丝氨酸蛋白酶衍生物及其在凝血功能障碍的预防或治疗中的用途.pdf

丝氨酸蛋白酶衍生物及其在凝血功能障碍的预防或治疗中 的用途
    技术领域 本发明涉及因子 X 的激活肽及其在提高丝氨酸蛋白酶衍生物 ( 特别是蛋白 C、 因子 IX 和因子 X 衍生物 ) 的半衰期和回收率中的用途， 以及这些衍生物在蛋白 C、 因子 IX 和因 子 X 相关病症 ( 特别是凝血功能障碍 ) 的预防或治疗中的用途。
     背景技术 凝血是在响应血管损伤而发生的主要和复杂的过程。 它包括形成凝块以停止出血 和开始修复受损血管 ： 其壁由含有血小板和血纤维蛋白的凝块覆盖。该过程几乎在损伤后 立即开始。
     凝血过程包括两种类型的组分 ： 称为血小板的细胞组分和称为凝血因子的蛋白组 分。 血小板立即在损伤部位形成栓塞 ； 这称为初级止血。 同时发生次级止血 ： 称为凝血因子 或凝固因子的血浆蛋白作出复杂级联响应， 以形成强化血小板栓塞的血纤维蛋白丝。
     次级止血的凝血级联被分成两种途径， 称为内源性途径或接触激活途径， 和外源 性途径， 也称为组织因子途径。许多凝血因子以及辅因子和调节因子参与其中以恰当地维 持该过程。
     例如， 蛋白 C 是用于调节凝血的主要机制 ( 称为 “抗凝血剂途径” ) 的关键因子。 蛋白 C 的活性形式 ( 激活的蛋白 C) 是丝氨酸蛋白酶， 其在与另一种辅因子 ( 蛋白 S) 结合 时降解对凝血酶的大量产生必要的凝血级联的两种因子 ： 因子 Va 和 VIIIa。这些因子的 破坏负向调节所形成的凝血酶的量， 导致抗凝血效应。特别是已知这种蛋白具有多效生物 活性 ： 不仅具有抗血栓形成活性 (Taylor 等人， 1987 ； Gruber 等人， 1990 ； Chesebro 等人， 1992 ； Hanson 等人， 1993 ； Arnljots 等人， 1994 ； Sakamoto 等人， 1994， Jang 等人， 1995， Kurz 等人， 1997 ； Gresele 等人， 1998 ； Mizutani 等人， 2000 ； Bernard 等人， 2001)， 还具有抗炎活 性 (Emson， 2000)、 抗细胞凋亡活性 (Joyce 等人， 2001) 和促溶血纤活性 (Comp 等人， 1981 ； Rezaie， 2001)。
     因子 IX( 以下称为 FIX) 是凝血的一个关键丝氨酸蛋白酶。 这种蛋白的缺失引起出 血病症， 称为 B 型血友病。在凝血期间， 激活的 FIX(FIXa) 与其激活辅因子， 因子 VIIIa( 以 下称为 FVIIIa)， 结合， 将其特定底物因子 X(FX， 以下称为 FX) 转换为其激活的衍生物， 激活 的因子 X( 以下称为 FXa)。
     因子 X 是凝血级联的另一个关键因子。 FX 的激活形式 (FXa) 是能够在与其辅因子 ( 凝血因子 Va) 结合时将凝血酶原活化成凝血酶的唯一的丝氨酸蛋白酶。此外， 长期被认 为是被动旁观者的因子 X 目前表现为经由其两种主要受体 ( 蛋白酶激活受体 -1(PAR-1) 和 PAR-2) 的激活作用于各种各样细胞类型的直接参与者。 最近的发现提示， PAR-2 在纤维 - 增 殖性疾病 ( 例如纤维化、 组织重建和癌症 ) 中起着重要作用， 并指因子 X 为协调凝血和疾病 进展之间的分界的重要介质 (Borensztajn 等人， 2008)。
     蛋白 C、 因子 IX 和因子 X 分别是肝脏中合成的 62kDa、 55kDa 和 59kDa 的糖蛋白。
     在其分泌进入血浆前， 其多肽链经过几次翻译后熟化以变成功能性酶原。
     两种酶原蛋白 C 和因子 X 由肽链裂解得到的氨基端轻链和羧基端重链组成， 其中 轻链和重链由二硫桥连接。酶原因子 IX 是单链糖蛋白。
     如同大多数丝氨酸蛋白酶前体一样， 蛋白 C、 因子 IX 和因子 X 是缺乏催化活性的酶 原。其激活是其重链中蛋白酶促裂解的结果。在蛋白 C 中， 这种裂解发生在重链的 N 末端， 从而释放 12 个氨基酸的 “激活” 肽。在因子 X 中， 这种裂解发生在酶原的 Arg 193 和 Ile 194 残基之间， 从而也释放 52 个氨基酸的 “激活” 肽。在因子 IX 中， 发生两个裂解， 也从前 体分子的内部区域释放分子量近似等于 11kDa 的激活肽。
     血液凝因必须很好地控制以避免出血或凝血的任何危险。因此， 凝血过程的失调 导致严重的病症， 例如出血 ( 增加的出血危险 ) 和血栓症 ( 增加的凝血危险 )。因增加的凝 血危险导致的病理包括严重的病症， 例如静脉或动脉血栓形成， 特别是影响大口径血管的 血栓形成、 心肌梗死、 血栓形成性疾病、 肺栓塞、 血管成形术或溶栓治疗后的冠状动脉再梗 塞， 以及患有影响蛋白 C 基因或凝血调节蛋白基因的遗传异常的患者的凝血异常。给予病 人抗凝血剂以终止血栓形成 ( 凝血不适当地存在于血管中 )。这用于易感者中深静脉血栓 形成、 肺栓塞、 心肌梗死和中风的初级和次级预防。出血是在血栓栓塞 (thromoboembolic) 并发症的预防和治疗中口服使用抗凝剂的最严重的并发症。用华法令或肝素抗凝血的个 体如果出血或需要手术时通常分别用特定的解毒药例如维生素 K 或鱼精蛋白治疗。不幸的 是， 华法令、 肝素、 维生素 K 和鱼精蛋白的治疗活性伴随不良的副作用， 这使其使用复杂化。 相反， 还没有用于逆转低分子量肝素 (LMWH) 或靶向因子 Xa(fXa) 的新型口服抗凝血剂的抗 凝血效应的特异性的和有效的解毒剂 ( 参考综述， Harenberg， 2008， Bauer， 2008， Khoo 等 人， 2009)。当使用这些新的抗凝疗法时， 可能观察到大出血。因此， 及时采取适当的机械的 和系统的行动以控制出血是必要的。 这包括停止抗凝血治疗以及， 如有可能， 使用可得到的 特定逆转剂逆转抗凝血效应。目前需要针对这些抗凝血剂的特异性解毒药。
     另一方面， 出血型的病理学特别地包括 A 或 B 型血友病 ( 分别缺乏因子 VIII 和 IX)。这些严重疾病常常由于用于治疗的中和抗因子 VIII 或 IX 的同种抗体的 “抑制剂” 的 存在而复杂化。
     目前有着改善这些病症的治疗的需要。
     第一种治疗策略是绕过凝血级联和调节的缺陷步骤。 用于改善目前治疗的另一种 策略是改善所使用化合物 ( 主要是在血浆中易被中和的蛋白质 ) 的半衰期。用于改善治疗 的另一种途径是重建自动放大系统或逆控制。
     用于高凝性病症 ( 例如蛋白 C 缺失 ) 的治疗是蛋白 C、 激活的蛋白 C、 蛋白 C 衍生 物……。目前用于血友病的治疗是对于 A 和 B 型血友病分别施用因子 VIII 或 IX。
     这些治疗是昂贵的， 特别是因为由于化合物的短半衰期而需要反复注射， 而且这 些治疗具有局限性， 如抑制剂或中和抗通常用于治疗 A 和 B 型血友病的因子 VIII 或 IX 的 同种抗体的的开发。此外， 已观察到施用重组蛋白质 ( 特别是因子 IX) 来治疗 B 型血友病， 由于较之施用血浆来源的产物具有更低的回收率而受到阻碍。
     已经提出潜在方法作为新的治疗策略。特别是， WO 03035861 专利申请描述了蛋 白 C 和因子 X 的凝血酶可酶解的嵌合衍生物。
     然而， 这些化合物的短的半衰期限制了其在凝血功能障碍中的使用。本发明提出一种新的方法解决该技术问题。
     发明简述
     本发明涉及多肽 PP， 其包含 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列 ( 因子 X 的 激活肽 )， 其中 39 或 49 位的天冬酰胺是 N- 糖基化的。
     本发明也涉及所述多肽用于提高循环蛋白例如丝氨酸蛋白酶酶原， 如因子 IX、 因 子 X、 蛋白 C， 的半衰期和回收率的用途。
     本发明也涉及融合蛋白 FP， 其含有 ：
     - 第一多肽 PP 和
     - 第二多肽， 其包含 SEQ ID NO ： 4 的 7 到 16 位的氨基酸序列。
     本发明涉及因子 X 或蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中所述蛋白质的天 然激活肽被融合蛋白 FP 取代。
     本发明涉及因子 X 或蛋白 C 的凝血酶可裂解衍生物， 其中所述蛋白质的天然激活 肽被融合蛋白 FP 取代。
     本发明还涉及因子 X 或蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其含有激活因子 X 或蛋白 C 或其功能保守的变体和融合蛋白 FP。
     本发明涉及编码本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的核酸分子。 本发明涉及本发明因子 X 的嵌合衍生物用于预防或治疗出血型的凝血病症的用途。 本发明涉及本发明因子 X 的嵌合衍生物用于预防或治疗由低分子量肝素 (LMWH) 或由靶向因子 Xa(fXa) 的抗凝血剂引起的出血的方法。
     本发明也涉及本发明蛋白 C 的嵌合衍生物用于预防或治疗涉及高凝性的病症的 用途。
     本发明涉及用于预防或治疗凝血障碍的包含本发明嵌合衍生物的药物组合物。
     发明详述
     通过对因子 X 的不同构造的研究， 本发明人证明因子 X 的激活肽在因子 X 的清除 过程及其回收中起着基本的作用。
     更具体地， 他们观察到， 这一激活肽的羧基末端的十九个氨基酸在因子 X 的清除 动力学中有着主要作用。该十九个残基的序列包含对观察到的机制重要的两个 N- 糖基化 位点。
     定义
     “功能保守的变体” 是其中蛋白或酶中给定的氨基酸残基发生变化但不改变多 肽的整体构象和功能的那些变体， 包括但不限于， 用具有类似性质 ( 例如， 极性、 氢键键合 潜力、 酸性、 碱性、 疏水性、 芳香性等 ) 的氨基酸取代。除了显示为保守的那些氨基酸以外 的氨基酸在蛋白质中可以不同， 以便具有相似功能的任何两个蛋白之间的蛋白质或氨基 酸序列的百分相似性可以改变， 且可以是例如根据比对方案 ( 例如通过群集法 (Cluster Method)) 确定的 70％到 99％， 其中相似性是基于 MEGALIGN 算法。 “功能保守的变体” 也包 括由 BLAST 或 FASTA 算法确定的具有至少 60％、 优选至少 75％、 最优选至少 85％、 进一步 优选至少 90％的氨基酸同一性的多肽， 且其与进行比较的天然或母蛋白 (parent protein) 具有相同或基本上相似的性质或功能。
     两个氨基酸序列超过 80％、 优选超过 85％、 优选超过 90％的氨基酸相同， 或超过 约 90％， 优选超过 95％的氨基酸相似 ( 功能上相同 ) 时是 “基本上同源” 或 “基本上相似” 的。优选地， 相似或同源的序列通过例如使用 GCG(Genetics Computer Group， Program Manual for the GCG Package， Version 7， Madison， Wisconsin) 堆 积 程 序 (pileup program) 的比对或任何序列比较算法例如 BLAST、 FASTA 等来鉴别。
     根据本发明， 术语 “融合蛋白” 或 “嵌合蛋白” 指的是通过连接两个或更多个基因或 其片段 ( 其原来编码分离的多肽 ) 而生成的蛋白质。这种融合基因的翻译导致具有源自各 原始多肽的功能性质的单个多肽。重组融合蛋白通过用于生物研究或治疗的重组 DNA 技术 人工生成。重组融合蛋白是通过融合基因的基因工程生成的蛋白质。这通常包括去除编码 第一蛋白的 cDNA 序列中的终止密码子， 然后通过连接或重叠延伸 PCR 同框 (in frame) 附 加第二蛋白的 cDNA 序列。然后该 DNA 序列由细胞表达为单个蛋白。该蛋白可以工程化以 包括两个原始蛋白的全部序列， 或仅任一个原始蛋白的一部分序列。
     术语 “回收率” 意指抗原或注射分子的活性水平相对于计算得到的理论或预期的 抗原或活性的百分比。
     “循环蛋白” 意指由身体器官细胞合成并在血流中输送的蛋白。循环蛋白的例子是 凝血因子、 蛋白激素。 凝血因子通常是丝氨酸蛋白酶。也有一些例外。例如， 因子 VIII 和因子 V 是糖蛋 白， 因子 XIII 是转谷氨酰胺酶。
     蛋白激素是分泌到血流中并在活动物体中具有内分泌功能的一类蛋白质。
     术语 “丝氨酸蛋白酶酶原” 具有本领域的一般含义并指丝氨酸蛋白酶的无活性前 体， 其需要裂解以使其变成活性酶。 根据本发明， 目标丝氨酸蛋白酶限于属于循环蛋白的那 些。
     丝氨酸蛋白酶包括其中活性部位的氨基酸之一是丝氨酸的几种蛋白酶。 根据本发 明， 目标丝氨酸蛋白酶可以是但不限于因子 IX、 因子 X 或蛋白 C， 且特别是因子 X 和蛋白 C。
     根据本发明， 术语 “丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物” 是通过将丝氨酸蛋白酶酶原 或其片段与目标多肽连接而获得的融合蛋白。 所得到的蛋白显示出所述丝氨酸蛋白酶的功 能性质。
     特别地， 术语 “丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物” 是通过激活的丝氨酸蛋白酶或其 片段与目标多肽的融合而获得的融合蛋白。
     根据本发明， 丝氨酸蛋白酶酶原的所述嵌合衍生物与天然丝氨酸蛋白酶酶原不 同， 但至少显示等同的活性。
     术语 “因子 X” 具有本领域的一般含义并指参与凝血机制的分泌的丝氨酸蛋白酶。 因子 X 可以来自于任何来源， 但通常是哺乳动物 ( 例如， 人和非人灵长类动物 ) 因子 X， 更特 别是人因子 X。通常， 人因子 X 的氨基酸序列由 SEQ ID NO ： 1( 图 1) 提供。
     存在不同的编号系统以定位因子 X 的氨基酸残基 ：
     - 参照由因子 X 的 cDNA 推导的序列的编号系统。
     - 参照由分泌的蛋白质推导的序列的编号系统， 分泌的蛋白包含轻链、 激活肽和重 链： 编号为 1 的氨基酸残基是轻链的氨基末端的第一氨基酸残基。使用了该编号系统。上 游的氨基酸位置用负数标识 ： 原肽 (pro-peptide) 的 C 末端氨基酸编号为 -1， 且翻译的蛋
     白的 N 末端氨基酸残基 ( 其是前肽 (pre-peptide) 的氨基末端氨基酸残基 ) 编号为 -40。
     如图 1 所示， 因子 X 的序列分成五个不同的区域， 其根据所使用的编号系统对应 于：
     --40 到 -28 位之间的前肽 ( 或信号肽 )，
     --27 到 -1 位之间的原肽，
     -1 到 142 位之间的轻链，
     -143 到 194 位之间的激活肽，
     -195 到 448 位之间的重链。
     术语 “因子 X” 或 “FX” 或 “成熟 FX” 或 “酶原 FX” 意指在由产生的肝细胞分泌后， 因子 X 的血液循环形式。 信号肽由信号肽酶切除， 原肽序列在成熟 N- 末端链的 N- 末端的前 11 个谷氨酸残基发生 γ 羧化作用后切除。进一步的加工步骤通过在根据所使用编号系统 的 Arg142 和 Ser143( 图 1， SEQ ID NO ： 1 的 182-183 位 ) 之间的裂解进行。这一加工步骤 也伴随着导致三肽 Arg140-Lys141-Arg142(SEQ ID NO ： 1 的 180-182 位 ) 的缺失。所获得 的分泌因子 X 酶原由 139 个氨基酸的 N- 端轻链和 306 个氨基酸的 C- 端重链组成， 轻链和 重链经由 Cys132 和 Cys302 之间的二硫桥共价连接。进一步的翻译后加工步骤包括 Asp63 的 β- 羟基化作用以及 N- 和 O- 型糖基化。
     术语 “激活的因子 X” 或 “FXa” 意指在需要凝血活性 ( 例如凝血酶产生 ) 的情况中 产生的循环因子 X 的酶学活性形式。在能够激活因子 X 的生理条件下， 从 Ser143 到 Arg194 的 52 个氨基酸的所谓激活肽通过在 Arg194 处切割重链的羧基端而与分子的其余部分分开 ( 图 1)。
     根据本发明， 术语 “因子 X” 和 “激活的因子 X” 包括天然存在的因子 X 和激活的因 子 X， 也包括其功能保守的变体和修饰形式。特别地， 本发明包括因子 X( 酶原或激活的形 式 ) 的所有已知的功能保守的变体， 例如 Camire 等人， 2000 描述的变体 ( 其中天然因子 X 的原肽被凝血酶原的原肽替代， 以获得更高产量的 γ- 羧化的成熟蛋白 )， 或 Rudolph 等人， 1997 描述的变体 ( 其中对应于因子 X 的残基 -2 的密码子 (ACG， 其对应于 SEQ ID NO ： 1的 39 位的苏氨酸 ) 可以变成 AGG( 其对应于精氨酸 ) 中以允许准确地切割原肽。
     术语 “因子 X 的激活肽” 具有其在本领域的一般含义并意指根据所使用的编号系 统的因子 X 的 143 到 194 位的 52 个氨基酸的多肽 (SEQ ID NO ： 1 的 183-234 位 )。该术语 可包括天然存在的因子 X 激活肽和其功能保守的变体和修饰形式。本文定义的激活肽相当 于因子 X 的人激活肽， 但是也可以来自任何来源， 然而通常是哺乳动物 ( 例如， 人和非人灵 长类动物 ) 因子 X， 更特别的是人因子 X。人因子 X 的激活肽的氨基酸序列由 SEQ ID NO ： 2 提供。
     在本发明中， 因子 X 激活肽的羧基端部分的 19 个最后氨基酸的序列对应于目标多 肽， 其对应于 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列， 或对应于根据所使用的编号系统的 因子 X 的 176 到 194 位 ( 图 1)。该多肽也称为 PA176-194。这一多肽在 SEQ ID NO ： 2 的 39 和 49 位包含两个糖基化位点， 对应于根据所使用编号系统的因子 X 的 181 和 191 位。
     术语 “蛋白 C” 具有本领域的一般含义并意指参与调节凝血的主要机制 ( 称为 “抗 凝血剂途径” ) 的分泌丝氨酸蛋白酶。蛋白 C 可以来自于任何来源， 但通常是哺乳动物 ( 例 如， 人和非人灵长类动物 ) 蛋白 C， 更特别是人蛋白。 通常， 人蛋白 C 的氨基酸序列由 SEQ IDNO ： 3 提供。
     蛋白 C 的激活肽是序列 SED ID NO ： 3 的 200 到 211 位之间发现的十二个氨基酸的 多肽。
     术语 “蛋白 C” 或 “PC” 或 “成熟 PC” 或 “酶原 PC” 意指由肝产生细胞分泌后的蛋白 C 的血液循环形式。信号肽由信号肽酶切除， 原肽序列在成熟 N- 末端链的 N- 末端的前 9 个 谷氨酸残基 ( 始于序列 SED ID NO ： 3 的 43 位的丙氨酸 ) 上发生 γ 羧化作用后切除。进一 步的加工步骤通过双联体 Lys198-Arg199(SED ID NO ： 3) 的缺失发生。所获得的分泌蛋白 C 酶原由 155 个氨基酸的 N- 末端轻链和 262 个氨基酸的 C- 末端重链组成， 其由二硫桥共价 连接。进一步的翻译后加工步骤包括 Asp113(SED ID NO ： 3) 的 β- 羟基化作用以及 N- 型 糖基化。
     术语 “激活的蛋白 X” 或 “PCa” 意指在需要凝血活性 ( 例如凝血酶产生 ) 的情况下 产生的循环蛋白 C 的酶学活性形式。 在能够激活蛋白 C 的生理条件下， Asp200 到 Arg211(SED ID NO ： 3) 的 12 个氨基酸的所谓激活肽通过在 Arg211(SED ID NO ： 3) 处裂解重链的羧基末 端来而与分子的其余部分分开。
     根据本发明， 术语 “蛋白 C” 或激活的蛋白 C” 包括天然存在的蛋白 C 和激活的蛋 白 C， 但也包括其功能保守的变体和修饰形式。特别是， 本发明包括蛋白 C( 酶原或激活的 形式 ) 的所有已知的功能保守的变体， 例如含有在 Asn355 和 371 处的取代的具有较高抗凝 血活性的激活的蛋白 C 衍生物 ( 美国专利 5453373)， 以及具有降低的抗凝血活性同时具有 所需的细胞保护性质 ( 抗细胞凋亡、 抗神经变性病症和抗中风的保护性质 ) 的激活的蛋白 C 的衍生物 ( 参见， 例如 WO 2005/007820)。这些突变体例如是 3K3A-APC 和 229/230-APC。 术语 “血纤维蛋白肽 A” 具有本领域的一般含义并意指通过凝血酶的作用从血纤维 蛋白原的 α- 链的 N- 末端片段移去的 16 个氨基酸残基的小肽。该术语可以包括天然存在 的血纤维蛋白肽 A 及其保守的功能变体和修饰形式。血纤维蛋白肽 A 可以来自任何来源， 但通常是哺乳动物 ( 例如， 人和非人灵长类动物 ) 血纤维蛋白肽 A， 更特别的是人血纤维蛋 白肽 A。通常， 人血纤维蛋白肽 A 的氨基酸序列由 SEQ ID NO ： 4 提供。
     根据本发明， 术语 “血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物” 意指含有血纤维蛋白肽 A 或其片段和血纤维蛋白肽 A 的羧基末端部分的凝血酶可裂解位点的多肽。这种衍生物由 因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的序列的 SEQID NO ： 5( 图 3A) 或 SEQ ID NO ： 6( 图 3B) 定义和由蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的序列 SEQ ID NO ： 13( 图 4A) 或 SEQ ID NO ： 14( 图 4B) 限定。
     根据本发明， 术语 “凝血酶可裂解位点” 意指可被凝血酶 ( 凝血的主要丝氨酸蛋白 酶 ) 识别和裂解的短的氨基酸序列。
     糖基化是将糖类连接到蛋白质上的酶过程。蛋白的糖基化通常是 N- 连接的。 “N- 连接” 意指糖部分连接到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺 -X- 丝氨酸和天 冬酰胺 -X- 苏氨酸 ( 其中 X 是除了脯氨酸外的任何氨基酸 ) 是用于糖部分酶促连接到天冬 酰胺侧链上的识别序列。因此， 这些三肽序列的任何一个在多肽中的存在产生潜在糖基化 位点。通常， 与蛋白 N- 连接的寡糖由葡萄糖、 甘露糖和 2N- 乙酰氨基葡萄糖分子组成， 然后 其可由多种不同的单糖 ( 包括半乳糖、 N- 乙酰氨基葡萄糖、 N- 乙酰半乳糖胺、 岩藻糖和唾液 酸 ) 延长。
     因此， 术语 “N- 糖基化的”意指多肽在以上定义的至少一个天冬酰胺残基上的 N- 糖基化。
     从广义上说， 术语 “预防” 或 “防止” 意指在还未诊断为患有疾病或病症的患者中 预防发生这种疾病或病症。
     从广义上说， 术语 “治疗” 或 “疗法” 意指逆转、 缓解、 抑制该术语应用的疾病或病 症的发展或者这种疾病或病症的一种或多种症状。
     术语 “患者” 意指患有凝血障碍或易患凝血障碍的任何受试者 ( 优选人 )。
     根据本发明， 术语 “蛋白 C 和因子 X 相关障碍” 意指涉及因子 X 或蛋白 C 的任何病 状， 特别是凝血功能障碍。
     根据本发明， 术语 “凝血功能障碍” 或 “凝血障碍” 意指由于凝血机制的失调而引 起的任何病状。因此它包括涉及过度凝血和凝血不足的病症。
     涉及过度凝血或高凝性的病症包括但不限于静脉或动脉血栓形成、 心肌梗死、 血 栓性疾病、 肺栓塞、 冠状动脉再闭塞和蛋白 C 缺乏。
     涉及凝血不足的病症称为出血病症， 且特别地包括因子 VIII、 IX 或 XI 缺乏。特别 地， 这些病症可以是 A 或 B 型血友病和由与另一种病症 ( 例如自身免疫性疾病或癌症 ) 有 关的自身抗体的出现导致的血友病。 源自因子 X 的激活肽的多肽
     本发明的第一个目的涉及多肽 PP， 其含有 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序 列， 其中 39 或 49 位的天冬酰胺是 N- 糖基化的。
     在优选的实施方式中， 39 和 49 位的天冬酰胺是 N- 糖基化的。
     在一个实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 32 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 31 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 30 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 29 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 28 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 27 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 26 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 25 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 24 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 23 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 22 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 21 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 20 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 19 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 18 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 17 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 16 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 15 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 14 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 13 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 12 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 11 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 10 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 9 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 8 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 7 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 6 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 5 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 4 到 52 位的氨基酸序12列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     列。
     102325880 A CN 102325893说明书9/28 页列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 3 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 2 到 52 位的氨基酸序列。
     列。 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。在可选的实 施方式中， 所述多肽不包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。
     本发明的另一个目的涉及多肽 PP 用于提高酶原 ( 特别是丝氨酸蛋白酶酶原 ) 的 半衰期的用途。
     源自因子 X 的激活肽的融合蛋白
     本发明的另一个目的涉及融合蛋白 FP， 其含有 ：
     - 由上述多肽 PP 构成的第一多肽和
     - 包含 SEQ ID NO ： 4 的 7 到 16 位的氨基酸序列的第二多肽。
     本发明的另一个目的涉及融合蛋白 FP， 其含有 ：
     - 由上述多肽 PP 构成的第一多肽和
     - 包含 SEQ ID NO ： 4 的 7 到 16 位的氨基酸序列的第二多肽，
     其中
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 14 位残基的甘氨酸被缬氨酸、 苯丙氨酸或丙氨酸取代， 和/或
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 15 位残基的缬氨酸被脯氨酸取代。
     在优选的实施方案中， 本发明涉及所述融合蛋白， 其中所述第一多肽的羧基端区 域与所述第二多肽的氨基端区域融合。
     在一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含 SEQ ID NO ： 4 的 7 到 16 位的氨基酸 序列。
     在另一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含 SEQ ID NO ： 4 的 6 到 16 位的氨基 酸序列。
     在另一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含 SEQ ID NO ： 4 的 5 到 16 位的氨基 酸序列。
     在另一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含 SEQ ID NO ： 4 的 4 到 16 位的氨基 酸序列。
     在另一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含 SEQ ID NO ： 4 的 3 到 16 位的氨基 酸序列。
     在另一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含 SEQ ID NO ： 4 的 2 到 16 位的氨基 酸序列。
     在另一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4。
     本发明的嵌合衍生物
     如上所述的本发明的多肽和融合蛋白可以与丝氨酸蛋白酶酶原或其活性形式或 片段融合以提高所述丝氨酸蛋白酶酶原的半衰期和回收率。
     本发明人证明， 因子 X 的激活肽和更特别是含有其最后的十九个氨基酸的其片段
     在因子 X 的长半衰期和注入的分子的良好回收率方面起主要作用。他们也证明， 因子 X 的 激活肽或含有其最后的十九个氨基酸的其片段可用于增加其他蛋白质 ( 例如循环蛋白 ) 的 半衰期和回收率。
     因此， 本发明的另一个目的涉及含有目标蛋白和上述多肽 PP 的嵌合蛋白。
     所述目标蛋白可以是在血液中具有短的半衰期的酶或其他蛋白。特别地， 它可以 是循环蛋白， 例如丝氨酸蛋白酶或蛋白激素。
     通常， 所述目标蛋白可以是蛋白 C、 因子 VII、 激活的因子 VII、 因子 IX、 胰岛素、 促 红细胞生成因子、 可溶性 P- 选择素糖蛋白配体…， 但它不是天然因子 X。
     所述蛋白可以其酶原形式或以其激活形式使用。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述蛋白， 其中所述多肽 PP 在羧基末端、 氨基末端与目标蛋白融合或融合到目标蛋白的氨基酸序列中。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述嵌合蛋白， 其中所述多肽 PP 在羧基末 端、 氨基末端中与目标蛋白融合或融合到目标蛋白的氨基酸序列中。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述嵌合蛋白， 其中目标酶原的激活肽被 多肽 PP 取代。
     在另一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述嵌合蛋白， 其中所述多肽 PP 在目标 蛋白的天然激活肽的定位部位与目标蛋白的激活形式融合。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述嵌合蛋白， 其中所述多肽 PP 由 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列组成， 其中 39 或 49 位的天冬酰胺是 N- 糖基化的。
     通常， 本发明涉及所述嵌合蛋白， 其中所述多肽 PP 包含 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列 ( 其中 39 或 49 位的天冬酰胺是 N- 糖基化的 ) 且其最大长度为 19 个氨基 酸、 20、 25、 30、 35、 40、 45 或 50 个氨基酸。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述嵌合蛋白， 其中所述多肽 PP 不是由因 子 X 的天然激活肽 (SEQ ID NO ： 2) 组成。
     在 一 个 具 体 的 实 施 方 式 中， 本 发 明 涉 及 所 述 嵌 合 蛋 白， 它 不 是 专 利 申 请 WO 2006018204 中描述的蛋白之一。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及含有蛋白 C 和多肽 PP 的嵌合蛋白， 条件是 所述肽的序列不是由 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列组成的。
     在更特别的实施方式中， 本发明涉及含有蛋白 C 和多肽 PP 的嵌合蛋白， 其中所述 多肽由 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列组成， 其中 39 或 49 位的天冬酰胺是 N- 糖 基化的。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及含有蛋白 C 的嵌合蛋白， 其中蛋白 C 的激活 肽被多肽 PP 取代， 条件是所述肽的序列不是由 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列组成的。
     在更特别的实施方式中， 本发明涉及含有蛋白 C 的嵌合蛋白， 其中蛋白 C 的激活肽 被由 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列组成的多肽 PP 取代， 其中 39 或 49 位的天冬 酰胺是 N- 糖基化的。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及含有激活的蛋白 C 和多肽 PP 的嵌合蛋白， 条件是所述肽的序列不是由 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列组成的。
     在更特别的实施方式中， 本发明涉及含有激活的蛋白 C 和由 SEQ ID NO ： 2 的 33 到52 位的氨基酸序列组成的多肽 PP 的嵌合蛋白， 其中 39 或 49 位的天冬酰胺是 N- 糖基化的。
     优选地， 其中 39 或 49 位的天冬酰胺被 N- 糖基化的 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的 氨基酸序列融合在激活的蛋白 C 的重链 N 末端部分上。
     本发明涉及含有多肽 PP 的丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物。
     特别地， 所述丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物是蛋白 C 和因子 X 的嵌合衍生物。 特 别地， 使用记载在 WO 03035861 专利申请或 Louvain-Quintard 等人， 2005 中的嵌合凝血酶 可裂解衍生物并进行修饰。
     因此， 本发明涉及因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中所述蛋白的天然激 活肽被上述融合蛋白 FP 取代。
     根据本发明， 本发明也包括本发明因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的功能保 守的变体。
     在一个具体的实施方式中， 本发明还涉及因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中对应于天然因子 X 的重链的前三个残基 (Ile-Val-Gly， SEQ ID NO ： 1 的 235-237 位 ) 的氨基酸可根据 Toso R 等人， 2008 及专利申请 WO 03035861 和 WO 04005347 中描述的修饰 方法进行修饰。
     特别地， 本发明涉及所述因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中 ： - 对应于 SEQ ID NO ： 1 的 235 位残基的异亮氨酸可被丙氨酸、 丝氨酸或亮氨酸取代； - 对应于 SEQ ID NO ： 1 的 236 位残基的缬氨酸可被苯丙氨酸或丙氨酸取代。
     在另一个具体的实施方式中， 本发明还涉及因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生 物， 其中对应于血纤维蛋白肽 A 的最后三个残基的氨基酸 (Gly-Val-Arg， SEQ ID NO ： 4的 14-16 位 ) 也可根据 Gustafsson D 等人， 2004 和专利申请 WO 04005347 中描述的修饰方法 进行修饰。
     特别地， 本发明涉及所述因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中 ：
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 14 位残基的甘氨酸可被缬氨酸、 苯丙氨酸或丙氨酸取 代；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 15 位残基的缬氨酸可被脯氨酸取代。
     根据本发明， 所述修饰用于提高凝血酶的切割或激活的因子 X 的效力， 且不改变 本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。
     因此， 本发明涉及因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中所述蛋白的天然激 活肽被融合蛋白取代， 所述融合蛋白含有 ：
     - 多肽 PP， 和
     - 由氨基酸序列 SEQ ID NO ： 5 或 SEQ ID NO ： 6 定义的血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂 解衍生物。
     在一个实施方式中， 所述因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的特征在于所述多 肽是因子 X 的天然激活肽 (SEQ ID NO ： 2)。
     在另一个实施方式中， 所述因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的特征在于所述 血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物由选自 SEQ ID NO ： 7、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 11 和 SEQ ID NO ： 12 的氨基酸序列选择的氨基酸序列限定。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中 - 所述多肽是因子 X 的天然激活肽 (SEQ ID NO ： 2)， 和
     - 所述血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物由氨基酸序列 DFLAEGGGVRIVG(SEQ ID NO ： 7) 定义。
     本发明也涉及蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中所述蛋白的天然激活肽 被融合蛋白 FP 取代。
     根据本发明， 本发明也包括本发明蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的功能保 守的变体。
     在一个具体的实施方式中， 在所述蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物中， 对应 于天然蛋白 C 的重链的前三个残基的氨基酸 (Leu-Ile-Asp， SEQ ID NO ： 3 的 212-214 位 ) 可以根据专利申请 WO 03035861 中描述的改性法改性。
     特别是， 在本发明蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物中 ：
     - 对应于 SEQ ID NO ： 3 的 212 位残基的亮氨酸可被丙氨酸或丝氨酸取代 ；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 3 的 213 位残基的异亮氨酸可被苯丙氨酸取代 ；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 3 的 214 位残基的天冬氨酸可被甘氨酸取代。
     在另一个具体的实施方式中， 本发明还涉及蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生 物， 其中对应于血纤维蛋白肽 A 的最后三个残基的氨基酸 (Gly-Val-Arg， SEQ ID NO ： 4的 14-16 位 ) 也可以根据 Gustafsson D 等人， 2004 和专利申请 WO 04005347 中描述的修饰方 法进行修饰。
     特别地， 本发明涉及所述因子 X 的嵌合凝血酶可裂解衍生物， 其中 ：
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 14 位残基的甘氨酸可被缬氨酸、 苯丙氨酸或丙氨酸取 代；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 15 位残基的缬氨酸可被脯氨酸取代。
     根据本发明， 所述修饰用于提高凝血酶的切割或激活的蛋白 C 衍生物的效力， 且 不改变本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。
     本发明还涉及蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中所述蛋白的天然激活肽 被融合蛋白取代， 所述融合蛋白含有 ：
     - 多肽 PP， 和
     - 由氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13 或 SEQ ID NO ： 14 定义的血纤维蛋白肽 A 凝血酶可 裂解衍生物。
     在一个实施方式中， 所述多肽是因子 X 的天然激活肽 (SEQ ID NO ： 2)。
     在另一个实施方式中， 所述血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物由选自 SEQ ID NO ： 15、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 19、 SEQ ID NO ： 20、 SEQ ID NO ： 21、 SEQ ID NO ： 22、 SEQ ID NO ： 23、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 25 和 SEQ ID NO ： 26 的氨基酸序列中选择的氨基酸序列限定。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生 物， 其中 ：
     - 所述多肽是因子 X 的天然激活肽 (SEQ ID NO ： 2)， 和
     - 所述血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物由氨基酸序列 DFLAEGGGVRLID(SEQ ID NO ： 15) 定义。
     本发明的另一个目的涉及蛋白 C 的嵌合衍生物， 其中多肽 PP 在天然蛋白 C 的激活 肽的氨基末端部分融合。
     本发明的另一个目的涉及丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物， 其特征在于它含有所 述激活的丝氨酸蛋白酶或其功能保守的变体和多肽 PP。
     特别地， 本发明涉及目标丝氨酸蛋白酶的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其特征在 于它包含所述激活的丝氨酸蛋白酶或其功能保守的变体和融合蛋白 FP。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其 包含激活的因子 X 或其功能保守的变体和融合蛋白 FP。
     在优选的实施方式中， 本发明涉及因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其含有 激活的因子 X 或其功能保守的变体和融合蛋白 FP， 其中融合蛋白 FP 的羧基末端部分与激活 的因子 X 的重链的氨基末端部分融合。
     根据本发明， 一些氨基酸可以被取代、 删除或添加以提高本发明因子 X 的嵌合的 凝血酶可裂解衍生物的活性。特别是， 对应于血纤维蛋白肽 A 的最后三个氨基酸 ( 氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 4 的 14 到 16 位 ) 和对应于激活的因子 X 的重链的前三个氨基酸 ( 氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 1 的 235 到 237 位 ) 的氨基酸可如上所述进行修饰。
     特别地， 本发明涉及所述的本发明因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中 ：
     - 对应于 SEQ ID NO ： 1 的 235 位残基的异亮氨酸可被丙氨酸、 丝氨酸或亮氨酸取 代；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 1 的 236 位残基的缬氨酸可被苯丙氨酸或丙氨酸取代。
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 14 位残基的甘氨酸可被缬氨酸、 苯丙氨酸或丙氨酸取 代；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 15 位残基的缬氨酸可被脯氨酸取代，
     根据本发明， 所述修饰用于提高凝血酶的切割或激活的因子 X 衍生物的效力， 且 不改变本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及含有激活的蛋白 C 的蛋白 C 的嵌合的凝血 酶可裂解衍生物或其功能保守的变体和融合蛋白 FP。
     在优选的实施方式中， 本发明涉及含有激活的蛋白 C 的蛋白 C 的嵌合的凝血酶可 裂解衍生物， 其或其功能保守的变体和融合蛋白 FP， 其中所述融合蛋白 FP 的羧基末端部分 与激活的蛋白 C 的重链的氨基末端部分融合。
     根据本发明， 一些氨基酸可以被取代、 删除或添加以改进本发明蛋白 C 的嵌合的 凝血酶可裂解衍生物。特别是， 对应于激活的蛋白 C 的重链的前三个氨基酸 (SEQ ID NO ： 3 的 212-214 位 ) 的氨基酸可如上所述进行修饰。
     特别地， 在本发明蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物中 ：
     - 对应于 SEQ ID NO ： 3 的 212 位残基的亮氨酸可被丙氨酸或丝氨酸取代 ；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 3 的 213 位残基的异亮氨酸可被苯丙氨酸取代 ；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 3 的 214 位残基的天冬氨酸可被甘氨酸取代 ；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 14 位残基的甘氨酸可被缬氨酸、 苯丙氨酸或丙氨酸取代； - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 15 位残基的缬氨酸可被脯氨酸取代。
     根据本发明， 所述修饰用于提高凝血酶的切割或激活的蛋白 C 衍生物的效力， 且 不改变本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。
     核酸、 载体和重组宿主细胞
     本发明的另一个目的涉及编码本发明多肽和嵌合衍生物的核酸分子。
     在一个实施方式中， 本发明涉及编码上述因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的 核酸分子。
     在另一个实施方式中， 本发明涉及编码上述蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物 的核酸分子。
     “编码序列” 或 “编码” 表达产物 ( 例如 RNA、 多肽、 蛋白质或酶 ) 的序列是被表达 时产生 RNA、 多肽、 蛋白质或酶的核苷酸序列， 也就是说， 核苷酸序列编码该多肽、 蛋白质或 酶的氨基酸序列。蛋白质的编码序列可以包括起始密码子 ( 通常是 ATG) 和终止密码子。
     这些核酸分子可以通过本领域技术人员熟知的常规方法获得， 特别是通过编码天 然蛋白的基因的定点诱变获得。
     通常， 所述核酸是 DNA 或 RNA 分子， 其可以包括在适当的载体中， 例如质粒、 粘粒、 附加体、 人工染色体、 噬菌体或病毒载体。
     因此， 本发明的另一个目的涉及载体和表达盒， 其中本发明的核酸分子与用于控 制转录的适当元件 ( 特别是启动子、 增强子和任选的终止子 ) 和任选地控制翻译的元件结 合， 且也涉及本发明核酸分子插入其中的重组载体。 例如， 这些重组载体可以是克隆载体或 表达载体。
     术语 “载体” 、 “克隆载体” 和 “表达载体” 意指 DNA 或 RNA 序列 ( 例如外源基因 ) 可 以通过其引入宿主细胞中的媒介体， 从而使宿主转化并促进所引入序列的表达 ( 例如转录 和翻译 )。
     可 以 使 用 用 于 动 物 细 胞 的 任 何 表 达 载 体， 只要编码本发明多肽或嵌合衍生 物 的 基 因 可 以 被 插 入 和 表 达。 适 合 的 载 体 例 子 包 括 pAGE107(Miyaji H 等 人， 1990)、 pAGE103(Mizukami T 等人， 1987)、 pHSG274(Brady G 等人， 1984)、 pKCR(O′ Hare K 等人， 1981)、 pSG1 beta d2-4-(Miyaji H 等人， 1990) 等。
     质粒的其他例子包括含有复制原点的复制质粒或整合质粒， 例如 pUC、 pcDNA、 pBR 等。
     病毒载体的其他例子包括腺病毒、 逆转录病毒、 疱疹病毒和 AAV 载体。这种重组病 毒可由本领域已知的技术制备， 例如通过转染包装细胞或通过辅助质粒 (helper plasmid) 或病毒瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括 PA317 细胞、 PsiCRIP 细胞、 GPenv+ 细胞、 293 细胞等。用于制备这种复制 - 缺陷型重组病毒的详细方案例如可从 WO 95/14785、 WO 96/22378、 US 5,882,877、 US 6,013,516、 US 4,861,719、 US 5,278,056 和 WO 94/19478 中 找到。
     用于动物细胞的表达载体中使用的启动子和增强子的例子包括 SV40 的早期启 动子和增强子 (Mizukami T. 等人， 1987)、 莫洛尼小鼠白血病病毒的 LTR 启动子和增强子 (Kuwana Y 等人， 1987)、 免疫球蛋白 H 链的启动子 (Mason JO 等人， 1985) 和增强子 (Gillies
     SD 等人， 1983) 等。
     本发明也包括含有本发明核酸分子的基因传递系统 (gene delivery system)， 其 可用于体内或体外的基因治疗。这例如包括病毒转移载体， 例如源自逆转录病毒、 腺病毒、 腺伴随病毒、 慢病毒属的那些， 它们常规地用于基因治疗。 这也包括含有本发明核酸分子和 非病毒基因传递媒介的基因传递系统。非病毒基因传递媒介的例子包括脂质体和聚合物 ( 例如聚乙烯亚胺、 环糊精、 组氨酸 / 赖氨酸 (HK) 聚合物等 )。
     本发明的主题也涉及用至少一种本发明的核酸分子遗传转化的原核或真核宿主 细胞。
     术语 “转化” 意指将 “外源” ( 即外来的或细胞外的 ) 基因、 DNA 或 RNA 序列引入宿 主细胞中以使宿主细胞表达所引入的基因或序列， 从而生成所需物质， 通常是由引入的基 因或序列编码的蛋白质或酶。接受和表达所引入的 DNA 或 RNA 的宿主细胞已被 “转化” 。
     优选地， 为表达和生成多肽和嵌合衍生物， 特别是本发明的蛋白 C 和因子 X 衍生 物， 选择真核细胞， 特别是哺乳动物细胞， 更特别是人细胞。
     通常， 可以使用细胞系例如 CHO、 BHK-21、 COS-7、 C127、 PER.C6 或 HEK293， 因为其对 衍生物进行正确的翻译后修饰的能力。
     本发明也包括带有包含本发明表达盒的至少一种转基因的转基因动物， 特别是转 基因非人类哺乳动物。 所述转基因动物可用于制备本发明的嵌合蛋白， 如例如早已由 Brink 等人， 2000 所描述的。
     本发明的表达载体的构建、 宿主细胞的转化和转基因动物的产生可以使用常规的 分子生物学技术完成。本发明的嵌合衍生物， 特别是蛋白 C 或因子 X 衍生物， 例如可以通过 培养本发明的遗传转化细胞并从培养基中回收由所述细胞表达的所述衍生物获得。 如有必 要， 它们随后可通过本领域技术人员本身已知的常规方法纯化， 例如通过分级沉淀 ( 特别 是硫酸铵沉淀 )、 电泳、 凝胶过滤、 亲和层析等。
     特别地， 用于制备和纯化重组蛋白的常规方法可用于制备本发明的蛋白质。 例如， 为制备本发明的蛋白 C 衍生物， 可以使用例如美国专利 4992373 或美国专利 4981952 中描 述的方法。
     治疗方法和用途
     本发明的第三个目的涉及本发明的嵌合衍生物在蛋白 C 和因子 X 相关疾病特别是 凝血功能障碍的预防或治疗中的用途。
     在一个实施方式中， 本发明涉及作为促凝血剂的本发明因子 X 的嵌合衍生物。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及因子 X 的嵌合衍生物在特别地由因子 VIII、 IX 或 XI 缺乏产生的出血型的凝血病症的预防或治疗中的用途。
     这些病症可以特别是 A 或 B 型血友病， 其可以是或不是因抑制剂 ( 中和抗常规用 于治疗的因子 VIII 或 IX 的同种抗体 ) 的存在而复杂化 ； 它们也可以是由于与另一种病症 ( 自身免疫性疾病、 癌症、 淋巴增生综合症、 特发性障碍等 ) 相关的自身抗体的出现而引起 的获得性血友病。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及用于 A 或 B 型血友病的预防或治疗的因子 X 的嵌合衍生物。
     在另一个实施方式中， 本发明涉及用于 B 型血友病的预防或治疗的因子 IX 的嵌合衍生物。 在另一个实施方式中， 本发明涉及用于纤维增生性疾病例如纤维化组织重建和癌 症的预防或治疗的因子 X 的嵌合衍生物。
     本发明涉及用于由低分子量肝素 (LMWH) 或由靶向因子 Xa(fXa) 的抗凝血剂引起 出血的预防或治疗的方法中的本发明因子 X 的嵌合衍生物。
     靶向因子 Xa 的抗凝血剂是公知的 ( 参见综述 Harenberg， 2008， Bauer， 2008， Kho 等人， 2009)。靶向因子 Xa 的抗凝血剂的例子是利伐沙班和贝曲沙班。
     在优选的实施方式中， 对应于 SEQ ID NO ： 1 的 419 位残基的所述因子 X 的嵌合衍 生物的丝氨酸被丙氨酸取代。
     在另一个实施方式中， 分别对应于 SEQ ID NO ： 1 的 387、 391 和 419 位残基的所述 因子 X 的嵌合衍生物的精氨酸、 赖氨酸和丝氨酸被丙氨酸取代。
     本发明的这些因子 X 的嵌合衍生物进行修饰， 以使它们直接或间接地与因子 Xa 抑 制剂结合。
     在结构上， 这些衍生物被修饰以不提供促凝血活性或降低促凝血活性， 且对于后 一实施方式来说不组装成凝血酶原酶复合物。
     在另一个实施方式中， 本发明涉及作为抗血栓形成剂、 抗炎剂、 抗神经变性剂和抗 细胞凋亡剂的蛋白 C 的嵌合衍生物。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及用于包括高凝性的病症的预防或治疗的蛋 白 C 的嵌合衍生物。
     这样的病症包括但不限于静脉或动脉血栓形成， 特别是影响大口径血管的血栓形 成、 心肌梗死、 血栓性疾病、 肺栓塞、 血管成形术或溶栓治疗后的冠状动脉再闭塞、 中风以及 患有影响 PC 基因或血栓调节蛋白基因的基因异常的患者的凝血异常。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及用于 A 或 B 型血友病的预防或治疗的蛋白 C 的嵌合衍生物。
     在另一个实施方式中， 本发明涉及用于呼吸和炎性疾病的预防或治疗的蛋白 C 的 嵌合衍生物。
     优选地， 所述嵌合衍生物以治疗有效量给药。
     “治疗有效量” 意指以适用于任何医学治疗的合理的利益 / 风险比治疗或预防蛋白 C 和因子 X 相关疾病的足够量的本发明嵌合衍生物。
     可以理解， 本发明化合物和组合物的总的日用量由主治医师在合理医学判断范围 内决定。用于任何特定患者的具体治疗有效剂量将取决于多种因素， 包括被治疗的病症 和病症的严重性 ； 所使用的具体化合物的活性 ； 所使用的具体组合物 ； 患者的年龄、 体重、 总体健康、 性别和饮食 ； 给药时间、 给药途径和所使用的具体化合物的排泄率 ； 治疗持续时 间； 与所使用的具体多肽联合使用或同时使用的药物 ； 以及医学领域公知的类似因素。例 如， 本领域公知所述化合物的起始剂量应低于达到预期治疗效果所要求的剂量水平和逐步 增加剂量直到达到预期效果。然而， 该产品的日剂量可以在每成人每天 0.01 到 1,000mg 的 宽范围内变化。优选地， 组合物包含 0.01、 0.05、 0.1、 0.5、 1.0、 2.5、 5.0、 10.0、 15.0、 25.0、 50.0、 100、 250 和 500mg 的活性成分以对症调整待治疗患者的症状的剂量。通常， 药物含有 约 0.01mg 到约 500mg 的活性成分， 优选 1mg 到约 100mg 的活性成分。药物的有效量通常每
     天 0.0002mg/kg 体重到约 20mg/kg 体重， 优选每天约 0.001mg/kg 体重到 7mg/kg 体重剂量 水平提供。
     药物组合物
     本发明的另一个目的涉及用于蛋白 C 和因子 X 相关疾病 ( 特别是凝血功能障碍 ) 的预防或治疗的含有本发明嵌合衍生物的药物组合物。
     “药学上” 或 “药学上可接受的” 意指当适当地给药于哺乳动物特别是人时， 不产生 不利的、 过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂意指 非毒性固体、 半固体或液体填充剂、 稀释剂、 包封材料或任何类型的制剂辅剂。
     在一个实施方式中， 本发明涉及用于上文详述的出血型、 纤维增生性凝血病症的 治疗的含有因子 X 的嵌合衍生物的药物组合物。
     在另一个实施方式中， 本发明涉及用于上文详述的涉及高凝性的病症、 炎症或呼 吸道疾病的预防或治疗的含有蛋白 C 的嵌合衍生物的药物组合物。
     丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物可以与药学上可接受的赋形剂和任选的持续释 放基质 ( 例如可生物降解的聚合物 ) 组合以形成治疗组合物。
     在用于经口、 舌下、 皮下、 肌肉内、 静脉内、 透皮、 局部或直肠给药的本发明药物组 合物中， 单独使用或与另一种有效成分组合使用的有效成分可以单位给药形式， 作为与常 规药物载体的混合物， 给药于动物和人类。适合的单位给药形式包括口服途径形式 ( 例如 片剂、 胶囊、 粉末、 颗粒和口服悬浮液或溶液 )、 舌下和口腔给药形式、 气雾剂、 植入物、 皮下、 透皮、 局部、 腹膜内、 肌肉内、 静脉内、 真皮下、 透皮、 鞘内和鼻内给药形式及直肠给药形式。
     优选地， 所述药物组合物包含用于能够注射的制剂的药学上可接受的载体。这些 可以特别是等渗、 无菌的盐溶液 ( 磷酸二氢钠或磷酸氢二钠， 氯化钠、 氯化钾、 氯化钙或氯 化镁等或这些盐的混合物 )、 或干燥的 ( 特别是冻干的 ) 组合物， ， 其在加入无菌水或生理盐 水 ( 根据情况 ) 时允许构成可注射溶液。
     适于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体 ； 含有芝麻油、 花生油或水 性丙二醇的制剂 ； 和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下， 该形式必须是无菌和必须是达到易注射的程度的流体。 它在制备和贮存条件下必须是稳定 的， 且必须抗微生物 ( 例如细菌和真菌 ) 污染。
     含有作为游离碱或药学上可接受盐的本发明化合物的溶液可以在与表面活性剂 ( 例如羟丙基纤维素 ) 适当地混合的水中制备。 分散体也可在甘油、 液体聚乙二醇及其混合 物中以及在油中制备。 在常规贮存和使用条件下， 这些制剂包含防腐剂以阻止微生物生长。
     本发明的丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物可配制成中性或盐形式的组合物。 药学 上可接受的盐包括酸加成盐 ( 由蛋白质的游离氨基形成 )， 且其与无机酸 ( 例如盐酸或磷 酸 ) 或有机酸 ( 例如醋酸、 草酸、 酒石酸、 扁桃酸等 ) 形成。由游离羧基形成的盐也可衍生 自无机碱 ( 例如氢氧化钠、 氢氧化钾、 氢氧化铵、 氢氧化钙或氢氧化铁 ) 以及有机碱 ( 例如 异丙胺、 三甲胺、 组氨酸、 普鲁卡因等 )。
     载体也可以是溶剂或分散介质， 包含例如水、 乙醇、 多元醇 ( 例如， 甘油、 丙二醇和 液体聚乙二醇等 )， 其适合的混合物及植物油。例如， 可通过使用包衣 ( 例如卵磷脂 )， 在分 散体的情况下通过保持所需粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。 微生物活 动的预防可由各种抗菌剂和抗真菌剂， 例如对羟基苯甲酸酯、 氯丁醇、 苯酚、 山梨酸、 硫柳汞等来实现。在许多情况下， 优选包括等渗剂， 例如， 糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收 可通过在组合物中使用延缓吸收剂， 例如单硬脂酸铝和明胶， 来实现。
     无菌注射溶液通过以下步骤制备 ： 将所需量的活性多肽与以上列举的几种其他成 分 ( 根据需要 ) 一起加入适当的溶剂中， 然后过滤除菌。通常， 分散体通过以下步骤制备 ： 将各种无菌活性成分加入无菌载体中， 所述载体含有基础分散介质和所需的以上列举的其 他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况中， 优选的制备方法是真空干燥和冻 干技术， 其从先前的无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何其他所需成分的粉末。
     在制剂时， 将溶液以与剂型相容的方式和以治疗有效的量给药。该制剂容易以多 种给药形式给药， 例如上述的可注射溶液类型， 但也可以使用药物缓释胶囊等。
     对于以水性溶液形式的肠胃外给药， 例如， 应将所述溶液适当缓冲 ( 如有必要 ) 并 首先利用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水性溶液尤其适于静脉内、 肌肉内、 皮下和腹膜内给药。关于这一点， 根据本发明的公开， 可使用的无菌水性介质对于 本领域技术人员是已知的。例如， 一剂药物可以溶解在 1ml 的等渗 NaCl 溶液中， 并加入到 1000ml 皮下输注液体中或在建议的输注部位注射。根据被治疗受试者的状况， 进行一些剂 量的变化将是必要的。无论如何， 负责给药的人将决定单个受试者的适当剂量。 本发明的丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物可在配制成治疗混合物以包含每剂约 0.0001 到 1.0 毫克、 或约 0.001 到 0.1 毫克、 或约 0.1 到 1.0 或甚至约 10 毫克左右。也可 多剂量给药。
     除了配制成用于肠胃外给药 ( 例如静脉内或肌肉内注射 ) 的本发明化合物外， 其他药学上可接受的形式例如包括用于口服的片剂或其他固体 ； 脂质体制剂 ； 延时释放胶 囊； 和任何其他目前使用的形式。
     附图说明
     图1： 因子 X 酶原氨基酸序列的不同部分的图示。
     前肽 ( 或信号肽 ) 由 -40 到 -18 位之间的氨基酸序列定义， 且由 -17 到 -1位之间的氨基酸序列定义。对应于 1 到 142 位氨基酸之间的序列， 重链对应于 195 到448 位氨基酸之间的序列。激活肽 (143 到 194 位 ) 加框， 且关注的 N- 糖基化位点用 * 标 记。 所用的编号系统显示在与序列相同的行上， 其他参照系统在序列下的行上以灰色显示。
     图2： 对于因子 X 的凝血酶可裂解衍生物的血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物 的图示。
     A. 所述血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物包含血纤维蛋白肽 A 的氨基酸序列， 其中 14 或 15 位的氨基酸可以根据图示修饰。在羧基末端部分， 增加 3 个另外的氨基酸以 形成带有血纤维蛋白肽 A( 或衍生物 ) 的最后 3 个氨基酸的 6 个氨基酸的凝血酶可裂解位 点。
     B. 在本发明的优选方式中， 仅使用血纤维蛋白肽 A 的最后 10 个氨基酸， 并与 3 个 氨基酸的肽融合以形成凝血酶可裂解位点。
     图3： 对于蛋白 C 的凝血酶可裂解衍生物的血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物 的图示。
     A. 所述血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物包含血纤维蛋白肽 A 的氨基酸序列，且在羧基末端部分增加 3 个氨基酸以形成带有血纤维蛋白肽 A( 或衍生物 ) 的最后 3 个氨 基酸的 6 个氨基酸的凝血酶可裂解位点。
     B. 在本发明的优选方式中， 仅使用血纤维蛋白肽 A 的最后 10 个氨基酸， 并与 3 个 氨基酸的肽融合以形成凝血酶可裂解位点。
     图4： FX 变体构建体的图示。
     有七个重组因子 X(FX) 蛋白。蛋白结构域如下 ： 轻链是灰色， 激活肽 (AP) 是白色， 因子 X 的催化域 (catalytic domain) 是黑色。激活肽是不同变体间的差异位点。FpA 相当 于由 SEQ ID NO ： 7 定义的血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物， ap 对应于 FX 激活肽的羧 基末端的残基 176-194， 黑线表示 FX 激活肽中 N181A 和 N191A 的突变位点。
     图5： 蛋白 C 变体构建体的图示。
     有三个重组蛋白 C 蛋白。蛋白结构域如下 ： 轻链是灰色， 激活肽 (AP) 是白色， 和蛋 白 C 的催化域是黑色。FpA 相当于由 SEQ ID NO ： 7 定义的血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍 生物， PP 对应于 FX 激活肽的羧基末端的残基 176-194。
     图6： wt-FX 从血浆的双相清除 (biphasic clearance)。
     将纯化 wt-FX 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。在指定时点采集血样。血 浆中残留 wt-FX 抗原的量用 ELISA( 参见 “实验过程” ) 定量。血浆中的残留抗原相对于注 射后 2min 时存在的量的百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的药代动力学参数 概括于表 I 中。数据表示各时点 3 只小鼠的平均值 ±S.D.。
     图7： FX/delAP-FpA 从血浆的单相清除。
     将纯化 FX/delAP-FpA 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。 在指定时点采集血 样。血浆中残留 FX/delAP-FpA 抗原的量用 ELISA( 参见 “实验过程” ) 定量。注射后血浆中 残留抗原相对于注射后 2min 时存在的量百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的 药代动力学参数概括于表 I 中。数据表示各时点 3 只小鼠的平均值 ±S.D.。
     图8： FX/AP-FpA 从血浆的双相清除。
     将纯化的 FX/AP-FpA 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。在指定时点采集血 样。血浆中残留 FX/AP-FpA 抗原的量用 ELISA( 参见 “实验过程” ) 定量。注射后血浆中残 留抗原相对于注射后 2min 时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的药 代动力学参数概括于表 I 中。数据表示各时点 3 个小鼠的平均值 ±S.D.。
     图9： FX/AP176-194 从血浆的双相清除。
     将纯化的 FX/AP176-194 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。 在指定时点采集 血样。血浆中残留 FX/AP176-194 抗原的量用 ELISA( 参见 “实验过程” ) 定量。注射后血浆 中残留抗原相对于注射后 2min 时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据 的药代动力学参数概括于表 I 中。数据表示各时点 3 只小鼠的平均值 ±S.D.。
     图 10 ： FX/AP176-194-N181A-N191A 从血浆的单相清除。
     将纯化的 FX/AP176-194-N181A-N191A 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。 在 指定时点采集血样。血浆中残留 FX/AP176-194-N181A-N191A 抗原的量用 ELISA( 参见 “实 验过程” ) 定量。血浆中残留抗原相对于注射后 2min 时存在量的百分比对于注射后的时间 作图。源自这些数据的药代动力学参数概括于表 I 中。数据表示各时点 3 只小鼠的平均值 ±S.D.。图 11 ： FX/AP176-194-N181A 从血浆的双相清除。
     将纯化的 FX/AP176-194-N181A 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。在指定 时点采集血样。血浆中残留 FX/AP176-194-N181A 抗原的量用 ELISA( 参见 “实验过程” )定 量。血浆中残留抗原相对于注射后 2min 时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自 这些数据的药代动力学参数概括于表 I 中。数据表示各时点 3 只小鼠的平均值 ±S.D.。
     图 12 ： FX/AP176-194-N191A 从血浆的单相清除。
     将纯化的 FX/AP176-194-N191A 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。在指定 时点采集血样。血浆中残留 FX/AP176-194-N191A 抗原的量用 ELISA( 参见 “实验过程” )定 量。血浆中残留抗原相对于注射后 2min 时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自 这些数据的药代动力学参数概括于表 I 中。数据表示各时点 3 只小鼠的平均值 ±S.D.。 具体实施方式
     实施例
     材料和方法
     材料
     幼仓鼠肾脏 (BHK) 来自于 ATCC(Rockville， 美国 )。 胎牛血清 (FCS) 和牛血清蛋白 ( 无 BSA 蛋白酶 ) 从 PAA 实验室 (Les Mureaux， 法国 ) 购买。Dulbecco′ s 改良 Eagle′ s/ F12 培养基、 青霉素 / 链霉素、 两性霉素 ( 两性霉素 B 脱氧胆酸盐 ) 从 Invitrogen(Cergy Pontoise， 法 国 ) 获 得。 苯 甲 脒 和 苯 基 磺 酰 氟 (PMSF) 来 自 于 Calbiochem(Meudon， 法 国 )。氨甲喋呤、 维生素 K1、 聚乙二醇 8000(PEG) 从 Sigma(Saint Quentin Fallavier， 法国 ) 购买。N- 苄氧基羰基 -D- 精胺酰基 -L- 精氨酸 - 对 - 硝基酰替苯胺 - 二盐酸化 物 (N-a-Z-D-Arg-Gly-Arg-p-NA) 产品名 S-2765 来自于 Chromogenix( 瑞典 )。 L-α- 磷脂酰基 -L- 丝氨酸 ( 来自牛脑 ) 和 L-α- 胆碱磷脂 ( 来自蛋黄 ) 来自于 Avanti Polarlipids(Albaster， 美国 )。QAE Sephadex A-50、 HiTrapTM Q 柱、 Heparin HiTrap 柱 得自 GE Healthcare(Orsay， 法国 )。抗蛋白 C 亲合性基质从 Roche Diagnostics(Meylan， 法国 ) 购买。
     重组 FX 衍生物的构建
     含有人因子 X cDNA 的哺乳动物表达质粒 pKG5(Christophe 等人， 2001)、 含有人胰 岛素 cDNA 的质粒和含有人蛋白 C cDNA 的质粒用作标准 PCR 诱突的模板， 以产生分别编码全 长人因子 X、 全长人胰岛素和带有 C- 末端 HPC-4 标签的全长人蛋白 ( 残基 EDQVDPRLIDGK， SEQ ID NO ： 27) 的 cDNA。使用 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit v3.1(Applied Biosystems Applera， Courtaboeuf， 法国 ) 在 ABI PRISM 310 DNA 测序 仪上根据厂商的说明通过 DNA 序列分析检查克隆到表达载体 pNUT 中的突变的全长 cDNA。 FX 构建体用作标准 PCR 诱变的模板 ( 参见引物表 I)， 以产生编码在激活肽中具有部分缺失 和特定突变的因子 X 变体的 cDNA， 所述变体称为 FX/AP176-194、 FX/delPA-FpA、 FX/AP-FpA、 FX/AP176-194-N181A、 FX/AP176-194-N191A 和 FX/AP176-194-N181A-N191A( 图 4)。胰岛素 构建体用作标准 PCR 诱突的模板， 以产生编码包含 SEQ ID NO ： 2( 因子 X 的激活肽 ) 的 33 到 52 位的氨基酸序列的含有多肽 PP 的胰岛素变体的 cDNA。类似地， 蛋白 C 构建体用作模 板以产生编码蛋白 C 变体的 cDNA( 图 5)。克隆到 pNUT- 表达载体中的构建体的被完全测序。
     表I： 用于产生不同因子 X 变体的引物
     表达重组衍生物的细胞系的获得
     按照供应商的说明使用 jetPEI 反应物 (Qbiogen， Ozyme， 法国 ) 将 pNUT- 构建 体转染到幼仓鼠肾脏细胞 (BHK) 中。用含有浓度为 100μM 的氨甲喋呤 (Sigma) 的培养 基选择转染细胞后， 在选择培养基中挑选并增殖单克隆以获得稳定的细胞系。使用从 Dako(Dakopatts， Glostrup， 丹麦 ) 获得的抗与辣根过氧化酶偶联或不偶联的因子 X 的多克 隆抗体， 通过酶联免疫吸附试验 (ELISA) 分析因子 X 抗原的产生。来自 Kordia(Leiden， 荷 兰 ) 的纯化人血浆源因子 X(pd-FX) 用作参照。通过来自 Dako 的人胰岛素 ELISA 试剂盒分 析胰岛素的产生。利用用于涂层的亲合纯化的小鼠单克隆抗体 (Roche， Meylan， 法国 ) 和 来自 Dako 的抗与辣根过氧化酶偶联的蛋白的多克隆抗体通过两位点 ELISA 分析蛋白 C 的 产生。选择产生因子 X、 胰岛素和蛋白 C 的细胞系。
     重组因子 X、 胰岛素和蛋白 C 衍生物的制备和纯化
     将产生重组因子 X、 胰岛素和蛋白 C 衍生物以及野生型因子 X、 胰岛素和蛋白 C 的 2 稳定细胞系保持在 300cm 烧瓶中用于在补充有 10％ FCS、 50μM 氨甲喋呤、 100U/ml 青霉素、 100μg/ml 链霉素和 5μg/ml 维生素 K1( 不用于胰岛素 ) 的 DMEM/F-12 中产生蛋白。每 48 小时收集含有目标蛋白的培养基。加入苯甲脒和 PMSF 到最终浓度分别为 10 和 2mM， 培养 基离心 (6000g)， 通过醋酸纤维素膜 (0.45μm) 以除去细胞碎片， 并在使用前在 -20℃下储 存。在 37℃解冻条件培养基。加 EDTA 到最终浓度为 5mM。在蒸馏水和 Tris(pH 7.4) 中 稀释培养基以分别获得 Tris 和 NaCl 的最终浓度 25 和 60mM。然后混合物在室温下与 QAE Sephadex A-50 珠搅拌 30min 以使最终浓度达到 0.25 ％ (wt/v)。洗涤珠子， 然后用 50mMTris(pH 7.4)、 500mM NaCl 和 10mM 苯甲脒洗脱。 洗脱馏分中所包含的重组蛋白 (ELISA) 立 即用含有 10mM 的苯甲脒的 25mM Tris(pH 7.4) 和 100mM NaCl 透析， 并在使用前在 -20℃储 存。在 37℃解冻浓缩的蛋白。加钙到最终浓度为 5mM。按照供应商的说明使用 HPC-4- 琼脂 糖 (Roche， Meylan， 法国 ) 通过亲合色谱进行重组蛋白质的纯化。在作为酶原使用前 1h， 因 子 X 衍生物与 1mM PMSF 一直孵育以中和可能在重组蛋白的制备和纯化期间产生的任何痕 量的激活的因子 X。相同的处理应用于蛋白 C 衍生物。对照实验表明在 Tris-HCl 缓冲液中 30min 后， PMSF 完全水解且不会干扰其他反应。 在还原 (100mM 二硫苏糖醇， 最终浓度 ) 和非 还原条件下使用重组蛋白的 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析， 然后用 Coomassie Brilliant Blue R-250 染色评估蛋白纯度。在还原纯化的重组蛋白并负载到 10％ SDS- 聚丙烯酰胺凝 胶上后， 进行因子 X、 胰岛素和蛋白 C 的鉴定。 将溶解的蛋白转移到 Immobilon 膜上并用抗与 辣根过氧化物酶偶联的因子 X、 胰岛素和蛋白 C 的多克隆抗体 (Dakopatt， Glostrup， 丹麦 ) 染色。等分纯化的衍生物并在使用前储存在 -80℃下。等分试样的浓度以其在 280nm 的吸 光率估计， 取因子 X、 胰岛素和蛋白 C 的消光系数 (E280nm 0.1％ ) 为 1.16、 1.05 和 1.45。
     小鼠
     整个研究使用 C57BL/6 背景的野生型雄性小鼠 (Janvier， Le Genest-St-Isle， 法 国 )， 其为 8 至 9 周大。按照法国规章和欧洲共同体的试验指南所推荐的进行饲养和实验。 24 只小鼠用于各清除率调查。
     小鼠中因子 X 衍生物的清除率、 回收率和生物分布
     将非麻醉小鼠置于约束器中， 其尾部在 40℃水浴中浸 3min。然后， 将在磷酸盐缓 冲盐水 (PBS) 中以 50μg/ml 稀释的 200μl 因子 X 衍生物注射入小鼠尾静脉中。在不同 的时间点 ( 注射后 2、 6、 10 和 30min 及 1、 2、 4 和 8h)， 通过腹膜内注射戊巴比妥钠 (60mg/ kg ； Ceva SantéAnimale， Libourue， 法国 ) 麻醉小鼠并从眼球后静脉丛将血液收集到含有 柠檬酸三钠 (9 体积的血对 1 体积的 0.138M 柠檬酸三钠 ) 的塑料管中。每个时间点用三 只小鼠， 每个小鼠仅流血一次。为了获得贫血小板的血浆， 在室温下 1000g 离心血样 20 分 钟。使用在碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中涂覆的称为 HPC-4 的小鼠单克隆抗体 (Roche) 和辣 根过氧化物酶偶联的抗人因子 X 的多克隆抗体 (Dako)， 通过免疫吸附试验测定血浆中因 子 X 衍生物的浓度。HPC4 标记的重组纯化和定量的野生型因子 X( 参见上文 ) 用作参照。 结果以注入的重组人因子 X 的百分数表示。对于生物分布实验和回收率测定， 如所描述的 (Fracker 和 Speck， BBRC 1978) 使用 Iodo Gen(Pierce Chemical Co.， Rockford， IL， 美国 ) 125 用 Na I(Perkin-Elmer， Courtaboeuf， 法国 ) 标记高度纯化的重组 FX 变体。比放射活性为 4 2 到 10×10 cpm/μg FX 变体。最终制剂中的游离碘通过用 20％三氯乙酸沉淀测定为低于 5％。回收率表示注射后 5min 血浆中存在的 FX 相对于注射的量的百分比。
     小鼠中蛋白 C 和胰岛素变体的清除率
     对于各蛋白 C 和胰岛素变体， 使用 24 只 8 周大的雄性 WT 小鼠。将 10μg 在 PBS 中稀释的纯化重组蛋白经由尾静脉注射入每只小鼠。 在注射后的不同时间点用三溴乙醇麻 醉小鼠 (60mg/kg 体重 )， 并使用水蛭素 (Diagnostica Stago， Asnieres， 法国 )(100UI， 最 终浓度 ) 由眼球后静脉收集血液。每个时间点使用三只小鼠， 各小鼠仅放血一次。制备血 浆并通过 ELISA 或通过剩余活度分析残留的注入抗原的浓度。
     数据分析清除率曲线指随时间变化的小鼠血浆中残留因子 X、 蛋白 C 和胰岛素衍生物抗原 相对于注射量的量 (％注射的浓度 )。数据拟合 ：
     ●单指数方程 ：
     Cp ＝ Ae-αt 方程 1
     ●或双指数方程 ：
     Cp ＝ Ae-αt+Be-βt 方程 2
     使 用 KaleidaGraph 软 件 (KaleidaGraph 版 本 4.02.， 用 于 Mac OS X， Synergy Software， Reading， 美国 ) 测定参数 A、 α、 B 和 β。Cp 指血浆中残留因子 X 衍生物相对于 注射量的量。这些参数是计算平均停留时间 (MRT) 所需要的。
     ●在双相清除过程中 ：
     MRT ＝ (A/α2+B/β2)/(A/α+B/β) 方程 3
     ●在单相清除机制中 ：
     MRT ＝ (A/α2)/(A/α) 方程 4
     此外， α 和 β 使用 T1/2α ＝ ln 2/α 和 T1/2β ＝ ln 2/β 分别计算初始和终 末阶段的半衰期。 凝血酶生成分析
     根 据 Hemker 等 人 描 述 的 方 法 (Hemker HC， Giesen P， Al Dieri R 等 人， Pathophysiol Haemost Thromb 2003 ； 33 ： 4-15)， 在配备有分配器的 Fluoroscan Ascent 荧 光 计 (Thermolabsystems OY， Helsink， Finland) 中 测 定 凝 血 酶 的 产 生。 简 言 之，
     将 补 充 有 盐 ( 对 照 ) 或 指 定 浓 度 的 抗 凝 血 剂 磺 达 肝 癸 钠 (fondaparinux)(Arixtra GlaxoSmithKline， Brentford， 英国 ) 和多种浓度的重组因子 X 衍生物的 80μl 血浆分 配到圆底 96- 孔微量滴定板中。含有 TF( 来自 Dade Behring 的重组脂质化人组织因 子， Innovin ) 和 磷 脂 (PL) 囊 泡 的 20μl 混 合 物 加 入 血 浆 样 品 中， 以获得最终浓度 1pM TF 和 4μM PL 囊 泡。 由 L-α- 磷 脂 酰 -L- 丝 氨 酸 (PS) 和 L-α- 磷 脂 酰 胆 碱 (PC) (Avanti Polarlipids， Albaster， Alabama， 美国 ) 制备的具有 100nm 标称直径的 PL 囊泡 (PC ∶ PS， 3 ∶ 1) 通过膜挤出方法合成 (Olson， F.， Hunt， C.A.， Szoka， F.C.， Vail， W.J. 和 Papahadjopoulos， D.(1979)Biochim Biophys Acta 557(1)， 9-23)。通过磷酸盐分析测定 磷脂浓度。最后， 通过添加含有荧光底物和 CaCl2 的 20μl 起动试剂触发凝血酶生成。荧 光底物 I-1140(Z-Gly-Gly-Arg-AMC) 来自 Bachem AG(Bubendorf， 瑞士 )。 在 37℃使用校正 的自动凝血酶生成图 (thrombogram) 对凝结血浆中的凝血酶产生动力学进行监测 60 分钟， 并使用 ThrombinoscopeTM 软件 (Thrombinoscope B.V.， Maastricht， 荷兰 ) 进行分析。每 个实验需要三个孔， 两个孔用于测定血浆样品的凝血酶生成， 一个孔用于校正。 所有实验重 复进行三次， 报告平均值。 测定内源凝血酶能力 (ETP)， 即曲线下面积， 峰值凝血酶和用于确 定凝血酶检测的延迟时间。
     结果
     重组体野生型因子 X 的双相清除
     为研究因子 X 从血浆中的清除， 将重组体野生型因子 X 静脉注射到小鼠体内。在 注射后的指定时间点， 给小鼠放血， 并分析血浆的因子 X 抗原。抗原值随注射后时间变化的 图示显示， 野生型因子 X 通过双相清除从血中消除， 其特征在于分别为 43 和 305min 的快速和缓慢半衰期 ( 图 6)。此外， 计算出 MRT 为 380min( 表 II)。
     表 II ： 描述 wt- 因子 X 及其变体从血浆的清除率和回收率的药代动力学参数。 N.A. ＝不适用。N.D. ＝未测定
     回收率 wt-FX FX/delAP-FpA FX/AP-FpA FX/AP176-194 FX/AP176-194-N181A-N191A FX/AP176-194-N181A FX/AP176-194-N191A
     69％ N.D. N.D. 67％ 29％ 61％ 76％ MRT 380min 58min 345min 330min 69min 191min 140min T1/2α 43min 40min 38min 44min 48min 15min 96min T1/2β 304min N.A. 266min 255min N.A. 140min N.A.重组 FX/delAP-FpA 的单相清除
     为确定激活肽在因子 X 的清除动力学中的作用， 设计、 制备并纯化了去除其激活 肽的因子 X 变体。命名为 FX/delAP-FpA 的该变体不具有因子 X 激活肽， 而具有对应于血纤 维蛋白肽 A 的羧基末端的 10 个残基。所述血纤维蛋白肽 A 残基的序列与存在于 FX 激活肽 中的相应的残基不同。 与野生型因子 X 相反， 在注射到小鼠体内后， FX/delAP-FpA 显示单相 清除模式， 表观半衰期为 40 分钟 ( 图 7)。另外， 与野生型因子 X 相比， 对于截短的分子 MRT 减少 6 倍 ( 表 II)。总之， 这些数据表明， 因子 X 的激活肽对血浆中因子 X 的清除起着重要 作用。
     重组 FX/AP-FPA 的双相清除
     为证实在 FX/delAP-FpA 的清除模式和药代动力学参数上观察到的效应不是由于 血纤维蛋白肽 A 残基的存在而是由于因子 X 激活肽的缺失， 设计、 制备、 纯化并鉴定了 FX/ AP-FpA。这一因子 X 变体包含在其羧基末端连接至血纤维蛋白肽 A 的 10 个残基的因子 X 激活肽的 52 个残基。将纯化的变体通过尾静脉注射施用于小鼠。观察到类似于野生型因 子 X 的清除模式 ( 图 8)。如表 II 所概括的， 对于该变体和 wt-FX 获得了类似的药代动力学 参数。因此， 先前观察到的 FX/delAP-FpA 清除的高速率 ( 参见上文 ) 与 FIX 序列的存在无 关， 而是由于 FX 激活肽的 52 个残基的缺失。
     重组 FX/AP176-194 的双相清除
     关注的是影响因子 X 清除的激活肽的残基。为此目的， 构建了称为 FX/AP176-194 的仅具有因子 X 激活肽的羧基末端的 19 个残基的因子 X 变体。通过尾静脉注射将纯化的 变体施用于小鼠。在不同时间点给小鼠放血并分析血浆的因子 X 抗原。这些实验显示， FX/ AP176-194 以与野生型因子 X 类似的方式从血浆中清除 ( 图 9)。事实上， 从试验数据可计 算得到类似的药代动力学参数 ( 表 II)。 这些数据证明， 因子 X 激活肽的羧基末端内的残基在因子 X 清除中起着重要作用。
     激活肽中的 N- 糖基化参与 FX 从循环的清除
     由于因子 X 的羧基末端包含两个 N- 糖基化位点 (Asn 181 和 191)， 使用在一 个或两个 N- 糖基化位点突变的 FX/AP 176-194 研究了这些翻译后修饰对因子 X 的循 环 寿 命 的 可 能 作 用。 制 备 了 称 为 FX/AP176-194-N181A、 FX/AP176-194-N191A 和 FX/ AP176-194-N181A-N191A 的两个单突变的和一个双突变的变体， 进行纯化并研究其清除。 双 突变体 FX/AP176-194-N181A-N191A 从循环中的清除比野生型因子 X 更快速， 且有意思地是 具有类似于 FXdelAP-FpA( 不具有因子 X 激活肽的因子 X 变体 ) 的清除模式 ( 图 10)。如 表 II 所示， 对于 FX/AP176-194-N181A-N191A 和 FX/delAP-FpA 获得了类似的药代动力学参 数。这些数据证明， 激活肽中的 181 和 191 位的 N- 糖基化对因子 X 的存留起着重要作用。 对于变体 FX/AP176-194-N181A， 观察到类似野生型因子 X 的双相清除 ( 图 11)。然而， 其从 循环中的消除如表 II 所示的比 wt-FX 更快。对于变体 FX/AP176-194-N191A， 观察到类似 于 FX/delAP-FpA 的单相清除 ( 图 12)。相反， 其消除比 FX/delAP-FpA 时间更长， 但与 FX/ AP176-194-N181A 相比具有类似的 MRT。这些数据显示， 181 位的 N- 糖基化造成因子 X 清除 的单相模式， 而 191 位的 N- 糖基化造成双相模式。此外， 两种 N- 糖基化对因子 X 的药代动 力学参数均起重要作用。
     参考文献
     在本申请中， 各个参考文献描述了本发明所属领域的技术现状。因此这些参考文 献的公开以引用方式合并入本公开。
     Arnljots B， Bergqvist D， B.Inhibition of microarterial thrombosis by activated protein C in a rabbit model.Thromb Haemost.1994 ； 72(3) ： 415-20.
     Bauer KA.New anticoagulants.Curr Opin Hematol.2008 ； 15(5) ： 509-15.
     Bernard GR， Vincent JL， Laterre PF， LaRosa SP， Dhainaut JF， Lopez-Rodriguez A， Steingrub JS， Garber GE， Helterbrand JD， Ely EW， Fisher CJ Jr.Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis.N Engl J Med.2001 ； 344(10) ： 699-709.
     Borensztajn K， Peppelenbosch MP， Spek CA.Factor Xa ： at the crossroads between coagulation and signaling in physiology and disease.Trends Mol Med.2008 ； 14(10) ： 429-40.
     Brady G， Jantzen HM， Bernard HU， Brown R， Schutz G， Hashimoto-Gotoh T.New cosmid vectors developed for eukaryotic DNA cloning.Gene.1984 Feb ； 27(2) ： 223-32.
     Brink MF， Bishop MD， Pieper FR.Developing efficient strategies for the generation of transgenic cattle which produce biopharmaceuticals in milk. Theriogenology.2000 ； 53(1) ： 139-48.
     Camire RM， Larson PJ， Stafford DW， High KA.Enhanced gamma-carboxylation of recombinant factor X using a chimeric construct containing the prothrombin propeptide.Biochemistry.2000 ； 39(46) ： 14322-9.Chesebro JH ， Webster MW ， Zoldhelyi P ， Roche PC ， Badimon L ， Badimon JJ.Antithrombotic therapy and progression of coronary artery disease. Antiplatelet versus antithrombins.Circulation.1992 ； 86(6 Suppl) ： III100-10.
     Christophe OD， Lenting PJ， Cherel G， Boon-Spijker M， Lavergne JM， Boertjes R， Briquel ME， de Goede-Bolder A， Goudemand J， Gaillard S， d′ Oiron R， Meyer D， Mertens K.Functional mapping of anti-factor IX inhibitors developed in patients with severe hemophilia.Blood.2001 ； 98(5) ： 1416-23.
     Comp PC， Esmon CT.Generation of fibrinolytic activity by infusion of activated protein C into dogs.J Clin Invest.1981 ； 68(5) ： 1221-8.
     Esmon CT.Regulation of blood coagulation.Biochim Biophys Acta.2000 ； 1477(1-2) ： 349-60.
     Gillies SD ，Morrison SL ，Oi VT ，Tonegawa S.A tissue-specific transcription enhancer element is located in the major intron of a rearranged immunoglobulin heavy chain gene.Cell.1983 Jul ； 33(3) ： 717-28.
     Gresele P， Momi S， Berrettini M， Nenci GG， Schwarz HP， Semeraro N， Colucci M.Activated human protein C prevents thrombin-induced thromboembolism in mice. Evidence that activated protein c reduces intravascular fibrin accumulation through the inhibition of additional thrombin generation.J Clin Invest.1998 ； 101(3) ： 667-76.
     G r u b e r A ，G r i f f i n J H ，H a r k e r L A ，H a n s o n S R . I n h i b i t i o n o f platelet-dependent thrombus formation by human activated protein C in a primate model.Blood.1989 ； 15 ； 73(3) ： 639-42.
     Gustafsson D， Bylund R， Antonsson T， Nilsson I，JE， Eriksson U，Bredberg U， Teger-Nilsson AC.A new oral anticoagulant ： the 50-year challenge.Nat Rev Drug Discov.2004 ； 3(8) ： 649-59.
     Hanson SR ，Griffin JH ，Harker LA ，Kelly AB ，Esmon CT ，Gruber A.Antithrombotic effects of thrombin-induced activation of endogenous protein C in primates.J Clin Invest.1993 ； 92(4) ： 2003-12.
     Harenberg J.Development of new anticoagulants ： present and future.Semin Thromb Hemost.2008 ； 34(8) ： 779-93.
     Jang Y， Guzman LA， Lincoff AM， Gottsauner-Wolf M， Forudi F， Hart CE， Courtman DW， Ezban M， Ellis SG， Topol EJ.Influence of blockade at specific levels of the coagulation cascade on restenosis in a rabbit atherosclerotic femoral artery injury model.Circulation.1995 ； 92(10) ： 3041-50.
     Joyce DE， Gelbert L， Ciaccia A， DeHoff B， Grinnell BW.Gene expression profile of antithrombotic protein c defines new mechanisms modulating inflammation and apoptosis.J Biol Chem.2001 ； 276(14) ： 11199-203.
     Kurz KD ，Smith T ，Wilson A ，Gerlitz B ，Richardson MA ，Grinnell BW.Antithrombotic efficacy in the guinea pig of a derivative of human proteinC with enhanced activation by thrombin.Blood.1997 ； 89(2) ： 534-40.
     Khoo CW， Tay KH， Shantsila E， Lip GY.Novel oral anticoagulants.Int J Clin Pract.2009 ； 63(4) ： 630-41.
     Kuwana Y， Asakura Y， Utsunomiya N， Nakanishi M， Arata Y， Itoh S， Nagase F， Kurosawa Y.Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V regions and T-cell receptor-derived C regions.Biochem Biophys Res Commun.1987 Dec 31 ； 149(3) ： 960-8.
     Louvain-Quintard VB， Bianchini EP， Calmel-Tareau C， Tagzirt M， Le Bonniec BF.Thrombin-activable factor X re-establishes an intrinsic amplification in tenase-deficient plasmas.J Biol Chem.2005 ； 280(50) ： 41352-9.
     Mason JO， Williams GT， Neuberger MS.Transcription cell type specificity is conferred by an immunoglobulin VH gene promoter that includes a functional consensus sequence.Cell.1985 Jun ； 41(2) ： 479-87.
     Miyaji H， Mizukami T， Hosoi S， Sato S， Fujiyoshi N， Itoh S.Expression of human beta-interferon in Namalwa KJM-1 which was adapted to serum-free medium. Cytotechnology.1990 Mar ； 3(2) ： 133-40.
     Mizukami T， Itoh S.A new SV40-based vector developed for cDNA expression in animal cells.J Biochem(Tokyo).1987 May ； 101(5) ： 1307-10.
     Mizutani A， Okajima K， Uchiba M， Noguchi T.Activated protein C reduces ischemia/reperfusion-induced renal injury in rats by inhibiting leukocyte activation.Blood.2000 ； 95(12) ： 3781-7.
     O′ Hare K， Benoist C， Breathnach R.Transformation of mouse fibroblasts to methotrexate resistance by a recombinant plasmid expressing a prokaryotic dihydrofolate reductase.Proc Natl Acad Sci U S A.1981 Mar ； 78(3) ： 1527-31.
     Rezaie AR.Vitronectin functions as a cofactor for rapid inhibition of activated protein C by plasminogen activator inhibitor-1.Implications for the mechanism of profibrinolytic action of activated protein C.J Biol Chem.2001 ； 276(19) ： 15567-70.
     Rudolph AE ， Mullane MP ， Porche-Sorbet R ， Miletich JP.Expression ， purification， and characterization of recombinant human factor X.Protein Expr Purif.1997 ； 10(3) ： 373-8.
     Taylor FB Jr， Chang A， Esmon CT， D′ Angelo A， Vigano-D′ Angelo S， Blick KE.Protein C prevents the coagulopathic and lethal effects of Escherichia coli infusion in the baboon.J Clin Invest.1987 ； 79(3) ： 918-25.
     Toso R， Zhu H， Camire RM.The conflormational switch from the factor X zymogen to protease state mediates exosite expression and prothrombinase assembly.J Biol Che m.2008 ； 283(27) ： 18627-35.
     背景技术 凝血是在响应血管损伤而发生的主要和复杂的过程。 它包括形成凝块以停止出血 和开始修复受损血管 ： 其壁由含有血小板和血纤维蛋白的凝块覆盖。该过程几乎在损伤后 立即开始。
     凝血过程包括两种类型的组分 ： 称为血小板的细胞组分和称为凝血因子的蛋白组 分。 血小板立即在损伤部位形成栓塞 ； 这称为初级止血。 同时发生次级止血 ： 称为凝血因子 或凝固因子的血浆蛋白作出复杂级联响应， 以形成强化血小板栓塞的血纤维蛋白丝。
     次级止血的凝血级联被分成两种途径， 称为内源性途径或接触激活途径， 和外源 性途径， 也称为组织因子途径。许多凝血因子以及辅因子和调节因子参与其中以恰当地维 持该过程。
     例如， 蛋白 C 是用于调节凝血的主要机制 ( 称为 “抗凝血剂途径” ) 的关键因子。 蛋白 C 的活性形式 ( 激活的蛋白 C) 是丝氨酸蛋白酶， 其在与另一种辅因子 ( 蛋白 S) 结合 时降解对凝血酶的大量产生必要的凝血级联的两种因子 ： 因子 Va 和 VIIIa。这些因子的 破坏负向调节所形成的凝血酶的量， 导致抗凝血效应。特别是已知这种蛋白具有多效生物 活性 ： 不仅具有抗血栓形成活性 (Taylor 等人， 1987 ； Gruber 等人， 1990 ； Chesebro 等人， 1992 ； Hanson 等人， 1993 ； Arnljots 等人， 1994 ； Sakamoto 等人， 1994， Jang 等人， 1995， Kurz 等人， 1997 ； Gresele 等人， 1998 ； Mizutani 等人， 2000 ； Bernard 等人， 2001)， 还具有抗炎活 性 (Emson， 2000)、 抗细胞凋亡活性 (Joyce 等人， 2001) 和促溶血纤活性 (Comp 等人， 1981 ； Rezaie， 2001)。
     因子 IX( 以下称为 FIX) 是凝血的一个关键丝氨酸蛋白酶。 这种蛋白的缺失引起出 血病症， 称为 B 型血友病。在凝血期间， 激活的 FIX(FIXa) 与其激活辅因子， 因子 VIIIa( 以 下称为 FVIIIa)， 结合， 将其特定底物因子 X(FX， 以下称为 FX) 转换为其激活的衍生物， 激活 的因子 X( 以下称为 FXa)。
     因子 X 是凝血级联的另一个关键因子。 FX 的激活形式 (FXa) 是能够在与其辅因子 ( 凝血因子 Va) 结合时将凝血酶原活化成凝血酶的唯一的丝氨酸蛋白酶。此外， 长期被认 为是被动旁观者的因子 X 目前表现为经由其两种主要受体 ( 蛋白酶激活受体 -1(PAR-1) 和 PAR-2) 的激活作用于各种各样细胞类型的直接参与者。 最近的发现提示， PAR-2 在纤维 - 增 殖性疾病 ( 例如纤维化、 组织重建和癌症 ) 中起着重要作用， 并指因子 X 为协调凝血和疾病 进展之间的分界的重要介质 (Borensztajn 等人， 2008)。
     蛋白 C、 因子 IX 和因子 X 分别是肝脏中合成的 62kDa、 55kDa 和 59kDa 的糖蛋白。
     凝血过程包括两种类型的组分 ： 称为血小板的细胞组分和称为凝血因子的蛋白组 分。 血小板立即在损伤部位形成栓塞 ； 这称为初级止血。 同时发生次级止血 ： 称为凝血因子 或凝固因子的血浆蛋白作出复杂级联响应， 以形成强化血小板栓塞的血纤维蛋白丝。
     次级止血的凝血级联被分成两种途径， 称为内源性途径或接触激活途径， 和外源 性途径， 也称为组织因子途径。许多凝血因子以及辅因子和调节因子参与其中以恰当地维 持该过程。
     例如， 蛋白 C 是用于调节凝血的主要机制 ( 称为 “抗凝血剂途径” ) 的关键因子。 蛋白 C 的活性形式 ( 激活的蛋白 C) 是丝氨酸蛋白酶， 其在与另一种辅因子 ( 蛋白 S) 结合 时降解对凝血酶的大量产生必要的凝血级联的两种因子 ： 因子 Va 和 VIIIa。这些因子的 破坏负向调节所形成的凝血酶的量， 导致抗凝血效应。特别是已知这种蛋白具有多效生物 活性 ： 不仅具有抗血栓形成活性 (Taylor 等人， 1987 ； Gruber 等人， 1990 ； Chesebro 等人， 1992 ； Hanson 等人， 1993 ； Arnljots 等人， 1994 ； Sakamoto 等人， 1994， Jang 等人， 1995， Kurz 等人， 1997 ； Gresele 等人， 1998 ； Mizutani 等人， 2000 ； Bernard 等人， 2001)， 还具有抗炎活 性 (Emson， 2000)、 抗细胞凋亡活性 (Joyce 等人， 2001) 和促溶血纤活性 (Comp 等人， 1981 ； Rezaie， 2001)。
     因子 IX( 以下称为 FIX) 是凝血的一个关键丝氨酸蛋白酶。 这种蛋白的缺失引起出 血病症， 称为 B 型血友病。在凝血期间， 激活的 FIX(FIXa) 与其激活辅因子， 因子 VIIIa( 以 下称为 FVIIIa)， 结合， 将其特定底物因子 X(FX， 以下称为 FX) 转换为其激活的衍生物， 激活 的因子 X( 以下称为 FXa)。
     因子 X 是凝血级联的另一个关键因子。 FX 的激活形式 (FXa) 是能够在与其辅因子 ( 凝血因子 Va) 结合时将凝血酶原活化成凝血酶的唯一的丝氨酸蛋白酶。此外， 长期被认 为是被动旁观者的因子 X 目前表现为经由其两种主要受体 ( 蛋白酶激活受体 -1(PAR-1) 和 PAR-2) 的激活作用于各种各样细胞类型的直接参与者。 最近的发现提示， PAR-2 在纤维 - 增 殖性疾病 ( 例如纤维化、 组织重建和癌症 ) 中起着重要作用， 并指因子 X 为协调凝血和疾病 进展之间的分界的重要介质 (Borensztajn 等人， 2008)。
     蛋白 C、 因子 IX 和因子 X 分别是肝脏中合成的 62kDa、 55kDa 和 59kDa 的糖蛋白。
     在其分泌进入血浆前， 其多肽链经过几次翻译后熟化以变成功能性酶原。
     两种酶原蛋白 C 和因子 X 由肽链裂解得到的氨基端轻链和羧基端重链组成， 其中 轻链和重链由二硫桥连接。酶原因子 IX 是单链糖蛋白。
     如同大多数丝氨酸蛋白酶前体一样， 蛋白 C、 因子 IX 和因子 X 是缺乏催化活性的酶 原。其激活是其重链中蛋白酶促裂解的结果。在蛋白 C 中， 这种裂解发生在重链的 N 末端， 从而释放 12 个氨基酸的 “激活” 肽。在因子 X 中， 这种裂解发生在酶原的 Arg 193 和 Ile 194 残基之间， 从而也释放 52 个氨基酸的 “激活” 肽。在因子 IX 中， 发生两个裂解， 也从前 体分子的内部区域释放分子量近似等于 11kDa 的激活肽。
     血液凝因必须很好地控制以避免出血或凝血的任何危险。因此， 凝血过程的失调 导致严重的病症， 例如出血 ( 增加的出血危险 ) 和血栓症 ( 增加的凝血危险 )。因增加的凝 血危险导致的病理包括严重的病症， 例如静脉或动脉血栓形成， 特别是影响大口径血管的 血栓形成、 心肌梗死、 血栓形成性疾病、 肺栓塞、 血管成形术或溶栓治疗后的冠状动脉再梗 塞， 以及患有影响蛋白 C 基因或凝血调节蛋白基因的遗传异常的患者的凝血异常。给予病 人抗凝血剂以终止血栓形成 ( 凝血不适当地存在于血管中 )。这用于易感者中深静脉血栓 形成、 肺栓塞、 心肌梗死和中风的初级和次级预防。出血是在血栓栓塞 (thromoboembolic) 并发症的预防和治疗中口服使用抗凝剂的最严重的并发症。用华法令或肝素抗凝血的个 体如果出血或需要手术时通常分别用特定的解毒药例如维生素 K 或鱼精蛋白治疗。不幸的 是， 华法令、 肝素、 维生素 K 和鱼精蛋白的治疗活性伴随不良的副作用， 这使其使用复杂化。 相反， 还没有用于逆转低分子量肝素 (LMWH) 或靶向因子 Xa(fXa) 的新型口服抗凝血剂的抗 凝血效应的特异性的和有效的解毒剂 ( 参考综述， Harenberg， 2008， Bauer， 2008， Khoo 等 人， 2009)。当使用这些新的抗凝疗法时， 可能观察到大出血。因此， 及时采取适当的机械的 和系统的行动以控制出血是必要的。 这包括停止抗凝血治疗以及， 如有可能， 使用可得到的 特定逆转剂逆转抗凝血效应。目前需要针对这些抗凝血剂的特异性解毒药。
     另一方面， 出血型的病理学特别地包括 A 或 B 型血友病 ( 分别缺乏因子 VIII 和 IX)。这些严重疾病常常由于用于治疗的中和抗因子 VIII 或 IX 的同种抗体的 “抑制剂” 的 存在而复杂化。
     目前有着改善这些病症的治疗的需要。
     第一种治疗策略是绕过凝血级联和调节的缺陷步骤。 用于改善目前治疗的另一种 策略是改善所使用化合物 ( 主要是在血浆中易被中和的蛋白质 ) 的半衰期。用于改善治疗 的另一种途径是重建自动放大系统或逆控制。
     用于高凝性病症 ( 例如蛋白 C 缺失 ) 的治疗是蛋白 C、 激活的蛋白 C、 蛋白 C 衍生 物……。目前用于血友病的治疗是对于 A 和 B 型血友病分别施用因子 VIII 或 IX。
     这些治疗是昂贵的， 特别是因为由于化合物的短半衰期而需要反复注射， 而且这 些治疗具有局限性， 如抑制剂或中和抗通常用于治疗 A 和 B 型血友病的因子 VIII 或 IX 的 同种抗体的的开发。此外， 已观察到施用重组蛋白质 ( 特别是因子 IX) 来治疗 B 型血友病， 由于较之施用血浆来源的产物具有更低的回收率而受到阻碍。
     已经提出潜在方法作为新的治疗策略。特别是， WO 03035861 专利申请描述了蛋 白 C 和因子 X 的凝血酶可酶解的嵌合衍生物。
     然而， 这些化合物的短的半衰期限制了其在凝血功能障碍中的使用。本发明提出一种新的方法解决该技术问题。
     发明简述
     本发明涉及多肽 PP， 其包含 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列 ( 因子 X 的 激活肽 )， 其中 39 或 49 位的天冬酰胺是 N- 糖基化的。
     本发明也涉及所述多肽用于提高循环蛋白例如丝氨酸蛋白酶酶原， 如因子 IX、 因 子 X、 蛋白 C， 的半衰期和回收率的用途。
     本发明也涉及融合蛋白 FP， 其含有 ：
     - 第一多肽 PP 和
     - 第二多肽， 其包含 SEQ ID NO ： 4 的 7 到 16 位的氨基酸序列。
     本发明涉及因子 X 或蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中所述蛋白质的天 然激活肽被融合蛋白 FP 取代。
     本发明涉及因子 X 或蛋白 C 的凝血酶可裂解衍生物， 其中所述蛋白质的天然激活 肽被融合蛋白 FP 取代。
     本发明还涉及因子 X 或蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其含有激活因子 X 或蛋白 C 或其功能保守的变体和融合蛋白 FP。
    
    本发明涉及编码本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的核酸分子。 本发明涉及本发明因子 X 的嵌合衍生物用于预防或治疗出血型的凝血病症的用途。 本发明涉及本发明因子 X 的嵌合衍生物用于预防或治疗由低分子量肝素 (LMWH) 或由靶向因子 Xa(fXa) 的抗凝血剂引起的出血的方法。
     本发明也涉及本发明蛋白 C 的嵌合衍生物用于预防或治疗涉及高凝性的病症的 用途。
     本发明涉及用于预防或治疗凝血障碍的包含本发明嵌合衍生物的药物组合物。
     发明详述
     通过对因子 X 的不同构造的研究， 本发明人证明因子 X 的激活肽在因子 X 的清除 过程及其回收中起着基本的作用。
     更具体地， 他们观察到， 这一激活肽的羧基末端的十九个氨基酸在因子 X 的清除 动力学中有着主要作用。该十九个残基的序列包含对观察到的机制重要的两个 N- 糖基化 位点。
     定义
     “功能保守的变体” 是其中蛋白或酶中给定的氨基酸残基发生变化但不改变多 肽的整体构象和功能的那些变体， 包括但不限于， 用具有类似性质 ( 例如， 极性、 氢键键合 潜力、 酸性、 碱性、 疏水性、 芳香性等 ) 的氨基酸取代。除了显示为保守的那些氨基酸以外 的氨基酸在蛋白质中可以不同， 以便具有相似功能的任何两个蛋白之间的蛋白质或氨基 酸序列的百分相似性可以改变， 且可以是例如根据比对方案 ( 例如通过群集法 (Cluster Method)) 确定的 70％到 99％， 其中相似性是基于 MEGALIGN 算法。 “功能保守的变体” 也包 括由 BLAST 或 FASTA 算法确定的具有至少 60％、 优选至少 75％、 最优选至少 85％、 进一步 优选至少 90％的氨基酸同一性的多肽， 且其与进行比较的天然或母蛋白 (parent protein) 具有相同或基本上相似的性质或功能。
     两个氨基酸序列超过 80％、 优选超过 85％、 优选超过 90％的氨基酸相同， 或超过 约 90％， 优选超过 95％的氨基酸相似 ( 功能上相同 ) 时是 “基本上同源” 或 “基本上相似” 的。优选地， 相似或同源的序列通过例如使用 GCG(Genetics Computer Group， Program Manual for the GCG Package， Version 7， Madison， Wisconsin) 堆 积 程 序 (pileup program) 的比对或任何序列比较算法例如 BLAST、 FASTA 等来鉴别。
     根据本发明， 术语 “融合蛋白” 或 “嵌合蛋白” 指的是通过连接两个或更多个基因或 其片段 ( 其原来编码分离的多肽 ) 而生成的蛋白质。这种融合基因的翻译导致具有源自各 原始多肽的功能性质的单个多肽。重组融合蛋白通过用于生物研究或治疗的重组 DNA 技术 人工生成。重组融合蛋白是通过融合基因的基因工程生成的蛋白质。这通常包括去除编码 第一蛋白的 cDNA 序列中的终止密码子， 然后通过连接或重叠延伸 PCR 同框 (in frame) 附 加第二蛋白的 cDNA 序列。然后该 DNA 序列由细胞表达为单个蛋白。该蛋白可以工程化以 包括两个原始蛋白的全部序列， 或仅任一个原始蛋白的一部分序列。
     术语 “回收率” 意指抗原或注射分子的活性水平相对于计算得到的理论或预期的 抗原或活性的百分比。
     “循环蛋白” 意指由身体器官细胞合成并在血流中输送的蛋白。循环蛋白的例子是 凝血因子、 蛋白激素。 凝血因子通常是丝氨酸蛋白酶。也有一些例外。例如， 因子 VIII 和因子 V 是糖蛋 白， 因子 XIII 是转谷氨酰胺酶。
     蛋白激素是分泌到血流中并在活动物体中具有内分泌功能的一类蛋白质。
     术语 “丝氨酸蛋白酶酶原” 具有本领域的一般含义并指丝氨酸蛋白酶的无活性前 体， 其需要裂解以使其变成活性酶。 根据本发明， 目标丝氨酸蛋白酶限于属于循环蛋白的那 些。
     丝氨酸蛋白酶包括其中活性部位的氨基酸之一是丝氨酸的几种蛋白酶。 根据本发 明， 目标丝氨酸蛋白酶可以是但不限于因子 IX、 因子 X 或蛋白 C， 且特别是因子 X 和蛋白 C。
     根据本发明， 术语 “丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物” 是通过将丝氨酸蛋白酶酶原 或其片段与目标多肽连接而获得的融合蛋白。 所得到的蛋白显示出所述丝氨酸蛋白酶的功 能性质。
     特别地， 术语 “丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物” 是通过激活的丝氨酸蛋白酶或其 片段与目标多肽的融合而获得的融合蛋白。
     根据本发明， 丝氨酸蛋白酶酶原的所述嵌合衍生物与天然丝氨酸蛋白酶酶原不 同， 但至少显示等同的活性。
     术语 “因子 X” 具有本领域的一般含义并指参与凝血机制的分泌的丝氨酸蛋白酶。 因子 X 可以来自于任何来源， 但通常是哺乳动物 ( 例如， 人和非人灵长类动物 ) 因子 X， 更特 别是人因子 X。通常， 人因子 X 的氨基酸序列由 SEQ ID NO ： 1( 图 1) 提供。
     存在不同的编号系统以定位因子 X 的氨基酸残基 ：
     - 参照由因子 X 的 cDNA 推导的序列的编号系统。
     - 参照由分泌的蛋白质推导的序列的编号系统， 分泌的蛋白包含轻链、 激活肽和重 链： 编号为 1 的氨基酸残基是轻链的氨基末端的第一氨基酸残基。使用了该编号系统。上 游的氨基酸位置用负数标识 ： 原肽 (pro-peptide) 的 C 末端氨基酸编号为 -1， 且翻译的蛋
     白的 N 末端氨基酸残基 ( 其是前肽 (pre-peptide) 的氨基末端氨基酸残基 ) 编号为 -40。
     如图 1 所示， 因子 X 的序列分成五个不同的区域， 其根据所使用的编号系统对应 于：
     --40 到 -28 位之间的前肽 ( 或信号肽 )，
     --27 到 -1 位之间的原肽，
     -1 到 142 位之间的轻链，
     -143 到 194 位之间的激活肽，
     -195 到 448 位之间的重链。
     术语 “因子 X” 或 “FX” 或 “成熟 FX” 或 “酶原 FX” 意指在由产生的肝细胞分泌后， 因子 X 的血液循环形式。 信号肽由信号肽酶切除， 原肽序列在成熟 N- 末端链的 N- 末端的前 11 个谷氨酸残基发生 γ 羧化作用后切除。进一步的加工步骤通过在根据所使用编号系统 的 Arg142 和 Ser143( 图 1， SEQ ID NO ： 1 的 182-183 位 ) 之间的裂解进行。这一加工步骤 也伴随着导致三肽 Arg140-Lys141-Arg142(SEQ ID NO ： 1 的 180-182 位 ) 的缺失。所获得 的分泌因子 X 酶原由 139 个氨基酸的 N- 端轻链和 306 个氨基酸的 C- 端重链组成， 轻链和 重链经由 Cys132 和 Cys302 之间的二硫桥共价连接。进一步的翻译后加工步骤包括 Asp63 的 β- 羟基化作用以及 N- 和 O- 型糖基化。
     术语 “激活的因子 X” 或 “FXa” 意指在需要凝血活性 ( 例如凝血酶产生 ) 的情况中 产生的循环因子 X 的酶学活性形式。在能够激活因子 X 的生理条件下， 从 Ser143 到 Arg194 的 52 个氨基酸的所谓激活肽通过在 Arg194 处切割重链的羧基端而与分子的其余部分分开 ( 图 1)。
     根据本发明， 术语 “因子 X” 和 “激活的因子 X” 包括天然存在的因子 X 和激活的因 子 X， 也包括其功能保守的变体和修饰形式。特别地， 本发明包括因子 X( 酶原或激活的形 式 ) 的所有已知的功能保守的变体， 例如 Camire 等人， 2000 描述的变体 ( 其中天然因子 X 的原肽被凝血酶原的原肽替代， 以获得更高产量的 γ- 羧化的成熟蛋白 )， 或 Rudolph 等人， 1997 描述的变体 ( 其中对应于因子 X 的残基 -2 的密码子 (ACG， 其对应于 SEQ ID NO ： 1的 39 位的苏氨酸 ) 可以变成 AGG( 其对应于精氨酸 ) 中以允许准确地切割原肽。
     术语 “因子 X 的激活肽” 具有其在本领域的一般含义并意指根据所使用的编号系 统的因子 X 的 143 到 194 位的 52 个氨基酸的多肽 (SEQ ID NO ： 1 的 183-234 位 )。该术语 可包括天然存在的因子 X 激活肽和其功能保守的变体和修饰形式。本文定义的激活肽相当 于因子 X 的人激活肽， 但是也可以来自任何来源， 然而通常是哺乳动物 ( 例如， 人和非人灵 长类动物 ) 因子 X， 更特别的是人因子 X。人因子 X 的激活肽的氨基酸序列由 SEQ ID NO ： 2 提供。
     在本发明中， 因子 X 激活肽的羧基端部分的 19 个最后氨基酸的序列对应于目标多 肽， 其对应于 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列， 或对应于根据所使用的编号系统的 因子 X 的 176 到 194 位 ( 图 1)。该多肽也称为 PA176-194。这一多肽在 SEQ ID NO ： 2 的 39 和 49 位包含两个糖基化位点， 对应于根据所使用编号系统的因子 X 的 181 和 191 位。
     术语 “蛋白 C” 具有本领域的一般含义并意指参与调节凝血的主要机制 ( 称为 “抗 凝血剂途径” ) 的分泌丝氨酸蛋白酶。蛋白 C 可以来自于任何来源， 但通常是哺乳动物 ( 例 如， 人和非人灵长类动物 ) 蛋白 C， 更特别是人蛋白。 通常， 人蛋白 C 的氨基酸序列由 SEQ IDNO ： 3 提供。
     蛋白 C 的激活肽是序列 SED ID NO ： 3 的 200 到 211 位之间发现的十二个氨基酸的 多肽。
     术语 “蛋白 C” 或 “PC” 或 “成熟 PC” 或 “酶原 PC” 意指由肝产生细胞分泌后的蛋白 C 的血液循环形式。信号肽由信号肽酶切除， 原肽序列在成熟 N- 末端链的 N- 末端的前 9 个 谷氨酸残基 ( 始于序列 SED ID NO ： 3 的 43 位的丙氨酸 ) 上发生 γ 羧化作用后切除。进一 步的加工步骤通过双联体 Lys198-Arg199(SED ID NO ： 3) 的缺失发生。所获得的分泌蛋白 C 酶原由 155 个氨基酸的 N- 末端轻链和 262 个氨基酸的 C- 末端重链组成， 其由二硫桥共价 连接。进一步的翻译后加工步骤包括 Asp113(SED ID NO ： 3) 的 β- 羟基化作用以及 N- 型 糖基化。
     术语 “激活的蛋白 X” 或 “PCa” 意指在需要凝血活性 ( 例如凝血酶产生 ) 的情况下 产生的循环蛋白 C 的酶学活性形式。 在能够激活蛋白 C 的生理条件下， Asp200 到 Arg211(SED ID NO ： 3) 的 12 个氨基酸的所谓激活肽通过在 Arg211(SED ID NO ： 3) 处裂解重链的羧基末 端来而与分子的其余部分分开。
     根据本发明， 术语 “蛋白 C” 或激活的蛋白 C” 包括天然存在的蛋白 C 和激活的蛋 白 C， 但也包括其功能保守的变体和修饰形式。特别是， 本发明包括蛋白 C( 酶原或激活的 形式 ) 的所有已知的功能保守的变体， 例如含有在 Asn355 和 371 处的取代的具有较高抗凝 血活性的激活的蛋白 C 衍生物 ( 美国专利 5453373)， 以及具有降低的抗凝血活性同时具有 所需的细胞保护性质 ( 抗细胞凋亡、 抗神经变性病症和抗中风的保护性质 ) 的激活的蛋白 C 的衍生物 ( 参见， 例如 WO 2005/007820)。这些突变体例如是 3K3A-APC 和 229/230-APC。 术语 “血纤维蛋白肽 A” 具有本领域的一般含义并意指通过凝血酶的作用从血纤维 蛋白原的 α- 链的 N- 末端片段移去的 16 个氨基酸残基的小肽。该术语可以包括天然存在 的血纤维蛋白肽 A 及其保守的功能变体和修饰形式。血纤维蛋白肽 A 可以来自任何来源， 但通常是哺乳动物 ( 例如， 人和非人灵长类动物 ) 血纤维蛋白肽 A， 更特别的是人血纤维蛋 白肽 A。通常， 人血纤维蛋白肽 A 的氨基酸序列由 SEQ ID NO ： 4 提供。
     根据本发明， 术语 “血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物” 意指含有血纤维蛋白肽 A 或其片段和血纤维蛋白肽 A 的羧基末端部分的凝血酶可裂解位点的多肽。这种衍生物由 因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的序列的 SEQID NO ： 5( 图 3A) 或 SEQ ID NO ： 6( 图 3B) 定义和由蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的序列 SEQ ID NO ： 13( 图 4A) 或 SEQ ID NO ： 14( 图 4B) 限定。
     根据本发明， 术语 “凝血酶可裂解位点” 意指可被凝血酶 ( 凝血的主要丝氨酸蛋白 酶 ) 识别和裂解的短的氨基酸序列。
     糖基化是将糖类连接到蛋白质上的酶过程。蛋白的糖基化通常是 N- 连接的。 “N- 连接” 意指糖部分连接到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺 -X- 丝氨酸和天 冬酰胺 -X- 苏氨酸 ( 其中 X 是除了脯氨酸外的任何氨基酸 ) 是用于糖部分酶促连接到天冬 酰胺侧链上的识别序列。因此， 这些三肽序列的任何一个在多肽中的存在产生潜在糖基化 位点。通常， 与蛋白 N- 连接的寡糖由葡萄糖、 甘露糖和 2N- 乙酰氨基葡萄糖分子组成， 然后 其可由多种不同的单糖 ( 包括半乳糖、 N- 乙酰氨基葡萄糖、 N- 乙酰半乳糖胺、 岩藻糖和唾液 酸 ) 延长。
     因此， 术语 “N- 糖基化的”意指多肽在以上定义的至少一个天冬酰胺残基上的 N- 糖基化。
     从广义上说， 术语 “预防” 或 “防止” 意指在还未诊断为患有疾病或病症的患者中 预防发生这种疾病或病症。
     从广义上说， 术语 “治疗” 或 “疗法” 意指逆转、 缓解、 抑制该术语应用的疾病或病 症的发展或者这种疾病或病症的一种或多种症状。
     术语 “患者” 意指患有凝血障碍或易患凝血障碍的任何受试者 ( 优选人 )。
     根据本发明， 术语 “蛋白 C 和因子 X 相关障碍” 意指涉及因子 X 或蛋白 C 的任何病 状， 特别是凝血功能障碍。
     根据本发明， 术语 “凝血功能障碍” 或 “凝血障碍” 意指由于凝血机制的失调而引 起的任何病状。因此它包括涉及过度凝血和凝血不足的病症。
     涉及过度凝血或高凝性的病症包括但不限于静脉或动脉血栓形成、 心肌梗死、 血 栓性疾病、 肺栓塞、 冠状动脉再闭塞和蛋白 C 缺乏。
     涉及凝血不足的病症称为出血病症， 且特别地包括因子 VIII、 IX 或 XI 缺乏。特别 地， 这些病症可以是 A 或 B 型血友病和由与另一种病症 ( 例如自身免疫性疾病或癌症 ) 有 关的自身抗体的出现导致的血友病。 源自因子 X 的激活肽的多肽
     本发明的第一个目的涉及多肽 PP， 其含有 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序 列， 其中 39 或 49 位的天冬酰胺是 N- 糖基化的。
     在优选的实施方式中， 39 和 49 位的天冬酰胺是 N- 糖基化的。
     在一个实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 32 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 31 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 30 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 29 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 28 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 27 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 26 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 25 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 24 到 52 位的氨基酸序 列。
     在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 23 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 22 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 21 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 20 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 19 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 18 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 17 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 16 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 15 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 14 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 13 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 12 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 11 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 10 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 9 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 8 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 7 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 6 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 5 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 4 到 52 位的氨基酸序12列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    列。
    102325880 A CN 102325893说明书9/28 页列。
    在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 3 到 52 位的氨基酸序 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含 SEQ ID NO ： 2 的 2 到 52 位的氨基酸序列。
    列。 在一个具体的实施方式中， 所述多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。在可选的实 施方式中， 所述多肽不包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 2。
     本发明的另一个目的涉及多肽 PP 用于提高酶原 ( 特别是丝氨酸蛋白酶酶原 ) 的 半衰期的用途。
     源自因子 X 的激活肽的融合蛋白
     本发明的另一个目的涉及融合蛋白 FP， 其含有 ：
     - 由上述多肽 PP 构成的第一多肽和
     - 包含 SEQ ID NO ： 4 的 7 到 16 位的氨基酸序列的第二多肽。
     本发明的另一个目的涉及融合蛋白 FP， 其含有 ：
     - 由上述多肽 PP 构成的第一多肽和
     - 包含 SEQ ID NO ： 4 的 7 到 16 位的氨基酸序列的第二多肽，
     其中
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 14 位残基的甘氨酸被缬氨酸、 苯丙氨酸或丙氨酸取代， 和/或
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 15 位残基的缬氨酸被脯氨酸取代。
     在优选的实施方案中， 本发明涉及所述融合蛋白， 其中所述第一多肽的羧基端区 域与所述第二多肽的氨基端区域融合。
     在一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含 SEQ ID NO ： 4 的 7 到 16 位的氨基酸 序列。
     在另一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含 SEQ ID NO ： 4 的 6 到 16 位的氨基 酸序列。
     在另一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含 SEQ ID NO ： 4 的 5 到 16 位的氨基 酸序列。
     在另一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含 SEQ ID NO ： 4 的 4 到 16 位的氨基 酸序列。
     在另一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含 SEQ ID NO ： 4 的 3 到 16 位的氨基 酸序列。
     在另一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含 SEQ ID NO ： 4 的 2 到 16 位的氨基 酸序列。
     在另一个具体的实施方式中， 所述第二多肽包含氨基酸序列 SEQ ID NO ： 4。
     本发明的嵌合衍生物
     如上所述的本发明的多肽和融合蛋白可以与丝氨酸蛋白酶酶原或其活性形式或 片段融合以提高所述丝氨酸蛋白酶酶原的半衰期和回收率。
     本发明人证明， 因子 X 的激活肽和更特别是含有其最后的十九个氨基酸的其片段
     在因子 X 的长半衰期和注入的分子的良好回收率方面起主要作用。他们也证明， 因子 X 的 激活肽或含有其最后的十九个氨基酸的其片段可用于增加其他蛋白质 ( 例如循环蛋白 ) 的 半衰期和回收率。
     因此， 本发明的另一个目的涉及含有目标蛋白和上述多肽 PP 的嵌合蛋白。
     所述目标蛋白可以是在血液中具有短的半衰期的酶或其他蛋白。特别地， 它可以 是循环蛋白， 例如丝氨酸蛋白酶或蛋白激素。
     通常， 所述目标蛋白可以是蛋白 C、 因子 VII、 激活的因子 VII、 因子 IX、 胰岛素、 促 红细胞生成因子、 可溶性 P- 选择素糖蛋白配体…， 但它不是天然因子 X。
     所述蛋白可以其酶原形式或以其激活形式使用。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述蛋白， 其中所述多肽 PP 在羧基末端、 氨基末端与目标蛋白融合或融合到目标蛋白的氨基酸序列中。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述嵌合蛋白， 其中所述多肽 PP 在羧基末 端、 氨基末端中与目标蛋白融合或融合到目标蛋白的氨基酸序列中。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述嵌合蛋白， 其中目标酶原的激活肽被 多肽 PP 取代。
     在另一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述嵌合蛋白， 其中所述多肽 PP 在目标 蛋白的天然激活肽的定位部位与目标蛋白的激活形式融合。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述嵌合蛋白， 其中所述多肽 PP 由 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列组成， 其中 39 或 49 位的天冬酰胺是 N- 糖基化的。
     通常， 本发明涉及所述嵌合蛋白， 其中所述多肽 PP 包含 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列 ( 其中 39 或 49 位的天冬酰胺是 N- 糖基化的 ) 且其最大长度为 19 个氨基 酸、 20、 25、 30、 35、 40、 45 或 50 个氨基酸。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述嵌合蛋白， 其中所述多肽 PP 不是由因 子 X 的天然激活肽 (SEQ ID NO ： 2) 组成。
     在 一 个 具 体 的 实 施 方 式 中， 本 发 明 涉 及 所 述 嵌 合 蛋 白， 它 不 是 专 利 申 请 WO 2006018204 中描述的蛋白之一。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及含有蛋白 C 和多肽 PP 的嵌合蛋白， 条件是 所述肽的序列不是由 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列组成的。
     在更特别的实施方式中， 本发明涉及含有蛋白 C 和多肽 PP 的嵌合蛋白， 其中所述 多肽由 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列组成， 其中 39 或 49 位的天冬酰胺是 N- 糖 基化的。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及含有蛋白 C 的嵌合蛋白， 其中蛋白 C 的激活 肽被多肽 PP 取代， 条件是所述肽的序列不是由 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列组成的。
     在更特别的实施方式中， 本发明涉及含有蛋白 C 的嵌合蛋白， 其中蛋白 C 的激活肽 被由 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的氨基酸序列组成的多肽 PP 取代， 其中 39 或 49 位的天冬 酰胺是 N- 糖基化的。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及含有激活的蛋白 C 和多肽 PP 的嵌合蛋白， 条件是所述肽的序列不是由 SEQ ID NO ： 2 的氨基酸序列组成的。
     在更特别的实施方式中， 本发明涉及含有激活的蛋白 C 和由 SEQ ID NO ： 2 的 33 到52 位的氨基酸序列组成的多肽 PP 的嵌合蛋白， 其中 39 或 49 位的天冬酰胺是 N- 糖基化的。
     优选地， 其中 39 或 49 位的天冬酰胺被 N- 糖基化的 SEQ ID NO ： 2 的 33 到 52 位的 氨基酸序列融合在激活的蛋白 C 的重链 N 末端部分上。
     本发明涉及含有多肽 PP 的丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物。
     特别地， 所述丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物是蛋白 C 和因子 X 的嵌合衍生物。 特 别地， 使用记载在 WO 03035861 专利申请或 Louvain-Quintard 等人， 2005 中的嵌合凝血酶 可裂解衍生物并进行修饰。
     因此， 本发明涉及因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中所述蛋白的天然激 活肽被上述融合蛋白 FP 取代。
     根据本发明， 本发明也包括本发明因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的功能保 守的变体。
     在一个具体的实施方式中， 本发明还涉及因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中对应于天然因子 X 的重链的前三个残基 (Ile-Val-Gly， SEQ ID NO ： 1 的 235-237 位 ) 的氨基酸可根据 Toso R 等人， 2008 及专利申请 WO 03035861 和 WO 04005347 中描述的修饰 方法进行修饰。
    
    特别地， 本发明涉及所述因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中 ： - 对应于 SEQ ID NO ： 1 的 235 位残基的异亮氨酸可被丙氨酸、 丝氨酸或亮氨酸取代； - 对应于 SEQ ID NO ： 1 的 236 位残基的缬氨酸可被苯丙氨酸或丙氨酸取代。
     在另一个具体的实施方式中， 本发明还涉及因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生 物， 其中对应于血纤维蛋白肽 A 的最后三个残基的氨基酸 (Gly-Val-Arg， SEQ ID NO ： 4的 14-16 位 ) 也可根据 Gustafsson D 等人， 2004 和专利申请 WO 04005347 中描述的修饰方法 进行修饰。
     特别地， 本发明涉及所述因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中 ：
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 14 位残基的甘氨酸可被缬氨酸、 苯丙氨酸或丙氨酸取 代；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 15 位残基的缬氨酸可被脯氨酸取代。
     根据本发明， 所述修饰用于提高凝血酶的切割或激活的因子 X 的效力， 且不改变 本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。
     因此， 本发明涉及因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中所述蛋白的天然激 活肽被融合蛋白取代， 所述融合蛋白含有 ：
     - 多肽 PP， 和
     - 由氨基酸序列 SEQ ID NO ： 5 或 SEQ ID NO ： 6 定义的血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂 解衍生物。
     在一个实施方式中， 所述因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的特征在于所述多 肽是因子 X 的天然激活肽 (SEQ ID NO ： 2)。
     在另一个实施方式中， 所述因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的特征在于所述 血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物由选自 SEQ ID NO ： 7、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 11 和 SEQ ID NO ： 12 的氨基酸序列选择的氨基酸序列限定。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中 - 所述多肽是因子 X 的天然激活肽 (SEQ ID NO ： 2)， 和
     - 所述血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物由氨基酸序列 DFLAEGGGVRIVG(SEQ ID NO ： 7) 定义。
     本发明也涉及蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中所述蛋白的天然激活肽 被融合蛋白 FP 取代。
     根据本发明， 本发明也包括本发明蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的功能保 守的变体。
     在一个具体的实施方式中， 在所述蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物中， 对应 于天然蛋白 C 的重链的前三个残基的氨基酸 (Leu-Ile-Asp， SEQ ID NO ： 3 的 212-214 位 ) 可以根据专利申请 WO 03035861 中描述的改性法改性。
     特别是， 在本发明蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物中 ：
     - 对应于 SEQ ID NO ： 3 的 212 位残基的亮氨酸可被丙氨酸或丝氨酸取代 ；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 3 的 213 位残基的异亮氨酸可被苯丙氨酸取代 ；
    - 对应于 SEQ ID NO ： 3 的 214 位残基的天冬氨酸可被甘氨酸取代。
     在另一个具体的实施方式中， 本发明还涉及蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生 物， 其中对应于血纤维蛋白肽 A 的最后三个残基的氨基酸 (Gly-Val-Arg， SEQ ID NO ： 4的 14-16 位 ) 也可以根据 Gustafsson D 等人， 2004 和专利申请 WO 04005347 中描述的修饰方 法进行修饰。
     特别地， 本发明涉及所述因子 X 的嵌合凝血酶可裂解衍生物， 其中 ：
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 14 位残基的甘氨酸可被缬氨酸、 苯丙氨酸或丙氨酸取 代；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 15 位残基的缬氨酸可被脯氨酸取代。
     根据本发明， 所述修饰用于提高凝血酶的切割或激活的蛋白 C 衍生物的效力， 且 不改变本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。
     本发明还涉及蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中所述蛋白的天然激活肽 被融合蛋白取代， 所述融合蛋白含有 ：
     - 多肽 PP， 和
     - 由氨基酸序列 SEQ ID NO ： 13 或 SEQ ID NO ： 14 定义的血纤维蛋白肽 A 凝血酶可 裂解衍生物。
     在一个实施方式中， 所述多肽是因子 X 的天然激活肽 (SEQ ID NO ： 2)。
     在另一个实施方式中， 所述血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物由选自 SEQ ID NO ： 15、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 19、 SEQ ID NO ： 20、 SEQ ID NO ： 21、 SEQ ID NO ： 22、 SEQ ID NO ： 23、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 25 和 SEQ ID NO ： 26 的氨基酸序列中选择的氨基酸序列限定。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及所述蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生 物， 其中 ：
     - 所述多肽是因子 X 的天然激活肽 (SEQ ID NO ： 2)， 和
     - 所述血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物由氨基酸序列 DFLAEGGGVRLID(SEQ ID NO ： 15) 定义。
     本发明的另一个目的涉及蛋白 C 的嵌合衍生物， 其中多肽 PP 在天然蛋白 C 的激活 肽的氨基末端部分融合。
     本发明的另一个目的涉及丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物， 其特征在于它含有所 述激活的丝氨酸蛋白酶或其功能保守的变体和多肽 PP。
     特别地， 本发明涉及目标丝氨酸蛋白酶的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其特征在 于它包含所述激活的丝氨酸蛋白酶或其功能保守的变体和融合蛋白 FP。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其 包含激活的因子 X 或其功能保守的变体和融合蛋白 FP。
     在优选的实施方式中， 本发明涉及因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其含有 激活的因子 X 或其功能保守的变体和融合蛋白 FP， 其中融合蛋白 FP 的羧基末端部分与激活 的因子 X 的重链的氨基末端部分融合。
     根据本发明， 一些氨基酸可以被取代、 删除或添加以提高本发明因子 X 的嵌合的 凝血酶可裂解衍生物的活性。特别是， 对应于血纤维蛋白肽 A 的最后三个氨基酸 ( 氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 4 的 14 到 16 位 ) 和对应于激活的因子 X 的重链的前三个氨基酸 ( 氨基酸 序列 SEQ ID NO ： 1 的 235 到 237 位 ) 的氨基酸可如上所述进行修饰。
     特别地， 本发明涉及所述的本发明因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物， 其中 ：
     - 对应于 SEQ ID NO ： 1 的 235 位残基的异亮氨酸可被丙氨酸、 丝氨酸或亮氨酸取 代；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 1 的 236 位残基的缬氨酸可被苯丙氨酸或丙氨酸取代。
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 14 位残基的甘氨酸可被缬氨酸、 苯丙氨酸或丙氨酸取 代；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 15 位残基的缬氨酸可被脯氨酸取代，
     根据本发明， 所述修饰用于提高凝血酶的切割或激活的因子 X 衍生物的效力， 且 不改变本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及含有激活的蛋白 C 的蛋白 C 的嵌合的凝血 酶可裂解衍生物或其功能保守的变体和融合蛋白 FP。
     在优选的实施方式中， 本发明涉及含有激活的蛋白 C 的蛋白 C 的嵌合的凝血酶可 裂解衍生物， 其或其功能保守的变体和融合蛋白 FP， 其中所述融合蛋白 FP 的羧基末端部分 与激活的蛋白 C 的重链的氨基末端部分融合。
     根据本发明， 一些氨基酸可以被取代、 删除或添加以改进本发明蛋白 C 的嵌合的 凝血酶可裂解衍生物。特别是， 对应于激活的蛋白 C 的重链的前三个氨基酸 (SEQ ID NO ： 3 的 212-214 位 ) 的氨基酸可如上所述进行修饰。
     特别地， 在本发明蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物中 ：
     - 对应于 SEQ ID NO ： 3 的 212 位残基的亮氨酸可被丙氨酸或丝氨酸取代 ；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 3 的 213 位残基的异亮氨酸可被苯丙氨酸取代 ；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 3 的 214 位残基的天冬氨酸可被甘氨酸取代 ；
     - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 14 位残基的甘氨酸可被缬氨酸、 苯丙氨酸或丙氨酸取代； - 对应于 SEQ ID NO ： 4 的 15 位残基的缬氨酸可被脯氨酸取代。
     根据本发明， 所述修饰用于提高凝血酶的切割或激活的蛋白 C 衍生物的效力， 且 不改变本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的活性。
     核酸、 载体和重组宿主细胞
     本发明的另一个目的涉及编码本发明多肽和嵌合衍生物的核酸分子。
     在一个实施方式中， 本发明涉及编码上述因子 X 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的 核酸分子。
     在另一个实施方式中， 本发明涉及编码上述蛋白 C 的嵌合的凝血酶可裂解衍生物 的核酸分子。
     “编码序列” 或 “编码” 表达产物 ( 例如 RNA、 多肽、 蛋白质或酶 ) 的序列是被表达 时产生 RNA、 多肽、 蛋白质或酶的核苷酸序列， 也就是说， 核苷酸序列编码该多肽、 蛋白质或 酶的氨基酸序列。蛋白质的编码序列可以包括起始密码子 ( 通常是 ATG) 和终止密码子。
     这些核酸分子可以通过本领域技术人员熟知的常规方法获得， 特别是通过编码天 然蛋白的基因的定点诱变获得。
     通常， 所述核酸是 DNA 或 RNA 分子， 其可以包括在适当的载体中， 例如质粒、 粘粒、 附加体、 人工染色体、 噬菌体或病毒载体。
     因此， 本发明的另一个目的涉及载体和表达盒， 其中本发明的核酸分子与用于控 制转录的适当元件 ( 特别是启动子、 增强子和任选的终止子 ) 和任选地控制翻译的元件结 合， 且也涉及本发明核酸分子插入其中的重组载体。 例如， 这些重组载体可以是克隆载体或 表达载体。
     术语 “载体” 、 “克隆载体” 和 “表达载体” 意指 DNA 或 RNA 序列 ( 例如外源基因 ) 可 以通过其引入宿主细胞中的媒介体， 从而使宿主转化并促进所引入序列的表达 ( 例如转录 和翻译 )。
     可 以 使 用 用 于 动 物 细 胞 的 任 何 表 达 载 体， 只要编码本发明多肽或嵌合衍生 物 的 基 因 可 以 被 插 入 和 表 达。 适 合 的 载 体 例 子 包 括 pAGE107(Miyaji H 等 人， 1990)、 pAGE103(Mizukami T 等人， 1987)、 pHSG274(Brady G 等人， 1984)、 pKCR(O′ Hare K 等人， 1981)、 pSG1 beta d2-4-(Miyaji H 等人， 1990) 等。
     质粒的其他例子包括含有复制原点的复制质粒或整合质粒， 例如 pUC、 pcDNA、 pBR 等。
     病毒载体的其他例子包括腺病毒、 逆转录病毒、 疱疹病毒和 AAV 载体。这种重组病 毒可由本领域已知的技术制备， 例如通过转染包装细胞或通过辅助质粒 (helper plasmid) 或病毒瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括 PA317 细胞、 PsiCRIP 细胞、 GPenv+ 细胞、 293 细胞等。用于制备这种复制 - 缺陷型重组病毒的详细方案例如可从 WO 95/14785、 WO 96/22378、 US 5,882,877、 US 6,013,516、 US 4,861,719、 US 5,278,056 和 WO 94/19478 中 找到。
     用于动物细胞的表达载体中使用的启动子和增强子的例子包括 SV40 的早期启 动子和增强子 (Mizukami T. 等人， 1987)、 莫洛尼小鼠白血病病毒的 LTR 启动子和增强子 (Kuwana Y 等人， 1987)、 免疫球蛋白 H 链的启动子 (Mason JO 等人， 1985) 和增强子 (Gillies
     SD 等人， 1983) 等。
     本发明也包括含有本发明核酸分子的基因传递系统 (gene delivery system)， 其 可用于体内或体外的基因治疗。这例如包括病毒转移载体， 例如源自逆转录病毒、 腺病毒、 腺伴随病毒、 慢病毒属的那些， 它们常规地用于基因治疗。 这也包括含有本发明核酸分子和 非病毒基因传递媒介的基因传递系统。非病毒基因传递媒介的例子包括脂质体和聚合物 ( 例如聚乙烯亚胺、 环糊精、 组氨酸 / 赖氨酸 (HK) 聚合物等 )。
     本发明的主题也涉及用至少一种本发明的核酸分子遗传转化的原核或真核宿主 细胞。
     术语 “转化” 意指将 “外源” ( 即外来的或细胞外的 ) 基因、 DNA 或 RNA 序列引入宿 主细胞中以使宿主细胞表达所引入的基因或序列， 从而生成所需物质， 通常是由引入的基 因或序列编码的蛋白质或酶。接受和表达所引入的 DNA 或 RNA 的宿主细胞已被 “转化” 。
     优选地， 为表达和生成多肽和嵌合衍生物， 特别是本发明的蛋白 C 和因子 X 衍生 物， 选择真核细胞， 特别是哺乳动物细胞， 更特别是人细胞。
     通常， 可以使用细胞系例如 CHO、 BHK-21、 COS-7、 C127、 PER.C6 或 HEK293， 因为其对 衍生物进行正确的翻译后修饰的能力。
     本发明也包括带有包含本发明表达盒的至少一种转基因的转基因动物， 特别是转 基因非人类哺乳动物。 所述转基因动物可用于制备本发明的嵌合蛋白， 如例如早已由 Brink 等人， 2000 所描述的。
     本发明的表达载体的构建、 宿主细胞的转化和转基因动物的产生可以使用常规的 分子生物学技术完成。本发明的嵌合衍生物， 特别是蛋白 C 或因子 X 衍生物， 例如可以通过 培养本发明的遗传转化细胞并从培养基中回收由所述细胞表达的所述衍生物获得。 如有必 要， 它们随后可通过本领域技术人员本身已知的常规方法纯化， 例如通过分级沉淀 ( 特别 是硫酸铵沉淀 )、 电泳、 凝胶过滤、 亲和层析等。
     特别地， 用于制备和纯化重组蛋白的常规方法可用于制备本发明的蛋白质。 例如， 为制备本发明的蛋白 C 衍生物， 可以使用例如美国专利 4992373 或美国专利 4981952 中描 述的方法。
     治疗方法和用途
     本发明的第三个目的涉及本发明的嵌合衍生物在蛋白 C 和因子 X 相关疾病特别是 凝血功能障碍的预防或治疗中的用途。
     在一个实施方式中， 本发明涉及作为促凝血剂的本发明因子 X 的嵌合衍生物。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及因子 X 的嵌合衍生物在特别地由因子 VIII、 IX 或 XI 缺乏产生的出血型的凝血病症的预防或治疗中的用途。
     这些病症可以特别是 A 或 B 型血友病， 其可以是或不是因抑制剂 ( 中和抗常规用 于治疗的因子 VIII 或 IX 的同种抗体 ) 的存在而复杂化 ； 它们也可以是由于与另一种病症 ( 自身免疫性疾病、 癌症、 淋巴增生综合症、 特发性障碍等 ) 相关的自身抗体的出现而引起 的获得性血友病。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及用于 A 或 B 型血友病的预防或治疗的因子 X 的嵌合衍生物。
     在另一个实施方式中， 本发明涉及用于 B 型血友病的预防或治疗的因子 IX 的嵌合衍生物。 在另一个实施方式中， 本发明涉及用于纤维增生性疾病例如纤维化组织重建和癌 症的预防或治疗的因子 X 的嵌合衍生物。
     本发明涉及用于由低分子量肝素 (LMWH) 或由靶向因子 Xa(fXa) 的抗凝血剂引起 出血的预防或治疗的方法中的本发明因子 X 的嵌合衍生物。
     靶向因子 Xa 的抗凝血剂是公知的 ( 参见综述 Harenberg， 2008， Bauer， 2008， Kho 等人， 2009)。靶向因子 Xa 的抗凝血剂的例子是利伐沙班和贝曲沙班。
     在优选的实施方式中， 对应于 SEQ ID NO ： 1 的 419 位残基的所述因子 X 的嵌合衍 生物的丝氨酸被丙氨酸取代。
     在另一个实施方式中， 分别对应于 SEQ ID NO ： 1 的 387、 391 和 419 位残基的所述 因子 X 的嵌合衍生物的精氨酸、 赖氨酸和丝氨酸被丙氨酸取代。
     本发明的这些因子 X 的嵌合衍生物进行修饰， 以使它们直接或间接地与因子 Xa 抑 制剂结合。
     在结构上， 这些衍生物被修饰以不提供促凝血活性或降低促凝血活性， 且对于后 一实施方式来说不组装成凝血酶原酶复合物。
     在另一个实施方式中， 本发明涉及作为抗血栓形成剂、 抗炎剂、 抗神经变性剂和抗 细胞凋亡剂的蛋白 C 的嵌合衍生物。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及用于包括高凝性的病症的预防或治疗的蛋 白 C 的嵌合衍生物。
     这样的病症包括但不限于静脉或动脉血栓形成， 特别是影响大口径血管的血栓形 成、 心肌梗死、 血栓性疾病、 肺栓塞、 血管成形术或溶栓治疗后的冠状动脉再闭塞、 中风以及 患有影响 PC 基因或血栓调节蛋白基因的基因异常的患者的凝血异常。
     在一个具体的实施方式中， 本发明涉及用于 A 或 B 型血友病的预防或治疗的蛋白 C 的嵌合衍生物。
     在另一个实施方式中， 本发明涉及用于呼吸和炎性疾病的预防或治疗的蛋白 C 的 嵌合衍生物。
     优选地， 所述嵌合衍生物以治疗有效量给药。
     “治疗有效量” 意指以适用于任何医学治疗的合理的利益 / 风险比治疗或预防蛋白 C 和因子 X 相关疾病的足够量的本发明嵌合衍生物。
     可以理解， 本发明化合物和组合物的总的日用量由主治医师在合理医学判断范围 内决定。用于任何特定患者的具体治疗有效剂量将取决于多种因素， 包括被治疗的病症 和病症的严重性 ； 所使用的具体化合物的活性 ； 所使用的具体组合物 ； 患者的年龄、 体重、 总体健康、 性别和饮食 ； 给药时间、 给药途径和所使用的具体化合物的排泄率 ； 治疗持续时 间； 与所使用的具体多肽联合使用或同时使用的药物 ； 以及医学领域公知的类似因素。例 如， 本领域公知所述化合物的起始剂量应低于达到预期治疗效果所要求的剂量水平和逐步 增加剂量直到达到预期效果。然而， 该产品的日剂量可以在每成人每天 0.01 到 1,000mg 的 宽范围内变化。优选地， 组合物包含 0.01、 0.05、 0.1、 0.5、 1.0、 2.5、 5.0、 10.0、 15.0、 25.0、 50.0、 100、 250 和 500mg 的活性成分以对症调整待治疗患者的症状的剂量。通常， 药物含有 约 0.01mg 到约 500mg 的活性成分， 优选 1mg 到约 100mg 的活性成分。药物的有效量通常每
     天 0.0002mg/kg 体重到约 20mg/kg 体重， 优选每天约 0.001mg/kg 体重到 7mg/kg 体重剂量 水平提供。
     药物组合物
     本发明的另一个目的涉及用于蛋白 C 和因子 X 相关疾病 ( 特别是凝血功能障碍 ) 的预防或治疗的含有本发明嵌合衍生物的药物组合物。
     “药学上” 或 “药学上可接受的” 意指当适当地给药于哺乳动物特别是人时， 不产生 不利的、 过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或赋形剂意指 非毒性固体、 半固体或液体填充剂、 稀释剂、 包封材料或任何类型的制剂辅剂。
     在一个实施方式中， 本发明涉及用于上文详述的出血型、 纤维增生性凝血病症的 治疗的含有因子 X 的嵌合衍生物的药物组合物。
     在另一个实施方式中， 本发明涉及用于上文详述的涉及高凝性的病症、 炎症或呼 吸道疾病的预防或治疗的含有蛋白 C 的嵌合衍生物的药物组合物。
     丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物可以与药学上可接受的赋形剂和任选的持续释 放基质 ( 例如可生物降解的聚合物 ) 组合以形成治疗组合物。
     在用于经口、 舌下、 皮下、 肌肉内、 静脉内、 透皮、 局部或直肠给药的本发明药物组 合物中， 单独使用或与另一种有效成分组合使用的有效成分可以单位给药形式， 作为与常 规药物载体的混合物， 给药于动物和人类。适合的单位给药形式包括口服途径形式 ( 例如 片剂、 胶囊、 粉末、 颗粒和口服悬浮液或溶液 )、 舌下和口腔给药形式、 气雾剂、 植入物、 皮下、 透皮、 局部、 腹膜内、 肌肉内、 静脉内、 真皮下、 透皮、 鞘内和鼻内给药形式及直肠给药形式。
     优选地， 所述药物组合物包含用于能够注射的制剂的药学上可接受的载体。这些 可以特别是等渗、 无菌的盐溶液 ( 磷酸二氢钠或磷酸氢二钠， 氯化钠、 氯化钾、 氯化钙或氯 化镁等或这些盐的混合物 )、 或干燥的 ( 特别是冻干的 ) 组合物， ， 其在加入无菌水或生理盐 水 ( 根据情况 ) 时允许构成可注射溶液。
     适于注射使用的药物形式包括无菌水性溶液或分散体 ； 含有芝麻油、 花生油或水 性丙二醇的制剂 ； 和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下， 该形式必须是无菌和必须是达到易注射的程度的流体。 它在制备和贮存条件下必须是稳定 的， 且必须抗微生物 ( 例如细菌和真菌 ) 污染。
     含有作为游离碱或药学上可接受盐的本发明化合物的溶液可以在与表面活性剂 ( 例如羟丙基纤维素 ) 适当地混合的水中制备。 分散体也可在甘油、 液体聚乙二醇及其混合 物中以及在油中制备。 在常规贮存和使用条件下， 这些制剂包含防腐剂以阻止微生物生长。
     本发明的丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物可配制成中性或盐形式的组合物。 药学 上可接受的盐包括酸加成盐 ( 由蛋白质的游离氨基形成 )， 且其与无机酸 ( 例如盐酸或磷 酸 ) 或有机酸 ( 例如醋酸、 草酸、 酒石酸、 扁桃酸等 ) 形成。由游离羧基形成的盐也可衍生 自无机碱 ( 例如氢氧化钠、 氢氧化钾、 氢氧化铵、 氢氧化钙或氢氧化铁 ) 以及有机碱 ( 例如 异丙胺、 三甲胺、 组氨酸、 普鲁卡因等 )。
     载体也可以是溶剂或分散介质， 包含例如水、 乙醇、 多元醇 ( 例如， 甘油、 丙二醇和 液体聚乙二醇等 )， 其适合的混合物及植物油。例如， 可通过使用包衣 ( 例如卵磷脂 )， 在分 散体的情况下通过保持所需粒径以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。 微生物活 动的预防可由各种抗菌剂和抗真菌剂， 例如对羟基苯甲酸酯、 氯丁醇、 苯酚、 山梨酸、 硫柳汞等来实现。在许多情况下， 优选包括等渗剂， 例如， 糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收 可通过在组合物中使用延缓吸收剂， 例如单硬脂酸铝和明胶， 来实现。
     无菌注射溶液通过以下步骤制备 ： 将所需量的活性多肽与以上列举的几种其他成 分 ( 根据需要 ) 一起加入适当的溶剂中， 然后过滤除菌。通常， 分散体通过以下步骤制备 ： 将各种无菌活性成分加入无菌载体中， 所述载体含有基础分散介质和所需的以上列举的其 他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况中， 优选的制备方法是真空干燥和冻 干技术， 其从先前的无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何其他所需成分的粉末。
     在制剂时， 将溶液以与剂型相容的方式和以治疗有效的量给药。该制剂容易以多 种给药形式给药， 例如上述的可注射溶液类型， 但也可以使用药物缓释胶囊等。
     对于以水性溶液形式的肠胃外给药， 例如， 应将所述溶液适当缓冲 ( 如有必要 ) 并 首先利用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水性溶液尤其适于静脉内、 肌肉内、 皮下和腹膜内给药。关于这一点， 根据本发明的公开， 可使用的无菌水性介质对于 本领域技术人员是已知的。例如， 一剂药物可以溶解在 1ml 的等渗 NaCl 溶液中， 并加入到 1000ml 皮下输注液体中或在建议的输注部位注射。根据被治疗受试者的状况， 进行一些剂 量的变化将是必要的。无论如何， 负责给药的人将决定单个受试者的适当剂量。 本发明的丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物可在配制成治疗混合物以包含每剂约 0.0001 到 1.0 毫克、 或约 0.001 到 0.1 毫克、 或约 0.1 到 1.0 或甚至约 10 毫克左右。也可 多剂量给药。
     除了配制成用于肠胃外给药 ( 例如静脉内或肌肉内注射 ) 的本发明化合物外， 其他药学上可接受的形式例如包括用于口服的片剂或其他固体 ； 脂质体制剂 ； 延时释放胶 囊； 和任何其他目前使用的形式。
    附图说明
     图1： 因子 X 酶原氨基酸序列的不同部分的图示。
    前肽 ( 或信号肽 ) 由 -40 到 -18 位之间的氨基酸序列定义， 且由 -17 到 -1位之间的氨基酸序列定义。对应于 1 到 142 位氨基酸之间的序列， 重链对应于 195 到448 位氨基酸之间的序列。激活肽 (143 到 194 位 ) 加框， 且关注的 N- 糖基化位点用 * 标 记。 所用的编号系统显示在与序列相同的行上， 其他参照系统在序列下的行上以灰色显示。
     图2： 对于因子 X 的凝血酶可裂解衍生物的血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物 的图示。
     A. 所述血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物包含血纤维蛋白肽 A 的氨基酸序列， 其中 14 或 15 位的氨基酸可以根据图示修饰。在羧基末端部分， 增加 3 个另外的氨基酸以 形成带有血纤维蛋白肽 A( 或衍生物 ) 的最后 3 个氨基酸的 6 个氨基酸的凝血酶可裂解位 点。
     B. 在本发明的优选方式中， 仅使用血纤维蛋白肽 A 的最后 10 个氨基酸， 并与 3 个 氨基酸的肽融合以形成凝血酶可裂解位点。
     图3： 对于蛋白 C 的凝血酶可裂解衍生物的血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物 的图示。
     A. 所述血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物包含血纤维蛋白肽 A 的氨基酸序列，且在羧基末端部分增加 3 个氨基酸以形成带有血纤维蛋白肽 A( 或衍生物 ) 的最后 3 个氨 基酸的 6 个氨基酸的凝血酶可裂解位点。
     B. 在本发明的优选方式中， 仅使用血纤维蛋白肽 A 的最后 10 个氨基酸， 并与 3 个 氨基酸的肽融合以形成凝血酶可裂解位点。
     图4： FX 变体构建体的图示。
     有七个重组因子 X(FX) 蛋白。蛋白结构域如下 ： 轻链是灰色， 激活肽 (AP) 是白色， 因子 X 的催化域 (catalytic domain) 是黑色。激活肽是不同变体间的差异位点。FpA 相当 于由 SEQ ID NO ： 7 定义的血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍生物， ap 对应于 FX 激活肽的羧 基末端的残基 176-194， 黑线表示 FX 激活肽中 N181A 和 N191A 的突变位点。
     图5： 蛋白 C 变体构建体的图示。
     有三个重组蛋白 C 蛋白。蛋白结构域如下 ： 轻链是灰色， 激活肽 (AP) 是白色， 和蛋 白 C 的催化域是黑色。FpA 相当于由 SEQ ID NO ： 7 定义的血纤维蛋白肽 A 凝血酶可裂解衍 生物， PP 对应于 FX 激活肽的羧基末端的残基 176-194。
     图6： wt-FX 从血浆的双相清除 (biphasic clearance)。
     将纯化 wt-FX 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。在指定时点采集血样。血 浆中残留 wt-FX 抗原的量用 ELISA( 参见 “实验过程” ) 定量。血浆中的残留抗原相对于注 射后 2min 时存在的量的百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的药代动力学参数 概括于表 I 中。数据表示各时点 3 只小鼠的平均值 ±S.D.。
     图7： FX/delAP-FpA 从血浆的单相清除。
     将纯化 FX/delAP-FpA 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。 在指定时点采集血 样。血浆中残留 FX/delAP-FpA 抗原的量用 ELISA( 参见 “实验过程” ) 定量。注射后血浆中 残留抗原相对于注射后 2min 时存在的量百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的 药代动力学参数概括于表 I 中。数据表示各时点 3 只小鼠的平均值 ±S.D.。
     图8： FX/AP-FpA 从血浆的双相清除。
     将纯化的 FX/AP-FpA 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。在指定时点采集血 样。血浆中残留 FX/AP-FpA 抗原的量用 ELISA( 参见 “实验过程” ) 定量。注射后血浆中残 留抗原相对于注射后 2min 时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据的药 代动力学参数概括于表 I 中。数据表示各时点 3 个小鼠的平均值 ±S.D.。
     图9： FX/AP176-194 从血浆的双相清除。
     将纯化的 FX/AP176-194 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。 在指定时点采集 血样。血浆中残留 FX/AP176-194 抗原的量用 ELISA( 参见 “实验过程” ) 定量。注射后血浆 中残留抗原相对于注射后 2min 时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自这些数据 的药代动力学参数概括于表 I 中。数据表示各时点 3 只小鼠的平均值 ±S.D.。
     图 10 ： FX/AP176-194-N181A-N191A 从血浆的单相清除。
     将纯化的 FX/AP176-194-N181A-N191A 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。 在 指定时点采集血样。血浆中残留 FX/AP176-194-N181A-N191A 抗原的量用 ELISA( 参见 “实 验过程” ) 定量。血浆中残留抗原相对于注射后 2min 时存在量的百分比对于注射后的时间 作图。源自这些数据的药代动力学参数概括于表 I 中。数据表示各时点 3 只小鼠的平均值 ±S.D.。图 11 ： FX/AP176-194-N181A 从血浆的双相清除。
     将纯化的 FX/AP176-194-N181A 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。在指定 时点采集血样。血浆中残留 FX/AP176-194-N181A 抗原的量用 ELISA( 参见 “实验过程” )定 量。血浆中残留抗原相对于注射后 2min 时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自 这些数据的药代动力学参数概括于表 I 中。数据表示各时点 3 只小鼠的平均值 ±S.D.。
     图 12 ： FX/AP176-194-N191A 从血浆的单相清除。
     将纯化的 FX/AP176-194-N191A 静脉内注射到小鼠体内 (10μg/ 小鼠 )。在指定 时点采集血样。血浆中残留 FX/AP176-194-N191A 抗原的量用 ELISA( 参见 “实验过程” )定 量。血浆中残留抗原相对于注射后 2min 时存在量的百分比对于注射后的时间作图。源自 这些数据的药代动力学参数概括于表 I 中。数据表示各时点 3 只小鼠的平均值 ±S.D.。 具体实施方式
     实施例
     材料和方法
     材料
     幼仓鼠肾脏 (BHK) 来自于 ATCC(Rockville， 美国 )。 胎牛血清 (FCS) 和牛血清蛋白 ( 无 BSA 蛋白酶 ) 从 PAA 实验室 (Les Mureaux， 法国 ) 购买。Dulbecco′ s 改良 Eagle′ s/ F12 培养基、 青霉素 / 链霉素、 两性霉素 ( 两性霉素 B 脱氧胆酸盐 ) 从 Invitrogen(Cergy Pontoise， 法 国 ) 获 得。 苯 甲 脒 和 苯 基 磺 酰 氟 (PMSF) 来 自 于 Calbiochem(Meudon， 法 国 )。氨甲喋呤、 维生素 K1、 聚乙二醇 8000(PEG) 从 Sigma(Saint Quentin Fallavier， 法国 ) 购买。N- 苄氧基羰基 -D- 精胺酰基 -L- 精氨酸 - 对 - 硝基酰替苯胺 - 二盐酸化 物 (N-a-Z-D-Arg-Gly-Arg-p-NA) 产品名 S-2765 来自于 Chromogenix( 瑞典 )。 L-α- 磷脂酰基 -L- 丝氨酸 ( 来自牛脑 ) 和 L-α- 胆碱磷脂 ( 来自蛋黄 ) 来自于 Avanti Polarlipids(Albaster， 美国 )。QAE Sephadex A-50、 HiTrapTM Q 柱、 Heparin HiTrap 柱 得自 GE Healthcare(Orsay， 法国 )。抗蛋白 C 亲合性基质从 Roche Diagnostics(Meylan， 法国 ) 购买。
     重组 FX 衍生物的构建
     含有人因子 X cDNA 的哺乳动物表达质粒 pKG5(Christophe 等人， 2001)、 含有人胰 岛素 cDNA 的质粒和含有人蛋白 C cDNA 的质粒用作标准 PCR 诱突的模板， 以产生分别编码全 长人因子 X、 全长人胰岛素和带有 C- 末端 HPC-4 标签的全长人蛋白 ( 残基 EDQVDPRLIDGK， SEQ ID NO ： 27) 的 cDNA。使用 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit v3.1(Applied Biosystems Applera， Courtaboeuf， 法国 ) 在 ABI PRISM 310 DNA 测序 仪上根据厂商的说明通过 DNA 序列分析检查克隆到表达载体 pNUT 中的突变的全长 cDNA。 FX 构建体用作标准 PCR 诱变的模板 ( 参见引物表 I)， 以产生编码在激活肽中具有部分缺失 和特定突变的因子 X 变体的 cDNA， 所述变体称为 FX/AP176-194、 FX/delPA-FpA、 FX/AP-FpA、 FX/AP176-194-N181A、 FX/AP176-194-N191A 和 FX/AP176-194-N181A-N191A( 图 4)。胰岛素 构建体用作标准 PCR 诱突的模板， 以产生编码包含 SEQ ID NO ： 2( 因子 X 的激活肽 ) 的 33 到 52 位的氨基酸序列的含有多肽 PP 的胰岛素变体的 cDNA。类似地， 蛋白 C 构建体用作模 板以产生编码蛋白 C 变体的 cDNA( 图 5)。克隆到 pNUT- 表达载体中的构建体的被完全测序。
    
    表I： 用于产生不同因子 X 变体的引物
    
    表达重组衍生物的细胞系的获得
     按照供应商的说明使用 jetPEI 反应物 (Qbiogen， Ozyme， 法国 ) 将 pNUT- 构建 体转染到幼仓鼠肾脏细胞 (BHK) 中。用含有浓度为 100μM 的氨甲喋呤 (Sigma) 的培养 基选择转染细胞后， 在选择培养基中挑选并增殖单克隆以获得稳定的细胞系。使用从 Dako(Dakopatts， Glostrup， 丹麦 ) 获得的抗与辣根过氧化酶偶联或不偶联的因子 X 的多克 隆抗体， 通过酶联免疫吸附试验 (ELISA) 分析因子 X 抗原的产生。来自 Kordia(Leiden， 荷 兰 ) 的纯化人血浆源因子 X(pd-FX) 用作参照。通过来自 Dako 的人胰岛素 ELISA 试剂盒分 析胰岛素的产生。利用用于涂层的亲合纯化的小鼠单克隆抗体 (Roche， Meylan， 法国 ) 和 来自 Dako 的抗与辣根过氧化酶偶联的蛋白的多克隆抗体通过两位点 ELISA 分析蛋白 C 的 产生。选择产生因子 X、 胰岛素和蛋白 C 的细胞系。
     重组因子 X、 胰岛素和蛋白 C 衍生物的制备和纯化
     将产生重组因子 X、 胰岛素和蛋白 C 衍生物以及野生型因子 X、 胰岛素和蛋白 C 的 2 稳定细胞系保持在 300cm 烧瓶中用于在补充有 10％ FCS、 50μM 氨甲喋呤、 100U/ml 青霉素、 100μg/ml 链霉素和 5μg/ml 维生素 K1( 不用于胰岛素 ) 的 DMEM/F-12 中产生蛋白。每 48 小时收集含有目标蛋白的培养基。加入苯甲脒和 PMSF 到最终浓度分别为 10 和 2mM， 培养 基离心 (6000g)， 通过醋酸纤维素膜 (0.45μm) 以除去细胞碎片， 并在使用前在 -20℃下储 存。在 37℃解冻条件培养基。加 EDTA 到最终浓度为 5mM。在蒸馏水和 Tris(pH 7.4) 中 稀释培养基以分别获得 Tris 和 NaCl 的最终浓度 25 和 60mM。然后混合物在室温下与 QAE Sephadex A-50 珠搅拌 30min 以使最终浓度达到 0.25 ％ (wt/v)。洗涤珠子， 然后用 50mMTris(pH 7.4)、 500mM NaCl 和 10mM 苯甲脒洗脱。 洗脱馏分中所包含的重组蛋白 (ELISA) 立 即用含有 10mM 的苯甲脒的 25mM Tris(pH 7.4) 和 100mM NaCl 透析， 并在使用前在 -20℃储 存。在 37℃解冻浓缩的蛋白。加钙到最终浓度为 5mM。按照供应商的说明使用 HPC-4- 琼脂 糖 (Roche， Meylan， 法国 ) 通过亲合色谱进行重组蛋白质的纯化。在作为酶原使用前 1h， 因 子 X 衍生物与 1mM PMSF 一直孵育以中和可能在重组蛋白的制备和纯化期间产生的任何痕 量的激活的因子 X。相同的处理应用于蛋白 C 衍生物。对照实验表明在 Tris-HCl 缓冲液中 30min 后， PMSF 完全水解且不会干扰其他反应。 在还原 (100mM 二硫苏糖醇， 最终浓度 ) 和非 还原条件下使用重组蛋白的 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析， 然后用 Coomassie Brilliant Blue R-250 染色评估蛋白纯度。在还原纯化的重组蛋白并负载到 10％ SDS- 聚丙烯酰胺凝 胶上后， 进行因子 X、 胰岛素和蛋白 C 的鉴定。 将溶解的蛋白转移到 Immobilon 膜上并用抗与 辣根过氧化物酶偶联的因子 X、 胰岛素和蛋白 C 的多克隆抗体 (Dakopatt， Glostrup， 丹麦 ) 染色。等分纯化的衍生物并在使用前储存在 -80℃下。等分试样的浓度以其在 280nm 的吸 光率估计， 取因子 X、 胰岛素和蛋白 C 的消光系数 (E280nm 0.1％ ) 为 1.16、 1.05 和 1.45。
     小鼠
     整个研究使用 C57BL/6 背景的野生型雄性小鼠 (Janvier， Le Genest-St-Isle， 法 国 )， 其为 8 至 9 周大。按照法国规章和欧洲共同体的试验指南所推荐的进行饲养和实验。 24 只小鼠用于各清除率调查。
     小鼠中因子 X 衍生物的清除率、 回收率和生物分布
     将非麻醉小鼠置于约束器中， 其尾部在 40℃水浴中浸 3min。然后， 将在磷酸盐缓 冲盐水 (PBS) 中以 50μg/ml 稀释的 200μl 因子 X 衍生物注射入小鼠尾静脉中。在不同 的时间点 ( 注射后 2、 6、 10 和 30min 及 1、 2、 4 和 8h)， 通过腹膜内注射戊巴比妥钠 (60mg/ kg ； Ceva SantéAnimale， Libourue， 法国 ) 麻醉小鼠并从眼球后静脉丛将血液收集到含有 柠檬酸三钠 (9 体积的血对 1 体积的 0.138M 柠檬酸三钠 ) 的塑料管中。每个时间点用三 只小鼠， 每个小鼠仅流血一次。为了获得贫血小板的血浆， 在室温下 1000g 离心血样 20 分 钟。使用在碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 中涂覆的称为 HPC-4 的小鼠单克隆抗体 (Roche) 和辣 根过氧化物酶偶联的抗人因子 X 的多克隆抗体 (Dako)， 通过免疫吸附试验测定血浆中因 子 X 衍生物的浓度。HPC4 标记的重组纯化和定量的野生型因子 X( 参见上文 ) 用作参照。 结果以注入的重组人因子 X 的百分数表示。对于生物分布实验和回收率测定， 如所描述的 (Fracker 和 Speck， BBRC 1978) 使用 Iodo Gen(Pierce Chemical Co.， Rockford， IL， 美国 ) 125 用 Na I(Perkin-Elmer， Courtaboeuf， 法国 ) 标记高度纯化的重组 FX 变体。比放射活性为 4 2 到 10×10 cpm/μg FX 变体。最终制剂中的游离碘通过用 20％三氯乙酸沉淀测定为低于 5％。回收率表示注射后 5min 血浆中存在的 FX 相对于注射的量的百分比。
     小鼠中蛋白 C 和胰岛素变体的清除率
     对于各蛋白 C 和胰岛素变体， 使用 24 只 8 周大的雄性 WT 小鼠。将 10μg 在 PBS 中稀释的纯化重组蛋白经由尾静脉注射入每只小鼠。 在注射后的不同时间点用三溴乙醇麻 醉小鼠 (60mg/kg 体重 )， 并使用水蛭素 (Diagnostica Stago， Asnieres， 法国 )(100UI， 最 终浓度 ) 由眼球后静脉收集血液。每个时间点使用三只小鼠， 各小鼠仅放血一次。制备血 浆并通过 ELISA 或通过剩余活度分析残留的注入抗原的浓度。
     数据分析清除率曲线指随时间变化的小鼠血浆中残留因子 X、 蛋白 C 和胰岛素衍生物抗原 相对于注射量的量 (％注射的浓度 )。数据拟合 ：
     ●单指数方程 ：
     Cp ＝ Ae-αt 方程 1
     ●或双指数方程 ：
     Cp ＝ Ae-αt+Be-βt 方程 2
     使 用 KaleidaGraph 软 件 (KaleidaGraph 版 本 4.02.， 用 于 Mac OS X， Synergy Software， Reading， 美国 ) 测定参数 A、 α、 B 和 β。Cp 指血浆中残留因子 X 衍生物相对于 注射量的量。这些参数是计算平均停留时间 (MRT) 所需要的。
     ●在双相清除过程中 ：
     MRT ＝ (A/α2+B/β2)/(A/α+B/β) 方程 3
     ●在单相清除机制中 ：
     MRT ＝ (A/α2)/(A/α) 方程 4
     此外， α 和 β 使用 T1/2α ＝ ln 2/α 和 T1/2β ＝ ln 2/β 分别计算初始和终 末阶段的半衰期。 凝血酶生成分析
     根 据 Hemker 等 人 描 述 的 方 法 (Hemker HC， Giesen P， Al Dieri R 等 人， Pathophysiol Haemost Thromb 2003 ； 33 ： 4-15)， 在配备有分配器的 Fluoroscan Ascent 荧 光 计 (Thermolabsystems OY， Helsink， Finland) 中 测 定 凝 血 酶 的 产 生。 简 言 之，
    将 补 充 有 盐 ( 对 照 ) 或 指 定 浓 度 的 抗 凝 血 剂 磺 达 肝 癸 钠 (fondaparinux)(Arixtra GlaxoSmithKline， Brentford， 英国 ) 和多种浓度的重组因子 X 衍生物的 80μl 血浆分 配到圆底 96- 孔微量滴定板中。含有 TF( 来自 Dade Behring 的重组脂质化人组织因 子， Innovin ) 和 磷 脂 (PL) 囊 泡 的 20μl 混 合 物 加 入 血 浆 样 品 中， 以获得最终浓度 1pM TF 和 4μM PL 囊 泡。 由 L-α- 磷 脂 酰 -L- 丝 氨 酸 (PS) 和 L-α- 磷 脂 酰 胆 碱 (PC) (Avanti Polarlipids， Albaster， Alabama， 美国 ) 制备的具有 100nm 标称直径的 PL 囊泡 (PC ∶ PS， 3 ∶ 1) 通过膜挤出方法合成 (Olson， F.， Hunt， C.A.， Szoka， F.C.， Vail， W.J. 和 Papahadjopoulos， D.(1979)Biochim Biophys Acta 557(1)， 9-23)。通过磷酸盐分析测定 磷脂浓度。最后， 通过添加含有荧光底物和 CaCl2 的 20μl 起动试剂触发凝血酶生成。荧 光底物 I-1140(Z-Gly-Gly-Arg-AMC) 来自 Bachem AG(Bubendorf， 瑞士 )。 在 37℃使用校正 的自动凝血酶生成图 (thrombogram) 对凝结血浆中的凝血酶产生动力学进行监测 60 分钟， 并使用 ThrombinoscopeTM 软件 (Thrombinoscope B.V.， Maastricht， 荷兰 ) 进行分析。每 个实验需要三个孔， 两个孔用于测定血浆样品的凝血酶生成， 一个孔用于校正。 所有实验重 复进行三次， 报告平均值。 测定内源凝血酶能力 (ETP)， 即曲线下面积， 峰值凝血酶和用于确 定凝血酶检测的延迟时间。
     结果
     重组体野生型因子 X 的双相清除
     为研究因子 X 从血浆中的清除， 将重组体野生型因子 X 静脉注射到小鼠体内。在 注射后的指定时间点， 给小鼠放血， 并分析血浆的因子 X 抗原。抗原值随注射后时间变化的 图示显示， 野生型因子 X 通过双相清除从血中消除， 其特征在于分别为 43 和 305min 的快速和缓慢半衰期 ( 图 6)。此外， 计算出 MRT 为 380min( 表 II)。
     表 II ： 描述 wt- 因子 X 及其变体从血浆的清除率和回收率的药代动力学参数。 N.A. ＝不适用。N.D. ＝未测定
     回收率 wt-FX FX/delAP-FpA FX/AP-FpA FX/AP176-194 FX/AP176-194-N181A-N191A FX/AP176-194-N181A FX/AP176-194-N191A
     69％ N.D. N.D. 67％ 29％ 61％ 76％ MRT 380min 58min 345min 330min 69min 191min 140min T1/2α 43min 40min 38min 44min 48min 15min 96min T1/2β 304min N.A. 266min 255min N.A. 140min N.A.重组 FX/delAP-FpA 的单相清除
     为确定激活肽在因子 X 的清除动力学中的作用， 设计、 制备并纯化了去除其激活 肽的因子 X 变体。命名为 FX/delAP-FpA 的该变体不具有因子 X 激活肽， 而具有对应于血纤 维蛋白肽 A 的羧基末端的 10 个残基。所述血纤维蛋白肽 A 残基的序列与存在于 FX 激活肽 中的相应的残基不同。 与野生型因子 X 相反， 在注射到小鼠体内后， FX/delAP-FpA 显示单相 清除模式， 表观半衰期为 40 分钟 ( 图 7)。另外， 与野生型因子 X 相比， 对于截短的分子 MRT 减少 6 倍 ( 表 II)。总之， 这些数据表明， 因子 X 的激活肽对血浆中因子 X 的清除起着重要 作用。
     重组 FX/AP-FPA 的双相清除
     为证实在 FX/delAP-FpA 的清除模式和药代动力学参数上观察到的效应不是由于 血纤维蛋白肽 A 残基的存在而是由于因子 X 激活肽的缺失， 设计、 制备、 纯化并鉴定了 FX/ AP-FpA。这一因子 X 变体包含在其羧基末端连接至血纤维蛋白肽 A 的 10 个残基的因子 X 激活肽的 52 个残基。将纯化的变体通过尾静脉注射施用于小鼠。观察到类似于野生型因 子 X 的清除模式 ( 图 8)。如表 II 所概括的， 对于该变体和 wt-FX 获得了类似的药代动力学 参数。因此， 先前观察到的 FX/delAP-FpA 清除的高速率 ( 参见上文 ) 与 FIX 序列的存在无 关， 而是由于 FX 激活肽的 52 个残基的缺失。
     重组 FX/AP176-194 的双相清除
     关注的是影响因子 X 清除的激活肽的残基。为此目的， 构建了称为 FX/AP176-194 的仅具有因子 X 激活肽的羧基末端的 19 个残基的因子 X 变体。通过尾静脉注射将纯化的 变体施用于小鼠。在不同时间点给小鼠放血并分析血浆的因子 X 抗原。这些实验显示， FX/ AP176-194 以与野生型因子 X 类似的方式从血浆中清除 ( 图 9)。事实上， 从试验数据可计 算得到类似的药代动力学参数 ( 表 II)。 这些数据证明， 因子 X 激活肽的羧基末端内的残基在因子 X 清除中起着重要作用。
     激活肽中的 N- 糖基化参与 FX 从循环的清除
     由于因子 X 的羧基末端包含两个 N- 糖基化位点 (Asn 181 和 191)， 使用在一 个或两个 N- 糖基化位点突变的 FX/AP 176-194 研究了这些翻译后修饰对因子 X 的循 环 寿 命 的 可 能 作 用。 制 备 了 称 为 FX/AP176-194-N181A、 FX/AP176-194-N191A 和 FX/ AP176-194-N181A-N191A 的两个单突变的和一个双突变的变体， 进行纯化并研究其清除。 双 突变体 FX/AP176-194-N181A-N191A 从循环中的清除比野生型因子 X 更快速， 且有意思地是 具有类似于 FXdelAP-FpA( 不具有因子 X 激活肽的因子 X 变体 ) 的清除模式 ( 图 10)。如 表 II 所示， 对于 FX/AP176-194-N181A-N191A 和 FX/delAP-FpA 获得了类似的药代动力学参 数。这些数据证明， 激活肽中的 181 和 191 位的 N- 糖基化对因子 X 的存留起着重要作用。 对于变体 FX/AP176-194-N181A， 观察到类似野生型因子 X 的双相清除 ( 图 11)。然而， 其从 循环中的消除如表 II 所示的比 wt-FX 更快。对于变体 FX/AP176-194-N191A， 观察到类似 于 FX/delAP-FpA 的单相清除 ( 图 12)。相反， 其消除比 FX/delAP-FpA 时间更长， 但与 FX/ AP176-194-N181A 相比具有类似的 MRT。这些数据显示， 181 位的 N- 糖基化造成因子 X 清除 的单相模式， 而 191 位的 N- 糖基化造成双相模式。此外， 两种 N- 糖基化对因子 X 的药代动 力学参数均起重要作用。
     参考文献
     在本申请中， 各个参考文献描述了本发明所属领域的技术现状。因此这些参考文 献的公开以引用方式合并入本公开。
     Arnljots B， Bergqvist D， B.Inhibition of microarterial thrombosis by activated protein C in a rabbit model.Thromb Haemost.1994 ； 72(3) ： 415-20.
     Bauer KA.New anticoagulants.Curr Opin Hematol.2008 ； 15(5) ： 509-15.
     Bernard GR， Vincent JL， Laterre PF， LaRosa SP， Dhainaut JF， Lopez-Rodriguez A， Steingrub JS， Garber GE， Helterbrand JD， Ely EW， Fisher CJ Jr.Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis.N Engl J Med.2001 ； 344(10) ： 699-709.
     Borensztajn K， Peppelenbosch MP， Spek CA.Factor Xa ： at the crossroads between coagulation and signaling in physiology and disease.Trends Mol Med.2008 ； 14(10) ： 429-40.
     Brady G， Jantzen HM， Bernard HU， Brown R， Schutz G， Hashimoto-Gotoh T.New cosmid vectors developed for eukaryotic DNA cloning.Gene.1984 Feb ； 27(2) ： 223-32.
     Brink MF， Bishop MD， Pieper FR.Developing efficient strategies for the generation of transgenic cattle which produce biopharmaceuticals in milk. Theriogenology.2000 ； 53(1) ： 139-48.
     Camire RM， Larson PJ， Stafford DW， High KA.Enhanced gamma-carboxylation of recombinant factor X using a chimeric construct containing the prothrombin propeptide.Biochemistry.2000 ； 39(46) ： 14322-9.Chesebro JH ， Webster MW ， Zoldhelyi P ， Roche PC ， Badimon L ， Badimon JJ.Antithrombotic therapy and progression of coronary artery disease. Antiplatelet versus antithrombins.Circulation.1992 ； 86(6 Suppl) ： III100-10.
     Christophe OD， Lenting PJ， Cherel G， Boon-Spijker M， Lavergne JM， Boertjes R， Briquel ME， de Goede-Bolder A， Goudemand J， Gaillard S， d′ Oiron R， Meyer D， Mertens K.Functional mapping of anti-factor IX inhibitors developed in patients with severe hemophilia.Blood.2001 ； 98(5) ： 1416-23.
     Comp PC， Esmon CT.Generation of fibrinolytic activity by infusion of activated protein C into dogs.J Clin Invest.1981 ； 68(5) ： 1221-8.
     Esmon CT.Regulation of blood coagulation.Biochim Biophys Acta.2000 ； 1477(1-2) ： 349-60.
     Gillies SD ，Morrison SL ，Oi VT ，Tonegawa S.A tissue-specific transcription enhancer element is located in the major intron of a rearranged immunoglobulin heavy chain gene.Cell.1983 Jul ； 33(3) ： 717-28.
     Gresele P， Momi S， Berrettini M， Nenci GG， Schwarz HP， Semeraro N， Colucci M.Activated human protein C prevents thrombin-induced thromboembolism in mice. Evidence that activated protein c reduces intravascular fibrin accumulation through the inhibition of additional thrombin generation.J Clin Invest.1998 ； 101(3) ： 667-76.
     G r u b e r A ，G r i f f i n J H ，H a r k e r L A ，H a n s o n S R . I n h i b i t i o n o f platelet-dependent thrombus formation by human activated protein C in a primate model.Blood.1989 ； 15 ； 73(3) ： 639-42.
    Gustafsson D， Bylund R， Antonsson T， Nilsson I，JE， Eriksson U，Bredberg U， Teger-Nilsson AC.A new oral anticoagulant ： the 50-year challenge.Nat Rev Drug Discov.2004 ； 3(8) ： 649-59.
     Hanson SR ，Griffin JH ，Harker LA ，Kelly AB ，Esmon CT ，Gruber A.Antithrombotic effects of thrombin-induced activation of endogenous protein C in primates.J Clin Invest.1993 ； 92(4) ： 2003-12.
     Harenberg J.Development of new anticoagulants ： present and future.Semin Thromb Hemost.2008 ； 34(8) ： 779-93.
     Jang Y， Guzman LA， Lincoff AM， Gottsauner-Wolf M， Forudi F， Hart CE， Courtman DW， Ezban M， Ellis SG， Topol EJ.Influence of blockade at specific levels of the coagulation cascade on restenosis in a rabbit atherosclerotic femoral artery injury model.Circulation.1995 ； 92(10) ： 3041-50.
     Joyce DE， Gelbert L， Ciaccia A， DeHoff B， Grinnell BW.Gene expression profile of antithrombotic protein c defines new mechanisms modulating inflammation and apoptosis.J Biol Chem.2001 ； 276(14) ： 11199-203.
     Kurz KD ，Smith T ，Wilson A ，Gerlitz B ，Richardson MA ，Grinnell BW.Antithrombotic efficacy in the guinea pig of a derivative of human proteinC with enhanced activation by thrombin.Blood.1997 ； 89(2) ： 534-40.
     Khoo CW， Tay KH， Shantsila E， Lip GY.Novel oral anticoagulants.Int J Clin Pract.2009 ； 63(4) ： 630-41.
     Kuwana Y， Asakura Y， Utsunomiya N， Nakanishi M， Arata Y， Itoh S， Nagase F， Kurosawa Y.Expression of chimeric receptor composed of immunoglobulin-derived V regions and T-cell receptor-derived C regions.Biochem Biophys Res Commun.1987 Dec 31 ； 149(3) ： 960-8.
     Louvain-Quintard VB， Bianchini EP， Calmel-Tareau C， Tagzirt M， Le Bonniec BF.Thrombin-activable factor X re-establishes an intrinsic amplification in tenase-deficient plasmas.J Biol Chem.2005 ； 280(50) ： 41352-9.
     Mason JO， Williams GT， Neuberger MS.Transcription cell type specificity is conferred by an immunoglobulin VH gene promoter that includes a functional consensus sequence.Cell.1985 Jun ； 41(2) ： 479-87.
     Miyaji H， Mizukami T， Hosoi S， Sato S， Fujiyoshi N， Itoh S.Expression of human beta-interferon in Namalwa KJM-1 which was adapted to serum-free medium. Cytotechnology.1990 Mar ； 3(2) ： 133-40.
     Mizukami T， Itoh S.A new SV40-based vector developed for cDNA expression in animal cells.J Biochem(Tokyo).1987 May ； 101(5) ： 1307-10.
     Mizutani A， Okajima K， Uchiba M， Noguchi T.Activated protein C reduces ischemia/reperfusion-induced renal injury in rats by inhibiting leukocyte activation.Blood.2000 ； 95(12) ： 3781-7.
     O′ Hare K， Benoist C， Breathnach R.Transformation of mouse fibroblasts to methotrexate resistance by a recombinant plasmid expressing a prokaryotic dihydrofolate reductase.Proc Natl Acad Sci U S A.1981 Mar ； 78(3) ： 1527-31.
     Rezaie AR.Vitronectin functions as a cofactor for rapid inhibition of activated protein C by plasminogen activator inhibitor-1.Implications for the mechanism of profibrinolytic action of activated protein C.J Biol Chem.2001 ； 276(19) ： 15567-70.
     Rudolph AE ， Mullane MP ， Porche-Sorbet R ， Miletich JP.Expression ， purification， and characterization of recombinant human factor X.Protein Expr Purif.1997 ； 10(3) ： 373-8.
     Taylor FB Jr， Chang A， Esmon CT， D′ Angelo A， Vigano-D′ Angelo S， Blick KE.Protein C prevents the coagulopathic and lethal effects of Escherichia coli infusion in the baboon.J Clin Invest.1987 ； 79(3) ： 918-25.
     Toso R， Zhu H， Camire RM.The conflormational switch from the factor X zymogen to protease state mediates exosite expression and prothrombinase assembly.J Biol Che m.2008 ； 283(27) ： 18627-35.
     Sakamoto T， Ogawa H， Yasue H， Oda Y， Kitajima S， Tsumoto K， Mizokami H.Prevention of arterial reocclusion after thrombolysis with activated proteinC.Comparison with heparin in a canine model of coronary artery thrombosis. Circulation.1994 ； 90(1) ： 427-32.32102325880 A CN 102325893
    序列表1/11 页
     33102325880 A CN 102325893序列表2/11 页
    34102325880 A CN 102325893序列表3/11 页
    35102325880 A CN 102325893序列表4/11 页
    36102325880 A CN 102325893序列表5/11 页
    37102325880 A CN 102325893序列表6/11 页
    38102325880 A CN 102325893序列表7/11 页
    39102325880 A CN 102325893序列表8/11 页
    40102325880 A CN 102325893序列表9/11 页
    41102325880 A CN 102325893序列表10/11 页
    42102325880 A CN 102325893序列表11/11 页