发酵肉汤制剂.pdf

1、10申请公布号CN102325872A43申请公布日20120118CN102325872ACN102325872A21申请号201080008621422申请日2010021961/154,23520090220US61/185,86520090610US61/304,21920100212USC12N1/00200601C12N9/42200601C12P7/10200601C12P7/56200601C12P21/02200601A01N37/02200601A01N37/08200601A01N37/1020060171申请人丹尼斯科美国公司地址美国加利福尼亚州72发明人TT黄A凯利J

2、麦克劳克林74专利代理机构北京市中咨律师事务所11247代理人黄革生林柏楠54发明名称发酵肉汤制剂57摘要本发明涉及含有有机酸和/或有机酸盐的发酵肉汤制剂、和制备和使用所述制剂的方法。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2011082286PCT申请的申请数据PCT/US2010/0247682010021987PCT申请的公布数据WO2010/096673EN2010082651INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书4页说明书23页附图4页CN102325885A1/4页21一种制备发酵肉汤制剂的方法，其包括孵育第一混合物，所述第一混合物包含A一种或多种发

3、酵肉汤，B以重量计所述混合物的01至15的量的第一有机酸成分，其包含至少一种15碳有机酸和/或其盐，和C以重量计所述混合物的0025至5的量的第二有机酸成分，其包含至少一种6碳或更多碳有机酸和/或其盐，其中孵育时间和条件导致所述一种或多种发酵肉汤中至少4LOG的活细胞减少，由此产生发酵肉汤制剂。2权利要求1的方法，其中所述第一有机酸成分为以重量计所述第一混合物的02至1，02至05，01至10，025至5，或03至3的量。3权利要求1或权利要求2的方法，其中所述第二有机酸成分为以重量计所述第一混合物的004至3，02至05，01至1，025至5，或03至3的量。4权利要求1至3中任一项的方法，

4、其中所述时间是8小时至36小时。5权利要求2的方法，其中所述时间是20小时至28小时。6权利要求1至5中任一项的方法，其中所述条件包括20至50的温度。7权利要求6的方法，其中所述条件包括25至40的温度。8权利要求7的方法，其中所述条件包括28至33的温度。9权利要求1至8中任一项的方法，其中所述条件包括35至5的PH。10权利要求9的方法，其中所述条件包括4至47的PH。11权利要求10的方法，其中所述条件包括42至45的PH。12权利要求1至11中任一项的方法，其中，以导致所述一种或多种发酵肉汤中活细胞数量的至少5LOG减少、6LOG减少、7LOG减少或8LOG减少的时间和条件，进行所述

5、孵育。13权利要求1至12中任一项的方法，其中所述活细胞的减少，与接受所述条件的第二混合物相比，高至少05倍，至少1倍，至少2倍，至少5倍或至少10倍，其中所述第二混合物只包含所述第一有机酸成分和所述第二有机酸成分中的一种，其量达到在所述第一混合物中的第一和第二有机酸成分的总重量百分比。14权利要求1至13中任一项的方法，其中所述细胞是真菌细胞。15权利要求14的方法，其中所述真菌细胞是丝状真菌细胞。16权利要求15的方法，其中所述丝状真菌细胞来自木霉属、曲霉属、青霉属、腐质霉属、金孢霉属或脉孢霉属。17权利要求1至16中任一项的方法，其中第一有机酸成分包含下述或由下述组成醋酸、醋酸盐、甲酸、

6、甲酸盐、丙酸、丙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。18权利要求17的方法，其中第一有机酸成分包含醋酸和/或其盐，或由醋酸和/或其盐组成。19权利要求1至18中任一项的方法，其中第二有机酸成分包含下述或由下述组成苯甲酸、苯甲酸盐、环己烷羧酸、环己烷羧酸盐、4甲基戊酸、4甲基戊酸盐、苯乙酸、苯乙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。20权利要求19的方法，其中第二有机酸成分包含苯甲酸和/或其盐，或由苯甲酸和/或其盐组成。权利要求书CN102325872ACN102325885A2/4页321权利要求1至20中任一项的方法，其中所述第一有机酸成分包含所述15碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐，和/或其中所述第二

7、有机酸成分包含所述6碳或更多碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐。22权利要求1至16中任一项的方法，其中所述第一有机酸成分包含以重量计0204浓度的醋酸和第二有机酸成分包含以重量计0204浓度的苯甲酸钠。23权利要求22的方法，其中所述时间是24小时，所述条件包括40的温度，和4至46的PH。24权利要求1至23中任一项的方法，其中所述一种或多种发酵肉汤中的至少一种含有由所述细胞分泌的一种或多种蛋白质。25权利要求24的方法，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种由所述细胞重组表达。26权利要求24或权利要求25的方法，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种是酶。27权利要求26的方法，其中所述酶是外切葡

8、聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或葡糖苷酶。28权利要求26的方法，其中所述一种或多种发酵肉汤中的至少一种含有由细胞重组表达和分泌的多种酶。29权利要求28的方法，其中所述多种酶各自是外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或葡糖苷酶。30权利要求1至29中任一项的方法，其中所述条件导致发酵肉汤制剂具有所述一种或多种发酵肉汤的酶活性的至少75，至少80，至少85，至少90，至少95或至少98。31权利要求1至30中任一项的方法，其中蛋白质占所述第一混合物的5至15重量百分比。32权利要求1至31中任一项的方法，还包括在所述孵育期中对所述第一混合物加入PH调节剂的步骤。33权利要求32的方法，其中

9、所述PH调节剂是磷酸。34权利要求32的方法，其中所述PH调节剂是硫酸。35权利要求32的方法，其中所述PH调节剂是氢氧化钠。36权利要求1至35中任一项的方法，其中所述第一混合物还包含一种或多种抗微生物剂。37权利要求36的方法，其中所述一种或多种抗微生物剂是以重量计所述第一混合物的00005至005的量。38权利要求37的方法，其中所述一种或多种抗微生物剂是以重量计所述第一混合物的0001至0025的量。39权利要求37或权利要求38的方法，其中抗微生物剂包含含有异酸、四异酸和/或酸的啤酒花提取物。40权利要求1至39中任一项的方法，还包括在所述孵育步骤之前制备所述第一混合物。权利要求书C

10、N102325872ACN102325885A3/4页441权利要求40的方法，其中通过如下程序制备所述第一混合物，所述程序包括组合一种或多种发酵肉汤和至少一种15碳有机酸和/或其盐，至少一种6碳或更多碳有机酸和/或其盐、和任选地一种或多种其他试剂。42权利要求41的方法，其中所述一种或多种其他试剂包括PH调节剂和/或抗微生物剂。43通过权利要求1至42中任一项的方法得到的或可通过权利要求1至42中任一项的方法得到的发酵肉汤制剂。44权利要求43的发酵肉汤制剂，其包含一种或多种选自外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶和葡糖苷酶的细胞外酶。45权利要求43或权利要求44的发酵肉汤制剂，其具有2

11、200至2800CMCU/G的内切葡聚糖酶活性和525至775PNPGU/G的葡糖苷酶活性。46权利要求43或权利要求44的发酵肉汤制剂，其具有2200至3200CMCU/G的内切葡聚糖酶活性，300至800PNPGU/G的葡糖苷酶活性，和2000至5000ABXU/G的木聚糖酶活性。47一种组合物，其包含A一种或多种包含细胞的发酵肉汤；B以重量计所述组合物的02至15的量的、包含至少一种15碳有机酸和/或其盐的第一有机酸成分；C以重量计所述组合物的004至06的量的、包含至少一种6碳或更多碳有机酸和/或其盐的第二有机酸成分。48权利要求47的组合物，其中所述第一有机酸成分是以重量计所述组合物

12、的02至1，02至05，01至10，025至5、或03至3的量。49权利要求47或权利要求48的组合物，其中所述第二有机酸成分是以重量计所述组合物的004至3，02至05，01至1，025至5，或03至3的量。50权利要求47至权利要求49中任一项的组合物，其中所述细胞主要或完全是非存活细胞。51权利要求50的组合物，其中如果在所述组合物中存在活细胞，那么在所述组合物中非存活细胞与活细胞的比例是至少101，至少501，至少1001，至少10001，至少10,0001，至少100,0001或至少1,000,0001。52权利要求47至51中任一项的组合物，其具有35至5的PH。53权利要求52的

13、组合物，其具有4至47的PH。54权利要求53的组合物，其具有42至45的PH。55权利要求47至54中任一项的组合物，其中所述细胞包含真菌细胞。56权利要求55的组合物，其中所述真菌细胞是丝状真菌细胞。57权利要求56的组合物，其中所述丝状真菌细胞来自木霉属、曲霉属、青霉属、腐质霉属、金孢霉属或脉孢霉属。58权利要求47至57中任一项的组合物，其中所述第一有机酸成分包含下述或由下述组成醋酸、醋酸盐、甲酸、甲酸盐、丙酸、丙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。59权利要求58的组合物，其中所述第一有机酸成分包含醋酸和/或其盐，或由醋酸和/或其盐组成。60权利要求47至59中任一项的组合物，其中所述

14、第二有机酸成分包含下述或由下述权利要求书CN102325872ACN102325885A4/4页5组成苯甲酸、苯甲酸盐、环己烷羧酸、环己烷羧酸盐、4甲基戊酸、4甲基戊酸盐、苯乙酸、苯乙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。61权利要求60的组合物，其中所述第二有机酸成分包含苯甲酸和/或其盐，或由苯甲酸和/或其盐组成。62权利要求47至61中任一项的组合物，其中所述第一有机酸成分包含所述15碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐和/或其中所述第二有机酸成分包含所述6碳或更多碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐。63权利要求47至57中任一项的组合物，其中所述第一有机酸成分包含以重量计0204浓度的醋酸和第二有机酸成分包含

15、以重量计0204浓度的苯甲酸钠。64权利要求47至63中任一项的组合物，其包含由所述细胞分泌的一种或多种蛋白质。65权利要求64的组合物，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种由所述细胞重组表达。66权利要求64或权利要求65的组合物，其中所述一种或多种蛋白质中的至少一种是酶。67权利要求66的组合物，其中所述酶是外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或葡糖苷酶。68权利要求64的组合物，其含有由细胞重组表达和分泌的多种酶。69权利要求68的组合物，其中所述多种酶各自是外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或葡糖苷酶。70权利要求47至69中任一项的组合物，其中蛋白质占所述组合物的5至15重量百

16、分比。71权利要求47至70中任一项的组合物，其还包含一种或多种抗微生物剂。72权利要求71的组合物，其中所述一种或多种抗微生物剂是以重量计所述组合物的00005至005的量。73权利要求72的组合物，其中所述一种或多种抗微生物剂是以重量计所述组合物的0001至0025的量。74权利要求72或权利要求73的组合物，其中抗微生物剂包括含有异酸、四异酸和/或酸的啤酒花提取物。75一种试剂盒，其包含A包装和B权利要求43或45中任一项的发酵肉汤制剂或权利要求47至74中任一项的组合物。权利要求书CN102325872ACN102325885A1/23页6发酵肉汤制剂0001与相关申请的交叉引用000

17、2本申请要求2009年2月20日递交的美国临时申请序列号61/154,235，2009年6月10日递交的61/185,865和2010年2月12日递交的61/304,219的优先权，上述每一个临时申请在此处以其整体引入作为参考。00031发明领域0004本发明涉及发酵肉汤制剂、制造其的方法及其用途。00052背景技术0006在多种培养或发酵微生物的工艺中，有时候必须在发酵过程中或结束时杀死混合物中的活细胞。特别是当把含有重组DNA的微生物作为生产宿主来培养并且希望避免任何活的重组生物被释放至环境中时。即使微生物不包含重组DNA，也常常希望在加工前杀死细胞以保证活细胞不被释放到环境中，无论是在生

18、产的产物中或在废产物中。0007许多需要杀死微生物的常规方法，例如加热，过于剧烈，可能在杀死细胞前破坏或改变期望的分泌产物。在这种情况下，必须在不杀死细胞的情况下回收产物，这需要使用繁重且代价高的防泄漏工艺和设备。美国专利号5,801,034和5,378,621描述了使用具有1至5个碳原子的单一有机酸杀死微生物细胞的方法。然而，根据这些专利的实施例，高水平的有机酸和低PH是最适的。低PH条件对发酵培养基中的许多目的酶产物的稳定性经常是不利的，并且高水平的有机酸经常抑制希望使用酶产物的下游应用，例如，在由酶产物通过酶催化作用已经产生的底物上产生有机物的微生物发酵。此外，使用高浓度的化学剂杀死微生

19、物细胞可能显著增加从发酵培养基中回收产物的成本。0008由此，仍然需要开发在较不剧烈的条件下杀死细胞的方法，其中使用较低浓度的化学剂是所期望的。00093发明概述0010许多工业蛋白质，例如酶，经常在产生其的发酵肉汤中商业提供。通常，蛋白质由细胞重组或非重组表达和分泌至包含发酵培养基和细胞的发酵肉汤中。常常希望在将蛋白质用于工业应用之前失活例如杀死细胞，以避免将复制性细胞释放至环境中。本发明公开满足了此需要，以基本上不干扰蛋白质例如酶的活性的方式失活细胞。0011在一些方面，本发明公开提供了制造发酵肉汤制剂的方法，其包括在一定条件下孵育第一混合物一段时间，所述第一混合物包含A一种或多种发酵肉汤

20、，B占第一混合物的01至15重量的量的第一有机酸成分，所述第一有机酸成分包含至少一种15碳有机酸即，在其主链和侧链中共具有15个碳的有机酸和/或其盐，和C占第一混合物的0025至5重量的量的第二有机酸成分，所述第二有机酸成分包含至少一种6碳或更多碳有机酸即，在其主链和侧链中共具有6个或更多个碳的有机酸和/或其盐，其中所述孵育条件和时间导致所述一种或多种发酵肉汤中至少4LOG的活细胞减少，由此产生发酵肉汤制剂。0012在特定的实施方案中，第一有机酸成分的量在如下范围中，所述范围的下限选自按重量计第一混合物的01，02，025，03，035，04，05，075或1，说明书CN102325872AC

21、N102325885A2/23页7而上限独立地选自按重量计第一混合物的03，04，05，075，1，2，3，5，7，10，12或15，例如按重量计第一混合物的02至1，02至05，01至10，025至5或03至3的量，等等。0013在特定的实施方案中，第二有机酸成分的量在如下范围中，所述范围的下限选自按重量计第一混合物的0025，003，004，0045，005，0075，01，02，025，03，035，04，05，075或1，而上限独立地选自按重量计第一混合物的01，02，03，04，05，075，1，2，3或5，例如，按重量计第一混合物的004至3，02至05，01至1，025至5或03

22、至3的量，等等。该有机酸可合适地为6至10碳有机酸，6至9碳有机酸或6至8碳有机酸。因此，在特定的实施方案中，第二有机酸成分包含6碳酸和/或其盐，7碳酸和/或其盐，8碳酸和/或其盐，9碳酸和/或其盐，或10碳酸和/或其盐，或由之组成。0014孵育时间适宜在下述范围中，所述范围的下限选自4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，14小时，16小时，18小时或20小时，而上限独立地选自12小时，16小时，20小时，24小时，28小时，32小时或36小时，例如从4小时至36小时，例如从8小时至36小时，从20小时至28小时，从8小时至16小时，从10小时至20小时，从16小时至30小时，等等。00

23、15孵育条件包括温度，所述温度适宜在下述范围中，该范围的下限选自20，22，25，28，30，32，34，36，38或40，而上限独立地选自28，33，35，40，45，50或55，例如从20至50，从25至40，从28至33，等等。0016孵育条件包括PH，所述PH适宜在下述范围中，该范围的下限选自35，36，37，38，39，4或42，而上限独立地选自38，4，42，44，45，46，47，48，49，5，52或55，例如从35至5，从4至47，或42至45的PH。可在孵育开始时和/或在孵育期间一次或多次调节PH，例如加入PH调节剂。在特定的实施方案中，PH调节剂是磷酸、硫酸或氢氧化钠。本

24、文也考虑在某些实施方案中第一和/或第二有机酸成分可在孵育开始时和/或孵育期中起调节PH的作用，并因此部分或完全地消除对另外的PH调节剂的需要。0017在某些方面，本发明方法在混合物中实现一种或多种发酵肉汤中的活细胞数的至少5LOG减少、6LOG减少、7LOG减少或8LOG减少。0018在特定的实施方案中，所述第一混合物中的活细胞减少，比接受所述条件的第二混合物或替代混合物中的减少，高至少025倍，至少05倍，至少1倍，至少2倍，至少5倍或至少10倍，其中所述第二混合物或替代混合物只包含一种有机酸成分，该一种有机酸成分的量达到在第一混合物中的第一和第二有机酸成分的总重量百分比。例如，使用与本发明

25、方法有关的第一有机酸成分的第一量例如以重量计1和第二有机酸成分的第二量以重量计05，比在相同或类似条件下以达到所述第一和第二量的总和的第三量例如15重量百分比使用单独第一有机酸成分或第二有机酸成分，导致活细胞数的更大减少。0019本发明方法可用于失活真菌细胞，例如丝状真菌细胞。在特定的实施方案中，丝状真菌细胞来自木霉属TRICHODERMA、曲霉属ASPERGILLUS、青霉属PENICILLIUM、腐质霉属HUMICOLA、金孢霉属CHRYSOSPORIUM或脉孢霉属NEUROSPORA。在以下章节521中描述了适于本公开的方法、制剂和组合物的其他细胞类型。0020在特定实施方案中，第一有机

26、酸成分包含下述或由下述组成醋酸、醋酸盐、甲酸、说明书CN102325872ACN102325885A3/23页8甲酸盐、丙酸、丙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。在一个实施方案中，第一有机酸成分包含醋酸和/或其盐，或由醋酸和/或其盐组成。0021在特定实施方案中，第二有机酸成分包含下述或由下述组成苯甲酸、苯甲酸盐、环己烷羧酸、环己烷羧酸盐、4甲基戊酸、4甲基戊酸盐、苯乙酸、苯乙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。在一个实施方案中，第二有机酸成分包含苯甲酸和/或其盐，或由苯甲酸和/或其盐组成。0022在本发明方法的一些实施方案中，第一有机酸成分包含所述15碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐，和/或第二有机

27、酸成分包含所述6碳或更多碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐。0023在某些特定的实施方案中，第一有机酸成分包含以重量计0204浓度的醋酸，和第二有机酸成分包含以重量计0204浓度的苯甲酸钠，和/或孵育时间是24小时，和/或孵育条件包括40的温度和/或孵育条件包括4至46的PH。0024在本发明方法中，第一混合物也可包含一种或多种抗微生物剂，例如以抑制污染性细菌或真菌的生长。在特定的实施方案中，该一种或多种抗微生物剂的量为第一混合物的00005至005重量，例如，所述混合物的0001至0025重量的量。在特定的实施方案中，抗微生物剂包含含有异酸、四异酸TETRAISOALPHAACIDS和/或酸的啤酒花

28、提取物。本文也考虑在特定实施方案中第一和/或第二有机酸成分可起抗微生物剂的作用，并因此部分或全部地消除对另外的抗微生物剂的需要。0025本发明方法还包括在上述孵育步骤前制备第一混合物的步骤，例如通过组合一种或多种发酵肉汤以及至少一种15碳有机酸和/或其盐、至少一种6碳或更多碳有机酸和/或其盐、和任选地一种或多种其他试剂，例如PH调节剂和/或抗微生物剂。0026在特定的实施方案中，本文描述的方法还包括培养细胞以产生在本发明中使用的发酵肉汤中的一种或多种的步骤。例如但不限于，可根据以下章节522中描述的任一种细胞培养方法，制备发酵肉汤。由此，本公开的组合物和制剂可包括通过本文公开的方法制备的发酵肉

29、汤。0027不受任何理论约束，本发明人相信，使用本文描述的2种有机酸成分与使用单一有机酸成分相比，导致实现细胞失活例如，如本文描述的，使活细胞数减少4或更多LOG倍所需的总有机酸成分的减少，并允许孵育反应在比原可能的情况更高的PH进行，由此最小化对起始发酵肉汤中的蛋白质例如酶的折叠和稳定性的副作用。因此，在某些方面，在导致如下发酵肉汤制剂的条件下进行本发明方法，所述发酵肉汤制剂中的一种或多种酶维持其至少75，至少80，至少85，至少90，至少95或至少98的起始酶活性。0028本发明还提供了通过本文描述的方法得到的或可通过本文描述的方法得到的发酵肉汤制剂。0029因此，在某些方面，本发明提供了

30、组合物，其包含A一种或多种含有细胞的发酵肉汤；B包含至少一种15碳有机酸和/或其盐的第一有机酸成分，其量为所述组合物的02至15重量；C包含至少一种6碳或更多碳有机酸和/或其盐的第二有机酸成分，其量为所述组合物的004至06重量。0030在特定的实施方案中，第一有机酸成分的量在如下范围中，该范围的下限选自以重量计组合物的01，02，025，03，035，04，05，075或1，而上限独立地选自以重量计组合物的03，04，05，075，1，2，3，5，7，10，说明书CN102325872ACN102325885A4/23页912或15，例如以重量计组合物的02至1，02至05，01至10，02

31、5至5或03至3的量，等等。0031在特定的实施方案中，第二有机酸成分的量在如下范围中，该范围的下限选自以重量计组合物的0025，003，004，0045，005，0075，01，02，025，03，035，04，05，075或1，而上限独立地选自以重量计组合物的01，02，03，04，05，075，1，2，3或5，例如，以重量计组合物的004至3，02至05，01至1，025至5或03至3的量，等等。0032应当理解，在本发明的制剂和组合物中有机酸成分通常至少部分是离解的形式，当这些成分是离解的形式时，成分的重量百分比不是指离解的离子例如钙的重量而是指用于制备该组合物或制剂的干物质例如酸或盐

32、的重量。这些成分离解的程度将取决于其各自的PKA值。优选在使有机酸成分的至少20，至少30，至少40，至少50，至少60或至少70离解的PH条件和温度下制造制剂或组合物。0033在某些方面，本发明组合物的PH适宜在下述范围，该范围的下限选自35，36，37，38，39，4或42，而上限独立地选自38，4，42，44，45，46，47，48，49，5，52或55，例如从35至5，从4至47，或42至45的PH。0034在某些方面，本发明的组合物中的细胞主要或完全是非存活的细胞。例如，在某些实施方案中，如果在组合物中存在活细胞，那么在所述组合物中非存活细胞与活细胞的比例是至少101，至少501，至

33、少1001，至少10001，至少10,0001，至少100,0001或至少1,000,0001。0035在某些方面，细胞包括真菌细胞，例如丝状真菌细胞。在特定的实施方案中，丝状真菌细胞来自木霉属、曲霉属、青霉属、腐质霉属、金孢霉属或脉孢霉属。0036在本发明的组合物的某些实施方案中，第一有机酸成分包含下述或由下述组成醋酸、醋酸盐、甲酸、甲酸盐、丙酸、丙酸盐、或前述两种或更多种的混合物。在特定实施方案中，第一有机酸成分包含醋酸和/或其盐，或由醋酸和/或其盐组成。0037在本发明的组合物的某些实施方案中，第二有机酸成分包含下述或由下述组成苯甲酸、苯甲酸盐、环己烷羧酸、环己烷羧酸盐、4甲基戊酸、4甲

34、基戊酸盐、苯乙酸、苯乙酸盐，或前述两种或更多种的混合物。在特定实施方案中，第二有机酸成分包含苯甲酸和/或其盐，或由苯甲酸和/或其盐组成。0038在某些实施方案中，第一有机酸成分包含15碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐，和/或第二有机酸成分包含6碳或更多碳有机酸的钠、钾、钙或镁盐。0039在以下章节524中描述了适用于本发明的方法和组合物的有机酸的其他细节和实施方案。0040在特定的实施方案中，第一有机酸成分包含以重量计0204浓度的醋酸，和/或第二有机酸成分包含以重量计0204浓度的苯甲酸钠。0041本发明的组合物可包含一种或多种抗微生物剂。在特定的实施方案中，该一种或多种抗微生物剂的量是以重量计组

35、合物的00005至005，例如是以重量计所述组合物的0001至0025的量。在特定的实施方案中，抗微生物剂包含含有异酸、四异酸和/或酸的啤酒花提取物。0042在本发明的方法、制剂和组合物中使用的发酵肉汤通常包含一种或多种由细胞分说明书CN102325872ACN102325885A5/23页10泌的蛋白质。所述一种或多种蛋白质中的至少一种可为重组表达的和/或为酶，例如外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或葡糖苷酶。在某些实施方案中，发酵肉汤包含由细胞重组表达和分泌的多种酶，例如外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、半纤维素酶或葡糖苷酶中的2种或更多种。在以下章节523中描述了适合在本发明的组合物和制剂

36、中存在的其他酶。在某些方面，蛋白质占本发明制剂或组合物的3至30重量百分比。在特定的实施方案中，蛋白质占本发明制剂或组合物的5至15重量百分比，7至10重量百分比，6至12重量百分比，5至20重量百分比，10至25重量百分比，10至20重量百分比，8至15重量百分比，或6至10重量百分比。0043在某些特定的实施方案中本发明的制剂或组合物具有1、2或所有3种以下活性0044A内切葡聚糖酶活性，范围从选自2000，2100，2200，2350，2500或2650CMCU/G的下限至独立地选自2400，2600，2800，3000，3200，3500，3750或4000CMCU/G的上限，例如从2

37、200CMCU/G至2800CMCU/G，从2200CMCU/G至3200CMCU/G，从2500至3500CMCU/G，等等；0045B葡糖苷酶活性，范围从选自300，375，450，475，500，525，550，600，650，或700PNPGU/G的下限至独立地选自475，525，575，635，700，775，800，850，900或950PNPGU/G的上限，例如从525PNPGU/G至775PNPGU/G，从300PNPGU/G至800PNPGU/G，从350PNPGU/G至850PNPGU/G，等等；和0046C木聚糖酶活性，范围从选自1000，1250，1500，1750，2

38、000，2250，2500，2750或3000ABXU/G的下限至独立地选自2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000或7000ABXU/G的上限，例如从2000ABXU/G至5000ABXU/G，从1500ABXU/G至4500ABXU/G，从3500ABXU/G至5500ABXU/G，等等。0047在另一个方面，本发明提供了水解纤维素物料的方法，其包括将纤维素物料和任意前述发酵肉汤制剂或组合物接触。在一些实施方案中，纤维素物料是植物生物质物质，例如木质素纤维素物质，其任选地已被预处理以提高酶促水解。由此，在某些方面本发明的制剂和组合物还包含未水解的纤维素

39、物料，部分水解的纤维素物料或基本上完全水解的例如90水解的或95水解的纤维素物料。在特定实施方案中，部分水解的纤维素物料I是高达40，高达50，高达60，高达70，高达80或高达90水解的纤维素物料；II是至少30，至少40，至少50，至少60，或至少70水解的纤维素物料；或III水解至落入独立地选自I和II的一对值之间的范围中，例如3080或4090水解的。注意本文描述的制剂和组合物的成分例如有机酸的重量范围一般不包括纤维素物料或纤维素物料的水解产物。0048在以下章节53描述了本发明的制剂和组合物的其他细节和实施方案。0049在一些方面，本发明提供了通过在本发明的制剂或组合物中发酵可以生产

40、有机物质的微生物来制备有机物质的方法。在一个实施方案中，所述微生物是产乙醇微生物，所述有机物质是乙醇。本发明的组合物可在同时糖化和发酵反应“SSF”或分开的糖化和发酵反应“SHF”中使用。0050不受任何理论约束，相比于与本发明的组合物类似或相同但仅包含一种有机酸成分的制剂或组合物在此分别称为“替代制剂”或“替代组合物”，在该替代制剂或组合物中所述一种有机酸成分为可失活或杀死发酵肉汤中的细胞的量，本发明的制剂和组合物有说明书CN102325872ACN102325885A6/23页11利地包含较少的发酵微生物的抑制剂。由此，在某些实施方案中，在本发明的制剂或组合物存在下由发酵微生物产生的有机物

41、质的产率，比在替代制剂或组合物存在下有机物质的产率，高至少025倍，至少05倍，至少1倍，至少2倍，至少5倍或至少10倍。例如，当对发酵微生物使用包含酶、第一量例如1重量的第一有机酸成分和第二量05重量的第二有机酸成分的本发明组合物或制剂时，由发酵微生物产生的有机物质的产率，比在相同或类似条件下使用包含相同酶和高达所述第一和第二量之和例如15重量百分比的第三量的单独第一有机酸成分或第二有机酸成分的组合物时的产率，更高。0051因此，在某些实施方案中，本发明制剂和组合物用于SSF反应。该方法包括使包含本发明的制剂或组合物、发酵微生物和纤维素底物的SSF反应混合物经历SSF条件。任选地，所述方法包

42、括形成SSF反应混合物的步骤，例如通过组合本发明的制剂或组合物、乙醇生产者ETHANOLOGEN和任选地纤维素底物。在特定的实施方案中，SSF条件包括缺乏补充的氮源。在另一个特定实施方案中，所述条件有助于纤维素水解为葡萄糖和/或半纤维素糖例如木糖、阿拉伯糖和/或甘露糖和有助于葡萄糖和/或半纤维素转化为有机物质例如乙醇。包含本发明的制剂或组合物、发酵微生物和任选地纤维素物料的SSF反应混合物也是本发明的一部分，本发明也涵盖其中纤维素物料已被部分水解和发酵的SSF反应产物。0052在其他实施方案中，本发明制剂和组合物用于SHF反应。该方法包括使包含本发明的制剂或组合物和纤维素底物的SHF反应混合物

43、经历SHF条件。任选地，所述方法包括形成SHF反应混合物的步骤，例如通过组合本发明的制剂或组合物和纤维素底物。在特定的实施方案中，SHF条件有助于纤维素水解为葡萄糖和/或半纤维素糖例如木糖、阿拉伯糖和/或甘露糖。任选地，然后将SHF反应产物用于发酵反应中以将得到的葡萄糖和/或半纤维素转化为有机物质例如乙醇。包含本发明的制剂或组合物和纤维素物料的SHF反应混合物也是本发明的一部分，本发明也涵盖其中纤维素物料已被部分水解的SHF反应产物。0053在以下章节54和55中描述了水解纤维素物料的方法和制备有机物质的方法的其他细节和实施方案。0054在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含包装和根据本发明

44、的制剂、组合物、SSF反应混合物、SSF反应产物、SHF反应混合物或SHF反应产物。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含在用发酵微生物制备有机物质的方法中使用的说明书，例如在用产乙醇微生物和以试剂盒中的细胞灭活的全肉汤或组合物水解的纤维素底物制备乙醇的方法中使用的说明书。在以下章节56中描述了本发明的试剂盒的其他细节和实施方案。0055在以下章节57中提供了本发明的方法、制剂和组合物的其他特定实施方案。00564附图简述0057图1显示了温度和制剂化学浓度对杀死里氏木霉TREESEI细胞的影响。0058图2显示了在40和PH4下苯甲酸钠浓度对杀死里氏木霉TREESEI细胞的影响。0059图3显示

45、了细胞灭活条件对杀死真菌细胞的影响。0060图4显示了具有6个或更多碳的有机酸的化学结构和PKA值。0061图5显示了在40和PH4下具有6个或更多碳的不同有机酸对杀死里氏木霉说明书CN102325872ACN102325885A7/23页12TREESEI细胞的影响。0062图6显示了在如实施例2描述的洗过的APB水解物上由鼠李糖乳杆菌LRHAMNOSUS产生的乳酸。0063图7显示了在如实施例2描述的洗过的APB水解物上由THERMOSACC酵母产生的乙醇。0064图8显示了在于如实施例2描述的洗过的APB水解物上进行THERMOSACC酵母发酵期间葡萄糖的积累。00655发明详述0066

46、51定义0067如本文使用的，术语“宿主细胞”指可转染用于产生多肽的重组表达载体以表达该多肽的细胞或细胞系。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然、偶然或有意的突变，该后代可能不一定和原始的亲本细胞完全相同在形态学上或在总基因组互补DNAGENOMICDNACOMPLEMENT上。宿主细胞包括被表达载体体内转染或转化的细胞。“宿主细胞”指细胞和从丝状真菌菌株，特别是木霉属物种菌株，的细胞产生的原生质体。0068当用于细胞、核酸、蛋白质或载体时，术语“重组”表示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过异源核酸或蛋白质的引入或天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或所述细胞来源于这样修饰的细胞。因此，例

47、如，重组细胞表达在细胞的天然非重组形式中不存在的基因，或表达原本异常表达的、不足表达的或完全不表达的天然基因。0069“丝状真菌”指真菌门EUMYCOTINA和卵菌门OOMYCOTA的所有丝状形式见ALEXOPOULOS，CJ1962，INTRODUCTORYMYCOLOGY，WILEY，NEWYORK。这些真菌的特征在于具有由几丁质、葡聚糖和其他复杂多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。本发明的丝状真菌在形态学、生理学和遗传学上和酵母截然不同。丝状真菌的营养生长是菌丝的伸长，并且碳分解代谢是专性需氧的。0070如本文使用的，术语“木霉属”或“木霉属物种”指以前或目前被归类为木霉属的任何真菌属。007

48、1术语“培养”指在合适生长的条件下在液体或固体培养基中微生物细胞群体的增长。0072如本文使用的，在本文中可互换使用的术语“纤维素底物”或“纤维素物料”指含有纤维素和/或半纤维素的物料。纤维素底物可为木质素纤维素物料，所述木质素纤维素物料含有彼此交联的和与木质素交联的纤维素、半纤维素和葡聚糖。这些纤维素底物也可含有其他物质，例如果胶、蛋白质、淀粉和脂质，但通常含有纤维素、半纤维素和葡聚糖作为主要成分。0073“发酵微生物”指适用于在期望的发酵过程中生产有机物质的任何微生物。0074如本文使用的术语“发酵肉汤”是指由细胞发酵产生的制品，该制品未经历过回收和/或纯化、或经历过最低程度的回收和/或纯化。例如，当微生物培养物被培养至饱和，并在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成例如由宿主细胞表达酶并分泌至细胞培养基中时，产生发酵肉汤。发酵肉汤可含有在发酵结束时得到的发酵物质的未分级分离的或已分级分离的内容物。通常，发酵肉汤是未分级分离的，包含用过的培养基和在去除例如通过离心微生物细胞例如丝状真菌细胞后存在的细胞碎片。在一些实施方案中，发酵说明书CN102325872ACN102325885A8/23页13肉汤含有用过的细胞培养基、细胞外酶、和活的和/或非存活的微生物细胞。0075“产乙醇的”指微生物从碳水化合物产生乙醇作为主要发酵产物的能力