项权利要求的应用，其特征在于其中所述的紫菜多糖的平均分子量范围为12000KD。6根据权利要求5中任一项权利要求的应用，其特征在于优选的紫菜多糖平均分子量为110KD。7根据权利要求16中任一项权利要求的应用，其特征在于所述的紫菜多糖还可以采用由紫菜多糖通

4、过降解得到的紫菜寡糖分子量3002000DA。8根据权利要求7的应用，其特征在于其中所述的降解方式包括超声波降解、微波降解、辐照降解、酸降解或自由基氧化降解。9根据权利要求1的应用，其特征在于其中的紫菜多糖来源于红藻门红毛菜科，紫菜属坛紫菜、条斑紫菜、甘紫菜等藻类的一种或几种。10根据权利要求1的应用，其特征在于所述肾脏疾病治疗药物或预防保健品是以紫菜多糖为活性成份制备的注射剂、口服制剂或局部给药制剂的药物组合物；该药物组合物包含治疗上有效量的紫菜多糖和至少一种药学上可接受的载体，将药物组合物制备成注射液、冻干粉针剂、注射微球、脂质体、片剂、胶囊剂、水剂、散剂、糊剂、喷雾剂、颗粒剂、滴丸剂、凝

5、胶剂、贴片或膏剂。权利要求书CN102319256ACN102319259A1/7页3紫菜多糖在制备肾脏疾病治疗药物或预防保健品中的应用技术领域0001本发明涉及紫菜多糖的制药用途，特别涉及低分子量紫菜多糖在制备肾病治疗药物和肾病预防类保健食品方面的用途。背景技术0002紫菜多糖是一种硫酸化的多糖，广泛地存在于紫菜属的植物中，占紫菜干重的2040。它的主要结构单元是3D半乳糖14L6硫酸基半乳糖1，其中部分L6硫酸基半乳糖被L3，6内醚半乳糖代替，形成结构单元23D半乳糖14L3，6内醚半乳糖1。紫菜多糖具有抗凝血、降血糖、调血脂、抗血栓、抑制肿瘤及增强细胞免疫功能等多种生物活性，广泛地用于食

6、品和医药等行业。自上世纪50年代以来，研究人员就对紫菜多糖的化学组分和生物活性进行过大量的研究。00030004肾脏是人体的重要排泄器官，具有排泄体内代谢产物、药物和毒物，以及调节体内水、电解质、酸碱平衡的功能，它在维持人体内环境的稳定性中起着重要的作用。当各种病因引起肾功能障碍时，人体内环境就会发生紊乱，导致糖尿病、冠心病及以高血压等疾病的产生。因此，肾功能的保护显得尤为重要。0005之前的研究表明，硫酸化的褐藻类多糖由于具有P选择素抑制作用、抗氧化作用、抗肾间质纤维化作用以及延缓肾小球硬化的作用，已被用于肾病的治疗。而紫菜多糖在肾病治疗中的应用尚无报道。发明内容0006本发明的目的是提供紫

7、菜多糖制备肾病治疗药物及肾病预防类保健品方面的用途。所述肾脏疾病包括急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭、尿毒症、肾病综合症和糖尿病肾病。0007本发明提供了含紫菜多糖的药物组合物。所述组合物包含治疗上有效量的紫菜多糖和至少一种药学上可接受的载体。该组合物的给药方式可以是但不限于静脉注射、口服、肌肉、皮下、皮肤表面、直肠骨、局部注射等方式，其剂型可以但不限于是注射液、冻干粉针剂、注射微球、脂质体、片剂、胶囊剂、水剂、散剂、糊剂、喷雾剂、颗粒剂、滴丸剂、凝胶剂、贴片或膏剂。0008本发明中的紫菜多糖包括从紫菜中提取得到的紫菜多糖及其降解产物低分说明书CN102319256ACN102319259A2/

8、7页4子量的紫菜多糖和紫菜寡糖。多糖的降解方式可以是超声波降解、微波降解、辐照降解、酸降解及自由基氧化降解中的任意一种或几种。多糖的分子量范围可以是12000KD，优选是110KDA。紫菜多糖的来源是红藻门红毛菜科紫菜属坛紫菜、条斑紫菜、甘紫菜等藻类的一种或几种。0009本发明的组合物中，单位制剂中低分子量紫菜多糖的含量可以是101000MG，优选是10100MG。0010本发明中的紫菜多糖可按以下方法提取和纯化0011目前文献中常以热水法提取紫菜多糖，也有以超声或微波辅助提取的报道。向提取液中加入乙醇或季胺盐都可以使多糖沉淀出来。为减少蛋白及色素的溶出，提取前可先以高浓度的醇类或甲醛溶液处理

9、藻体。以水粗提得到的紫菜多糖中含有部分水溶性的盐类及色素等，需要进一步纯化。常采用透析或者超滤的方法除去小分子杂质。0012将紫菜多糖降解从而制备低分子量的紫菜多糖或寡糖的方法可采用以下几种00131酸降解法。酸性溶液可以引起糖苷键的断裂，从而获得分子量较低的紫菜多糖。调节反应液中酸的浓度、反应时间及反应温度可获得不同分子量大小的降解产物。00142物理降解法，包括辐射法、超声波和微波等方法。物理法是通过超声波或微波等引起分子链上化学键的断裂，从而获得低分子量的产物。00153自由基氧化降解法。此法主要是利用羟自由基与糖环中碳上的氢原子反应，即氢抽提反应，使糖苷键断裂。自由基氧化降解法可在酸性

10、、碱性及中性环境下进行，通过调控溶液PH值、过氧化氢用量、反应时间和温度以得到不同分子量的产物。0016在本发明的一个具体实施方式中，低分子量的紫菜多糖通过以下方法制备将干紫菜剪碎后，以高浓度的乙醇溶液反复回流。弃去乙醇后，以沸水提取。提取液以硅藻土助滤过滤，滤液先以自来水流水透析一天，然后以蒸馏水透析，将透析液浓缩，加乙醇沉淀，沉淀干燥得紫菜多糖。取适量多糖，溶于硫酸溶液中，在一定条件下搅拌反应。反应结束后加入氢氧化钡以除去硫酸。离心后，将上清液浓缩后，冷冻干燥。附图说明0017图1ARF各实验组大鼠血清中尿素氮含量，与模型组II相比较，P005P001；0018图2ARF各实验组大鼠血清中

11、肌酐含量，与模型组II相比较，P005P001；0019图3ARF实验组VI皮细胞图；0020图4ARF实验组VI髓质细胞图；0021图5ARF实验组VII皮细胞图；0022图6ARF实验组VII髓质细胞图；0023图7CRF各实验组大鼠血清中尿素氮含量，与模型组II相比较，P005P001；0024图8CRF各实验组大鼠血清中肌酐含量，与模型组II相比较，P005P001。0025以下将通过具体实施方式对本发明进行进一步的说明。说明书CN102319256ACN102319259A3/7页5具体实施方式0026实施例1紫菜多糖的制备0027将干的条斑紫菜剪碎后，在质量浓度90的乙醇中回流3H

12、，重复3次。弃去乙醇后，将紫菜在室温下晾干后，置于高压锅中，加水量为40倍紫菜重量，以120的沸水提取4H，提取液以硅藻土过滤，滤液浓缩后，以自来水流水透析一天，然后以蒸馏水透析一天，将透析液浓缩，加乙醇至其终质量浓度为75，使紫菜多糖沉淀。干燥后得到紫菜多糖P，其重均分子量为237KDA，总糖含量为798，3，6内醚半乳糖含量为746，硫酸基含量172。0028低分子量紫菜多糖LPA的制备0029称取紫菜多糖，溶于蒸馏水中配成质量浓度为15的溶液；向该溶液中加入抗坏血酸和过氧化氢，使它们的终浓度分别达到30MMOL/L，混合均匀后，室温下反应2小时，反应完毕后，透析，以除去抗坏血酸和过氧化氢

13、。所得溶液浓缩后，冷冻干燥，得到低分子量紫菜多糖LP。经检测，其数均分子量为65KDA，峰位分子量为72KDA，重均分子量为8KDA。化学组分分析结果总糖质量含量812，硫酸基质量含量1730030低分子量紫菜多糖LPB的制备0031称取紫菜多糖，溶于蒸馏水中配成质量浓度为25的溶液。向该溶液中加入浓硫酸，使其终浓度达到05MOL/L，混合均匀，在80下搅拌反应4小时，反应完毕后，向反应液中加入饱和氢氧化钡溶液至中性。离心除去沉淀，浓缩上清液后，冷冻干燥，制得低分子量的紫菜多糖LB。经检测，其数均分子量为14KDA，峰位分子量为16KDA，重均分子量为2KDA，分子量范围为1KDA4KDA。化

14、学组分分析结果为总糖含量754，硫酸基含量162。0032实施例2紫菜多糖胶囊的制备0033取紫菜多糖50G，加入微晶纤维素30G，混合，装胶囊，每粒胶囊汗紫菜多糖50100MG。0034实施例3低分子量紫菜多糖注射剂的制备0035取低分子量紫菜多糖50G，加入注射用水500ML，甘露醇50G，调PH至70，无菌过滤后，分装，冷冻干燥。0036实施例4紫菜多糖抗急性肾衰活性的测试实验0037实验动物标准SD大鼠0038动物模型甘油致ARF模型SD大鼠禁水24H后，以甘油质量浓度50，生理盐水配制10ML/KG体重分别在两侧后肢肌肉注射，之后实验动物自由进食和饮水，48H即成稳定ARF模型，可持

15、续1周。0039药物配制将未经降解的紫菜多糖P实施例1制备低分子量紫菜多糖LP，实施例2制备以注射用水按2MG/ML和6MG/ML两种浓度各配制100ML，022M滤膜过滤除菌后4保存，使用时5ML/KG体重腹腔注射10MG/KG和30MG/KG体重；地塞米松以生理盐水配制为002MG/ML100ML，5ML/KG体重腹腔注射01MG/KG体重。0040实验分组0041I空白对照组说明书CN102319256ACN102319259A4/7页60042II单纯ARF模型组0043IIIARF地塞米松01MG/KG0044IVARFLP10MG/KG0045VARFLP30MG/KG0046VI

16、ARFP10MG/KG0047VIIARFP30MG/KG0048实验方法0049健康成年标准SD大鼠随即均分为7组，每组13只。除I组注射生理盐水10ML/KG外其余各组均用10ML/KG50的甘油肌肉注射造ARF模型，IVVII组于48H时按分组要求分别于腹腔注射LP各1次，72H、96H和120H时分别重复注射提取物一次，III组则在相同时间点注射5ML/KG生理盐水，III组在相同时间点注射地塞米松01MG/KG，144H时处死动物取血和肾脏进行检测。0050检测指标00511动物死亡率，尿量00522血生化BUN、SCR、白蛋白、K、NA、CA2等检测00533形态学检查光镜肾脏结构

17、检查石蜡包埋切片2M，二甲苯脱腊和梯队酒精水化后行HE染色苏木素8MIN，流水冲洗1MIN，蒸馏水浸1MIN，加伊红5MIN，流水冲洗30S，烤干，透明后用中性树胶封片。0054实验结果0055血生化检测的结果见图1、2及表1，模型组大鼠血清中肌酐和尿素氮的含量远高于正常组。而P及LP治疗可有效地降低肌酐和尿素氮的含量。对肌酐含量的降低程度，P组及LP组优于阳性对照组，而LP组的效果更佳。而对于血清中尿素氮含量以及各离子的影响，给药组与阳性对照无显著性差异。0056表1各实验组大鼠血液检测结果0057说明书CN102319256ACN102319259A5/7页70058实验组大鼠肾脏细胞的检

18、测表明，正常组大鼠肾脏皮髓质分界清楚，肾小球、肾小管大致正常。而模型组的大鼠的肾小球毛细血管攀扩张、淤血，皮、髓质肾小管明显扩张，部分肾小管内可见蛋白管型，间质血管扩张、淤血伴少量淋巴细胞浸润。阳性对照组及给药组的大鼠虽有少量的肾小管扩张，但肾脏皮髓质分界清楚，肾小球大致正常见图36。0059结论紫菜多糖P及LP对急性肾衰具有显著治疗作用，可有效降低急性肾衰动物血清肌酐和尿素氮含量，对肾衰动物的肾脏病理学有明显改善作用。0060实施例5紫菜多糖抗慢性肾衰活性的测试实验0061实验动物成年SPF级雄性WISTERIA大鼠0062动物模型腺膘呤致CRF模型WISTERIA大鼠以普通饲料饲养并观察一

19、周，状态良好后，以腺嘌呤300MG/KG体重灌胃给药，每天一次，连续21天即成稳定CRF模型。0063实验分组0064I空白对照组0065II单纯CRF模型组0066IIICRF海昆肾喜胶囊150MG/KG0067IVCRFLP50MG/KG0068VCRFLP150MG/KG0069实验方法0070健康成年标准WISTERIA大鼠随即均分为5组，每组10只。除I组注射生理盐水10ML/KG外其余各组均用腺嘌呤300MG/KG体重灌胃给药造CRF模型，III、IV和V组称重后按设计方法灌胃给药28天，每天一次。III组则在相同时间点灌胃5ML/KG生理盐水，III组在相同时间以海昆肾喜胶囊15

20、0MG/KG灌胃。28天结束后，以10水合氯醛4ML/KG麻醉后心脏穿刺采血3ML。所得血液室温静置半小时自然凝血。之后以30000RPM离心10MIN，取血清4保存，用于测定生化指标。说明书CN102319256ACN102319259A6/7页80071取血后将大鼠处死，摘取两侧肾脏，除去肾上腺和其他非肾脏组织，用生理盐水冲洗，医用纱布吸去表面水分，称其湿重，计算肾脏指数。同时观察肾脏体积，颜色及质地变化。0072检测指标00731大鼠生长状况的观察00742血生化BUN、SCR检测00753肾脏形态学的观察00764大鼠体重及双湿肾重的称量0077实验结果0078正常组大鼠生长良好，活动

21、正常，体重也会逐日增加，体毛有光泽。而其它组以腺嘌呤灌胃后摄食量下降。造模期间，大鼠逐渐消瘦，精神萎靡，背毛竖起，干枯无光泽，活动减少，耳廓略显苍白，并伴有多饮、多尿现象。按照预定剂量给灌胃给药后，各组大鼠体重逐渐增加，摄食量也渐增并和正常组近似，精神和体毛状态均有所好转。0079血生化检测的结果见图7、图8，模型组大鼠血清中肌酐和尿素氮的含量远高于正常组。而LP治疗可有效地降低肌酐和尿素氮的含量。对肌酐和尿素氮含量的降低程度，LP组优于阳性对照组。LP组中两个样品对于血清肌酐和尿素氮的作用并没有剂量依赖性，低剂量组的活性近似于高剂量组。0080正常组的肾脏体积较小，呈暗红色，质地坚实有光泽，

22、表面光滑，剖面正常，包膜不易剥离；模型组肾脏明显较大，呈灰白色，无光泽，表面不平，皮质髓质分界不清，包膜易剥离。治疗组的肾脏苍白程度较低，剖面呈红色。0081由表2可知，模型组的大鼠体重最轻，LP给药组的体重最重。模型组的双湿肾重最大，治疗组的会稍小，但都高于正常组。而给肾重与体重比值是衡量大鼠肾脏健康程度的一个指标。由表2知，模型组大鼠的比值最大，正常组最小，可见腺嘌呤致大鼠慢性肾衰造成肾脏肿大，而治疗组的比值较小，可见海昆肾喜和LP可在一定程度上缓解肾脏的损伤。从数值上看，LP的效果更佳。0082表2各实验组大鼠体重、双湿肾重及肾重与体重的比值0083说明书CN102319256ACN102319259A7/7页90084与模型组II相比较，P005P0010085结论说明00861证明紫菜多糖可有效地降低慢性肾衰大鼠中血清尿素氮和肌酐含量，对肾功能具有显著改善作用。00872紫菜多糖可用于肾功能衰竭的预防和治疗。说明书CN102319256ACN102319259A1/4页10图1图2说明书附图CN102319256ACN102319259A2/4页11图3图4说明书附图CN102319256ACN102319259A3/4页12图5图6说明书附图CN102319256ACN102319259A4/4页13图7图8说明书附图CN102319256A