丝氨酸蛋白酶衍生物及其在凝血功能障碍的预防或治疗中的用途.pdf

1、10申请公布号CN102325880A43申请公布日20120118CN102325880ACN102325880A21申请号200980157388322申请日2009122108305990720081219EP09305349420090423EP61/22296020090703USC12N9/64200601C07K19/00200601A61K38/4320060171申请人国家健康与医学研究院地址法国巴黎72发明人奥利弗克里斯托夫塞西尔德尼吉莱纳谢雷尔保罗盖冈74专利代理机构北京市金杜律师事务所11256代理人陈文平金惠淑54发明名称丝氨酸蛋白酶衍生物及其在凝血功能障碍的预防或治

2、疗中的用途57摘要本发明涉及丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物，其含有用于提高所述衍生物的半衰期的因子X的激活肽或其片段。优选地，所述嵌合衍生物是蛋白C和因子X衍生物。本发明也涉及用于预防或治疗凝血功能障碍的所述衍生物。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2011081986PCT申请的申请数据PCT/EP2009/0676322009122187PCT申请的公布数据WO2010/070137EN2010062451INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书3页说明书28页序列表11页附图11页CN102325893A1/3页21一种多肽，其包含SEQIDNO2的33

3、到52位的氨基酸序列，其中在39位或49位的天冬酰胺是N糖基化的。2权利要求1所述的多肽，其用于提高丝氨酸蛋白酶酶原的半衰期。3一种融合蛋白，含有权利要求1所述的第一多肽，和第二多肽，其包含SEQIDNO4的7到16位的氨基酸序列。4权利要求3所述的融合蛋白，其中所述第一多肽的羧基端区域与所述第二多肽的氨基端区域融合。5因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白质的天然激活肽由权利要求34中任一项所述的融合蛋白取代。6权利要求5所述的因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中对应于SEQIDNO1的235位残基的异亮氨酸被丙氨酸、丝氨酸或亮氨酸取代，和/或对应于SEQIDNO1的236位残基的

4、缬氨酸被苯丙氨酸或丙氨酸取代，和/或对应于SEQIDNO4的14位残基的甘氨酸被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代，和/或；对应于SEQIDNO4的15位残基的缬氨酸被脯氨酸取代。7一种因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白质的天然激活肽被融合蛋白取代，所述融合蛋白含有权利要求1所述的多肽，和氨基酸序列SEQIDNO5或SEQIDNO6所定义的血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物。8权利要求7所述的因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述多肽由氨基酸序列SEQIDNO2所定义。9权利要求78任一项所述的因子X的嵌合凝血酶可裂解衍生物，其中所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物由选自SEQIDNO

5、7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11和SEQIDNO12的氨基酸序列所定义。10权利要求79任一项所述的因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述多肽由氨基酸序列SEQIDNO2所定义，和所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物由氨基酸序列SEQIDNO7所定义。11一种蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白质的天然激活肽由权利要求34中任一项所述的融合蛋白取代。12权利要求11所述的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中对应于SEQIDNO3的212位残基的亮氨酸被丙氨酸或丝氨酸取代；和/或对应于SEQIDNO3的213位残基的异亮氨酸被苯丙氨酸

6、取代；和/或对应于SEQIDNO3的214位残基的天冬氨酸被甘氨酸取代；和/或对应于SEQIDNO4的14位残基的甘氨酸被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代；和/或对应于SEQIDNO4的15位残基的缬氨酸被脯氨酸取代。权利要求书CN102325880ACN102325893A2/3页313一种蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白质的天然激活肽被融合蛋白取代，所述融合蛋白含有权利要求1所述的多肽，和由氨基酸序列SEQIDNO13或SEQIDNO14定义的血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物。14权利要求13所述的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述多肽由氨基酸序列SEQIDNO2所定义。

7、15权利要求1314任一项所述的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物由选自SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17、SEQIDNO18、SEQIDNO19、SEQIDNO20、SEQIDNO21、SEQIDNO22、SEQIDNO23、SEQIDNO24、SEQIDNO25或SEQIDNO26的氨基酸序列定义。16权利要求1315任一项所述的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述多肽由氨基酸序列SEQIDNO2定义，和所述血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物由氨基酸序列SEQIDNO15定义。17一种因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其含

8、有激活的因子X或其功能保守的变体和权利要求34任一项所述的融合蛋白。18权利要求17所述的因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述融合蛋白与激活的因子X或其功能保守的变体的重链氨基末端融合。19权利要求1718任一项所述的因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中对应于SEQIDNO1的235位残基的异亮氨酸被丙氨酸、丝氨酸或亮氨酸取代；和/或对应于SEQIDNO1的236位残基的缬氨酸被苯丙氨酸或丙氨酸取代；和/或对应于SEQIDNO4的14位残基的甘氨酸被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代；和/或对应于SEQIDNO4的15位残基的缬氨酸被脯氨酸取代。20一种蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其含

9、有激活的蛋白C或其功能保守的变体和权利要求34任一项所述的融合蛋白。21权利要求20所述的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述融合蛋白与激活的因子X或其功能保守的变体的重链氨基末端融合。22权利要求2021任一项所述的蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中对应于SEQIDNO3的212位残基的亮氨酸被丙氨酸或丝氨酸取代；和/或对应于SEQIDNO3的213位残基的异亮氨酸被苯丙氨酸取代；和/或对应于SEQIDNO3的214位残基的天冬氨酸被甘氨酸取代；和/或对应于SEQIDNO4的14位残基的甘氨酸被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代；和/或对应于SEQIDNO4的15位残基的缬氨酸被脯氨酸取

10、代。23一种核酸分子，其编码权利要求516任一项所述的嵌合的凝血酶可裂解衍生物。24权利要求510和1719任一项所述的因子X的嵌合衍生物，用于出血型的凝血病症的预防或治疗。权利要求书CN102325880ACN102325893A3/3页425权利要求24所述的因子X的嵌合衍生物，用于A或B型血友病的预防或治疗。26权利要求1116和2022任一项所述的蛋白C的嵌合衍生物，用于涉及高凝性的病症的预防或治疗。27权利要求26所述的蛋白C的嵌合衍生物，用于血栓症的预防或治疗。28用于预防或治疗凝血障碍的药物组合物，其包含权利要求522任一项所述的嵌合衍生物。29一种融合蛋白，其含有权利要求1所述

11、的第一多肽，和含有SEQIDNO4的7到16位的氨基酸序列的第二多肽，其中对应于SEQIDNO4的14位残基的甘氨酸被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代，和/或对应于SEQIDNO4的15位残基的缬氨酸被脯氨酸取代。30权利要求29所述的融合蛋白，其中所述第一多肽的羧基端区域与第二多肽的氨基端区域融合。31权利要求510和1719任一项所述的因子X的嵌合衍生物，用于预防或治疗由低分子量肝素LMWH或由靶向因子XA的抗凝血剂引发的出血的方法中。32权利要求31所述的因子X的嵌合衍生物，其中所述因子X的嵌合衍生物的对应于SEQIDNO1的419位残基的丝氨酸被丙氨酸取代。33权利要求32所述的因子X的嵌

12、合衍生物，其中所述因子X嵌合衍生物的分别对应于SEQIDNO1的387和391位残基的精氨酸和赖氨酸被丙氨酸取代。34一种融合蛋白，其含有权利要求1所述的第一多肽，和目标蛋白质。35权利要求34所述的融合蛋白，其中所述目标蛋白质是一种循环蛋白。权利要求书CN102325880ACN102325893A1/28页5丝氨酸蛋白酶衍生物及其在凝血功能障碍的预防或治疗中的用途技术领域0001本发明涉及因子X的激活肽及其在提高丝氨酸蛋白酶衍生物特别是蛋白C、因子IX和因子X衍生物的半衰期和回收率中的用途，以及这些衍生物在蛋白C、因子IX和因子X相关病症特别是凝血功能障碍的预防或治疗中的用途。背景技术00

13、02凝血是在响应血管损伤而发生的主要和复杂的过程。它包括形成凝块以停止出血和开始修复受损血管其壁由含有血小板和血纤维蛋白的凝块覆盖。该过程几乎在损伤后立即开始。0003凝血过程包括两种类型的组分称为血小板的细胞组分和称为凝血因子的蛋白组分。血小板立即在损伤部位形成栓塞；这称为初级止血。同时发生次级止血称为凝血因子或凝固因子的血浆蛋白作出复杂级联响应，以形成强化血小板栓塞的血纤维蛋白丝。0004次级止血的凝血级联被分成两种途径，称为内源性途径或接触激活途径，和外源性途径，也称为组织因子途径。许多凝血因子以及辅因子和调节因子参与其中以恰当地维持该过程。0005例如，蛋白C是用于调节凝血的主要机制称

14、为“抗凝血剂途径”的关键因子。蛋白C的活性形式激活的蛋白C是丝氨酸蛋白酶，其在与另一种辅因子蛋白S结合时降解对凝血酶的大量产生必要的凝血级联的两种因子因子VA和VIIIA。这些因子的破坏负向调节所形成的凝血酶的量，导致抗凝血效应。特别是已知这种蛋白具有多效生物活性不仅具有抗血栓形成活性TAYLOR等人，1987；GRUBER等人，1990；CHESEBRO等人，1992；HANSON等人，1993；ARNLJOTS等人，1994；SAKAMOTO等人，1994，JANG等人，1995，KURZ等人，1997；GRESELE等人，1998；MIZUTANI等人，2000；BERNARD等人，20

15、01，还具有抗炎活性EMSON，2000、抗细胞凋亡活性JOYCE等人，2001和促溶血纤活性COMP等人，1981；REZAIE，2001。0006因子IX以下称为FIX是凝血的一个关键丝氨酸蛋白酶。这种蛋白的缺失引起出血病症，称为B型血友病。在凝血期间，激活的FIXFIXA与其激活辅因子，因子VIIIA以下称为FVIIIA，结合，将其特定底物因子XFX，以下称为FX转换为其激活的衍生物，激活的因子X以下称为FXA。0007因子X是凝血级联的另一个关键因子。FX的激活形式FXA是能够在与其辅因子凝血因子VA结合时将凝血酶原活化成凝血酶的唯一的丝氨酸蛋白酶。此外，长期被认为是被动旁观者的因子X

16、目前表现为经由其两种主要受体蛋白酶激活受体1PAR1和PAR2的激活作用于各种各样细胞类型的直接参与者。最近的发现提示，PAR2在纤维增殖性疾病例如纤维化、组织重建和癌症中起着重要作用，并指因子X为协调凝血和疾病进展之间的分界的重要介质BORENSZTAJN等人，2008。0008蛋白C、因子IX和因子X分别是肝脏中合成的62KDA、55KDA和59KDA的糖蛋白。说明书CN102325880ACN102325893A2/28页6在其分泌进入血浆前，其多肽链经过几次翻译后熟化以变成功能性酶原。0009两种酶原蛋白C和因子X由肽链裂解得到的氨基端轻链和羧基端重链组成，其中轻链和重链由二硫桥连接。

17、酶原因子IX是单链糖蛋白。0010如同大多数丝氨酸蛋白酶前体一样，蛋白C、因子IX和因子X是缺乏催化活性的酶原。其激活是其重链中蛋白酶促裂解的结果。在蛋白C中，这种裂解发生在重链的N末端，从而释放12个氨基酸的“激活”肽。在因子X中，这种裂解发生在酶原的ARG193和ILE194残基之间，从而也释放52个氨基酸的“激活”肽。在因子IX中，发生两个裂解，也从前体分子的内部区域释放分子量近似等于11KDA的激活肽。0011血液凝因必须很好地控制以避免出血或凝血的任何危险。因此，凝血过程的失调导致严重的病症，例如出血增加的出血危险和血栓症增加的凝血危险。因增加的凝血危险导致的病理包括严重的病症，例如

18、静脉或动脉血栓形成，特别是影响大口径血管的血栓形成、心肌梗死、血栓形成性疾病、肺栓塞、血管成形术或溶栓治疗后的冠状动脉再梗塞，以及患有影响蛋白C基因或凝血调节蛋白基因的遗传异常的患者的凝血异常。给予病人抗凝血剂以终止血栓形成凝血不适当地存在于血管中。这用于易感者中深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗死和中风的初级和次级预防。出血是在血栓栓塞THROMOBOEMBOLIC并发症的预防和治疗中口服使用抗凝剂的最严重的并发症。用华法令或肝素抗凝血的个体如果出血或需要手术时通常分别用特定的解毒药例如维生素K或鱼精蛋白治疗。不幸的是，华法令、肝素、维生素K和鱼精蛋白的治疗活性伴随不良的副作用，这使其使用复杂化

19、。相反，还没有用于逆转低分子量肝素LMWH或靶向因子XAFXA的新型口服抗凝血剂的抗凝血效应的特异性的和有效的解毒剂参考综述，HARENBERG，2008，BAUER，2008，KHOO等人，2009。当使用这些新的抗凝疗法时，可能观察到大出血。因此，及时采取适当的机械的和系统的行动以控制出血是必要的。这包括停止抗凝血治疗以及，如有可能，使用可得到的特定逆转剂逆转抗凝血效应。目前需要针对这些抗凝血剂的特异性解毒药。0012另一方面，出血型的病理学特别地包括A或B型血友病分别缺乏因子VIII和IX。这些严重疾病常常由于用于治疗的中和抗因子VIII或IX的同种抗体的“抑制剂”的存在而复杂化。001

20、3目前有着改善这些病症的治疗的需要。0014第一种治疗策略是绕过凝血级联和调节的缺陷步骤。用于改善目前治疗的另一种策略是改善所使用化合物主要是在血浆中易被中和的蛋白质的半衰期。用于改善治疗的另一种途径是重建自动放大系统或逆控制。0015用于高凝性病症例如蛋白C缺失的治疗是蛋白C、激活的蛋白C、蛋白C衍生物。目前用于血友病的治疗是对于A和B型血友病分别施用因子VIII或IX。0016这些治疗是昂贵的，特别是因为由于化合物的短半衰期而需要反复注射，而且这些治疗具有局限性，如抑制剂或中和抗通常用于治疗A和B型血友病的因子VIII或IX的同种抗体的的开发。此外，已观察到施用重组蛋白质特别是因子IX来治

21、疗B型血友病，由于较之施用血浆来源的产物具有更低的回收率而受到阻碍。0017已经提出潜在方法作为新的治疗策略。特别是，WO03035861专利申请描述了蛋白C和因子X的凝血酶可酶解的嵌合衍生物。0018然而，这些化合物的短的半衰期限制了其在凝血功能障碍中的使用。本发明提出说明书CN102325880ACN102325893A3/28页7一种新的方法解决该技术问题。0019发明简述0020本发明涉及多肽PP，其包含SEQIDNO2的33到52位的氨基酸序列因子X的激活肽，其中39或49位的天冬酰胺是N糖基化的。0021本发明也涉及所述多肽用于提高循环蛋白例如丝氨酸蛋白酶酶原，如因子IX、因子X、

22、蛋白C，的半衰期和回收率的用途。0022本发明也涉及融合蛋白FP，其含有0023第一多肽PP和0024第二多肽，其包含SEQIDNO4的7到16位的氨基酸序列。0025本发明涉及因子X或蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白质的天然激活肽被融合蛋白FP取代。0026本发明涉及因子X或蛋白C的凝血酶可裂解衍生物，其中所述蛋白质的天然激活肽被融合蛋白FP取代。0027本发明还涉及因子X或蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物，其含有激活因子X或蛋白C或其功能保守的变体和融合蛋白FP。0028本发明涉及编码本发明嵌合的凝血酶可裂解衍生物的核酸分子。0029本发明涉及本发明因子X的嵌合衍生物用于预防

23、或治疗出血型的凝血病症的用途。0030本发明涉及本发明因子X的嵌合衍生物用于预防或治疗由低分子量肝素LMWH或由靶向因子XAFXA的抗凝血剂引起的出血的方法。0031本发明也涉及本发明蛋白C的嵌合衍生物用于预防或治疗涉及高凝性的病症的用途。0032本发明涉及用于预防或治疗凝血障碍的包含本发明嵌合衍生物的药物组合物。0033发明详述0034通过对因子X的不同构造的研究，本发明人证明因子X的激活肽在因子X的清除过程及其回收中起着基本的作用。0035更具体地，他们观察到，这一激活肽的羧基末端的十九个氨基酸在因子X的清除动力学中有着主要作用。该十九个残基的序列包含对观察到的机制重要的两个N糖基化位点。

24、0036定义0037“功能保守的变体”是其中蛋白或酶中给定的氨基酸残基发生变化但不改变多肽的整体构象和功能的那些变体，包括但不限于，用具有类似性质例如，极性、氢键键合潜力、酸性、碱性、疏水性、芳香性等的氨基酸取代。除了显示为保守的那些氨基酸以外的氨基酸在蛋白质中可以不同，以便具有相似功能的任何两个蛋白之间的蛋白质或氨基酸序列的百分相似性可以改变，且可以是例如根据比对方案例如通过群集法CLUSTERMETHOD确定的70到99，其中相似性是基于MEGALIGN算法。“功能保守的变体”也包括由BLAST或FASTA算法确定的具有至少60、优选至少75、最优选至少85、进一步优选至少90的氨基酸同一

25、性的多肽，且其与进行比较的天然或母蛋白PARENTPROTEIN具有相同或基本上相似的性质或功能。说明书CN102325880ACN102325893A4/28页80038两个氨基酸序列超过80、优选超过85、优选超过90的氨基酸相同，或超过约90，优选超过95的氨基酸相似功能上相同时是“基本上同源”或“基本上相似”的。优选地，相似或同源的序列通过例如使用GCGGENETICSCOMPUTERGROUP，PROGRAMMANUALFORTHEGCGPACKAGE，VERSION7，MADISON，WISCONSIN堆积程序PILEUPPROGRAM的比对或任何序列比较算法例如BLAST、FAS

26、TA等来鉴别。0039根据本发明，术语“融合蛋白”或“嵌合蛋白”指的是通过连接两个或更多个基因或其片段其原来编码分离的多肽而生成的蛋白质。这种融合基因的翻译导致具有源自各原始多肽的功能性质的单个多肽。重组融合蛋白通过用于生物研究或治疗的重组DNA技术人工生成。重组融合蛋白是通过融合基因的基因工程生成的蛋白质。这通常包括去除编码第一蛋白的CDNA序列中的终止密码子，然后通过连接或重叠延伸PCR同框INFRAME附加第二蛋白的CDNA序列。然后该DNA序列由细胞表达为单个蛋白。该蛋白可以工程化以包括两个原始蛋白的全部序列，或仅任一个原始蛋白的一部分序列。0040术语“回收率”意指抗原或注射分子的活

27、性水平相对于计算得到的理论或预期的抗原或活性的百分比。0041“循环蛋白”意指由身体器官细胞合成并在血流中输送的蛋白。循环蛋白的例子是凝血因子、蛋白激素。0042凝血因子通常是丝氨酸蛋白酶。也有一些例外。例如，因子VIII和因子V是糖蛋白，因子XIII是转谷氨酰胺酶。0043蛋白激素是分泌到血流中并在活动物体中具有内分泌功能的一类蛋白质。0044术语“丝氨酸蛋白酶酶原”具有本领域的一般含义并指丝氨酸蛋白酶的无活性前体，其需要裂解以使其变成活性酶。根据本发明，目标丝氨酸蛋白酶限于属于循环蛋白的那些。0045丝氨酸蛋白酶包括其中活性部位的氨基酸之一是丝氨酸的几种蛋白酶。根据本发明，目标丝氨酸蛋白酶

28、可以是但不限于因子IX、因子X或蛋白C，且特别是因子X和蛋白C。0046根据本发明，术语“丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物”是通过将丝氨酸蛋白酶酶原或其片段与目标多肽连接而获得的融合蛋白。所得到的蛋白显示出所述丝氨酸蛋白酶的功能性质。0047特别地，术语“丝氨酸蛋白酶酶原的嵌合衍生物”是通过激活的丝氨酸蛋白酶或其片段与目标多肽的融合而获得的融合蛋白。0048根据本发明，丝氨酸蛋白酶酶原的所述嵌合衍生物与天然丝氨酸蛋白酶酶原不同，但至少显示等同的活性。0049术语“因子X”具有本领域的一般含义并指参与凝血机制的分泌的丝氨酸蛋白酶。因子X可以来自于任何来源，但通常是哺乳动物例如，人和非人灵长类动物因子

29、X，更特别是人因子X。通常，人因子X的氨基酸序列由SEQIDNO1图1提供。0050存在不同的编号系统以定位因子X的氨基酸残基0051参照由因子X的CDNA推导的序列的编号系统。0052参照由分泌的蛋白质推导的序列的编号系统，分泌的蛋白包含轻链、激活肽和重链编号为1的氨基酸残基是轻链的氨基末端的第一氨基酸残基。使用了该编号系统。上游的氨基酸位置用负数标识原肽PROPEPTIDE的C末端氨基酸编号为1，且翻译的蛋说明书CN102325880ACN102325893A5/28页9白的N末端氨基酸残基其是前肽PREPEPTIDE的氨基末端氨基酸残基编号为40。0053如图1所示，因子X的序列分成五个

30、不同的区域，其根据所使用的编号系统对应于005440到28位之间的前肽或信号肽，005527到1位之间的原肽，00561到142位之间的轻链，0057143到194位之间的激活肽，0058195到448位之间的重链。0059术语“因子X”或“FX”或“成熟FX”或“酶原FX”意指在由产生的肝细胞分泌后，因子X的血液循环形式。信号肽由信号肽酶切除，原肽序列在成熟N末端链的N末端的前11个谷氨酸残基发生羧化作用后切除。进一步的加工步骤通过在根据所使用编号系统的ARG142和SER143图1，SEQIDNO1的182183位之间的裂解进行。这一加工步骤也伴随着导致三肽ARG140LYS141ARG1

31、42SEQIDNO1的180182位的缺失。所获得的分泌因子X酶原由139个氨基酸的N端轻链和306个氨基酸的C端重链组成，轻链和重链经由CYS132和CYS302之间的二硫桥共价连接。进一步的翻译后加工步骤包括ASP63的羟基化作用以及N和O型糖基化。0060术语“激活的因子X”或“FXA”意指在需要凝血活性例如凝血酶产生的情况中产生的循环因子X的酶学活性形式。在能够激活因子X的生理条件下，从SER143到ARG194的52个氨基酸的所谓激活肽通过在ARG194处切割重链的羧基端而与分子的其余部分分开图1。0061根据本发明，术语“因子X”和“激活的因子X”包括天然存在的因子X和激活的因子X

32、，也包括其功能保守的变体和修饰形式。特别地，本发明包括因子X酶原或激活的形式的所有已知的功能保守的变体，例如CAMIRE等人，2000描述的变体其中天然因子X的原肽被凝血酶原的原肽替代，以获得更高产量的羧化的成熟蛋白，或RUDOLPH等人，1997描述的变体其中对应于因子X的残基2的密码子ACG，其对应于SEQIDNO1的39位的苏氨酸可以变成AGG其对应于精氨酸中以允许准确地切割原肽。0062术语“因子X的激活肽”具有其在本领域的一般含义并意指根据所使用的编号系统的因子X的143到194位的52个氨基酸的多肽SEQIDNO1的183234位。该术语可包括天然存在的因子X激活肽和其功能保守的变

33、体和修饰形式。本文定义的激活肽相当于因子X的人激活肽，但是也可以来自任何来源，然而通常是哺乳动物例如，人和非人灵长类动物因子X，更特别的是人因子X。人因子X的激活肽的氨基酸序列由SEQIDNO2提供。0063在本发明中，因子X激活肽的羧基端部分的19个最后氨基酸的序列对应于目标多肽，其对应于SEQIDNO2的33到52位的氨基酸序列，或对应于根据所使用的编号系统的因子X的176到194位图1。该多肽也称为PA176194。这一多肽在SEQIDNO2的39和49位包含两个糖基化位点，对应于根据所使用编号系统的因子X的181和191位。0064术语“蛋白C”具有本领域的一般含义并意指参与调节凝血的

34、主要机制称为“抗凝血剂途径”的分泌丝氨酸蛋白酶。蛋白C可以来自于任何来源，但通常是哺乳动物例如，人和非人灵长类动物蛋白C，更特别是人蛋白。通常，人蛋白C的氨基酸序列由SEQID说明书CN102325880ACN102325893A6/28页10NO3提供。0065蛋白C的激活肽是序列SEDIDNO3的200到211位之间发现的十二个氨基酸的多肽。0066术语“蛋白C”或“PC”或“成熟PC”或“酶原PC”意指由肝产生细胞分泌后的蛋白C的血液循环形式。信号肽由信号肽酶切除，原肽序列在成熟N末端链的N末端的前9个谷氨酸残基始于序列SEDIDNO3的43位的丙氨酸上发生羧化作用后切除。进一步的加工步

35、骤通过双联体LYS198ARG199SEDIDNO3的缺失发生。所获得的分泌蛋白C酶原由155个氨基酸的N末端轻链和262个氨基酸的C末端重链组成，其由二硫桥共价连接。进一步的翻译后加工步骤包括ASP113SEDIDNO3的羟基化作用以及N型糖基化。0067术语“激活的蛋白X”或“PCA”意指在需要凝血活性例如凝血酶产生的情况下产生的循环蛋白C的酶学活性形式。在能够激活蛋白C的生理条件下，ASP200到ARG211SEDIDNO3的12个氨基酸的所谓激活肽通过在ARG211SEDIDNO3处裂解重链的羧基末端来而与分子的其余部分分开。0068根据本发明，术语“蛋白C”或激活的蛋白C”包括天然存

36、在的蛋白C和激活的蛋白C，但也包括其功能保守的变体和修饰形式。特别是，本发明包括蛋白C酶原或激活的形式的所有已知的功能保守的变体，例如含有在ASN355和371处的取代的具有较高抗凝血活性的激活的蛋白C衍生物美国专利5453373，以及具有降低的抗凝血活性同时具有所需的细胞保护性质抗细胞凋亡、抗神经变性病症和抗中风的保护性质的激活的蛋白C的衍生物参见，例如WO2005/007820。这些突变体例如是3K3AAPC和229/230APC。0069术语“血纤维蛋白肽A”具有本领域的一般含义并意指通过凝血酶的作用从血纤维蛋白原的链的N末端片段移去的16个氨基酸残基的小肽。该术语可以包括天然存在的血纤

37、维蛋白肽A及其保守的功能变体和修饰形式。血纤维蛋白肽A可以来自任何来源，但通常是哺乳动物例如，人和非人灵长类动物血纤维蛋白肽A，更特别的是人血纤维蛋白肽A。通常，人血纤维蛋白肽A的氨基酸序列由SEQIDNO4提供。0070根据本发明，术语“血纤维蛋白肽A凝血酶可裂解衍生物”意指含有血纤维蛋白肽A或其片段和血纤维蛋白肽A的羧基末端部分的凝血酶可裂解位点的多肽。这种衍生物由因子X的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的序列的SEQIDNO5图3A或SEQIDNO6图3B定义和由蛋白C的嵌合的凝血酶可裂解衍生物的序列SEQIDNO13图4A或SEQIDNO14图4B限定。0071根据本发明，术语“凝血酶可裂解位

38、点”意指可被凝血酶凝血的主要丝氨酸蛋白酶识别和裂解的短的氨基酸序列。0072糖基化是将糖类连接到蛋白质上的酶过程。蛋白的糖基化通常是N连接的。“N连接”意指糖部分连接到天冬酰胺残基的侧链上。三肽序列天冬酰胺X丝氨酸和天冬酰胺X苏氨酸其中X是除了脯氨酸外的任何氨基酸是用于糖部分酶促连接到天冬酰胺侧链上的识别序列。因此，这些三肽序列的任何一个在多肽中的存在产生潜在糖基化位点。通常，与蛋白N连接的寡糖由葡萄糖、甘露糖和2N乙酰氨基葡萄糖分子组成，然后其可由多种不同的单糖包括半乳糖、N乙酰氨基葡萄糖、N乙酰半乳糖胺、岩藻糖和唾液酸延长。说明书CN102325880ACN102325893A7/28页1

39、10073因此，术语“N糖基化的”意指多肽在以上定义的至少一个天冬酰胺残基上的N糖基化。0074从广义上说，术语“预防”或“防止”意指在还未诊断为患有疾病或病症的患者中预防发生这种疾病或病症。0075从广义上说，术语“治疗”或“疗法”意指逆转、缓解、抑制该术语应用的疾病或病症的发展或者这种疾病或病症的一种或多种症状。0076术语“患者”意指患有凝血障碍或易患凝血障碍的任何受试者优选人。0077根据本发明，术语“蛋白C和因子X相关障碍”意指涉及因子X或蛋白C的任何病状，特别是凝血功能障碍。0078根据本发明，术语“凝血功能障碍”或“凝血障碍”意指由于凝血机制的失调而引起的任何病状。因此它包括涉及

40、过度凝血和凝血不足的病症。0079涉及过度凝血或高凝性的病症包括但不限于静脉或动脉血栓形成、心肌梗死、血栓性疾病、肺栓塞、冠状动脉再闭塞和蛋白C缺乏。0080涉及凝血不足的病症称为出血病症，且特别地包括因子VIII、IX或XI缺乏。特别地，这些病症可以是A或B型血友病和由与另一种病症例如自身免疫性疾病或癌症有关的自身抗体的出现导致的血友病。0081源自因子X的激活肽的多肽0082本发明的第一个目的涉及多肽PP，其含有SEQIDNO2的33到52位的氨基酸序列，其中39或49位的天冬酰胺是N糖基化的。0083在优选的实施方式中，39和49位的天冬酰胺是N糖基化的。0084在一个实施方式中，所述多

41、肽包含SEQIDNO2的33到52位的氨基酸序列。0085在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的32到52位的氨基酸序列。0086在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的31到52位的氨基酸序列。0087在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的30到52位的氨基酸序列。0088在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的29到52位的氨基酸序列。0089在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的28到52位的氨基酸序列。0090在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的27到52位的氨基酸序列。0091在一个具体的实

42、施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的26到52位的氨基酸序列。0092在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的25到52位的氨基酸序列。0093在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的24到52位的氨基酸序列。说明书CN102325880ACN102325893A8/28页120094在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的23到52位的氨基酸序列。0095在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的22到52位的氨基酸序列。0096在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的21到52位的氨基酸序列。0097在一个具体的实施方

43、式中，所述多肽包含SEQIDNO2的20到52位的氨基酸序列。0098在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的19到52位的氨基酸序列。0099在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的18到52位的氨基酸序列。0100在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的17到52位的氨基酸序列。0101在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的16到52位的氨基酸序列。0102在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的15到52位的氨基酸序列。0103在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的14到52位的氨基酸序列。0104在

44、一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的13到52位的氨基酸序列。0105在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的12到52位的氨基酸序列。0106在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的11到52位的氨基酸序列。0107在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的10到52位的氨基酸序列。0108在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的9到52位的氨基酸序列。0109在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的8到52位的氨基酸序列。0110在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的7到52位的氨基酸序列。

45、0111在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的6到52位的氨基酸序列。0112在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的5到52位的氨基酸序列。0113在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的4到52位的氨基酸序说明书CN102325880ACN102325893A9/28页13列。0114在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的3到52位的氨基酸序列。0115在一个具体的实施方式中，所述多肽包含SEQIDNO2的2到52位的氨基酸序列。0116在一个具体的实施方式中，所述多肽包含氨基酸序列SEQIDNO2。在可选的实施方式中，所述多肽不

46、包含氨基酸序列SEQIDNO2。0117本发明的另一个目的涉及多肽PP用于提高酶原特别是丝氨酸蛋白酶酶原的半衰期的用途。0118源自因子X的激活肽的融合蛋白0119本发明的另一个目的涉及融合蛋白FP，其含有0120由上述多肽PP构成的第一多肽和0121包含SEQIDNO4的7到16位的氨基酸序列的第二多肽。0122本发明的另一个目的涉及融合蛋白FP，其含有0123由上述多肽PP构成的第一多肽和0124包含SEQIDNO4的7到16位的氨基酸序列的第二多肽，0125其中0126对应于SEQIDNO4的14位残基的甘氨酸被缬氨酸、苯丙氨酸或丙氨酸取代，和/或0127对应于SEQIDNO4的15位残

47、基的缬氨酸被脯氨酸取代。0128在优选的实施方案中，本发明涉及所述融合蛋白，其中所述第一多肽的羧基端区域与所述第二多肽的氨基端区域融合。0129在一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含SEQIDNO4的7到16位的氨基酸序列。0130在另一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含SEQIDNO4的6到16位的氨基酸序列。0131在另一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含SEQIDNO4的5到16位的氨基酸序列。0132在另一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含SEQIDNO4的4到16位的氨基酸序列。0133在另一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含SEQIDNO4的3到16位的氨基酸序列。013

48、4在另一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含SEQIDNO4的2到16位的氨基酸序列。0135在另一个具体的实施方式中，所述第二多肽包含氨基酸序列SEQIDNO4。0136本发明的嵌合衍生物0137如上所述的本发明的多肽和融合蛋白可以与丝氨酸蛋白酶酶原或其活性形式或片段融合以提高所述丝氨酸蛋白酶酶原的半衰期和回收率。0138本发明人证明，因子X的激活肽和更特别是含有其最后的十九个氨基酸的其片段说明书CN102325880ACN102325893A10/28页14在因子X的长半衰期和注入的分子的良好回收率方面起主要作用。他们也证明，因子X的激活肽或含有其最后的十九个氨基酸的其片段可用于增加其他蛋

49、白质例如循环蛋白的半衰期和回收率。0139因此，本发明的另一个目的涉及含有目标蛋白和上述多肽PP的嵌合蛋白。0140所述目标蛋白可以是在血液中具有短的半衰期的酶或其他蛋白。特别地，它可以是循环蛋白，例如丝氨酸蛋白酶或蛋白激素。0141通常，所述目标蛋白可以是蛋白C、因子VII、激活的因子VII、因子IX、胰岛素、促红细胞生成因子、可溶性P选择素糖蛋白配体，但它不是天然因子X。0142所述蛋白可以其酶原形式或以其激活形式使用。0143在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述蛋白，其中所述多肽PP在羧基末端、氨基末端与目标蛋白融合或融合到目标蛋白的氨基酸序列中。0144在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述嵌合蛋白，其中所述多肽PP在羧基末端、氨基末端中与目标蛋白融合或融合到目标蛋白的氨基酸序列中。0145在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述嵌合蛋白，其中目标酶原的激活肽被多肽PP取代。0146在另一个具体的实施方式中，本发明涉及所述嵌合蛋白，其中所述多肽PP在目标蛋白的天然激活肽的定位部位与目标蛋白的激活形式融合。0147在一个具体的实施方式中，本发明涉及所述嵌合蛋白，其中所述多肽PP由SEQIDNO2的33到52位的氨基酸序列组成，其中39或49位的天冬酰胺是N糖基化的。0148通常，本发明涉及所述嵌合蛋白，其中所述多肽PP包含SEQIDNO2的3