发酵肉汤制剂 与相关申请的交叉引用
本申请要求 2009 年 2 月 20 日递交的美国临时申请序列号 61/154,235， 2009 年 6 月 10 日递交的 61/185,865 和 2010 年 2 月 12 日递交的 61/304,219 的优先权， 上述每一个 临时申请在此处以其整体引入作为参考。
1. 发明领域
本发明涉及发酵肉汤制剂、 制造其的方法及其用途。
2. 背景技术
在多种培养或发酵微生物的工艺中， 有时候必须在发酵过程中或结束时杀死混合 物中的活细胞。特别是当把含有重组 DNA 的微生物作为生产宿主来培养并且希望避免任何 活的重组生物被释放至环境中时。 即使微生物不包含重组 DNA， 也常常希望在加工前杀死细 胞以保证活细胞不被释放到环境中， 无论是在生产的产物中或在废产物中。
许多需要杀死微生物的常规方法， 例如加热， 过于剧烈， 可能在杀死细胞前破坏或 改变期望的分泌产物。 在这种情况下， 必须在不杀死细胞的情况下回收产物， 这需要使用繁 重且代价高的防泄漏工艺和设备。美国专利号 5,801,034 和 5,378,621 描述了使用具有 1 至 5 个碳原子的单一有机酸杀死微生物细胞的方法。然而， 根据这些专利的实施例， 高水平 的有机酸和低 pH 是最适的。低 pH 条件对发酵培养基中的许多目的酶产物的稳定性经常是 不利的， 并且高水平的有机酸经常抑制希望使用酶产物的下游应用， 例如， 在由酶产物通过 酶催化作用已经产生的底物上产生有机物的微生物发酵。此外， 使用高浓度的化学剂杀死 微生物细胞可能显著增加从发酵培养基中回收产物的成本。
由此， 仍然需要开发在较不剧烈的条件下杀死细胞的方法， 其中使用较低浓度的 化学剂是所期望的。
3. 发明概述
许多工业蛋白质， 例如酶， 经常在产生其的发酵肉汤中商业提供。通常， 蛋白质由 细胞 ( 重组或非重组 ) 表达和分泌至包含发酵培养基和细胞的发酵肉汤中。常常希望在将 蛋白质用于工业应用之前失活例如杀死细胞， 以避免将复制性细胞释放至环境中。本发明 公开满足了此需要， 以基本上不干扰蛋白质例如酶的活性的方式失活细胞。
在一些方面， 本发明公开提供了制造发酵肉汤制剂的方法， 其包括在一定条件下 孵育第一混合物一段时间， 所述第一混合物包含 ： (a) 一种或多种发酵肉汤， (b) 占第一混 合物的 0.1％至 15％重量的量的第一有机酸成分， 所述第一有机酸成分包含至少一种 1-5 碳有机酸 ( 即， 在其主链和侧链中共具有 1-5 个碳的有机酸 ) 和 / 或其盐， 和 (c) 占第一混 合物的 0.025％至 5％重量的量的第二有机酸成分， 所述第二有机酸成分包含至少一种 6 碳 或更多碳有机酸 ( 即， 在其主链和侧链中共具有 6 个或更多个碳的有机酸 ) 和 / 或其盐， 其 中所述孵育条件和时间导致所述一种或多种发酵肉汤中至少 4log 的活细胞减少， 由此产 生发酵肉汤制剂。
在特定的实施方案中， 第一有机酸成分的量在如下范围中， 所述范围的下限选自 按重量计第一混合物的 0.1％， 0.2％， 0.25％， 0.3％， 0.35％， 0.4％， 0.5％， 0.75％或 1％，
而上限独立地选自按重量计第一混合物的 0.3％， 0.4％， 0.5％， 0.75％， 1％， 2％， 3％， 5％， 7％， 10％， 12％或 15％， 例如按重量计第一混合物的 0.2％至 1％， 0.2％至 0.5％， 0.1％至 10％， 0.25％至 5％或 0.3％至 3％的量， 等等。
在特定的实施方案中， 第二有机酸成分的量在如下范围中， 所述范围的下限选自 按重量计第一混合物的 0.025％， 0.03％， 0.04％， 0.045％， 0.05％， 0.075％， 0.1％， 0.2％， 0.25％， 0.3％， 0.35％， 0.4％， 0.5％， 0.75％或 1％， 而上限独立地选自按重量计第一混合 物的 0.1 ％， 0.2 ％， 0.3 ％， 0.4 ％， 0.5 ％， 0.75 ％， 1 ％， 2 ％， 3 ％或 5 ％， 例如， 按重量计第一 混合物的 0.04％至 3％， 0.2％至 0.5％， 0.1％至 1％， 0.25％至 5％或 0.3％至 3％的量， 等 等。该有机酸可合适地为 6- 至 10- 碳有机酸， 6- 至 9- 碳有机酸或 6- 至 8- 碳有机酸。因 此， 在特定的实施方案中， 第二有机酸成分包含 6- 碳酸和 / 或其盐， 7- 碳酸和 / 或其盐， 8- 碳酸和 / 或其盐， 9- 碳酸和 / 或其盐， 或 10- 碳酸和 / 或其盐， 或由之组成。
孵育时间适宜在下述范围中， 所述范围的下限选自 4 小时， 6 小时， 8 小时， 10 小时， 12 小时， 14 小时， 16 小时， 18 小时或 20 小时， 而上限独立地选自 12 小时， 16 小时， 20 小时， 24 小时， 28 小时， 32 小时或 36 小时， 例如从 4 小时至 36 小时， 例如从 8 小时至 36 小时， 从 20 小时至 28 小时， 从 8 小时至 16 小时， 从 10 小时至 20 小时， 从 16 小时至 30 小时， 等等。 孵育条件包括温度， 所述温度适宜在下述范围中， 该范围的下限选自 20℃， 22℃， 25 ℃， 28 ℃， 30 ℃， 32 ℃， 34 ℃， 36 ℃， 38 ℃ 或 40 ℃， 而 上 限 独 立 地 选 自 28 ℃， 33 ℃， 35 ℃， 40℃， 45℃， 50℃或 55℃， 例如从 20℃至 50℃， 从 25℃至 40℃， 从 28℃至 33℃， 等等。
孵育条件包括 pH， 所述 pH 适宜在下述范围中， 该范围的下限选自 3.5， 3.6， 3.7， 3.8， 3.9， 4 或 4.2， 而上限独立地选自 3.8， 4， 4.2， 4.4， 4.5， 4.6， 4.7， 4.8， 4.9， 5， 5.2 或 5.5， 例如从 3.5 至 5， 从 4 至 4.7， 或 4.2 至 4.5 的 pH。可在孵育开始时和 / 或在孵育期间一次 或多次调节 pH， 例如加入 pH 调节剂。在特定的实施方案中， pH 调节剂是磷酸、 硫酸或氢氧 化钠。本文也考虑在某些实施方案中第一和 / 或第二有机酸成分可在孵育开始时和 / 或孵 育期中起调节 pH 的作用， 并因此部分或完全地消除对另外的 pH 调节剂的需要。
在某些方面， 本发明方法在混合物中实现一种或多种发酵肉汤中的活细胞数的至 少 5log 减少、 6log 减少、 7log 减少或 8log 减少。
在特定的实施方案中， 所述第一混合物中的活细胞减少， 比接受所述条件的第二 混合物或替代混合物中的减少， 高至少 0.25 倍， 至少 0.5 倍， 至少 1 倍， 至少 2 倍， 至少 5 倍 或至少 10 倍， 其中所述第二混合物或替代混合物只包含一种有机酸成分， 该一种有机酸成 分的量达到在第一混合物中的第一和第二有机酸成分的总重量百分比。例如， 使用与本发 明方法有关的第一有机酸成分的第一量 ( 例如以重量计 1％ ) 和第二有机酸成分的第二量 ( 以重量计 0.5％ )， 比在相同或类似条件下以达到所述第一和第二量的总和的第三量 ( 例 如 1.5％重量百分比 ) 使用单独第一有机酸成分或第二有机酸成分， 导致活细胞数的更大 减少。
本发明方法可用于失活真菌细胞， 例如丝状真菌细胞。 在特定的实施方案中， 丝状 真菌细胞来自木霉属 (Trichoderma)、 曲霉属 (Aspergillus)、 青霉属 (Penicillium)、 腐质 霉属 (Humicola)、 金孢霉属 (Chrysosporium) 或脉孢霉属 (Neurospora)。 在以下章节 5.2.1 中描述了适于本公开的方法、 制剂和组合物的其他细胞类型。
在特定实施方案中， 第一有机酸成分包含下述或由下述组成 ： 醋酸、 醋酸盐、 甲酸、
甲酸盐、 丙酸、 丙酸盐、 或前述两种或更多种的混合物。 在一个实施方案中， 第一有机酸成分 包含醋酸和 / 或其盐， 或由醋酸和 / 或其盐组成。
在特定实施方案中， 第二有机酸成分包含下述或由下述组成 ： 苯甲酸、 苯甲酸盐、 环己烷羧酸、 环己烷羧酸盐、 4- 甲基戊酸、 4- 甲基戊酸盐、 苯乙酸、 苯乙酸盐、 或前述两种或 更多种的混合物。在一个实施方案中， 第二有机酸成分包含苯甲酸和 / 或其盐， 或由苯甲酸 和 / 或其盐组成。
在本发明方法的一些实施方案中， 第一有机酸成分包含所述 1-5 碳有机酸的钠、 钾、 钙或镁盐， 和 / 或第二有机酸成分包含所述 6 碳或更多碳有机酸的钠、 钾、 钙或镁盐。
在某些特定的实施方案中， 第一有机酸成分包含以重量计 0.2％ -0.4％浓度的醋 酸， 和第二有机酸成分包含以重量计 0.2％ -0.4％浓度的苯甲酸钠， 和 / 或孵育时间是 24 小时， 和 / 或孵育条件包括 40℃的温度和 / 或孵育条件包括 4 至 4.6 的 pH。
在本发明方法中， 第一混合物也可包含一种或多种抗微生物剂， 例如以抑制污染 性细菌或真菌的生长。在特定的实施方案中， 该一种或多种抗微生物剂的量为第一混合物 的 0.0005 至 0.05％重量， 例如， 所述混合物的 0.001 至 0.025％重量的量。在特定的实施 方案中， 抗微生物剂包含含有异 -α 酸、 四 - 异 α 酸 (tetra-iso alpha acids) 和 / 或 β 酸的啤酒花提取物。本文也考虑在特定实施方案中第一和 / 或第二有机酸成分可起抗微生 物剂的作用， 并因此部分或全部地消除对另外的抗微生物剂的需要。 本发明方法还包括在上述孵育步骤前制备第一混合物的步骤， 例如通过组合一种 或多种发酵肉汤以及至少一种 1-5 碳有机酸和 / 或其盐、 至少一种 6 碳或更多碳有机酸和 / 或其盐、 和任选地一种或多种其他试剂， 例如 pH 调节剂和 / 或抗微生物剂。
在特定的实施方案中， 本文描述的方法还包括培养细胞以产生在本发明中使用的 发酵肉汤中的一种或多种的步骤。 例如 ( 但不限于 )， 可根据以下章节 5.2.2 中描述的任一 种细胞培养方法， 制备发酵肉汤。 由此， 本公开的组合物和制剂可包括通过本文公开的方法 制备的发酵肉汤。
不受任何理论约束， 本发明人相信， 使用本文描述的 2 种有机酸成分与使用单一 有机酸成分相比， 导致实现细胞失活 ( 例如， 如本文描述的， 使活细胞数减少 4 或更多 log 倍 ) 所需的总有机酸成分的减少， 并允许孵育反应在比原可能的情况更高的 pH 进行， 由此 最小化对起始发酵肉汤中的蛋白质例如酶的折叠和稳定性的副作用。 因此， 在某些方面， 在 导致如下发酵肉汤制剂的条件下进行本发明方法， 所述发酵肉汤制剂中的一种或多种酶维 持其至少 75％， 至少 80％， 至少 85％， 至少 90％， 至少 95％或至少 98％的起始酶活性。
本发明还提供了通过本文描述的方法得到的或可通过本文描述的方法得到的发 酵肉汤制剂。
因此， 在某些方面， 本发明提供了组合物， 其包含 (a) 一种或多种含有细胞的发酵 肉汤 ； (b) 包含至少一种 1-5 碳有机酸和 / 或其盐的第一有机酸成分， 其量为所述组合物的 0.2％至 1.5％重量 ； (c) 包含至少一种 6 碳或更多碳有机酸和 / 或其盐的第二有机酸成分， 其量为所述组合物的 0.04％至 0.6％重量。
在特定的实施方案中， 第一有机酸成分的量在如下范围中， 该范围的下限选自以 重量计组合物的 0.1％， 0.2％， 0.25％， 0.3％， 0.35％， 0.4％， 0.5％， 0.75％或 1％， 而上限 独立地选自以重量计组合物的 0.3％， 0.4％， 0.5％， 0.75％， 1％， 2％， 3％， 5％， 7％， 10％，
12％或 15％， 例如以重量计组合物的 0.2％至 1％， 0.2％至 0.5％， 0.1％至 10％， 0.25％至 5％或 0.3％至 3％的量， 等等。
在特定的实施方案中， 第二有机酸成分的量在如下范围中， 该范围的下限选自 以 重 量 计 组 合 物 的 0.025 ％， 0.03 ％， 0.04 ％， 0.045 ％， 0.05 ％， 0.075 ％， 0.1 ％， 0.2 ％， 0.25％， 0.3％， 0.35％， 0.4％， 0.5％， 0.75％或 1％， 而上限独立地选自以重量计组合物的 0.1 ％， 0.2 ％， 0.3 ％， 0.4 ％， 0.5 ％， 0.75 ％， 1 ％， 2 ％， 3 ％或 5 ％， 例如， 以重量计组合物的 0.04％至 3％， 0.2％至 0.5％， 0.1％至 1％， 0.25％至 5％或 0.3％至 3％的量， 等等。
应当理解， 在本发明的制剂和组合物中有机酸成分通常至少部分是离解的形式， 当这些成分是离解的形式时， 成分的重量百分比不是指离解的离子 ( 例如钙 ) 的重量而是 指用于制备该组合物或制剂的干物质 ( 例如酸或盐 ) 的重量。这些成分离解的程度将取决 于其各自的 pKa 值。优选在使有机酸成分的至少 20％， 至少 30％， 至少 40％， 至少 50％， 至 少 60％或至少 70％离解的 pH 条件和温度下制造制剂或组合物。
在某些方面， 本发明组合物的 pH 适宜在下述范围， 该范围的下限选自 3.5， 3.6， 3.7， 3.8， 3.9， 4 或 4.2， 而上限独立地选自 3.8， 4， 4.2， 4.4， 4.5， 4.6， 4.7， 4.8， 4.9， 5， 5.2 或 5.5， 例如从 3.5 至 5， 从 4 至 4.7， 或 4.2 至 4.5 的 pH。
在某些方面， 本发明的组合物中的细胞主要或完全是非存活的细胞。例如， 在某 些实施方案中， 如果在组合物中存在活细胞， 那么在所述组合物中非存活细胞与活细胞的 比例是至少 10 ∶ 1， 至少 50 ∶ 1， 至少 100 ∶ 1， 至少 1000 ∶ 1， 至少 10,000 ∶ 1， 至少 100,000 ∶ 1 或至少 1,000,000 ∶ 1。
在某些方面， 细胞包括真菌细胞， 例如丝状真菌细胞。在特定的实施方案中， 丝状 真菌细胞来自木霉属、 曲霉属、 青霉属、 腐质霉属、 金孢霉属或脉孢霉属。
在本发明的组合物的某些实施方案中， 第一有机酸成分包含下述或由下述组成 ： 醋酸、 醋酸盐、 甲酸、 甲酸盐、 丙酸、 丙酸盐、 或前述两种或更多种的混合物。 在特定实施方案 中， 第一有机酸成分包含醋酸和 / 或其盐， 或由醋酸和 / 或其盐组成。
在本发明的组合物的某些实施方案中， 第二有机酸成分包含下述或由下述组成 ： 苯甲酸、 苯甲酸盐、 环己烷羧酸、 环己烷羧酸盐、 4- 甲基戊酸、 4- 甲基戊酸盐、 苯乙酸、 苯乙 酸盐， 或前述两种或更多种的混合物。在特定实施方案中， 第二有机酸成分包含苯甲酸和 / 或其盐， 或由苯甲酸和 / 或其盐组成。
在某些实施方案中， 第一有机酸成分包含 1-5 碳有机酸的钠、 钾、 钙或镁盐， 和/或 第二有机酸成分包含 6 碳或更多碳有机酸的钠、 钾、 钙或镁盐。
在以下章节 5.2.4 中描述了适用于本发明的方法和组合物的有机酸的其他细节 和实施方案。
在特定的实施方案中， 第一有机酸成分包含以重量计 0.2％ -0.4％浓度的醋酸， 和 / 或第二有机酸成分包含以重量计 0.2％ -0.4％浓度的苯甲酸钠。
本发明的组合物可包含一种或多种抗微生物剂。在特定的实施方案中， 该一种或 多种抗微生物剂的量是以重量计组合物的 0.0005 至 0.05％， 例如是以重量计所述组合物 的 0.001 至 0.025％的量。在特定的实施方案中， 抗微生物剂包含含有异 -α- 酸、 四-异 α 酸和 / 或 β 酸的啤酒花提取物。
在本发明的方法、 制剂和组合物中使用的发酵肉汤通常包含一种或多种由细胞分泌的蛋白质。所述一种或多种蛋白质中的至少一种可为重组表达的和 / 或为酶， 例如外切 葡聚糖酶、 内切葡聚糖酶、 半纤维素酶或 β- 葡糖苷酶。在某些实施方案中， 发酵肉汤包含 由细胞重组表达和分泌的多种酶， 例如外切葡聚糖酶、 内切葡聚糖酶、 半纤维素酶或 β- 葡 糖苷酶中的 2 种或更多种。在以下章节 5.2.3 中描述了适合在本发明的组合物和制剂中存 在的其他酶。在某些方面， 蛋白质占本发明制剂或组合物的 3 至 30 重量百分比。在特定的 实施方案中， 蛋白质占本发明制剂或组合物的 5 至 15 重量百分比， 7 至 10 重量百分比， 6至 12 重量百分比， 5 至 20 重量百分比， 10 至 25 重量百分比， 10 至 20 重量百分比， 8 至 15 重量 百分比， 或 6 至 10 重量百分比。
在某些特定的实施方案中本发明的制剂或组合物具有 1、 2 或所有 3 种以下活性 ：
(a) 内切葡聚糖酶活性， 范围从选自 2000， 2100， 2200， 2350， 2500 或 2650CMC U/g 的下限至独立地选自 2400， 2600， 2800， 3000， 3200， 3500， 3750 或 4000CMC U/g 的上限， 例如 从 2200CMC U/g 至 2800CMC U/g， 从 2200CMC U/g 至 3200CMC U/g， 从 2500 至 3500CMC U/g， 等等 ；
(b)β- 葡糖苷酶活性， 范围从选自 300， 375， 450， 475， 500， 525， 550， 600， 650， 或 700pNPG U/g 的下限至独立地选自 475， 525， 575， 635， 700， 775， 800， 850， 900 或 950pNPG U/ g 的上限， 例如从 525pNPG U/g 至 775pNPGU/g， 从 300pNPG U/g 至 800pNPG U/g， 从 350pNPG U/g 至 850pNPGU/g， 等等 ； 和 (c) 木 聚 糖 酶 活 性， 范 围 从 选 自 1000， 1250， 1500， 1750， 2000， 2250， 2500， 2750 或 3000ABX U/g 的 下 限 至 独 立 地 选 自 2500， 3000， 3500， 4000， 4500， 5000， 5500， 6000 或 7000ABX U/g 的上限， 例如从 2000ABX U/g 至 5000ABX U/g， 从 1500ABX U/g 至 4500ABX U/ g， 从 3500ABX U/g 至 5500ABX U/g， 等等。
在另一个方面， 本发明提供了水解纤维素物料的方法， 其包括将纤维素物料和任 意前述发酵肉汤制剂或组合物接触。 在一些实施方案中， 纤维素物料是植物生物质物质， 例 如木质素纤维素物质， 其任选地已被预处理以提高酶促水解。 由此， 在某些方面本发明的制 剂和组合物还包含未水解的纤维素物料， 部分水解的纤维素物料或基本上完全水解的 ( 例 如＞ 90％水解的或＞ 95％水解的 ) 纤维素物料。在特定实施方案中， 部分水解的纤维素物 料 (i) 是高达 40％， 高达 50％， 高达 60％， 高达 70％， 高达 80％或高达 90％水解的纤维素 物料 ； (ii) 是至少 30％， 至少 40％， 至少 50％， 至少 60％， 或至少 70％水解的纤维素物料 ； 或 (iii) 水解至落入独立地选自 (i) 和 (ii) 的一对值之间的范围中， 例如 30 ％ -80 ％或 40％ -90％水解的。注意本文描述的制剂和组合物的成分 ( 例如有机酸 ) 的重量范围一般 不包括纤维素物料或纤维素物料的水解产物。
在以下章节 5.3 描述了本发明的制剂和组合物的其他细节和实施方案。
在一些方面， 本发明提供了通过在本发明的制剂或组合物中发酵可以生产有机物 质的微生物来制备有机物质的方法。 在一个实施方案中， 所述微生物是产乙醇微生物， 所述 有机物质是乙醇。本发明的组合物可在同时糖化和发酵反应 (“SSF” ) 或分开的糖化和发 酵反应 (“SHF” ) 中使用。
不受任何理论约束， 相比于与本发明的组合物类似或相同但仅包含一种有机酸成 分的制剂或组合物 ( 在此分别称为 “替代制剂” 或 “替代组合物” ， 在该替代制剂或组合物中 所述一种有机酸成分为可失活或杀死发酵肉汤中的细胞的量 )， 本发明的制剂和组合物有
利地包含较少的发酵微生物的抑制剂。 由此， 在某些实施方案中， 在本发明的制剂或组合物 存在下由发酵微生物产生的有机物质的产率， 比在替代制剂或组合物存在下有机物质的产 率， 高至少 0.25 倍， 至少 0.5 倍， 至少 1 倍， 至少 2 倍， 至少 5 倍或至少 10 倍。例如， 当对发 酵微生物使用包含酶、 第一量 ( 例如 1％重量 ) 的第一有机酸成分和第二量 (0.5％重量 ) 的 第二有机酸成分的本发明组合物或制剂时， 由发酵微生物产生的有机物质的产率， 比在相 同或类似条件下使用包含相同酶和高达所述第一和第二量之和 ( 例如 1.5％重量百分比 ) 的第三量的单独第一有机酸成分或第二有机酸成分的组合物时的产率， 更高。
因此， 在某些实施方案中， 本发明制剂和组合物用于 SSF 反应。该方法包括使包含 本发明的制剂或组合物、 发酵微生物和纤维素底物的 SSF 反应混合物经历 SSF 条件。任选 地， 所述方法包括形成 SSF 反应混合物的步骤， 例如通过组合本发明的制剂或组合物、 乙醇 生产者 (ethanologen) 和任选地纤维素底物。在特定的实施方案中， SSF 条件包括缺乏补 充的氮源。在另一个特定实施方案中， 所述条件有助于纤维素水解为葡萄糖和 / 或半纤维 素糖 ( 例如木糖、 阿拉伯糖和 / 或甘露糖 ) 和有助于葡萄糖和 / 或半纤维素转化为有机物 质 ( 例如乙醇 )。 包含本发明的制剂或组合物、 发酵微生物和任选地纤维素物料的 SSF 反应 混合物也是本发明的一部分， 本发明也涵盖其中纤维素物料已被部分水解和发酵的 SSF 反 应产物。 在其他实施方案中， 本发明制剂和组合物用于 SHF 反应。该方法包括使包含本发 明的制剂或组合物和纤维素底物的 SHF 反应混合物经历 SHF 条件。任选地， 所述方法包括 形成 SHF 反应混合物的步骤， 例如通过组合本发明的制剂或组合物和纤维素底物。在特定 的实施方案中， SHF 条件有助于纤维素水解为葡萄糖和 / 或半纤维素糖 ( 例如木糖、 阿拉伯 糖和 / 或甘露糖 )。任选地， 然后将 SHF 反应产物用于发酵反应中以将得到的葡萄糖和 / 或 半纤维素转化为有机物质 ( 例如乙醇 )。包含本发明的制剂或组合物和纤维素物料的 SHF 反应混合物也是本发明的一部分， 本发明也涵盖其中纤维素物料已被部分水解的 SHF 反应 产物。
在以下章节 5.4 和 5.5 中描述了水解纤维素物料的方法和制备有机物质的方法的 其他细节和实施方案。
在另一个方面， 本发明提供了试剂盒， 其包含包装和根据本发明的制剂、 组合物、 SSF 反应混合物、 SSF 反应产物、 SHF 反应混合物或 SHF 反应产物。在一些实施方案中， 所述 试剂盒还包含在用发酵微生物制备有机物质的方法中使用的说明书， 例如在用产乙醇微生 物和以试剂盒中的细胞灭活的全肉汤或组合物水解的纤维素底物制备乙醇的方法中使用 的说明书。在以下章节 5.6 中描述了本发明的试剂盒的其他细节和实施方案。
在以下章节 5.7 中提供了本发明的方法、 制剂和组合物的其他特定实施方案。
4. 附图简述
图 1 显示了温度和制剂化学浓度对杀死里氏木霉 (T.Reesei) 细胞的影响。
图 2 显示了在 40℃和 pH 4 下苯甲酸钠浓度对杀死里氏木霉 (T.Reesei) 细胞的影 响。
图 3 显示了细胞灭活条件对杀死真菌细胞的影响。
图 4 显示了具有 6 个或更多碳的有机酸的化学结构和 pKa 值。
图 5 显示了在 40 ℃和 pH 4 下具有 6 个或更多碳的不同有机酸对杀死里氏木霉
(T.Reesei) 细胞的影响。
图 6 显 示 了 在 如 实 施 例 2 描 述 的 洗 过 的 APB 水 解 物 上 由 鼠 李 糖 乳 杆 菌 (L.rhamnosus) 产生的乳酸。
图 7 显示了在如实施例 2 描述的洗过的 APB 水解物上由 Thermosacc 酵母产生的 乙醇。
图 8 显示了在于如实施例 2 描述的洗过的 APB 水解物上进行 Thermosacc 酵母发 酵期间葡萄糖的积累。
5. 发明详述
5.1 定义
如本文使用的， 术语 “宿主细胞” 指可转染用于产生多肽的重组表达载体以表达 该多肽的细胞或细胞系。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代， 并且由于天然、 偶然或有意 的突变， 该后代可能不一定和原始的亲本细胞完全相同 ( 在形态学上或在总基因组互补 DNA(genomic DNA complement) 上 )。宿主细胞包括被表达载体体内转染或转化的细胞。 “宿主细胞” 指细胞和从丝状真菌菌株， 特别是木霉属物种菌株， 的细胞产生的原生质体。
当用于细胞、 核酸、 蛋白质或载体时， 术语 “重组” 表示所述细胞、 核酸、 蛋白质或载 体已通过异源核酸或蛋白质的引入或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰， 或所述细胞来源 于这样修饰的细胞。因此， 例如， 重组细胞表达在细胞的天然 ( 非重组 ) 形式中不存在的基 因， 或表达原本异常表达的、 不足表达的或完全不表达的天然基因。 “丝状真菌” 指真菌门 (Eumycotina) 和卵菌门 (Oomycota) 的所有丝状形式 ( 见 Alexopoulos， C.J.(1962)， Introductory Mycology， Wiley， New York)。这些真菌的特征 在于具有由几丁质、 β- 葡聚糖和其他复杂多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本发明的丝 状真菌在形态学、 生理学和遗传学上和酵母截然不同。 丝状真菌的营养生长是菌丝的伸长， 并且碳分解代谢是专性需氧的。
如本文使用的， 术语 “木霉属” 或 “木霉属物种” 指以前或目前被归类为木霉属的 任何真菌属。
术语 “培养” 指在合适生长的条件下在液体或固体培养基中微生物细胞群体的增 长。
如本文使用的， 在本文中可互换使用的术语 “纤维素底物” 或 “纤维素物料” 指含 有纤维素和 / 或半纤维素的物料。纤维素底物可为木质素纤维素物料， 所述木质素纤维素 物料含有彼此交联的和与木质素交联的纤维素、 半纤维素和 β- 葡聚糖。这些纤维素底物 也可含有其他物质， 例如果胶、 蛋白质、 淀粉和脂质， 但通常含有纤维素、 半纤维素和 β- 葡 聚糖作为主要成分。
“发酵微生物” 指适用于在期望的发酵过程中生产有机物质的任何微生物。
如本文使用的术语 “发酵肉汤” 是指由细胞发酵产生的制品， 该制品未经历过回收 和 / 或纯化、 或经历过最低程度的回收和 / 或纯化。例如， 当微生物培养物被培养至饱和， 并在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成 ( 例如由宿主细胞表达酶 ) 并分泌至细胞培养基 中时， 产生发酵肉汤。发酵肉汤可含有在发酵结束时得到的发酵物质的未分级分离的或已 分级分离的内容物。通常， 发酵肉汤是未分级分离的， 包含用过的培养基和在去除 ( 例如通 过离心 ) 微生物细胞 ( 例如丝状真菌细胞 ) 后存在的细胞碎片。在一些实施方案中， 发酵
肉汤含有用过的细胞培养基、 细胞外酶、 和活的和 / 或非存活的微生物细胞。
“产乙醇的” 指微生物从碳水化合物产生乙醇作为主要发酵产物的能力。在一些实 施方案中， 产乙醇微生物也可用于产生其他有机物质。
“羧甲基纤维素单位” 或 “CMC U” 指在 50℃和 pH 4.8 下在 1 分钟内释放 1μmol 还 原糖 ( 表示成葡萄糖当量 ) 的内切葡聚糖酶活性的单位。
“pNP- 葡糖苷单位” 或 “pNPG U” 指在 50℃和 pH 4.8 下从对硝基苯基 -β-D- 吡喃 葡萄糖苷释放 1μmol 硝基酚的 β- 葡糖苷酶活性的单位。
“ABX 单位” 或 “ABX U” 指， 如使用二硝基水杨酸 (DNS) 方法 (Miller， 1959， Anal Chem.， 31 ： 426-428) 测定的， 在 50mM 柠檬酸钠缓冲液 pH 5.3 中在 50℃从 1％的木聚糖 ( 来 自桦树木材 ) 溶液中释放 1μmol 木糖还原糖当量的木聚糖酶活性的单位。
5.2 杀死细胞的方法
本发明提供了杀死培养基中的细胞的方法， 由此产生细胞被灭活的全肉汤。在一 些实施方案中， 该方法包括使细胞接触具有 1 至 5 个碳原子的第一有机酸 ( 以重量计约 0.2％至约 1％的浓度 ) 和具有 6 个或更多个碳原子的第二有机酸 ( 以重量计约 0.04％至 约 0.3％的浓度 ) 的组合。在一些实施方案中， 该方法包括使细胞接触具有 1 至 5 个碳原子 的第一有机酸 ( 以重量计约 0.2％至约 0.5％的浓度 ) 和具有 6 个或更多个碳原子的第二 有机酸 ( 以重量计约 0.2％至约 0.5％的浓度 ) 的组合。在其他实施方案中， 方法包括使细 胞接触具有 6 个或更多个碳原子的有机酸 ( 以重量计约 0.25％至约 0.5％的浓度 )。可以 在合适的 pH 和温度下将所述方法进行合适的一段时间， 以达到基本上完全 ( 即处理后至少 约 4、 5 或 6log 的活细胞减少 ) 或完全 ( 即处理后没有活细胞 ) 的细胞灭活。通常， pH 为 约 3.5 至约 4.5， 约 4 至约 4.4， 或约 3.9 至约 4.2， 温度为约 30℃至约 40℃， 并且在此 pH 和 温度下进行方法约 8 至约 24 小时。在一个实施方案中， 在 pH 约 4 和温度约 40℃下进行方 法约 24 小时。在一些实施方案中， 细胞被杀死但不裂解。在一些实施方案中， 一些或全部 的细胞被裂解。
5.2.1 微生物细胞
细胞通常是微生物细胞， 例如细菌或真菌细胞， 并通常产生至少一种目的分子， 例 如酶或有机化合物。在一些实施方案中， 细胞产生至少一种重组表达的酶。在一些实施方 案中， 目的分子被分泌至细胞外培养基。 在一些实施方案中， 目的分子在细胞内产生且不被 分泌至细胞外培养基中。当分子在细胞内产生且不被分泌至细胞外， 可能需要裂解已杀死 的细胞以将分子释放至液体培养基。
在一些实施方案中， 微生物细胞是丝状真菌细胞， 包括天然存在的丝状真菌， 具有 天然存在的或诱导的突变的丝状真菌， 和已被遗传改造的丝状真菌。
在一些实施方案中， 真菌细胞是曲霉属 (Aspergillus)， 枝顶孢属 (Acremonium)， 短 梗 霉 属 (Aureobasidium)， 白 僵 菌 属 (Beauveria)， 烟 管 菌 属 (Bjerkandera)， 头孢 霉 属 (Cephalosporium)， 拟 蜡 菌 属 (Ceriporiopsis)， 毛 壳 菌 属 (Chaetomium)， 金孢 霉 属 (Chrysosporium)， 麦 角 菌 属 (Claviceps)， 旋 孢 腔 菌 属 (Cochiobolus)， 鬼伞属 (Coprinus)， 革盖菌属 (Coriolus)， 棒囊壳属 (Corynascus)， 隐球酵母属 (Cryptococcus)， 黑 蛋 巢 菌 属 (Cyathus)， 内 座 壳 属 (Endothia)， 线 黑 粉 菌 属 (Filobasidium)， 镰孢属 (Fusarium)， 粘 帚 霉 属 (Gilocladium)， 腐 质 菌 属 (Humicola)， Magnaporthe， 毁丝霉属 (Myceliophthora)， 漆 斑 菌 属 (Myrothecium)， 毛 菌 属 (Mucor)， Neocallimastix， 脉 孢 霉 属 (Neurospora)， 拟 青 霉 属 (Paeilomyces)， 青 霉 属 (Penicillium)， 原毛平革菌 属 (Phanerochaete)， 射 脉 菌 属 (Phlebia)， Piromyces， 侧 耳 属 (Pleurotus)， 柄孢壳属 (Podospora)， 拟青霉属 (Paecilomyces)， 梨孢属 (Pyricularia)， 根毛霉属 (Rhizomucor)， 根 霉 属 (Rhizopus)， 裂 褶 菌 属 (Schizophylum)， 侧 孢 霉 属 (Sporotrychum)， 壳多孢 属 (Stagonospora)， 篮 状 菌 属 (Talaromyces)， Toypoladium， 木 霉 属 (Trichoderma)， 嗜 热 丝 孢 菌 属 (Thermomyces)， 嗜 热 子 囊 菌 属 (Thermoascus)， 梭 孢 壳 属 (Thielavia)， Tolypocladium， 发 癣 菌 属 (Trichophyton) 和 栓 菌 属 (Trametes) 物 种 或 衍 生 自 上 述 的物种。在一些实施方案中， 真菌细胞是棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)， 泡盛曲 霉 (Aspergillus awamori)， 臭 曲 霉 (Aspergillus foetidus)， 日 本 曲 霉 (Aspergillus japonicus)， 构 巢 曲 霉 (Aspergillus nidulans)， 黑 曲 霉 (Aspergillus niger)， 烟曲 霉 (Aspergillus fumigatus) 或 米 曲 霉 (Aspergillus oryzae)。 在 一 些 实 施 方 案 中， 真 菌 细 胞 是 杆 孢 状 镰 孢 (Fusarium bactridioides)， 禾 谷 镰 孢 (Fusarium cerealis)， Fusarium crookwellense，大 刀 镰 孢 (Fusarium culmorum)，禾 本 科 镰 孢 (Fusarium gramin earum)， 禾赤镰孢 (Fusarium graminum)， 异孢镰孢 (Fusarium heterosporum)， 合欢木镰孢 (Fusarium negundi)， 尖镰孢 (Fusarium oxysporum)， 多枝镰孢 (Fusarium reticulatum)， 粉红镰孢 (Fusarium roseum)， 接骨木镰刀菌 (Fusarium sambucinum)， 肤色 镰孢 (Fusarium sarcochroum)， 拟分枝孢镰孢 (Fusarium sporotrich ioides)， 硫色镰孢 (Fusarium sulphureum)， Fusarium torulosum， Fusarium trichothecioides 或 Fusarium venenatum。在一些实施方案中， 真菌细胞是苍烟管菌 (Bjerkandera adusta)， 干拟蜡 菌 (Ceriporiopsis aneirin a)， Ceriporiopsis caregiea， 浅黄拟蜡菌 (Ceriporiopsis gilvescens)， Ceriporiopsis pannocinta， Cerporiopsis rivulosa， Ceriporiopsis subrufa， Ceriporiopsis subvermispora， 毛革盖菌 (Coriolus hirsutus)， 特异腐质霉 (Humicola insolens)， 柔毛腐质霉 (Humicola lanuginosa)， 米赫毛霉 (Mucor miehei)， 嗜 热 毁 丝 霉 (Myceliophthora thermophila)，粗 糙 脉 胞 菌 (Neurospora crassa)， Scytalidium thermophilum， 太 瑞 斯 梭 孢 壳 (Thielavia terrestris)， Trametes pleurotus， Trametes villosa， Trametes versicolor， Chaetomium paecilomyces， Endothia mucor，产 紫 青 霉 (Penicillium purpurogenum)，绳 状 青 霉 (Penicillium funiculosum)， 黄 孢 原 毛 平 革 菌 (Phanerochaete chrysosporium)， 脉 射 菌 (Phlebia radiate) 或刺芹侧耳 (Pleurotus eryngii)。在一些实施方案中， 真菌细胞是哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)， 康氏木霉 (Trichoderma koningii)， 长梗木霉 (Trich oderma longibrachiatum)， 里氏木霉 (Trichoderma reesei) 或绿色木霉 (Trichoderma viride)。
5.2.2 微生物细胞的培养
可通过本领域已知的任何培养方法培养微生物细胞， 导致表达。 通常， 使用适于产 生一种或多种目的分子 ( 例如一种或多种酶和 / 或有机化合物 ) 的条件， 例如适于表达能 够水解纤维素底物的酶的条件。 微生物培养物的发酵可包括摇瓶培养， 小或大规模发酵， 例 如在实验室或工业发酵罐中在合适的培养基和允许表达纤维素酶的条件下进行的， 连续、 分批、 补料分批或固态发酵。培养在包含碳和氮源和无机盐的合适营养培养基中使用本领 域已知的程序进行。 合适的培养基、 温度范围和适于生长和生产目的分子例如生物分子， 例如酶或其它蛋白质， 或有机化合物的其他条件是本领域已知的。
发酵， 例如丝状真菌细胞的发酵， 经常以这样的方式进行， 即， 可以控制含碳底物 作为限制性因素， 由此对细胞提供含碳底物的良好转化和避免细胞污染实质量的未转化底 物。后者对水溶性底物不是问题， 因为任何剩余的痕量可容易地被洗掉。然而在非水溶性 底物的情况下， 这可能是个问题， 并需要加入产物处理步骤， 例如合适的洗涤步骤。
可如下进行发酵， 即培养微生物细胞例如丝状真菌细胞至稳定期， 并在限碳条件 下维持细胞足以表达一种或多种目的分子的一段时间。
5.2.3 微生物细胞表达的酶
在本发明的方法中使用的微生物细胞可为非重组的和 / 或重组的， 例如非重组的 和 / 或重组的丝状真菌。在一些实施方案中微生物细胞含有一个或多个可与微生物细胞同 源或异源的基因。
在一些实施方案中， 微生物细胞例如丝状真菌细胞含有一个或多个可与所述 细胞同源或异源的基因， 其中所述一个或多个基因编码可降解纤维素底物的酶。编码 纤维素物料降解酶的基因是本领域技术人员已知的。编码降解纤维素底物的酶的基因 的合适非限制性实例包括， 内切葡聚糖酶、 纤维二糖水解酶、 葡糖水解酶、 β- 葡糖苷酶、 木葡聚糖酶、 木聚糖酶、 木糖苷酶、 α- 阿拉伯呋喃糖苷酶、 α- 葡糖醛酸糖苷酶、 乙酰木 聚糖酯酶、 甘露聚糖酶、 甘露糖苷酶、 α- 半乳糖苷酶、 甘露聚糖乙酰酯酶、 半乳聚糖酶、 阿拉伯聚糖酶 (arabinanase)、 果胶酸裂解酶、 果胶裂解酶、 果胶酸裂合酶、 聚半乳糖醛 酸酶、 果胶乙酰酯酶、 果胶甲基酯酶、 α- 阿拉伯呋喃糖苷酶、 β- 半乳糖苷酶、 半乳聚糖 酶、 阿拉伯聚糖酶 (arabinanase)、 α- 阿拉伯呋喃糖苷酶、 鼠李糖半乳糖醛酸酶、 鼠李 糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、 和鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、 木糖半乳糖醛酸糖苷酶 (xylogalacturonosidase)、 木糖半乳糖醛酸酶、 鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、 木质素过 氧化物酶、 锰依赖性过氧化物酶和漆酶。
在本发明的一些实施方案中， 重组微生物细胞例如重组丝状真菌细胞过表达酶 ( 一种或多种 )， 以改进纤维素底物的降解。可选地， 微生物细胞可为非重组细胞和过表达 酶以改进纤维素底物降解的重组细胞的混合物。在本发明的一些实施方案中， 微生物细胞 例如丝状真菌细胞过表达 β- 葡糖苷酶。可选地， 微生物细胞可为非重组细胞和过表达 β- 葡糖苷酶的重组细胞的混合物。
在本文中， 术语 “β- 葡糖苷酶” 定义为 ： 分类为 EC 3.2.1.21 的 β-D- 葡萄糖苷 葡糖水解酶、 和 / 或在某些 GH 家族， 包括但不限于 GH 家族 1， 3， 7， 9 或 48 中催化纤维二糖 水解并释放 β-D- 葡萄糖的那些酶。过表达的 β- 葡糖苷酶可来自与宿主细胞相同或不同 的物种。值得注意地是， 过表达的 β- 葡糖苷酶不必是在真菌细胞中表达的真菌 β- 葡糖 苷酶。
在 一 些 实 施 方 案 中， 可 通 过 表 达 编 码 β- 葡 糖 苷 酶 的 基 因， 产 生 β- 葡 糖 苷 酶。例如， β- 葡糖苷酶可， 例如由革兰氏阳性生物 ( 例如芽孢杆菌 (Bacillus) 和放线 菌 (Actinomycetes)) 或真核宿主 ( 例如木霉、 曲霉、 酵母 (Saccharomyces) 和毕赤酵母 (Pichia))， 分泌至细胞外空间。 应当理解， 在一些实施方案中， 可在重组微生物中相对天然 水平过表达 β- 葡糖苷酶。在一些实施方案中， 如果使用宿主细胞表达 β- 葡糖苷酶， 细 胞可经遗传修饰以减少一种或多种细胞内源蛋白质的表达。在一些实施方案中， 细胞可含有一个或多个已被缺失或失活的天然基因， 特别是编码分泌蛋白质的基因。例如， 可缺失 或失活一个或多个蛋白酶编码基因 ( 例如天冬酰胺蛋白酶编码基因 ； 见 Berka 等人， Gene 199086 ： 153-162 和 USP 6,509,171) 或纤维素酶编码基因。在一个实施方案中， 木霉属物 种宿主细胞例如里氏木霉宿主细胞在 cbh1、 cbh2 和 egl1、 和 egl2 基因中含有失活性缺失， 如在 PCT 申请号 WO05/001036 中描述的。编码 β- 葡糖苷酶的核酸可存在于木霉属物种宿 主细胞的核基因组中或可存在于在木霉宿主细胞中复制的质粒中。
可使用的 β- 葡糖苷酶的实例包括 ： 来自棘孢曲霉 (Kawaguchi 等人， 1996， Gene 173 ： 287-288)， 河 内 曲 霉 (Aspergillus kawachi)(Iwashita 等 人， 1999， Appl.Environ. Microbiol.65 ： 5546-5553)， 米 曲 霉 (WO2002/095014)， 双 氮 纤 维 单 胞 菌 (Cellulomonas biazotea)(Wong 等 人， 1998， Gene 207 ： 79-86)， 扣 囊 复 膜 孢 酵 母 (Saccharomycopsis fibuligera)(Machida 等 人， 1988， Appl.Environ.Microbiol.54 ： 3147-3155)，栗 酒 裂 殖 酵 母 (Schizosaccharomyces pombe)(Wood 等 人， 2002， Nature 415 ： 871-880)， 里氏 木霉 β- 葡糖苷酶 1( 美国专利号 6,022,725)， 里氏木霉 β- 葡糖苷酶 3( 美国专利号 6,982,159)， 里 氏 木 霉 β- 葡 糖 苷 酶 4( 美 国 专 利 号 7,045,332)， 里 氏 木 霉 β- 葡 糖 苷 酶 5( 美国专利号 7,005,289)， 里氏木霉 β- 葡糖苷酶 6(USPN20060258554)， 和里氏木霉 β- 葡糖苷酶 7(USPN 20040102619) 的 β- 葡糖苷酶。 在一些实施方案中， 由微生物细胞分泌至细胞外的目的酶可溶于细胞外培养基和 / 或细胞灭活的发酵肉汤中。在一些实施方案中， 由微生物细胞分泌至细胞外的目的酶不 可溶于细胞外培养基和 / 或细胞灭活的发酵肉汤中。在一些实施方案中， 细胞外培养基和 / 或细胞灭活的肉汤含有可溶和不可溶的目的酶的混合物。
5.2.4 有机酸
本发明的方法包括在如本文描述的条件下， 以本文所述的量， 例如以实现活细胞 数量的至少 4log， 5log， 6log， 7log 或 8log 减少的量， 使有机酸或其盐接触培养基中的细 胞， 以失活细胞。
在一些实施方案中， 方法包括使细胞接触以重量计约 0.1％至约 15％， 0.2％至约 1％， 或约 0.2％至约 0.5％浓度的含有 1 至 5 个碳原子的第一有机酸 ( 或其盐 ) 和以重量 计约 0.025％至 5％， 以重量计 0.04％至约 0.3％， 或以重量计约 0.2％至约 0.5％的含有 6 个或更多个碳原子的第二有机酸 ( 或其盐 )。 在多个实施方案中， 组合使用以重量计约 0.2， 0.25， 0.3， 0.35， 0.4， 0.5， 0.55， 0.6， 0.65， 0.7， 0.75， 0.8， 0.85， 0.9， 0.95 或 1 ％ 中 任 一 浓 度的第一有机酸和以重量计约 0.04， 0.05， 0.06， 0.07， 0.08， 0.09， 0.1， 0.15， 0.2， 0.25 或 0.3， 0.35， 0.4， 0.45 或 0.5％中任一浓度的第二有机酸。在一个实施方案中， 第一有机酸是 以重量计约 0.2％至约 0.5％， 或以重量计约 0.28％浓度的醋酸， 第二有机酸是以重量计约 0.04％至约 0.06％， 或约 0.044％浓度的苯甲酸。在一个实施方案中， 第一有机酸是以重量 计约 0.2％至约 0.5％， 或以重量计约 0.28％浓度的醋酸， 第二有机酸是以重量计约 0.2％ 至约 0.5％， 或约 0.22％浓度的苯甲酸。
在一些实施方案中， 方法包括使细胞接触以重量计约 0.25％至约 0.5％浓度的含 有 6 个或更多个碳原子的有机酸 ( 或其盐 )。在多个实施方案中， 使用以重量计约 0.25， 0.3， 0.35， 0.4， 0.45， 或 0.5％中任一浓度的含有 6 个或更多个碳原子的有机酸。在一个实 施方案中， 含有 6 个或更多个碳原子的有机酸是以重量计约 0.5％浓度的苯甲酸。
在一些实施方案中， 含有 1 至 5 个碳原子的有机酸是醋酸、 甲酸、 丙酸 ( 或其盐 )， 或其组合。在一个实施方案中， 含有 1 至 5 个碳原子的有机酸是醋酸。
在一些实施方案中， 含有 6 个或更多个碳原子的有机酸是苯甲酸、 环己烷羧酸、 4- 甲基戊酸、 己二酸、 3- 甲基戊二酸、 苯乙酸 ( 或其盐 )， 或其组合。在一个实施方案中， 含 有 6 个或更多个碳原子的有机酸是苯甲酸 ( 或其盐， 例如苯甲酸钠 )。在一些实施方案中， 含有 6 个或更多个碳原子的有机酸含有 6 至 8( 即 6、 7 或 8) 个碳原子。 在一些实施方案中， 含有 6 个或更多个碳原子的有机酸含有 1 或 2 个羧酸官能团。在一些实施方案中， 含有 6 个或更多个碳原子的有机酸是芳香族有机酸。在一些实施方案中， 含有 6 个或更多个碳原 子的有机酸含有 7 或 8 个碳和 1 个苯基基团。
5.3 组合物
本发明提供了由如本文描述的用于杀死细胞的方法产生的组合物。 在一些实施方 案中， 组合物是含有如本文描述的有机酸、 已杀死的细胞和 / 或细胞碎片、 和培养基的细胞 灭活的全肉汤。 在一些实施方案中， 组合物含有如本文描述的有机酸， 和任选地还含有已杀 死的细胞和 / 或细胞碎片。在一个实施方案中， 从如本文描述的细胞灭活的全肉汤中移出 已杀死的细胞和 / 或细胞碎片， 以提供不含这些成分的组合物。本发明的细胞灭活的全肉 汤或组合物通常含有由用于产生该细胞灭活的全肉汤或组合物的微生物细胞产生的至少 一种目的分子 ( 例如生物分子， 例如蛋白质， 例如酶和 / 或有机物质 )。
任选地可向细胞灭活的全肉汤或组合物中加入额外的防腐剂和 / 或抗微生物剂 ( 例如制菌剂 )， 包括但不限于山梨糖醇、 氯化钠、 山梨酸钾和本领域已知的其他防腐剂和 / 或抗微生物剂。
在一些实施方案中， 可对细胞灭活的全肉汤或组合物补充一种或多种微生物细胞 不内源表达的或以相对低的水平表达的酶活性。例如， 可加入一种或多种酶以改进纤维素 底物的降解， 例如降解为可发酵的糖例如葡萄糖或半纤维素糖 ( 例如木糖、 阿拉伯糖、 甘露 糖 )。 补充的酶可作为补充剂加入细胞灭活的全肉汤或组合物中， 且该酶可为分开的发酵肉 汤的成分， 或可为纯化的或被最低程度地回收和 / 或纯化的。补充的酶的合适的非限制性 实例包括纤维二糖水解酶、 内切葡聚糖酶、 β- 葡糖苷酶、 内切 --β-1， 3(4)- 葡聚糖酶、 葡 糖水解酶、 木葡聚糖酶、 木聚糖酶、 木糖苷酶、 阿拉伯呋喃糖苷酶、 α- 葡糖醛酸酶、 乙酰木聚 糖酯酶、 甘露聚糖酶、 甘露糖苷酶、 α- 半乳糖苷酶、 甘露聚糖乙酰酯酶、 半乳聚糖酶、 阿拉伯 聚糖酶 (arabinanase)、 果胶酸裂解酶、 果胶裂解酶、 果胶酶、 聚半乳糖醛酸酶、 果胶乙酰酯 酶、 果胶甲基酯酶、 β- 半乳糖苷酶、 半乳聚糖酶、 阿拉伯聚糖酶 (arabinanase)、 α- 阿拉伯 呋喃糖苷酶、 鼠李糖半乳糖醛酸酶、 阿魏酸 (ferrulic acid) 酯酶、 鼠李糖半乳糖醛酸聚糖 裂解酶、 鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、 木糖半乳糖醛酸糖苷酶、 木糖半乳糖醛酸酶、 鼠 李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶、 木质素过氧化物酶、 锰依赖性过氧化物酶、 具有木质素过氧化 物酶和锰依赖性过氧化物酶的组合性能的杂合过氧化物酶、 葡糖淀粉酶、 淀粉酶、 蛋白酶和 漆酶。
在一些实施方案中， 细胞灭活的全肉汤或组合物包括纤维素分解酶， 包括但不限 于： (i) 内切葡聚糖酶 (EG) 或 1， 4--d- 葡聚糖 -4- 葡聚糖水解酶 (EC 3.2.1.4)， (ii) 外 切葡聚糖酶， 包括 1， 4--d- 葡聚糖葡聚糖水解酶 ( 又称纤维糊精酶 )(EC 3.2.1.74) 和 1， 4--d- 葡聚糖纤维二糖水解酶 ( 外切纤维二糖水解酶， CBH)(EC 3.2.1.91)， 和 (iii)β- 葡糖苷酶 (BG) 或 β- 葡萄糖苷葡糖水解酶 (EC 3.2.1.21)。
在一些实施方案中， 细胞灭活的全肉汤或组合物含有一种或多种选自外切葡聚糖 酶、 内切葡聚糖酶、 半纤维素酶和 β- 葡糖苷酶的酶。在一个实施方案中， 细胞灭活的全肉 汤或组合物含有约 1000 至约 2000， 约 1500 至约 2500， 约 2200 至约 2800， 或约 2500CMC U/ g 内切葡聚糖酶活性和约 450 至约 775， 约 525 至约 775， 约 400 至约 800， 或约 650pNPG U/ gβ- 葡糖苷酶活性。可使用本领域已知的方法测定羧甲基纤维素 (CMC) 活性和对硝基苯 基 -β-D- 吡喃葡萄糖苷 (pNPG) 活性 ( 见例如 Ghose， T.K.， “Measurement of Cellulase Activities， ” Pure & Appl. Chem.59， pp.257-268， 1987 ； Chen， H.， Hayn， M.， Esterbauer， H. “Purification and characterization of two extracellular b-glucosidases from Trichoderma reesei， ” Biochimica etBiophysica Acta， 1992， 1121， 54-60)。
在一些实施方案中， 细胞灭活的全肉汤或组合物含有以重量计约 0.2％至约 1％， 约 0.2％至约 0.5％， 或约 0.28％浓度的醋酸和以重量计约 0.2％至约 0.5％， 或约 0.22％ 浓度的苯甲酸， pH 为约 3.9 至约 4.3， 约 3.5 至约 4.5， 约 4 至约 5， 约 4.5 至约 5.5， 约 4.8 至约 5.2， 或约 4。
在一些实施方案中， 细胞灭活的全肉汤或组合物含有在发酵结束时得到的发酵物 质的未分级分离的内容物。通常， 细胞灭活的全肉汤或组合物含有在将微生物细胞 ( 例如 丝状真菌细胞 ) 培养至饱和并在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成 ( 例如纤维素酶和 / 或葡糖苷酶表达 ) 后存在的用过的培养基和细胞碎片。在一些实施方案中， 细胞灭活的全 肉汤或组合物含有用过的细胞培养基、 细胞外酶和已杀死的丝状真菌细胞。在一些实施方 案中， 可使用本领域已知的方法， 透化和 / 或裂解在细胞灭活的全肉汤或组合物中存在的 微生物细胞。
本发明也提供了反应组合物， 其含有纤维素物料、 如本文描述的细胞灭活的全肉 汤或组合物、 和在培养基中的发酵微生物的混合物。 在一些实施方案中， 反应组合物基本上 不含补充的氮源。在一些实施方案中， 发酵微生物是产乙醇微生物。在一些实施方案中， 该 反应组合物与含有以重量计约 1.4％醋酸和约 0.22％苯甲酸的反应组合物相比， 其中产生 的有机物质增加至少约 50％。 在一个实施方案中， 发酵微生物是产乙醇微生物， 有机物质是 乙醇， 并且该反应组合物与含有以重量计约 1.4％醋酸和约 0.22％苯甲酸的反应组合物相 比， 乙醇的产生增加至少约 10 倍。
如本文描述的细胞灭活的全肉汤或组合物通常是液体， 但可含有不溶性成分， 例 如已杀死的细胞、 细胞碎片、 培养基成分和 / 或不溶性酶。在一些实施方案中， 可去除不溶 性成分以提供澄清的液体组合物。
5.4 水解纤维素物料的方法
本发明提供了水解纤维素物料的方法。 方法包括使纤维素物料接触从如本文描述 的杀死细胞的方法得到的细胞灭活的全肉汤或组合物， 其中所述细胞灭活的全肉汤或组合 物为足以使纤维素物料被细胞灭活的全肉汤或组合物中的一种或多种酶酶促水解的量。
纤维素底物的合适的非限制性实例包括但不限于， 生物质、 草本物质、 农业废料、 林业废料、 城镇固体废物、 废纸、 和纸浆和纸渣。在本发明中使用的纤维素底物的通常形式 包括但不限于， 树、 灌木和草、 小麦、 麦秸、 甘蔗渣、 玉米、 玉米壳、 玉米核 ( 包括来自玉米核 的纤维 )、 来自谷物例如玉米研磨 ( 包括湿磨和干磨 ) 的产品和副产品、 以及城镇固体废物、 废纸、 和庭院废物。可从 “原始生物质” ( 例如树、 灌木、 草、 水果、 花、 草本作物、 硬木和软 木 )， “非原始生物质” ( 例如农业副产品、 商业有机废物、 建筑和拆除垃圾、 城镇固体废物和 庭院废物 ) 或 “混合生物质” ( 其是原始和非原始生物质的混合物 ) 得到纤维素底物。
在一些实施方案中， 纤维素底物包括木材、 木浆、 造纸泥、 纸浆废液、 刨花板、 玉米 秆、 玉米纤维、 稻、 纸和纸浆加工废物、 木本或草本植物、 果浆、 蔬菜浆、 浮石 (pumice)、 酒糟、 草、 稻壳、 甘蔗渣、 棉花、 黄麻、 大麻、 亚麻、 竹子、 剑麻、 马尼拉麻 (abaca)、 稻草、 玉米棒、 酒 糟、 叶、 麦杆、 椰子毛、 藻类、 柳枝稷和其混合物。
纤维素底物可就此使用或可以使用本领域已知的常规方法进行预处理。 这些预处 理包括化学、 物理和生物预处理。例如， 物理预处理技术可包括但不限于各种类型的研磨、 粉碎、 汽蒸 / 蒸气爆破、 辐射和水热解 (hydrothermolysis)。 化学预处理技术可包括但不限 于， 稀酸、 碱、 有机溶剂、 氨、 二氧化硫、 二氧化碳和 pH- 控制的水热解。生物预处理技术可包 括但不限于， 使用溶木质素微生物。
5.5 在微生物中生产有机物质的方法
本发明提供了在微生物， 例如发酵微生物中生产有机物质的方法。方法包括用细 胞灭活的全肉汤或组合物 ( 如上所述 ) 生产水解的纤维素物料， 和在水解的纤维素物料存 在下在适于发酵微生物产生一种或多种目的有机物质的条件下培养发酵微生物。 在一些实 施方案中， 发酵微生物是产乙醇微生物， 该方法用于产生乙醇。在一些实施方案中， 使用预 处理的纤维素物料。
纤维素物料的水解和用于产生有机物质的发酵微生物的发酵可同时或相继进行。
在一些实施方案中， 与用含有以重量计约 1.4％的醋酸和约 0.22％的苯甲酸的组 合物水解纤维素物料并在其上培养发酵微生物的方法相比， 使用本文描述的细胞灭活的全 肉汤或组合物可以导致有机物质的产量增加至少约 50％。在一些实施方案中， 与用含有以 重量计约 1.4％的醋酸和约 0.22％的苯甲酸的组合物水解纤维素物料和在其上培养发酵 微生物的方法相比， 有机物质 ( 例如乙醇或其它有机分子 ) 的产量增加至少约 0.5， 1， 2， 3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 或 10 倍。
合适的发酵微生物能够将糖例如葡萄糖、 木糖、 半乳糖、 阿拉伯糖、 甘露糖或寡糖 发酵或转化成期望的发酵产物 ( 一种或多种 )。发酵微生物的合适的非限制性实例包括真 菌生物， 例如酵母和细菌。
在一些实施方案中， 发酵微生物是产乙醇微生物， 例如天然存在的产乙醇生物， 具 有天然存在的或诱导的突变的产乙醇生物、 或已被遗传修饰的产乙醇生物。
在一些实施方案中， 产乙醇微生物是可将葡萄糖有效发酵成乙醇的酵母细胞， 例 如 酿 酒 酵 母 (Saccharomyces cerevisiae)、 葡 萄 汁 酵 母 (S.uvarum)、 脆壁克鲁维酵 母 (Kluyveromyces fagilis)、 拟热带假丝酵母 (candida pseudotropicalis) 和管囊酵 母 (Pachysolen tannophilus)。合适的菌株包括但不限于酿酒酵母 D5A(ATCC200062)， 酿 酒 酵 母 Y567(ATCC24858)， ACA 174(ATCC 60868)， MY91(ATCC 201301)， MY138(ATCC 201302)， C5(ATCC 201298)， ET7(ATCC 201299)， LA6(ATCC201300)， OSB21(ATCC 201303)， F23( 球形酵母 (S.globosus)ATCC90920)， ACA 174(ATCC 60868)， A54(ATCC 90921)， NRCC 202036(ATCC 46534)， ATCC 24858， ATCC 24858， G 3706(ATCC 42594)， NRRL， Y-265(ATCC 60593)， Sa28(ATCC 26603) 和 ATCC 24845-ATCC 24860。在本发明中适用的其他非酿酒酵母的酵母菌株包括巴斯德毕赤酵母 (Pichia pastoris)(tozony ID 4922)， S.pastorianus SA 23( 卡 尔 酵 母 (S.carlsbergensis)ATCC 26602)， S. pastorianus( 卡 尔 酵 母 ATCC 2345)， Candida acidothermophilum( 东方伊萨酵母 (Issatchenkia orientalis)， ATCC 20381)。在一些实施方案中， 产乙醇微生物是重组酵母菌株。合适的重组酵母可含有编码 木糖还原酶、 木糖醇脱氢酶和 / 或木酮糖激酶的基因 ( 见例如 USPN 5,789,210)。
在一些实施方案中， 产乙醇微生物是细菌细胞， 例如革兰氏阴性、 兼性厌氧细菌 细胞， 例如来自肠杆菌科 (Enterobacteriaceae) 的细菌细胞。在一些实施方案中， 产乙 醇微生物来自埃希氏菌属 (Escherichia) 或克雷伯氏菌属 (Klebsiella)， 例如大肠杆菌 B， 大肠杆菌 DH5α， 大肠杆菌 KO4(ATCC 55123)， 大肠杆菌 KO11(ATCC 55124)， 大肠杆菌 KO12(ATCC55125)， 大肠杆菌 LY01， 产酸克雷伯氏菌 (K.oxytoca)M5A1， 或产酸克雷伯氏菌 P2(ATCC 55307)。在一些实施方案中， 产乙醇微生物是发酵单胞菌属 (Zymomonas) 物种， 或 来源于运动发酵单胞菌 (Zymomonas mobilis)(ATCC31821)。在一些实施方案中， 重组发酵 单胞菌菌株可含有例如编码木糖异构酶、 木酮糖激酶、 转醛醇酶和转酮醇酶的基因。
尽管将纤维素物料水解成葡萄糖和其他小糖是重要的步骤， 但同时糖化和发酵 (SSF) 依赖于产乙醇微生物的活培养物将这些糖转化为乙醇。
通常将发酵微生物加至水解产物， 允许发酵进行 12-96 小时， 例如 30-80 小时。温 度通常是 26-40℃， 例如约 32℃， pH 通常是 3-6。
发酵后， 可以通过本领域已知的任何方法， 回收目的有机物质。 这些方法包括但不 限于蒸馏、 提取、 层析、 电泳程序和差异溶解度。例如， 在乙醇发酵中， 可通过常规蒸馏方法 分离和纯化乙醇。根据本发明的方法得到的乙醇可用作燃料乙醇、 饮用乙醇或作为工业乙 醇。
虽然不受理论的约束， 但相信， 未澄清的、 细胞灭活的全肉汤可以为产乙醇微生物 提供剩余的营养物。这可导致更快的乙醇发酵和改进乙醇产率。除了糖化的纤维素以外可 以不需要向产乙醇微生物提供营养培养基或可以减少补充营养物的量的能力， 导致用于乙 醇发酵工艺的原材料成本的降低。
在一些实施方案中， 在发酵微生物中生产有机物质的方法中使用如本文描述的细 胞灭活的全肉汤或组合物， 可减少用于发酵微生物的补充氮源的量和 / 或类型。在一些实 施方案中， 本发明的方法和组合物可降低用于发酵微生物生长所需的酵母提取物、 蛋白胨 和 / 或尿素的量。
在一些实施方案中， 如本文描述的用于在发酵微生物中生产有机物质的方法缺乏 或基本上不含用于发酵微生物的补充氮源和 / 或营养源。在一些实施方案中， 方法和组合 物缺乏或基本上不含酵母提取物、 蛋白胨和 / 或尿素。本领域技术人员理解， 本发明的方法 和组合物可以无或基本上不含补充氮源， 但是痕量的氮源和 / 或营养源可作为杂质存在或 以不实质性增加全发酵肉汤的营养值的量加入发酵微生物。
在一个实施方案中， 本发明提供了通过同时糖化和发酵产生有机物质的方法。方 法包括在缺乏补充氮源的情况下组合纤维素物料 ( 例如预处理的纤维素物料 )、 如本文描 述的含有一种或多种能够水解所述纤维素物料的酶 ( 例如外切葡聚糖酶、 内切葡聚糖酶、 半纤维素酶和 / 或 β- 葡糖苷酶 ) 的细胞灭活的全肉汤或组合物、 和发酵微生物。在有助 于纤维素水解成葡萄糖和 / 或半纤维素糖 ( 例如木糖、 阿拉伯糖和 / 或甘露糖 ) 和有助于葡萄糖和 / 或半纤维素糖转化为有机物质的条件下孵育纤维素物料、 细胞灭活的全肉汤或 组合物、 和发酵微生物。在一些实施方案中， 和使用含有以重量计约 1.4％醋酸和约 0.22％ 苯甲酸的细胞灭活的全肉汤或组合物的方法相比， 有机物质的产量增加至少约 50％。在一 个实施方案中， 发酵微生物是产乙醇微生物， 有机物质是乙醇， 并且和使用含有以重量计约 1.4％醋酸和约 0.22％苯甲酸的细胞灭活的全肉汤或组合物的方法相比， 乙醇的产量增加 至少约 10 倍。在一个实施方案中， 使用含有约 1000 至约 2000， 约 1500 至约 2500， 约 2200 至约 2800， 或约 2500CMC U/g 内切葡聚糖酶活性和约 450 至约 775， 约 525 至约 775， 约 400 至约 800， 或约 650pNPG U/g β- 葡糖苷酶活性、 以重量计约 0.2 ％至约 1 ％， 约 0.2 ％至 约 0.5％， 或约 0.28％的醋酸、 以重量计约 0.2％至约 0.5％， 或约 0.22％的苯甲酸 ( 或约 0.26％苯甲酸钠 )、 pH 为约 3.9 至约 4.3， 约 3.5 至约 4.5， 约 4 至约 5， 约 4.5 至约 5.5， 约 4.8 至约 4.2， 或约 4 的细胞灭活的全肉汤。
5.6 试剂盒
本发明也提供试剂盒。 本发明的试剂盒包含含有如本文描述的有机酸组合的细胞 灭活的全肉汤或组合物。提供了合适的包装。如本文使用的， “包装” 是指， 通常系统使用的 并能够将如本文描述的试剂盒组分容纳在固定边界内的固体基质、 材料或容器。
试剂盒也可含有使用细胞灭活的全肉汤或组合物的说明书。例如， 可提供在水解 纤维素底物的方法中使用细胞灭活的全肉汤或组合物的说明书、 或在如本文描述的在发酵 微生物中生产有机物质的方法中使用的说明书。 可以以印刷的形式或以电子介质的形式例 如软盘、 CD 或 DVD， 或以可得到该说明书的网站地址的形式， 提供说明书。
5.7 具体实施方案
在一个方面， 本发明提供了杀死发酵培养物中的细胞的方法。方法包括使在培养 基中含有细胞的发酵培养物接触含有 1 至 5 个碳原子的第一有机酸或其盐和含有 6 个或 更多个碳原子的第二有机酸或其盐。在一个实施方案中， 第一有机酸的浓度是以重量计约 0.2％至约 1％， 第二有机酸的浓度是以重量计约 0.04％至约 0.3％。 在一个实施方案中， 第 一有机酸的浓度是以重量计约 0.2％至约 0.5％， 第二有机酸的浓度是以重量计约 0.2％至 约 0.5％。 以足以实现基本上完全的细胞杀死的温度和 pH 和时间， 进行该方法， 由此产生细 胞灭活的全肉汤。在一些实施方案中， 时间是约 8 至约 24 小时， 温度是约 30℃至约 40℃， pH 是约 3.5 至约 4.5， 约 3.9 至约 4.2， 或约 4 至约 4.4。在一个实施方案中， 时间是约 24 小时， 温度是约 40℃， pH 是约 4。基本上完全的细胞杀死通常涉及至少约 4log， 5log， 6log， 7log， 或 8log 的活细胞减少。
在杀死细胞的方法的一些实施方案中， 细胞是微生物细胞 ( 即真菌或细菌 )。 在一 些实施方案中， 细胞是真菌细胞， 例如丝状真菌细胞。在一些实施方案中， 细胞是丝状真菌 细胞， 可以选自木霉属、 曲霉属、 青霉属、 腐质霉属、 金孢霉属和脉孢霉属。
在杀死细胞的方法的一些实施方案中， 第一有机酸选自醋酸、 甲酸或丙酸。 在一个 实施方案中， 第一有机酸是醋酸。 在一些实施方案中， 第二有机酸选自苯甲酸、 环己烷羧酸、 4- 甲基戊酸和苯乙酸。 在一个实施方案中， 第二有机酸是苯甲酸。 在一些实施方案中， 使用 有机酸的盐， 例如苯甲酸钠。 在一个实施方案中， 第一有机酸是以重量计约 0.28％浓度的醋 酸， 第二有机酸是以重量计约 0.044％浓度的苯甲酸 ( 或以重量计约 0.052％浓度的苯甲酸 钠 )。在一个实施方案中， 第一有机酸是以重量计约 0.28％浓度的醋酸， 第二有机酸是以重量计约 0.22％浓度的苯甲酸 ( 或以重量计约 0.26％浓度的苯甲酸钠 )。
在杀死细胞的方法的一些实施方案中， 细胞分泌至少一种目的酶至细胞外的培养 基中。在一些实施方案中， 目的酶是重组表达的。在一些实施方案中， 细胞分泌至少一种选 自外切葡聚糖酶、 内切葡聚糖酶、 半纤维素酶和 β- 葡糖苷酶的目的酶。
在另一个方面， 本发明提供了通过本文描述的任何杀死细胞的方法产生的细胞灭 活的全肉汤。在一个实施方案中， 细胞灭活的全肉汤含有一种或多种在杀死细胞前由细胞 分泌至细胞外培养基中的酶。在一些实施方案中， 细胞灭活的全肉汤含有在细胞外培养基 中的至少一种选自外切葡聚糖酶、 内切葡聚糖酶、 半纤维素酶和 β- 葡糖苷酶的酶。在一 些实施方案中， 细胞灭活的全肉汤含有约 1000 至约 2000， 约 1500 至约 2500， 约 2200 至约 2800， 或约 2500CMC U/g 内切葡聚糖酶活性和约 450 至约 775， 约 525 至约 775， 约 400 至约 800， 或约 650pNPG U/g β- 葡糖苷酶活性。在一个实施方案中， 组合物含有约 2200 至约 2800CMC U/g 内切葡聚糖酶活性和约 450 至约 775pNPG U/g β- 葡糖苷酶活性、 和约 3.9 至 约 4.3 的 pH。
在一些实施方案中， 与使用含有以重量计约 1.4％醋酸和约 0.22％苯甲酸的细胞 灭活的全肉汤的方法相比， 由发酵微生物产生的有机物质增加至少约 50％。在一个实施方 案中， 发酵微生物是产乙醇微生物。在一个实施方案中， 与使用含有以重量计约 1.4％醋酸 和约 0.22％苯甲酸的细胞灭活的全肉汤的方法相比， 由发酵产乙醇生物产生的乙醇增加至 少约 10 倍。 在另一个方面， 本发明提供了包含含有 1 至 5 个碳原子的第一有机酸或其盐和含 有 6 个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐、 和目的酶的组合物。在一些实施方案中， 组 合物也含有已杀死的细胞和培养基， 其中细胞在接触第一和第二有机酸之前在该培养基中 生长并产生目的酶。在一个实施方案中， 第一有机酸以约 0.2％至约 1％重量的浓度存在于 组合物中， 第二有机酸以约 0.04％至约 0.3％重量的浓度存在。在一个实施方案中， 第一有 机酸以约 0.2％至约 0.5％重量的浓度存在于组合物中， 第二有机酸以约 0.2％至约 0.5％ 重量的浓度存在。在一些实施方案中， 第一有机酸选自醋酸、 甲酸或丙酸。在一个实施方案 中， 第一有机酸是醋酸。在一些实施方案中， 第二有机酸选自苯甲酸、 环己烷羧酸、 4- 甲基 戊酸和苯乙酸。在一个实施方案中， 第二有机酸是苯甲酸。在一些实施方案中， 使用有机酸 的盐， 例如苯甲酸钠。在一个实施方案中， 第一有机酸是以重量计约 0.28％浓度的醋酸， 第 二有机酸是以重量计约 0.044％浓度的苯甲酸 ( 或以重量计约 0.052％浓度的苯甲酸钠 )。 在一个实施方案中， 第一有机酸是以重量计约 0.28％浓度的醋酸， 第二有机酸是以重量计 约 0.22％浓度的苯甲酸 ( 或以重量计约 0.26％浓度的苯甲酸钠 )。在一些实施方案中， 组 合物含有一种或多种选自外切葡聚糖酶、 内切葡聚糖酶、 半纤维素酶和 β- 葡糖苷酶的酶。 在一个实施方案中， 组合物含有约 1000 至约 2000， 约 1500 至约 2500， 约 2200 至约 2800， 或 约 2500CMC U/g 内切葡聚糖酶活性和约 450 至约 775， 约 525 至约 775， 约 400 至约 800， 或 约 650pNPG U/g β- 葡糖苷酶活性。在一些实施方案中， pH 是约 3.9 至约 4.3， 约 3.5 至约 4.5， 约 4 至约 5， 约 4.5 至约 5.5， 约 4.8 至约 5.2， 或约 4。在一个实施方案中， 组合物含有 约 2200 至约 2800CMC U/g 内切葡聚糖酶活性和约 450 至约 775pNPG U/g β- 葡糖苷酶活 性。以及约 3.9 至约 4.3 的 pH。
在另一个方面， 本发明提供了水解纤维素物料的方法， 包括使纤维素物料接触通
过如本文描述的杀死细胞的方法产生的细胞灭活的全肉汤、 或接触包含含有 1 至 5 个碳原 子的第一有机酸或其盐、 含有 6 个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐、 和至少一种目的 酶的如本文描述的组合物， 其中细胞灭活的全肉汤或组合物为有效地引起纤维素物料被细 胞灭活的全肉汤或组合物中的一种或多种酶酶促水解的量。在一些实施方案中， 使用的组 合物还包括培养基和已杀死的细胞， 其中细胞在接触第一和第二有机酸之前在该培养基中 生长并产生目的酶。在一些实施方案中， 纤维素物料是植物生物质物质。在一个实施方案 中， 纤维素物料是木质素纤维素物质。 在一些实施方案中， 预处理纤维素物料以增强酶促水 解。 本发明也提供 ： 用通过如本文描述的杀死细胞的方法产生的细胞灭活的全肉汤、 或用如 本文描述的包含含有 1 至 5 个碳原子的第一有机酸或其盐、 含有 6 个或更多个碳原子的第 二有机酸或其盐、 至少一种目的酶和任选地发酵培养基及已杀死的细胞的组合物进行水解 而产生的、 水解的纤维素物料。
在另一个方面， 本发明提供了产生有机物质的方法。方法包括将生产有机物质的 微生物在培养基中在水解的纤维素物料存在的情况下在适于该微生物产生所述有机物质 的条件下进行发酵， 其中所述水解的纤维素物料通过用由如本文描述的杀死细胞的方法产 生的细胞灭活的全肉汤、 或用如本文描述的包含含有 1 至 5 个碳原子的第一有机酸或其盐、 含有 6 个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐、 至少一种目的酶和任选地发酵培养基及已 杀死的细胞的组合物进行水解而产生。 在一个实施方案中， 微生物是产乙醇微生物， 有机物 质是乙醇。在一个实施方案中， 和用下述细胞灭活的全肉汤或组合物水解纤维素物料的方 法相比， 在培养基中的有机物质的浓度增加至少约 50％， 其中所述细胞灭活的全肉汤或组 合物， 除了含有以重量计约 1.4％的醋酸和约 0.22％的苯甲酸外， 与在本方法中使用的细 胞灭活的全肉汤或组合物相比含有类似、 基本上相同或完全相同的成分。在一个实施方案 中， 和使用含有以重量计约 1.4％的醋酸和约 0.22％的苯甲酸的细胞灭活的全肉汤或组合 物的方法相比， 由发酵产乙醇生物产生的乙醇增加至少约 10 倍。
在一些实施方案中， 纤维素物料的酶促水解和微生物的发酵同时进行。在其他实 施方案中， 纤维素物料的酶促水解在微生物发酵之前发生。
在另一个方面， 本发明提供了通过同时糖化发酵产生有机物质的方法。方法包括 (a) 在缺乏补充氮源的情况下组合纤维素底物、 通过如本文描述的杀死细胞的方法产生的 细胞灭活的全肉汤或如本文描述的包含含有 1 至 5 个碳原子的第一有机酸或其盐、 含有 6 个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐、 至少一种目的酶和任选地发酵培养基及已杀死的 细胞的组合物、 和发酵微生物 ； 在有助于纤维素水解成葡萄糖和 / 或半纤维素糖 ( 例如木 糖、 阿拉伯糖和 / 或甘露糖 ) 和有助于葡萄糖和 / 或半纤维素转化成有机物质的条件下在 培养基中孵育纤维素底物、 细胞灭活的全发酵肉汤或组合物、 和发酵微生物， 其中和用下述 细胞灭活的全肉汤或组合物水解纤维素物料的方法相比， 在培养基中的有机物质的浓度增 加至少约 50％， 所述细胞灭活的全肉汤或组合物， 与在本方法中使用的细胞灭活的全肉汤 或组合物相比， 除了含有以重量计约 1.4％的醋酸和约 0.22％的苯甲酸外， 含有类似、 基本 上相同或完全相同的成分。 在一个实施方案中， 发酵微生物是产乙醇微生物， 有机物质是乙 醇。在一个实施方案中， 和使用含有以重量计约 1.4％的醋酸和约 0.22％的苯甲酸的细胞 灭活的全肉汤或组合物的方法相比， 由发酵产乙醇生物产生的乙醇增加至少约 10 倍。
在另一个方面， 本发明提供了用于产生有机物质的反应组合物。反应组合物含有纤维素底物、 通过如本文描述的杀死细胞的方法产生的细胞灭活的全肉汤或如本文描述的 包含含有 1 至 5 个碳原子的第一有机酸或其盐、 含有 6 个或更多个碳原子的第二有机酸或 其盐、 至少一种目的酶和任选地发酵培养基和已杀死的细胞的组合物、 和在培养基中的发 酵微生物的混合物。反应组合物基本上不含补充氮源， 并且和用下述细胞灭活的全肉汤或 组合物水解纤维素物料的方法相比， 在培养基中的有机物质的浓度增加至少约 50％， 其中， 所述细胞灭活的全肉汤或组合物， 除了含有以重量计约 1.4％的醋酸和约 0.22％的苯甲酸 外， 与在本方法中使用的细胞灭活的全肉汤或组合物相比含有类似、 基本上相同或完全相 同的成分。在一个实施方案中， 发酵微生物是产乙醇微生物， 有机物质是乙醇。在一个实施 方案中， 和含有以重量计约 1.4％的醋酸和约 0.22％的苯甲酸的细胞灭活的全肉汤或组合 物的反应组合物相比， 由发酵产乙醇生物产生的乙醇增加至少约 10 倍。
在另一个方面， 本发明提供了试剂盒， 其包含在包装中的通过如本文描述的杀死 细胞的方法产生的细胞灭活的全肉汤或如本文描述的包含含有 1 至 5 个碳原子的第一有机 酸或其盐、 含有 6 个或更多个碳原子的第二有机酸或其盐、 至少一种目的酶和任选地发酵 培养基和已杀死的细胞的组合物。在一些实施方案中， 试剂盒还包含在用发酵微生物制备 有机物质的方法中使用的说明书， 例如在用产乙醇微生物和以试剂盒中的细胞灭活的全肉 汤或组合物水解的纤维素底物制备乙醇的方法中使用的说明书。
以下实施例旨在举例说明本发明， 而非限制本发明。
6. 实施例
实施例 1
杀死细胞的条件
真菌细胞计数的确定
用无菌水连续稀释等分试样的里氏木霉 150 小时发酵物至 103 的稀释系数。然后 将 100μl 稀释物样品在购自 DifcoTM(REF#213200) 的马铃薯葡萄糖琼脂 (PDA) 上涂板并在 25℃孵育。然后在孵育 3 天后计数孵育的 PDA 板上的菌落形成单位 (CFU)。通过琼脂上存 在的分开的生长的单细胞群来表征 CFU， 在琼脂上存在的 CFU 的数乘以涂板的稀释度就是 在原始样品中存在的 CFU 数。
将黑曲霉和绳状青霉的分开的孢子悬浮物在购自 DifcoTM(REF#213200) 的 PDA 上 涂板并在 25℃孵育 3 天。然后在无菌情况下将含有黑曲霉和绳状青霉菌落的 PDA 的部分 分别地移出， 并分别置于含有由 5g/L 酵母提取物和 20g/L 葡萄糖组成的酵母提取物葡萄糖 (YEG) 培养基的分开摇瓶中。 然后在设定为 200rpm 和 33℃的旋转摇床上孵育摇瓶 3 天。 移 4 出生长培养物样品并用无菌水连续稀释至 10 的稀释系数。然后将 100μl 稀释物样品在 PDA 上涂板并在 25℃孵育。然后计数孵育的 PDA 板上的 CFU。在不同温度下用醋酸和苯甲 酸钠杀死里氏木霉细胞
将里氏木霉发酵肉汤分成 5 份等分试样并如下表 1 所述配制。然后使用 10％ (w/ w) 硫酸将配制的肉汤调整为 pH 4.0。然后将每份制剂再分成 3 份等分试样， 一份等分试样 在 10℃孵育， 另一份等分试样在 25℃孵育， 第三份等分试样在 40℃孵育。 孵育 24 小时后使 用 10％ (w/w) 氢氧化钠将所有等分试样调整为 pH4.8。然后用无菌水将每份等分试样连续 稀释， 在 PDA 上涂板并在 25℃孵育。然后计数孵育的 PDA 板上的 CFU。
表1里氏木霉发酵肉汤的配制描述制剂 11.2g/L 醋酸， 2.06g/L 苯甲酸钠 8.4g/L 醋酸， 1.55g/L 苯甲酸钠 5.6g/L 醋酸， 1.03g/L 苯甲酸钠 2.8g/L 醋酸， 0.52g/L 苯甲酸钠 20g/L 醋酸所有制剂在 40℃的温度下达到完全的细胞杀死。 可在较低的温度下实现里氏木霉 细胞杀死但需要较高浓度的有机酸。图 1 中的图说明了温度和制剂化学浓度对里氏木霉细 胞杀死的影响。苯甲酸钠的影响
向分开的里氏木霉等分试样加入苯甲酸钠至 2.5g/L 苯甲酸钠或 5g/L 苯甲酸钠的 终浓度。然后将等分试样调整为 pH4 并在 40℃孵育 24 小时。孵育 24 小时后使用 10％ (w/ w) 氢氧化钠将所有等分试样调整为 pH4.8。 然后用无菌水将每份等分试样连续稀释， 在 PDA 上涂板并在 25℃孵育。然后计数孵育的 PDA 板的 CFU。结果在图 2 中显示。
配制为 2.5g/L 苯甲酸钠， pH4 的里氏木霉在 40℃孵育 24 小时后发生了 5log 的活 细胞减少， 而具有 5g/L 苯甲酸钠， pH4 的里氏木霉制剂在 40℃孵育 24 小时后经历了 7log 的活细胞减少且存在低于 10 的 CFU。
对黑曲霉和绳状青霉培养物应用细胞杀死条件
对里氏木霉、 黑曲霉和绳状青霉生长培养物的分开等分试样加入醋酸和苯甲酸钠 分别至 2.8g/L 和 2.6g/L 的终浓度。然后将等分试样调整为 pH4 并在 40℃孵育 24 小时。 孵育 24 小时后使用 10％ (w/w) 氢氧化钠将所有等分试样调整为 pH4.8。然后用无菌水将 每份等分试样连续稀释， 在 PDA 上涂板并在 25℃孵育。然后计数孵育的 PDA 板的 CFU。结 果在图 3 中显示。
在暴露于细胞杀死条件 24 小时后， 自里氏木霉、 黑曲霉和绳状青霉， 无活细胞存 在。
使用具有 6 个或更多个碳的有机酸杀死细胞
将分开的未经配制的里氏木霉发酵肉汤等分试样再分成 10 份等分试样并如下表 2 所述用具有 6 个或更多个碳的有机酸配制。有机酸的化学结构和 pKa 在图 4 中显示。
表2
使用具有 6 个或更多个碳原子的有机酸配制里氏木霉发酵肉汤
25102325872 A CN 102325885说里氏木霉等分试样 # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11明书21/23 页制剂组合物 5g/L 环己烷羧酸 15g/L 环己烷羧酸 5g/L L- 抗坏血酸 15g/L L- 抗坏血酸 5g/L 己二酸 (pH 5) 15g/L 己二酸 (pH 5) 5g/L 4- 甲基戊酸 15g/L 4- 甲基戊酸 5g/L 3- 甲基戊二酸 15g/L 3- 甲基戊二酸 5g/L 苯乙酸然后用 10％ (w/w) 硫酸将配制的培养物调整为 pH4.0。 然后在 40℃孵育配制的培 养物。孵育 2 和 4 小时后， 测量配制的培养物的 pH 并用 10％ (w/w) 硫酸调整为 4.0 并返回 40℃孵育。孵育 24 小时后移出配制的培养物， 然后将 100μl 配制的培养物以 100， 101， 102 和 103 的稀释度在 PDA 上涂板并在 25℃孵育。然后计数孵育的 PDA 板的 CFU。结果在图 5 中显示。
实施例 2
细胞灭活的全肉汤对在微生物中生产有机物质的影响
从分泌外切葡聚糖酶、 内切葡聚糖酶、 半纤维素酶和 β- 葡糖苷酶至细胞外培养 基的里氏木霉细胞的发酵培养物， 制备细胞灭活的全肉汤。如实施例 1 中描述的， 发酵培 养物用以重量计 0.28％的醋酸和 0.052％的苯甲酸钠在 pH4 和 40℃处理 24 小时 (“肉汤 A” )， 或用以重量计 1.4％醋酸、 0.26％苯甲酸钠和 0.5％山梨酸钾在 pH4 和 10℃处理 24 小 时 (“肉汤 B” )。调查了这两种肉汤对微生物发酵生产有机物质的影响。使用肉汤水解纤 维素底物以产生用作微生物生长碳源的葡聚糖水解物。 评估了在该葡聚糖水解物上生长的 微生物的有机物质生产。
产生水解物
从国家再生能源实验室 (NREL) 得到预处理的甘蔗渣。NREL 用稀硫酸和增加的温 度预处理了甘蔗渣 (Schell 等人 (2004)Bioresource Technology 91， 179-188)。 然后用去 离子水洗涤经酸预处理的甘蔗渣， 直到 pH 大于 4.2， 然后通过真空过滤去除残余的水。 然后 在 121℃高压灭菌洗过的酸预处理的甘蔗渣 (wAPB)20 分钟， 以从 wAPB 底物中去除任何微生
物污染物。然后按照每克底物葡聚糖使用 80mg 蛋白质剂量的肉汤 A 或肉汤 B， 从高压灭菌 的 wAPB 产生 13％ (w/w) 葡聚糖水解物。 在下述糖化条件下产生每种水解物， 所述糖化条件 为： 在设定为 200rpm 的旋转摇床中在 50℃孵育 5 天。然后遵照在下面 HPLC 测定章节中概 述的程序， 分析每种水解物中的葡萄糖浓度。在糖化 wAPB 后， 将每种水解物分至 3 个烧瓶， 并用无菌过滤的 50mM 柠檬酸钠缓冲液 (pH 4.8) 稀释以产生 1％ (w/w) 葡聚糖、 7％ (w/w) 葡聚糖、 和 13％ (w/w) 葡聚糖水解物混合物。
鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus) 培养物的制备
从 美 国 典 型 培 养 物 保 藏 中 心 (ATCC) 得 到 冻 干 的 鼠 李 糖 乳 杆 菌 (ATCC7469)， 并用无菌水再水化。然后将再水化的鼠李糖乳杆菌在购自 DifcoTM 的乳杆菌 MRS 琼脂 (REF#288210) 上涂板并在 37℃孵育 2 天以得到鼠李糖乳杆菌菌落。然后将鼠李糖乳杆菌 菌落无菌地加入含有购自 DifcoTM 的乳杆菌 MRS 液体培养基 (REF#288130) 的摇瓶中。然后 在设定为 33℃和 150rpm 的旋转摇床中孵育鼠李糖乳杆菌摇瓶 1 天以得到生长培养物。鼠 李糖乳杆菌水解物发酵
以 3％ (v/w) 浓度接种鼠李糖乳杆菌生长培养物至分开的具有用肉汤 A 和 B 产生 的 wAPB(7％ (w/w) 葡聚糖 ) 的水解物烧瓶中。在设定为 37℃和 150rpm 的旋转摇床中在厌 氧条件下发酵接种了鼠李糖乳杆菌的烧瓶 5 天。 在孵育 1、 2、 3 和 5 天后对发酵混合物取样， 并遵照在下面 HPLC 测定章节中概述的程序， 分析乳酸和葡萄糖浓度。结果在图 6 中显示。 Thermosacc 酵母同时糖化发酵 (SSF)
以每克底物葡聚糖 80mg 蛋白质的浓度， 将洗过的酸预处理甘蔗渣、 50mM 柠檬酸钠 缓冲液 (pH 4.8) 和肉汤 A 或 B 加入分开的烧瓶中。然后在每个烧瓶中接种 1％ (v/w) 再水 化的 Thermosacc 酵母， 然后接种 1％ (v/w) 酵母营养物 ( 由 10％ (w/w) 酵母提取物， 10％ (w/w) 蛋白胨和 1％ (w/w) 葡萄糖组成 )。然后在设定为 38℃和 150rpm 的旋转摇床中孵育 每个烧瓶。在孵育 2、 3、 4 和 5 天后对发酵混合物取样， 并遵照在下面 HPLC 测定章节中概述 的程序， 分析乙醇和葡萄糖浓度。结果在图 7 和 8 中显示。
HPLC 测定
在 5mM 硫酸中 10 倍稀释所有用于 HPLC 分析的样品， 并在注射至 HPLC 以前过滤通 过 0.2μm 滤器。使用 BioRad Aminex HPX-87H 离子排阻柱 (300mm x 7.8mm) 进行 HPLC 分 析。
结果
肉汤 A 和 B 产生的水解物都产生了超过 130g/L 的葡萄糖， 分别具有 90.4 ％和 92.6％的葡萄糖转化百分比。在任一水解物中都未检测到乳酸。
随着 wAPB 的葡聚糖载荷 (loading) 的降低， 从鼠李糖乳杆菌产生的乳酸浓度增 加， 这提示了来自底物的强抑制作用。在 13％葡聚糖载荷的由肉汤 A 和 B 产生的 wAPB 水解 物， 产生的乳酸水平彼此没有显著差异。在自肉汤 A 产生的 7％葡聚糖载荷的 wAPB 上鼠李 糖乳杆菌产生的乳酸， 比自肉汤 B 产生的水解物得到的乳酸产量， 高 1.5 倍。图 6 中的图比 较了在自肉汤 A 和 B 产生的 wAPB 水解物上鼠李糖乳杆菌产生的乳酸。
与自肉汤 B 产生的水解物相比， 在肉汤 A 产生的 13 ％葡聚糖的 wAPB 水解物上 Thermosacc 酵母产生的乙醇高 12.5 倍 ( 图 7)。图 7 中的图比较了在肉汤 A 和 B 产生的 13％葡聚糖 wAPB 水解物上 Thermosacc 酵母产生的乙醇。在 5 天的 Thermosacc 酵母发酵
后， 与肉汤 A 产生的水解物相比， 来自肉汤 B 产生的水解物的残余葡萄糖蓄积大 4 倍。图 8 中的图比较了在 Thermosacc 酵母发酵自肉汤 A 和 B 产生的水解物期间葡萄糖的蓄积量。
尽管为了清楚理解的目的已通过举例说明和实施例的方式一定详细地描述了前 述发明， 但对本领域技术人员显而易见的是， 可以实施某些变化和修改而不背离本发明的 精神和范围。因此， 不应将说明书理解为限制本发明的范围。
为了所有的目的， 所有在此引用的出版物、 专利和专利申请以其整体引入作为参 考， 其引入程度就如同特异地且单独地指出将每一出版物、 专利或专利申请引入作为参考 一样。