用于 DMO 的有效靶向的叶绿体转运肽及其用途 本申请是申请日为 2007 年 6 月 6 日、 申请号为 200780052290.2、 发明名称为 “用 于 DMO 的有效靶向的叶绿体转运肽及其用途” 的发明专利申请的分案申请。
发明背景
本申请要求于 2007 年 2 月 26 日提交的美国临时专利申请 60/891,675 和 2007 年 6 月 5 日提交的美国专利申请 11/758,659 的优先权， 本文完整引入其公开内容作为参考。
发明领域 本发明涉及植物生物技术领域。更具体的说， 本发明涉及允许有效加工和定位植 物中的麦草畏单加氧酶的叶绿体转运肽的鉴定和用途。
相关技术描述
DMO( 麦草畏单加氧酶 ) 在植物中催化除草剂麦草畏 (3， 6- 二氯 - 邻茴香酸 ) 降解 为无毒的 3， 6- 二氯水杨酸 (3， 6-DCSA)， 从而赋予除草剂耐受性。DMO 的活性需要用于将电 子从 NADH 向麦草畏转移的两种中间蛋白质 ： 还原酶和铁氧还蛋白 ( 美国专利 7,022,896 ； Herman 等人， 2005)。 然而， 转基因植物中的麦草畏耐受性已通过单独用 DMO 转化得到证明， 表明植物内源性的还原酶和铁氧还蛋白可以在电子转移中代替。 参与电子转移的植物铁氧 还蛋白位于质体中。因此， 为了获得 DMO 的高效性能并因此获得提高的麦草畏耐受性， 需要 将 DMO 靶向至叶绿体。
在许多情况下， 这种靶向可以通过被称作叶绿体转运肽 (CTP) 或者质体转运肽的 N- 末端延伸的存在而实现。如果表达的多肽将要在植物质体 ( 如叶绿体 ) 中区室化， 细菌 来源的染色体转基因必须具有与编码表达的多肽的序列相融合的编码 CTP 序列的序列。因 此， 将外源多肽定位到叶绿体中通常是借助于将编码 CTP 序列的多核苷酸序列可操作地连 接到编码外源多肽的多核苷酸的 5’ 区域上来完成的。CTP 在向质体内转移过程中通过加工 步骤被去除。但是， 加工效率可能受 CTP 的氨基酸序列和肽氨基端附近的序列影响。
Weeks 等人 ( 美国专利 7,022,896) 描述了玉米 cab-m7 信号序列 ( 参见， Becker 等人， 1992 和 PCT WO 97/41228 ； GenBank 登记号 X53398) 和豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列 (Creissen 等人， 1992 和 PCT WO 97/41228) 在将 DMO 靶向至植物质体方面的潜在用途， 但 是没有给出关于加工或者靶向效率的数据。含有包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶 (Rubisco) 小亚基编码序列的 27 个氨基酸序列的豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚 基 (RbcS)CTP， 也已经用于将 DMO 靶向至叶绿体 ( 例如， 美国临时申请 60/811,152)。然而， 已经在蛋白质印迹 (Western blot) 分析过程中发现， 这种豌豆 RbcS CTP 产生一个正确加 工的 DMO 蛋白质条带 ( ～ 38 kDa)， 但是还产生一个与 DMO 和 RbcS 编码区的 27 个氨基酸 相对应的较大的条带 ( ～ 41kDa)。额外的氨基酸可能不利地影响 DMO 的活性。此外， 由于 DMO 的不完全加工， 转基因产品中额外的蛋白质造成监管方面的障碍， 为了使产品在政府机 构注册的目的， 还需要在产品表征方面投入额外的努力， 由此增加了产品注册的费用。因 此， 需要鉴定有效地产生正确加工的 DMO 的 CTP， 从而提供完全的 DMO 活性以及易于表征产 品的优点。
发明概述
本发明的一方面涉及一种重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加 氧酶的核苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 其中， 该核苷酸序列编码包括选 自 SEQ ID NOs ： 1-11 的序列的叶绿体转运肽。在某些实施方案中， 重组 DNA 分子包括选自 SEQ ID NOs ： 12-22 的核苷酸序列。在某些实施方案中， 重组 DNA 分子包括编码选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。包括与在植物细 胞中具有功能的启动子可操作地连接的 DNA 分子的 DNA 构建体也是本发明的一方面。
另一方面， 本发明包括用 DNA 分子转化的植物细胞， 所述 DNA 分子包括可操作地连 接到编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 其中， 叶绿 体转运肽序列选自 SEQ ID NOs ： 1-11。在某些实施方案中， 重组 DNA 分子包括选自 SEQ ID NOs ： 12-22 的核苷酸序列。在某些实施方案中， DNA 分子包括编码选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列， 其中， DNA 分子可操作地连接到 在植物细胞中具有功能的启动子上。在特定的实施方案中， DNA 分子包括选自 SEQ ID NOs ： 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37 和 39 的核苷酸序列。
在某些实施方案中， 植物细胞是双子叶植物细胞。 在其它实施方案中， 植物细胞是 单子叶植物细胞。 在特定的实施方案中， 植物细胞是大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽植物细胞。 本发明也涉及包括这样的细胞的植物组织培养物， 涉及包括这样的细胞的转基因种子和转 基因植物。 在某些实施方案中， 转基因种子或者植物是双子叶种子或植物。 在其它实施方案 中， 转基因种子或者植物是单子叶种子或者植物。转基因种子或者植物可以是大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽种子或者植物。
本发明进一步涉及产生耐受麦草畏的植物的方法， 包括 ： 将重组 DNA 分子引入植 物细胞中， 并由其再生植物， 所述 DNA 分子包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的核 苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的序列选自 SEQ ID NOs ： 12-22。 在某些实施方案中， 重组 DNA 分子包含编码选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。DNA 分子可以可操作地连接到在植物 细胞中具有功能的启动子上。 该方法可以进一步包括通过将亲本植株与它自身或者第二植 株杂交产生耐受麦草畏的植物， 其中亲本植株和 / 或第二植株包括所述 DNA 构建体， 并且耐 受麦草畏的植物从所述的亲本植株和 / 或第二植株遗传了该 DNA 构建体。
一种在植物细胞中表达麦草畏单加氧酶的方法是本发明的进一步的方面， 该方法 包括将选择的 CTP 可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的序列上。
另一方面， 本发明涉及一种在农作物生长环境中控制杂草生长的方法， 包括 ： 种植 这样的植物或其种子， 并向农作物生长环境施用有效控制杂草生长的量的麦草畏除草剂。 麦草畏除草剂可以自上方向农作物生长环境施用， 由此麦草畏除草剂的量不损伤所述的植 物或其种子， 却损伤与该植物或其种子基因型相同但是缺乏构建体的植物或者种子。
本发明的进一步的方面涉及生产食物、 饲料或者工业产品的方法， 包括 ：
a) 获得植物， 该植物包括按照 5’ 到 3’ 的方向可操作地连接到编码叶绿体转运肽 的核苷酸序列和编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列或其部分上的编码在植物细胞中具有 功能的启动子的核苷酸序列 ； b) 从所述植物或其部分制备食物、 饲料、 纤维或者工业产品。
在该方法的某些实施方案中， 食物或者饲料是谷物、 粗粉、 油、 淀粉、 面粉或者蛋白质。 在该方法的其它的实施方案中， 工业产品是生物燃料、 纤维、 工业化学品、 药物或者营养 品。
针对出土前 (pre emergence) 施用麦草畏提供保护的、 包括可操作地连接到编码 麦草畏单加氧酶的 DNA 上的编码叶绿体转运肽的 DNA 的耐受麦草畏的种子， 是本发明的进 一步的方面。 在某些实施方案中， 耐受麦草畏的种子包括编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 例如选自 SEQ ID NOs ： 12-22 的核苷酸序列。耐受麦草畏的种子可以进一步包括编码选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及提高单子叶植物的直立能力 (standability) 的方法， 包 括： a) 获得并培育通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂交产生的植物， 其中该亲本植 株和 / 或第二植株包含所述 DNA 构建体并且耐受麦草畏的植物从所述的亲本植株和 / 或第 二植株遗传了该 DNA 构建体 ； b) 用麦草畏处理植物。在某些实施方案中， 植物是玉米植物。 在其它的实施方式中， 可以测量包括支柱根的形状、 数量、 长度和 / 或结构、 倒伏百分比和 产量的与直立能力相关的参数。
本发明提供以下实施方案 ：
1. 一种重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列 上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列编码选自 SEQ ID NOs ： 1-11 的序列。
2. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其中， 所述编码叶绿体转运肽的 DNA 序列包括选 自 SEQ ID NOs ： 12-22 的序列。
3. 一种重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列 上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列编码选自拟南 芥 5- 烯醇丙酮酰莽草酸 -3- 磷酸合酶 CTP2 叶绿体转运肽序列和豌豆核酮糖二磷酸羧化 酶 - 加氧酶小亚基叶绿体转运肽序列的序列。
4. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列编码选自 SEQ ID NOs ： 2-7 的序列。
5. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列编码选自 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5 的序列。
6. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列包括选自 SEQ ID NOs ： 13-18 的序列。
7. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列包括选自 SEQ ID NOs ： 13、 15 和 16 的序列。
8. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其中， 所述编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列编码 选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的多肽。
9. 如第 8 项所述的重组 DNA 分子， 其中， 所述 DNA 序列选自 SEQ ID NOs ： 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37 和 39。10. 一种 DNA 构建体， 其包括与启动子可操作地连接的如第 1 项所述的 DNA 分子。
11. 如第 5 项所述的 DNA 构建体， 其中， 所述启动子选自 FMV35S 启动子、 At.ANT1 启动子、 FMV.35S-EF1a 启动子、 eIF4A10 启动子、 AGRtu.nos 启动子、 水稻胞质磷酸丙糖异构 酶 (OsTPI) 启动子、 水稻肌动蛋白 15 基因 (OsAct15) 启动子和 γ- 薏苡醇溶蛋白启动子。
12. 如第 10 项所述的构建体， 其中， 所述启动子在植物细胞中是具有功能的。
13. 用第 10 项所述的 DNA 构建体转化的植物细胞。
14. 如第 13 项所述的细胞， 其中， 所述植物细胞是双子叶植物细胞。
15. 如第 13 项所述的细胞， 其中， 所述植物细胞是单子叶植物细胞。
16. 如第 13 项所述的细胞， 其中， 所述植物细胞是大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽植 物细胞。
17. 一种植物组织培养物， 其包含第 13 项所述的细胞。
18. 如第 17 项所述的植物组织培养物， 其包含双子叶植物细胞。
19. 如第 17 项所述的植物组织培养物， 其包含单子叶植物细胞。
20. 如第 17 项所述的植物组织培养物， 其包含大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽植物细 胞。
21. 用第 10 项所述的 DNA 构建体转化的转基因植物。 22. 如第 21 项所述的转基因植物， 其中， 所述植物是双子叶植物。 23. 如第 21 项所述的转基因植物， 其中， 所述植物是单子叶植物。 24. 如第 21 项所述的转基因植物， 其中， 所述植物是大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽植物。 25. 一种产生耐受麦草畏的植物的方法， 包括将第 10 项所述的构建体引入植物细 胞中， 并由其再生包含第 10 项所述的构建体的植物。
26. 如第 25 项所述的方法， 进一步包括通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂 交产生耐受麦草畏的植物， 其中， 所述亲本植株和 / 或第二植株包含 DNA 构建体， 并且耐受 麦草畏的植物从所述的亲本植株和 / 或第二植株遗传了 DNA 构建体。
27. 一种在植物细胞中表达麦草畏单加氧酶的方法， 包括将选择的 CTP 可操作地 连接到编码麦草畏单加氧酶的序列上。
28. 一种在农作物生长环境中控制杂草生长的方法， 包括第 20 项所述的植物或其 种子， 并向农作物生长环境施用有效控制杂草生长的量的麦草畏除草剂。
29. 如第 28 项所述的方法， 其中， 所述麦草畏除草剂自上方向农作物生长环境施 用。
30. 如第 28 项所述的方法， 其中， 所述麦草畏除草剂的量不损伤第 21 项所述的植 物或其种子， 却损伤与第 20 项所述的植物的基因型相同但是缺乏第 10 项所述的构建体的 植物。
31. 一种生产食物、 饲料或者工业产品的方法， 包括 ：
a) 获得第 21 项所述的植物或其部分 ； 和
b) 从该植物或者其部分制备食物、 饲料、 纤维或者工业产品。
32. 如第 31 项所述的方法， 其中， 所述食物或者饲料是谷物、 粗粉、 油、 淀粉、 面粉 或者蛋白质。
33. 如第 31 项所述的方法， 其中， 所述工业产品是生物燃料、 纤维、 工业化学品、 药 物或者营养品。
34. 一种针对出土前施用麦草畏提供保护的耐受麦草畏的种子， 其包含可操作地 连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 上的编码叶绿体转运肽的 DNA。
35. 如第 34 项所述的耐受麦草畏的种子， 其中， 所述 DNA 编码选自 SEQ ID NOs ： 1-11 的叶绿体转运肽。
36. 如第 35 项所述的耐受麦草畏的种子， 其中， 所述编码叶绿体转运肽的 DNA 包含 选自 SEQ ID NOs ： 12-22 的序列。
37. 如第 34 项所述的耐受麦草畏的种子， 其中， 所述 DNA 编码包含选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的序列的麦草畏单加氧酶。
38. 一种提高单子叶植物的直立能力的方法， 包括 ： a) 培育通过第 26 项所述的方 法产生的植物或种子 ； 和 b) 用麦草畏处理该植物或种子。
39. 如第 38 项所述的方法， 进一步包括 ： c) 测量选自支柱根的数量、 形状、 长度或 结构、 倒伏百分比和产量的与直立能力相关的参数。
附图简述 图1： CTP-DMO 构建体在 DMO 的正确加工和提供麦草畏耐受性中的应用。
发明详述
根据本发明， 提供了用于在植物细胞中更有效地表达和向叶绿体转运麦草畏单加 氧酶 (DMO) 多肽的组合物和方法。因此本发明的组合物和方法在增强植物和细胞对除草剂 麦草畏的耐受性方面有用。尤其通过用叶绿体转运肽 (CTP) 将 DMO 靶向至叶绿体， 可以实 现提高的 DMO 表达和对麦草畏的耐受性。
然而， 令人惊奇的是， 本发明人已经发现某些 CTP 与 DMO 组合不能很好地发挥功 能。例如， 一些 CTP 不能导致足够的蛋白质表达。这包括蛋白质的不正确表达， 以及改变大 小的蛋白质的产生和不完全的体内活性。 这会导致不完全的除草剂耐受性并且使注册审批 变得复杂。 本发明提供 CTP， 当该 CTP 与 DMO 联合使用时， 提供意想不到的益处， 包括但不限 于： 提高的转运至叶绿体的水平、 在表达 DMO 的转基因植物中增强的除草剂耐受性、 正确大 小的蛋白质表达的理想水平和适当的翻译后修饰。当与 DMO 组合后提供意想不到的益处的 CTP 的一个例子是转运肽 CTP2， 包括 SEQ ID NO ： 4 或 5 的核酸， 并且包括编码 SEQ ID NOs ： 15 和 16 的序列。在其它实施方案中， 使用豌豆 (Pisum sativum) 核酮糖二磷酸羧化酶 - 加 氧酶小亚基 CTP 编码序列， 例如由 SEQ ID NO ： 2 所代表的或者编码 SEQ ID NO ： 13。因此， 包括可操作地连接到 CTP2 和 / 或豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚基 CTP 转运肽编 码序列上的 DMO 编码序列的 DNA 构建体构成本发明的一个方面， 由其编码的蛋白质也构成 本发明的一个方面。
嗜 麦 芽 假 单 胞 菌 (Pseudomonas maltophilia) 菌 株 DI6 的 麦 草 畏 单 加 氧 酶 (Herman 等人， 2005 ； 美国专利公开 20030115626 ； GenBank 登记 AY786443， 本文引入其编码 DMO 的序列作为参考 ) 催化除草剂麦草畏的解毒。DMO 是用于将麦草畏解毒成无毒的 3， 6- 二氯水杨酸 (3， 6-DCSA) 的三组分体系中的一部分， 且如上所述需要还原酶和铁氧还蛋 白功能来转移电子。由于参与电子转移的内源性植物铁氧还蛋白定位于质体中， 为了获得 DMO 的有效活性和例如在双子叶植物中的麦草畏耐受性或者例如在单子叶植物中增强的麦
草畏耐受性， 优选 DMO 靶向至质体 ( 例如叶绿体 )。
测试叶绿体转运肽 (CTP) 在将 DMO 靶向至质体和 DMO 加工中的效率。与这些 CTP 有关的 DMO 的质体定位和加工从没有或部分到完全不等。发现只有一些 CTP 允许将 DMO 完 全加工成正确的大小。因此， 基于它的蛋白质或者核苷酸序列， 任意给定的 CTP 提供完全和 有效的 DMO 加工的能力是难以预料和出人意料的。
此外， 也已经在拟南芥中发现， 在没有合适的 CTP 的情况下， 几乎没有或者没有 DMO 的表达与几乎没有或者没有麦草畏耐受性相关。这表明叶绿体靶向对于麦草畏的解毒 进而对于耐受性是重要的。允许有效加工 DMO 的 CTP 在将 DMO 靶向至农作物的质体例如叶 绿体方面是有用的， 因此提供以下优势 ： 完全的 DMO 活性和对麦草畏的较高的耐受性， 以及 易于表征产品和降低注册费用。
包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 上的编码叶绿体转运肽的 DNA 的 嵌合 DNA 分子可以通过本领域技术人员熟知的分子生物学方法制备 ( 例如， Sambrook 等人， 1989)。本发明提供了可操作地连接到已知的编码 DMO( 包括表 1 中列出的那些 ) 的 DNA 分 子上的 CTP， 用于提高植物中 DMO 的表达。
来自在细胞核中编码的任何基因并且其产物可将多肽靶向至叶绿体的叶绿体转 运肽， 可以进行 DMO 有效表达的检测。 可以分离或者合成叶绿体转运肽序列。 为了在双子叶 植物、 单子叶植物或者这两者中表达， 可以优化编码 CTP 的核苷酸序列。通过将每一个可操 作地连接到 DMO 编码序列上， 测试下面的转运肽 ： PsRbcS- 衍生的 CTPs(SEQ ID NO ： 1和2： 豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚基 CTP ； Coruzzi 等人， 1984) ； AtRbcS CTP (SEQ ID NO ： 3： 拟南芥核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚基 1A CTP ； CTP1 ； 美国专利 5,728,925) ； AtShkG CTP(SEQ ID NO ： 4： 拟南芥 5- 烯醇丙酮酰莽草酸 -3- 磷酸合酶 (EPSPS) ； CTP2 ； Klee 等人， 1987) ； AtShkGZm CTP(SEQ ID NO ： 5： CTP2 合成的 ； 为单子叶植物表达进行密码子优 化； WO04009761 的 SEQ ID NO ： 14) ； PhShkG CTP(SEQ ID NO ： 6： 矮牵牛 (Petunia hybrida) EPSPS ； CTP4 ； 为单子叶植物表达进行密码子优化 ； Gasser 等人， 1988) ； TaWaxy CTP(SEQ ID NO ： 7： 小麦 (Triticum aestivum) 结合颗粒的淀粉合酶 CTP 合成的， 为玉米表达进行密码子 优化 ： Clark 等人， 1991) ： OsWaxy CTP(SEQ ID NO ： 8： 水稻 (Oryza sativa) 淀粉合酶 CTP ； Okagaki， 1992) ； NtRbcS CTP(SEQ ID NO ： 9： 烟草 (Nicotiana tabacum) 核酮糖 1， 5- 二磷 酸羧化酶小亚基叶绿体转运肽 ； Mazur， 等人， 1985) ； ZmAS CTP(SEQ ID NO ： 10 ： 玉米 (Zea mays) 邻氨基苯甲酸合酶 α2 亚单位基因 CTP ； Gardiner 等人， 2004) ； 和 RgASCTP(SEQ ID NO ： 11 ： 芸香 (Ruta graveolens) 邻氨基苯甲酸合酶 CTP ； Bohlmann， 等人， 1995)。编码 SEQ ID NO ： 1-SEQ ID NO ： 11 的核苷酸序列分别在 SEQ ID NO ： 12-SEQ ID NO ： 22 中给出。
可能有用的其它转运肽包括玉米 cab-m7 信号序列 (Becker 等人， 1992 ； PCT WO 97/41228) 和豌豆 (Pisum sativum) 谷胱甘肽还原酶信号序列 (Creissen 等人， 1995 ； PCT WO 97/41228)。具有来自于基因编码区的额外氨基酸的 CTP( 所述氨基酸是该基因编码区 的一部分或与它融合 )， 例如 AtRbcS CTP( 其包含转运肽， 成熟核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧 酶蛋白的 24 个氨基酸， 然后是转运肽的最后 6 个氨基酸的重复 )， 可以被用来产生 DMO。 ZmAS CTP7 也包含来自于基因编码区的额外 18 个氨基酸。其它 CTP 也可以用来产生 DMO， 它们具 有来自于基因编码区的额外的氨基酸 ( 例如 27 个氨基酸 )( 所述氨基酸是该基因编码区的 一部分 )， 例如 PsRbcS CTP， 紧接着是通过克隆方法引入的氨基酸 ( 例如 3 个氨基酸 )。具有较少的编码全长 CTP 的氨基酸 ( 例如 21 个氨基酸 ) 的 CTP， 例如 RgAs CTP， 也可以被用来 产生 DMO。优选地， 使用编码全长 CTP 的核苷酸序列。可以包括一个或者多个核苷酸添加或 者缺失， 以便于 CTP 的克隆。这些添加或者缺失可以在其它表达元件和编码区的前面或者 后面， 导致一个或者多个编码氨基酸的修饰， 例如在限制性酶识别位点处或者位于其附近。
在一个实施方案中， 本发明涉及编码叶绿体转运肽的核酸序列， 该叶绿体转运肽 与 SEQ ID NOs ： 1-11 中的任意一个或者多个多肽序列至少具有 70％的同一性， 包括与这些 序列有至少大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％、 99％或者更高的序列同一性， 包 括 100％的同一性。 在特定的实施方案中， 所述核酸序列编码与 SEQ ID NOs ： 1-11 中的一个 相同的叶绿体转运肽。在另一个实施方案中， 编码 CTP 的核酸序列与 SEQ ID NOs ： 12-22 中 的任意一个或者多个核酸序列具有至少 70％的序列同一性， 包括与这些序列中的一个或者 多个至少有大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％、 99％或者更大的序列同一性， 包 括 100％的同一性。这些序列和本文所述的任意其它序列的多肽或者多核苷酸比较和同一 性的确定可以如本领域公知的那样进行， 例如， 使用 MEGAlign(DNAStar， Inc.， 1228S.Park St.， Madison， WI)， 采用缺省参数。这样的软件通过确定相似性或者同一性的程度， 匹配相 似的序列。
通过使用前序列可以将 DMO 靶向至其它细胞器例如线粒体， 以利用存在于该细胞 器中的铁氧还蛋白氧化还原系统。或者， 通过双靶向肽可以将 DMO 靶向至叶绿体和线粒体 两者， 以利用两个铁氧还蛋白氧化还原系统， 使工作更加有效。 这样的元件是本领域的技术 人员已知的。例如， 线粒体前序列在 Silva Filho 等人， (1996) 中有描述。编码双靶向肽序 列的核酸序列可以从编码下述已知能被靶向至叶绿体和线粒体两者的蛋白质的核苷酸序 列中被鉴定出来 ： Zn-MP(Moberg 等人， 2003)、 谷胱甘肽还原酶 (Rudhe 等人， 2002 ； Creissen 等人， 1995) 和组氨酰 -tRNA 合成酶 (Akashi 等人， 1998)。例如， 如表 1 所示， 在编码 SEQ IDNOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40 多肽的序列中， 发现可以用于这方面的 DMO 编码序列 的例子。
表 1. 使用的 DMO 和 DMO 变体。
在某些实施方案中， 编码麦草畏单加氧酶的核酸与编码 SEQ IDNOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 中任意一个多肽的序列具有至少 70％的同一性， 包括与这些序列具有 至少大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％、 99％和更高的序列同一性。在某些实施 方案中， 核酸与 SEQ ID NOs ： 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37 或 39 中的任意一个核酸序列具有 至少 70％的序列同一性， 包括与这些序列中的一个具有至少大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％、 99％和更大的序列同一性。 在进一步的实施方案中， 麦草畏单加氧酶可以 是任一个这样的序列的变体和 / 或可以是工程化的合成 DMO 分子， 例如， 如在 2007 年 1 月 12 日提交的名称为 “DMO Methods And Compositions” 的美国临时申请 60/884,854 中描述 的， 本文特别引入其完整公开内容作为参考。
具有降解植物生长素样除草剂的能力的 DMO 的变体， 以及草甘膦或者其它除草 剂耐受基因， 可以根据标准方法容易地制备， 并测定其活性。也可以通过本领域已知的技 术， 例如， 从合适的生物体中鉴定这些序列， 所述生物体包括能够降解例如麦草畏的生物 素样除草剂或者其它除草剂的细菌 ( 美国专利 5,445,962 ； Cork 和 Krueger， 1991 ； Cork 和 Khalil， 1995)。一种分离 DMO 或者其它序列的方法是通过例如与由来源生物体构建的 文库进行核酸杂交， 或者使用来自来源生物体的 mRNA 和基于公开的去饱和酶的引物进行 RT-PCR。本发明因此包括在严格条件下与本文所述的 DMO 编码序列杂交的核酸的应用。本 领域的技术人员理解通过增加盐浓度和降低温度可以提供严格性较低的条件。因此， 杂交 条件可以容易地控制， 并且一般是根据预期的结果选择的方法。高严格性条件的一个例子 50％甲酰胺和 42℃。通过在这样的条件下洗涤例如 10 分钟， 可以除去那些在这 是 5X SSC、 些条件下不与特定靶序列杂交的序列。
变体也可以化学合成， 例如， 根据本领域众所周知的技术， 利用已知的 DMO 多核苷 酸序列合成。 例如， DNA 序列可以通过亚磷酰胺化学法 (phosphoroamidite) 在自动 DNA 合成 仪上合成。化学合成有许多优势。特别是， 化学合成是合乎需要的， 因为将要表达 DNA 序列 的宿主所偏好的密码子可以用来优化表达。 并非所有的密码子都需要改变来获得改进的表 达， 但是优选地至少将那些在宿主中很少用到的密码子改变为宿主偏好的密码子。通过改 变超过大约 50％， 最优选至少大约 80％的密码子成为宿主偏好的密码子， 可以得到高水平 的表达。 许多宿主细胞的密码子偏好是已知的 ( 例如， PCT WO 97/31115 ； PCT WO 97/11086 ； EP 646643 ； EP 553494 ； 和美国专利： 5,689,052 ； 5,567,862 ； 5,567,600 ； 5,552,299 和 5,017,692)。可以通过本领域已知的方法， 推导出其它宿主细胞的密码子偏好。此外， 利用 化学合成， 可以容易地改变 DNA 分子的序列或者其编码的蛋白质， 例如用来优化表达 ( 例 如， 消除干扰转录或翻译的 mRNA 二级结构 )、 在方便的位点加入独特的限制性位点、 以及删 除蛋白酶酶切位点。
在根据需要保留或者改变酶活性的同时， 可以对蛋白质的多肽序列， 如本文提供 的 DMO 序列， 进行修饰和改变。在 2007 年 1 月 12 日提交的美国临时申请 60/884,854 中提 供了产生 DMO 序列的示例性的方法。下面是基于改变蛋白质的氨基酸来产生相当的或甚 至改进的、 修饰的多肽和相应的编码序列的讨论。已知， 例如， 在蛋白质结构中某些氨基酸 可以被其它氨基酸代替， 却不会明显损失与底物分子上诸如结合位点的结构相互结合的能 力。因为蛋白质的相互作用能力和性质限定了蛋白质的生物学功能活性， 所以可以在蛋白 质序列中， 当然也可以在其 DNA 编码序列中， 进行某些氨基酸序列置换， 而仍然获得具有相 似性质的蛋白质。因此设想 ： 可以对本文描述的 DMO 肽序列或者其它除草剂耐受性多肽和 相应的 DNA 编码序列进行各种改变， 而不会明显减弱它们的生物学效用或者活性。
进行这样的改变时， 需要考虑氨基酸的亲水指数。本领域中一般理解亲水氨基酸 指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性 (Kyte 等人， 1982)。普遍认为， 氨基 酸的相对亲水特性对产生的蛋白质的二级结构具有贡献， 而蛋白质的二级结构又限定了蛋 白质与例如酶、 底物、 受体、 DNA、 抗体、 抗原等其它分子的相互作用。基于它们的疏水性和 电荷特性， 每种氨基酸已被分配了亲水指数 (Kyte 等人， 1982)， 这些是 ： 异亮氨酸 (+4.5) ； 缬氨酸 (+4.2) ； 亮氨酸 (+3.8) ； 苯丙氨酸 (+2.8) ； 半胱氨酸 / 胱氨酸 (+2.5) ； 甲硫氨酸 (+1.9) ； 丙氨酸 (+1.8) ； 甘氨酸 (-0.4) ； 苏氨酸 (-0.7) ； 丝氨酸 (-0.8) ； 色氨酸 (-0.9) ； 酪 氨酸 (-1.3) ； 脯氨酸 (-1.6) ； 组氨酸 (-3.2) ； 谷氨酸 (-3.5) ； 谷氨酰胺 (-3.5) ； 天冬氨酸 (-3.5) ； 天冬酰胺 (-3.5) ； 赖氨酸 (-3.9) 和精氨酸 (-4.5)。
本领域已知， 氨基酸可以被其它具有相似亲水指数或者得分的氨基酸代替， 而仍 然产生具有相似生物学活性的蛋白质， 即， 仍然获得生物学功能相当的蛋白质。 进行这样的 转变时， 优选其亲水指数在 ±2 之内的氨基酸置换， 尤其优选在 ±1 之内的氨基酸置换， 甚 至更优选在 ±0.5 之内的氨基酸置换。
本领域中也理解在亲水性的基础上可以有效进行相似氨基酸的置换。美国专利 4,554,101 提出， 受到邻近氨基酸亲水性控制的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的 生物学性质相关。如美国专利 4,554,101 所述， 下面的亲水性值被分配给氨基酸残基 ： 精 氨酸 (+3.0) ； 赖氨酸 (+3.0) ； 天冬氨酸 (+3.0±1) ； 谷氨酸 (+3.0±1) ； 丝氨酸 (+0.3) ； 天 冬酰胺 (+0.2) ； 谷氨酰胺 (+0.2) ； 甘氨酸 (0) ； 苏氨酸 (-0.4) ； 脯氨酸 (-0.5±1) ； 丙氨酸 (-0.5) ； 组氨酸 (-0.5) ； 半胱氨酸 (-1.0) ； 甲硫氨酸 (-1.3) ； 缬氨酸 (-1.5) ； 亮氨酸 (-1.8) ； 异亮氨酸 (-1.8) ； 酪氨酸 (-2.3) ； 苯丙氨酸 (-3.5) ； 色氨酸 (-3.4)。应当理解 ： 氨 基酸可以被另一种具有相似亲水性值的氨基酸代替， 而仍然获得生物学相当的蛋白质。在 这样的改变中， 优选其亲水性值在 ±2 之内的氨基酸置换， 尤其优选在 ±1 之内的氨基酸置 换， 甚至更优选在 ±0.5 之内的氨基酸置换。将这些和各种上述特征考虑在内的示例性的 置换是本领域的技术人员熟知的， 且包括 ： 精氨酸和赖氨酸， 谷氨酸和天冬氨酸， 丝氨酸和 苏氨酸， 谷氨酰胺和天冬酰胺， 及缬氨酸、 亮氨酸和异亮氨酸。
包括可操作地连接到 DMO 序列上的 CTP 序列的 DNA 构建体可以通过被可操作地连 接到在植物中具有功能的启动子上而在诸如原生质体、 瞬时或者稳定转化的植物细胞等测 试系统中表达。描述这样的启动子的例子包括美国专利 6,437,217( 玉米 RS81 启动子 )、 美国专利 5,641,876( 水稻肌动蛋白启动子 ； OsAct1)、 美国专利 6,426,446( 玉米 RS324 启 动子 )、 美国专利 6,429,362( 玉米 PR-1 启动子 )、 美国专利 6,232,526( 玉米 A3 启动子 )、 美国专利 6,177,611( 组成型玉米启动子 )、 美国专利 5,322,938、 5,352,605、 5,359,142 和 5,530,196(35S 启动子 )、 美国专利 6,433,252( 玉米 L3 油质蛋白启动子 )、 美国专利 6,429,357( 水稻肌动蛋白 2 启动子以及水稻肌动蛋白 2 内含子 )、 美国专利 5,837,848( 根 特异性启动子 )、 美国专利 6,294,714( 光诱导型启动子 )、 美国专利 6,140,078( 盐诱导型 启动子 )、 美国专利 6,252,138( 病原体诱导型启动子 )、 美国专利 6,175,060( 磷缺乏诱导 型启动子 )、 美国专利 6,388,170( 例如， PC1SV 启动子 )、 SEQ ID NO ： 41 的 PC1SV 启动子、 美国专利 6,635,806(γ- 薏苡醇溶蛋白 (coixin) 启动子 ) 和美国专利 7,151,204( 玉米 叶绿体醛缩酶启动子 )。可以使用的其它启动子是胭脂氨酸合酶 (NOS) 启动子 (Ebert 等 人， 1987)、 章鱼氨酸合酶 (OCS) 启动子 ( 其在根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 的肿瘤诱导的质粒中携带 )、 花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒 (CaMV)19S 启 动子 (Lawton 等人， 1987)、 CaMV 35S 启动子 (Odell 等人， 1985)、 玄参花叶病毒 35S- 启 动 子 (Walker 等 人， 1987)、 蔗 糖 合 酶 启 动 子 (Yang 等 人， 1990)、 R 基因复合体启动子 (Chandler 等人， 1989) 和叶绿素 a/b 结合蛋白基因启动子等。在本发明中， 具 有增强 子 序 列 的 CaMV35S(e35S ； 美 国 专 利 5,322,938 ； 5,352,605 ； 5,359,142 和 5,530,196)、 FMV35S( 美国专利 6,051,753 ； 5,378,619)、 花生褪绿条纹花椰菜花叶病毒 (PC1SV ； 美国 专利 5,850,019)、 At.Act 7( 登记号 #U27811)、 At.ANT1( 美国专利申请 20060236420)、 FMV.35S-EF1a( 美 国 专 利 申 请 20050022261)、 eIF4A10( 登 记 号 #X79008) 和 AGRtu. nos(GenBank 登记号 V00087 ； Depicker 等人， 1982 ； Bevan 等人， 1983)、 水稻胞质磷酸丙糖 异构酶 (OsTPI ； 美国专利 7,132,528) 和水稻肌动蛋白 15 基因 (OsAct15 ； 美国专利申请 2006-0162010) 启动子可能特别有用。
作为翻译前导序列起作用的 5’ UTR 是位于基因的启动子序列和编码序列之间的 DNA 遗传元件， 可以被包括在启动子和 CTP-DMO 序列之间。 翻译前导序列存在于翻译启动序 列上游的完全加工的 mRNA 之中。 翻译前导序列可以影响初级转录物向 mRNA 的加工、 mRNA 稳 定性或者翻译效率。翻译前导序列的例子包括玉米和矮牵牛花热休克蛋白前导序列 ( 美国 专利 5,362,865)、 植物病毒外壳蛋白前导序列、 植物核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶前导序 列、 GmHsp( 美国专利 5,659,122)、 PhDnaK( 美国专利 5,362,865)、 AtAnt1、 TEV(Carrington 和 Freed， 1990) 和 AGRtunos(GenBank 登 记 号 V00087 ； Bevan 等 人， 1983) 等 (Turner 和Foster， 1995)。在本发明中， 可能尤其有益的 5’ UTR 是 GmHsp1( 美国专利 5,659,122)、 PhDnaK( 美 国 专 利 5,362,865)、 AtAnt1、 TEV(Carrington 和 Freed， 1990)、 OsAct1( 美 国 专 利 5641876)、 OsTPI( 美 国 专 利 7,132,528)、 OsAct15( 美 国 公 开 20060162010) 和 AGRtunos(GenBank 登记号 V00087 ； Bevan 等人， 1983)。
3’ 非翻译序列、 3’ 转录终止区或者多腺苷酸化区域意思是连接到并位于结构多核 苷酸分子下游的 DNA 分子， 并且包括提供能够影响转录、 mRNA 加工或者基因表达的多腺苷 酸化信号和其它调控信号的多核苷酸。多腺苷酸化信号在植物中发挥功能， 以导致向 mRNA 前体的 3’ 末端增加多聚腺苷酸。多腺苷酸化序列可以来源于天然基因、 多种植物基因或者 T-DNA 基因。 这些序列可以包含于 CTP-DMO 序列的下游。 3’ 转录终止区的例子是胭脂氨酸合 酶 3’ 区 (nos 3’ ； Fraley 等人， 1983)。举例说明了不同的 3’ 非翻译区的应用 (Ingelbrecht 等人， 1989)。 来自豌豆 RbcS2 基因 (Ps.RbcS2-E9 ； Coruzzi 等人， 1984)、 AGRtu.nos(Genbank 登记号 E01312)、 E6( 登记号 #U30508) 和 TaHsp17( 小麦低分子量热休克蛋白基因 ； 登记号 #X13431) 的多腺苷酸化分子特别有利地用于本发明。
除了上述的表达元件以外， 为了尤其在单子叶植物中表达编码区， 在启动子和 3’ UTR 之间可能需要内含子。 “内含子” 指的是多核苷酸分子， 其可以从基因的基因组拷贝 的间插序列分离或者鉴定， 而且一般可以被定义为在翻译前 mRNA 加工过程中被剪切掉的 区域。或者， 内含子可以合成产生。内含子本身可以包含影响可操作地连接的基因的转录 的亚元件例如顺式元件或者增强子区域。 “植物内含子” 是在植物细胞中发挥功能的天然或 者非天然的内含子。 植物内含子可以用作调控元件来调节可操作地连接的一种或多种基因 的表达。转化构建体中的多核苷酸分子序列可以包含内含子。相对于可以转录的多核苷酸 序列， 内含子可以是异源的。 内含子的例子包括玉米肌动蛋白内含子 ( 美国专利 5641876)、 玉米 HSP70 内含子 (ZmHSP70 ； 美国专利 5,859,347 ； 美国专利 5,424,412) 和水稻 TPI 内含 子 (OsTPI ； 美国专利 7,132,528)， 并且在实施本发明中是有益的。
可以通过植物组织培养和转化领域的技术人员所知的方法， 在如原生质体或者 瞬时或稳定转化的单子叶或双子叶植物细胞的测试系统中测试 CTP-DMO 构建体是否提供 DMO 的正确加工。按照本发明， 可以使用本领域中已知的任一种将转基因构建体导入植物 的技术 ( 参见， 例如， Miki 等人， 1993)。据信， 合适的植物转化方法实际上包括任一种可将 DNA 导入细胞中的方法， 如美国专利 5,384,253 所描述的电穿孔法 ； 美国专利 5,015,580、 5,550,318、 5,538,880、 6,160,208、 6,399,861 和 6,403,865 所 描 述 的 微 粒 轰 击 法 ； 美国 专利 5,635,055、 5,824,877、 5,591,616、 5,981,840 和 6,384,301 所描述的土壤杆菌介导 转化法 ； 和美国专利 5,508,184 描述的原生质体转化法。通过应用如这些方法的技术， 实 际上任何植物种的细胞都可以稳定地转化， 而且这些细胞可以发育成转基因植物。美国 专利 5,846,797、 5,159,135、 5,004,863 和 6,624,344 公开了在棉花转化中特别有用的技 术。例如， 在美国专利 5,750,871 中特别公开了转化芸苔属 (Brassica) 植物的技术 ； 例如， 在 Zhang 等人， 1999、 美国专利 6,384,301 和 US 7,002,058 中公开了转化大豆的技术。在 WO9506722 中公开了转化玉米的技术。可以用于本发明的植物的一些非限制性例子包括苜 蓿、 大麦、 豆类、 甜菜、 花茎甘蓝、 卷心菜、 胡萝卜、 油菜、 花椰菜、 芹菜、 大白菜、 玉米、 棉花、 黄 瓜、 干豆、 茄子、 茴香、 青刀豆、 葫芦、 韭菜、 莴苣、 甜瓜、 燕麦、 黄秋葵、 洋葱、 豌豆、 胡椒、 南瓜、 花生、 马铃薯、 南瓜、 萝卜、 水稻、 高粱、 大豆、 菠菜、 倭瓜、 甜玉米、 甜菜、 向日葵、 西红柿、 西瓜和小麦。 实现将外源 DNA 导入接受体细胞后， 产生转基因植物的下一步一般涉及鉴定用于 进一步的培养和植物再生的转化的细胞。为了提高鉴定转化体的能力， 可能需要与按照本 发明制备的转化载体一起使用可选择或可筛选的标记基因。在这种情况下， 一般接下来通 过将细胞暴露于一种或多种选择剂检测可能转化的细胞群， 或者针对需要的标记基因的性 状筛选细胞。
在暴露于选择剂后存活的细胞， 或者在筛选试验中评分为阳性的细胞， 可以在支 持植物再生的培养基上继续培养。任何合适的植物组织培养基， 例如， MS 或者 N6 培养基 (Murashige 和 Skoog， 1962 ； Chu 等人， 1975)， 可以通过包含如生长调节剂的其它物质进行 改变。可以在含有生长调节剂的基础培养基上维持组织， 直到获得足够的组织来开始植物 再生工作， 或者进行反复几轮人工选择， 直到组织的形态适合再生， 典型地至少两周， 然后 转移到有助于幼苗形成的培养基上。定期转移培养物， 直到发生足够的幼苗形成。一旦幼 苗形成， 就将它们转移到有助于根形成的培养基上。 一旦形成足够的根， 就可以将植物转移 到土壤中进一步生长和成熟。
为了证实外源 DNA 或者 “转基因” 在再生植物中的存在， 可以进行多种试验。这样 的试验包括， 例如， “分子生物学” 试验， 如 DNA 印迹法和 RNA 印迹法和 PCRTM ； “生物化学” 试 验， 如检测蛋白质产物的存在， 例如， 通过免疫学方法 (ELISA 和蛋白质印迹法 ) 或者通过酶 功能 ； 植物部分试验， 如叶或者根试验 ； 以及， 通过分析整个再生植物的表型。
一旦转基因被导入植物中， 就可以通过杂交将该基因导入到任何与该第一植物性 相容的植物中， 而根本不需要直接转化第二种植物。因此， 本文中使用的术语 “后代” 指的 是按照本发明制备的亲本植株的任何一代后代， 其中， 该后代包含按照本发明制备的选择 的 DNA 构建体。因此， “转基因植物” 可以是任何一代。如本文公开的， “杂交” 一种植物以 提供相对于初始植物系具有一个或者多个添加的转基因或者等位基因的植物系， 被定义为 通过将初始系与包含本发明的转基因或者等位基因的供体植物系杂交从而导致特定的序 列被导入植物系中的技术。为了实现这一点， 例如， 可以进行如下步骤 ： (a) 种植第一 ( 初 始系 ) 和第二 ( 包含需要的转基因或者等位基因的供体植物系 ) 亲本植株的种子 ； (b) 将 第一和第二亲本植株的种子培育成有花的植物 ； (c) 用第二亲本植物的花粉对第一亲本植 物的花授粉 ； 和 (d) 收获具有已受精的花的亲本植物上产生的种子。
可以测试稳定转化的植物组织和植物是否通过 DMO 蛋白质的正确加工提供麦草 畏耐受性。 在农作物植物中提供麦草畏耐受性可以用来设计控制生长环境中的杂草生长的 方法， 包括 ： 向农作物生长环境施用有效控制杂草生长的量的麦草畏除草剂。 麦草畏除草剂 以一定的量自上方向农作物生长环境施用， 所述麦草畏除草剂的量不损伤用 CTP-DMO 构建 体转化的农作物植物或种子， 却损伤具有同样的基因型但是缺乏 CTP-DMO 构建体的农作物 植物。
基于公开的内容， 用于本发明的除草剂组合物的制备对于本领域的技术人员来说 是显而易见的。这样的可商购的组合物除了活性成分外， 典型地还包含如表面活性剂、 固 体或液体载体、 溶剂和粘合剂等组分。可用于向植物施用的表面活性剂的例子包括以下物 质的碱金属盐、 碱土金属盐或铵盐 ： 芳香族磺酸类， 例如， 木素磺酸、 苯酚磺酸、 萘磺酸和二 丁基萘磺酸， 和脂肪酸、 芳基磺酸酯、 烷基醚、 月桂基醚、 脂肪醇硫酸盐和脂肪醇二醇醚硫酸
盐， 磺化萘及其衍生物与甲醛的缩合物、 萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物、 苯酚或苯酚磺 酸与甲醛的缩合物、 苯酚与甲醛和亚硫酸钠的缩合物、 聚氧乙烯辛基苯基醚、 乙氧基化的异 辛基 -、 辛基 - 或壬基苯酚、 三丁基苯基聚二醇醚、 烷基芳基聚醚醇、 异十三烷醇、 乙氧基化 的蓖麻油、 乙氧基化的三芳基苯酚、 磷酸化的三芳基苯酚乙氧基化物的盐、 月桂醇聚二醇醚 乙酸酯、 山梨醇酯、 木质素 - 亚硫酸盐废液或甲基纤维素， 或它们的混合物。表面活性剂应 用的常见实例是大约 0.25 重量％ -1.0 重量％， 更常用地为大约 0.25 重量％ -0.5 重量％。
向植物施用的组合物可以是固体或液体。使用固体组合物时， 可能需要包含一种 或多种载体材料和活性化合物。载体的例子包括矿物土， 如硅石、 硅胶、 硅酸盐、 滑石、 高 岭土、 镁质粘土 (attaclay)、 石灰石 (limestone)、 白垩 (chalk)、 黄土 (loess)、 粘土、 白 云石 (dolomite)、 硅藻土 (diatomaceous earth)、 硫酸钙、 硫酸镁、 氧化镁、 磨碎的合成材 料， 肥料， 如硫酸铵、 磷酸铵、 硝酸铵、 硫脲和脲， 植物来源的产品， 如谷物粗粉、 树皮粗粉、 木 粉和坚果壳粗粉、 纤维素粉、 硅镁土 (attapulgites)、 蒙脱石 (montmorillonites)、 云母 (mica)、 蛭石 (vermiculites)、 合成的二氧化硅和合成的硅酸钙， 或它们的混合物。
对于液体溶液， 可以包含水溶性的化合物或盐， 如硫酸钠、 硫酸钾、 氯化钠、 氯化 钾、 醋酸钠、 硫酸氢铵、 氯化铵、 醋酸铵、 甲酸铵、 草酸铵、 碳酸铵、 碳酸氢铵、 硫代硫酸铵、 二 磷酸氢铵、 磷酸二氢铵、 磷酸氢铵钠、 硫氰酸铵、 氨基磺酸铵或氨基甲酸铵。 除草剂组合物中的其它示例性的成分包括 ： 粘合剂， 如聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙烯 醇、 部分水解的聚醋酸乙烯酯、 羧甲基纤维素、 淀粉、 乙烯吡咯烷酮 / 醋酸乙烯酯共聚物和 聚醋酸乙烯酯或它们的混合物 ； 润滑剂， 如硬脂酸镁、 硬脂酸钠、 滑石或聚乙二醇或它们的 混合物 ； 防泡剂， 如乳化硅油、 长链醇、 磷酸酯、 乙炔二醇、 脂肪酸或有机氟化合物 ； 和螯合 剂， 如： 乙二胺四乙酸 (EDTA) 的盐、 三次氮基三乙酸的盐或聚磷酸的盐或它们的混合物。
可以使用从大约 2.5g/ha 到大约 10,080g/ha 的麦草畏， 包括大约 2.5g/ha- 大约 5,040g/ha、 大约 5g/ha- 大约 2,020g/ha、 大约 10g/a- 大约 820g/h 和大约 50g/ha- 大约 1,000g/ha、 大约 100g/ha- 大约 800g/ha 和大约 250g/ha- 大约 800g/ha。
CTP-DMO 构建体可以连接到包含用于可筛选 / 可评分 / 可选择的标记和 / 或赋予 另一种需要的性状的遗传元件的一个或者多个多核苷酸分子上。 通常用来筛选推测转化的 细胞的基因包括 β- 葡糖醛酸糖苷酶 (GUS)、 β- 半乳糖苷酶、 萤光素酶和氯霉素乙酰转移 酶 (Jefferson， 1987 ； Teeri 等人， 1989 ； Koncz 等人 1987 ； De Block 等人， 1984)、 绿色荧光 蛋白 (GFP)(Chalfie 等人， 1994 ； Haseloff 和 Amos， 1995 ； 和 PCT 申请 WO97/41228)。例如， 在 Miki 和 McHugh， 2004 中描述了选择性标记基因的非限制例子。
赋予另一种需要的性状的核苷酸分子包括， 但不限于 ： 提供需要的与植物形 态、 生理、 生长和发育、 产量、 营养强化、 抗病性或抗虫性、 或环境或化学耐受性有关的特 性的基因， 还可以包括遗传元件， 包括 ： 除草剂抗性 ( 美国专利 6,803,501 ； 6,448,476 ； 6,248,876 ； 6,225,114 ； 6,107,549 ； 5,866,775 ； 5,804,425 ； 5,633,435 ； 5,463,175) 、 增 加 的 产 量 ( 美 国 专 利 RE38,446 ； 6,716,474 ； 6,663,906 ； 6,476,295 ； 6,441,277 ； 6,423,828 ； 6,399,330 ； 6,372,211 ； 6,235,971 ； 6,222,098 ； 5,716,837)、 害虫控制 ( 美国 专 利 6,809,078 ； 6,713,063 ； 6,686,452 ； 6,657,046 ； 6,645,497 ； 6,642,030 ； 6,639,054 ； 6,620,988 ； 6,593,293 ； 6,555,655 ； 6,538,109 ； 6,537,756 ； 6,521,442 ； 6,501,009 ； 6,468,523 ； 6,326,351 ； 6,313,378 ； 6,284,949 ； 6,281,016 ； 6,248,536 ； 6,242,241 ；
6,221,649 ； 6,177,615 ； 6,156,573 ； 6f,153,814 ； 6,110,464 ； 6,093,695 ； 6,063,756 ； 6,063,597 ； 6,023,013 ； 5,959,091 ； 5,942,664 ； 5,942,658,5,880,275 ； 5,763,245 ； 5,763,241)、 真 菌 病 抗 性 ( 美 国 专 利 6,653,280 ； 6,573,361 ； 6,506,962 ； 6,316,407 ； 6,215,048 ； 5,516,671 ； 5,773,696 ； 6,121,436 ； 6,316,407 ； 6,506,962)、病 毒 抗 性 ( 美 国 专 利 6,617,496 ； 6,608,241 ； 6,015,940 ； 6,013,864 ； 5,850,023 ； 5,304,730)、 线虫抗 性 ( 美国专利 6,228,992)、 细菌性疾病抗性 ( 美国专利 5,516,671)、 植物生长发育 ( 美 国专利 6,723,897 ； 6,518,488)、 淀粉生产 ( 美国专利 6,538,181 ； 6,538,179 ； 6,538,178 ； 5,750,876 ； 6,476,295)、 改变的油的生产 ( 美国专利 6,444,876 ； 6,426,447 ； 6,380,462)、 高 油 产 量 ( 美 国 专 利 6,495,739 ； 5,608,149 ； 6,483,008 ； 6,476,295)、 改变的脂肪酸含 量 ( 美 国 专 利 6,828,475 ； 6,822,141 ； 6,770,465 ； 6,706,950 ； 6,660,849 ； 6,596,538 ； 6,589,767 ； 6,537,750 ； 6,489,461 ； 6,459,018)、 高蛋白质产量 ( 美国专利 6,380,466)、 果 实成熟 ( 美国专利 5,512,466)、 加强的动物和人的营养 ( 美国专利 6,723,837 ； 6,653,530 ； 6,541,259 ； 5,985,605 ； 6,171,640)、生 物 聚 合 物 ( 美 国 专 利 RE37,543 ； 6,228,623 ； 5,958,745 和美国专利公开 US20030028917)、 环境应激耐受性 ( 美国专利 6,072,103)、 药 物肽和可分泌的肽 ( 美国专利 6,812,379 ； 6,774,283 ； 6,140,075 ； 6,080,560)、 改进的加 工性状 ( 美国专利 6,476,295)、 提高的可消化性 ( 美国专利 6,531,648)、 低水平的棉子 糖 ( 美国专利 6,166,292)、 工业酶生产 ( 美国专利 5,543,576)、 改进的香味 ( 美国专利 6,011,199)、 固氮 ( 美国专利 5,229,114)、 杂交种子生产 ( 美国专利 5,689,041)、 纤维生 产 ( 美国专利 6,576,818 ； 6,271,443 ； 5,981,834 ； 5,869,720) 和生物燃料生产 ( 美国专利 5,998,700)。 这些或者其它的遗传元件、 方法和转基因中的任一种可以用于本发明， 是本领 域的技术人员基于本公开内容可以理解的。
另外， 一个或者多个连接到 CTP-DMO 构建体上的多核苷酸分子通过编码导致内源 基因表达的靶向抑制 ( 例如经过反义、 抑制性 RNA(RNAi) 或者共抑制介导的机制 ) 的 RNA 分 子， 可以实现上面提到的植物特性或者表型。RNA 也可以是催化性的 RNA 分子 ( 即核酶 )， 设计用来切割需要的内源性 mRNA 产物。因此， 任何编码影响感兴趣的表型或者形态学改变 的转录 RNA 分子的多核苷酸分子可以用于实践本发明。
本发明也公开了生产食物、 饲料或工业产品的方法， 包括包含 CTP-DMO 构建体的 植物或者这种植物的一部分， 以及从植物或者其部分制备食物、 饲料、 纤维或工业产品， 其 中， 食物或饲料是谷物、 粗粉、 油、 淀粉、 面粉或蛋白质， 且工业产品是生物燃料、 纤维、 工业 化学品、 药物或营养品。
本发明的另一方面涉及改进单子叶植物的直立能力的方法， 包括 ： a) 获得并种植 通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂交产生的植物， 其中亲本植株和 / 或第二植株包 含所述 DNA 构建体， 并且耐受麦草畏的植物从所述的亲本植株和 / 或第二植株遗传了该 DNA 构建体 ； 和 b) 用麦草畏处理该植物。可以测量包括支柱根的数量、 形状、 长度或结构、 倒伏 百分比和产量的与直立能力相关的参数。在某些实施方案中， 植物是玉米植物。 实施例
下述这些实施例用来说明本发明的实施方案。本领域的技术人员应该理解 ： 下 面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现的、 在本发明的实践中良好地发挥作用的技术。 然而， 本领域的技术人员根据本发明的公开内容应该理解， 可以对公开的特定的实施方 案进行许多改变， 仍然获得相同或类似的结果， 而没有偏离本发明的概念、 精神和范围。更 具体地说， 显然某些化学和生理学相关的试剂可以代替本文中所述的试剂， 而将获得相同 或相似的结果。所有这些对于本领域技术人员明显的类似的代替和修改， 被认为是在所附 的权利要求书限定的本发明的精神、 范围和概念之内。
实施例 1
用于转化的 CTP-DMO 构建体的制备
按照标准方法 ( 例如 Sambrook 等人， 1989) 制备表 2 中所示的 DNA 构建体， 该 DNA 构建体在植物启动子和多腺苷酸化信号序列之间包含与 DMO 基因或其变体可操作地连接 的 CTP。 如下所述， 在玉米原生质体系统或在稳定转化的拟南芥或者大豆植物中测试这些构 建体。
实施例 2 玉米原生质体中的 CTP-DMO 构建体的分析从 12 天的黄化幼苗 ( 来自 LH200×LH5 杂交 ) 制备玉米叶叶肉原生质体。将第 二叶的中间部分 ( 大约 6cm 长 ) 用刀片切割成 0.5mm 的条， 并且在真空过滤 30 分钟后， 在 烧瓶中用含有 2％ (w/v) 纤维素酶 RS、 0.3％ (w/v) 离析酶 R10( 都来自 Karlan Research Products Corp， SantaRosa， CA)、 0.6M 甘露醇、 10mM MES(pH 5.7) 和 1mM CaCl2 的酶溶液在 23℃消化不超过 2 小时。来自过滤的和消化的叶组织的原生质体通过用手摇动烧瓶 5 分钟 释放， 并通过 60-μm 尼龙网过滤分离。原生质体通过以 150g 离心 2 分钟收集， 用 0.6M 冷 6 甘露醇溶液洗涤一次， 离心， 以 2×10 /mL 再悬浮于冷 0.6M 甘露醇中。然后使用聚乙二醇 (PEG)， 以 12.5μgDNA 转化原生质体， 并在室温下孵育 16-20 小时。
原生质体存储于 -80℃， 直到通过蛋白质印迹法 (western blot) 分析。原生质体 在冰上融化， 并将 1-3 倍体积的含有 5.0％ β-ME 的 2xLaemmli 样品缓冲液 / 染料 (BioRad) 加到原生质体。然后将原生质体蛋白质样本的等分试样加热到大约 100℃保持 5 分钟， 并 加样到预制的 Tris-HCL 10％聚丙烯酰胺凝胶上。在大约 80-100Amps 的恒定电流下电泳 大约 35 分钟。然后将蛋白质在 100V 恒定电压下从凝胶电转移至 0.2 微米的硝酸纤维素 膜上进行 1-3 小时。膜用 TBST 中的 5％ (w/v) 奶粉在室温下封闭 1 小时或者在 4℃下封闭 过夜。用在 TBST 中 1 ∶ 200 稀释的山羊抗 -DMO 抗体探测膜 1 小时。使用 TBS 冲洗 3 次， 每次 5 分钟， 以除去过量的抗体。用在含 0.5％ (w/v) 奶粉的 TBST 中以 1 ∶ 7,500 比例稀 释的过氧化物酶偶联的兔抗山羊 IgG(Sigma， St.Louis， MO) 探测膜 1 小时。用 TBST 冲洗 3 次， 每次 5 分钟， 以除去过量的过氧化物酶偶联物。除了那些特别指出的以外， 所有的程序， 包括封闭和所有的其它孵育， 在室温下进行。使用 ECL 检测系统 (Amersham Biosciences， Piscataway， NJ) 显示免疫活性的条带， 并在 Kodak BioMaxTM MS 胶片上曝光。适当大小的 免疫活性条带的存在表明 DMO 的正确加工和定位 ( 表 1)。 因此， 例如， 使用可操作地连接到 DMO 上并转化到玉米原生质体中的 CTP4 在蛋白质印迹分析后产生 38kDa 的免疫活性条带。
实施例 3
各种 CTP-DMO 构建体在拟南芥中的测试
按照 Clough 和 Bent(1998) 开发的方法， 转化拟南芥哥伦比亚生态型植物。将通 过这种方法获得的种子接种到含有 0.5、 1.0 到 2.0 或 4.0 毫克 / 升的多种浓度麦草畏的植 物选择培养基上。将这些板在 4℃孵育 48 小时， 然后转移到设定为 23.5℃、 具有 16 小时光 周期的 Percival 孵箱中。用 CTP-DMO 构建体转化的种子在含有麦草畏的培养基上生长成 植物， 并长出初生叶和次生叶， 而未转化的种子和阴性分离子 (segregants) 死亡或者没有 长出初生叶和次生叶。通过 PCR 试验检测为 3’ UTR 阳性的转基因植物用于进一 步分析。
来自转基因拟南芥植物的 3-5 个叶穿孔用于蛋白质印迹分析。在 Harbil paint 振摇器中用 500-1000μl PSBT 和 4 个玻璃珠进行蛋白质提取 3 分钟。在 4℃下以 3000rpm 旋转样本 3 分钟。向上清液的等分试样中加入等体积的含有 5.0％ β-ME 的 2x Laemmli 样 品缓冲液 / 染料 (cat.No.161-0737 BioRad)。 蛋白质印迹分析的其余步骤与实施例 2 中一 样。正确大小的免疫活性条带的存在表明 DMO 的正确加工和定位 ( 表 2)。例如， 如表 2 所 示， 在用 pMON73749 或者 pMON73725 转化拟南芥后可见的条带的比较中， 使用缺少来自豌豆 核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶的 27 个氨基酸的编码序列的 RbcSnoc-CTP 产生定位于叶绿 体的正确加工的 DMO， 而使用包含 27 个氨基酸的编码序列的 RbcS CTP 则产生 2 个免疫活性条带。 实施例 4
CTP-DMO 构建体在大豆中的测试
使 用 标 准 程 序 通 过 土 壤 杆 菌 介 导 的 大 豆 转 化 ( 例 如， Zhang 等 人， 1999 ； US 7,002,058) 获得转基因大豆 ( 例如， cvs.Thorne， NE3001 和 A3525) 植物。来自转基因大 豆植物的 3-5 个叶穿孔用于蛋白质印迹分析。在 Harbil paint 振摇器中用 500-1000μl PSBT 和 4 个玻璃珠进行蛋白质提取 3 分钟。在 4℃下以 3000rpm 旋转样本 3 分钟。向上清 液的等分试样中加入等体积的 2x Laemmli 样品缓冲液 / 染料 (BioRad)/5.0％ β-ME。蛋 白质印迹分析的其余步骤与实施例 2 中一样。正确大小的免疫活性条带的存在表明 DMO 的 正确加工和定位 ( 表 2)。
用构建体 ( 其编码连接到附着有核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶编码区的另外 24 个氨基酸和由于引入限制性酶识别位点而添加的 3 个氨基酸的豌豆核酮糖二磷酸羧化 酶 - 加氧酶转运肽上的 DMO) 转化的大豆植物， 当在出土前阶段用 0.51b 的麦草畏处理接着 在出土后 (V6) 阶段用 21b 麦草畏处理时， 显示 17-20％的损伤率。将其与用编码只连接到 豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶转运肽上的 DMO 的构建体转化的大豆植物进行比较， 后 者显示大约 12％的损伤率。 这些结果表明使用没有额外氨基酸的转运肽导致单一 DMO 活性 的产生 ( 而不是多个部分或不同加工的多肽 ) 和对麦草畏的较高的耐受性。单一形式的酶 的产生也导致易于表征产品和降低注册费用。
实施例 5
DMO 的高效生产和较高的麦草畏耐受性需要 CTP
用如实施例 3 所述的几种构建体 ( 图 1) 转化拟南芥哥伦比亚生态型植物。在包 含从 0.5、 1.0 到 2.0 毫克 / 升的各种浓度的麦草畏的植物组织培养基上选择转化的种子。 用 CTP-DMO 构建体转化的种子在含有麦草畏的培养基上生长成植物， 并长出初生叶和次生 叶， 而未转化的种子和阴性分离子死亡或者没有长出初生叶和次生叶。生长并检测为 DMO 基因阳性的转基因植物用于进一步分析。
如图 1 所示， 用不含 CTP 的构建体转化的植物几乎没有或者没有表现出对麦草畏 的耐受性。当在出土前阶段用 0.5lb/a 的麦草畏处理接着在出土后 (V6) 阶段用 2lb/a 的 麦草畏处理时， 用编码没有连接到 CTP 上的 DMO 的 DNA 构建体转化的大豆植物没有显示出 土前耐受性， 而用其中 DMO 连接到 CTP 上的构建体转化的植物显示出土前和出土后对麦草 畏的耐受性。
实施例 6
耐受麦草畏的转基因玉米植物的产生
为了测试 DMO 基因在向单子叶植物提供麦草畏耐受性方面的用途， 在植物基因表 达元件如启动子 ( 例如， PC1SV、 e35S、 OsAct1、 OsTPI、 OsAct15) 和内含子 ( 例如， OsAct1、 OsAct15、 OsTPI、 ZmHSP70) 的控制下， 产生了转基因玉米植物， 其包含 DMO 基因 ( 例如， SEQ ID NOS ： 29、 33、 35、 37、 39)， 具有或者不具有转运肽 ( 例如， TaWaxy、 CTP1、 CTP2 合成、 CTP4)。 该表达元件包含来自水稻肌动蛋白 1 基因的第一内含子和侧翼 UTR 外显子序列， 还在 5’ 端 包含外显子 1 的 12nt 和在 3’ 端包含外显子 2 的 7nt， 还有 3’ UTR( 例如， TaHsp17)。
转基因玉米植物基本上通过美国专利申请 20040244075 所述的方法产生。在单一
位置重复试验中评价具有单一拷贝的转基因玉米事件的麦草畏耐受性。使用来自 6 个构建 体中的每一个的 6 个事件。 实验设计如下 ： 列 / 项目 ： 1； 处理 ： 在 V3 阶段的 0.5lb/a 麦草畏， 接着在 V8 阶段的 1lb/a 麦草畏 ( BASF， Raleigh， NC) ； 重复 ： 2； 行距 ： 30 英寸 ； 地 决长度 ： 最小 20 英尺 ； 植物密度 ： 大约 30 株 /17.5 英尺 ； 通道 (alley) ： 2.5 英尺。 整个地块 均匀施肥以获得农艺学上可接受的农作物。为了控制玉米根虫， 在耕种时期施用每排 1000 3G(Syngenta Crop Protection， Greensboro， NC， USA)。 英尺 5 盎司土壤杀虫剂， 如 如果观察到小地老虎 (black cutworm) 的侵扰， 以每英亩 4-8 盎司的量施用 3.2EC(FMC Corporation， Philadelphia， PA)。此外， 使用喷洒杀虫剂计划以控制所有地上 的鳞翅目害虫， 包括欧洲玉米螟、 玉米耳虫和秋季粘虫。每 3 周以每英亩 4-8 盎司的量施 用 3.2EC 以控制鳞翅目害虫 ； 大约施用 4 次。出土前施用如 Xtra 5.6L(Monsanto， St.Louis， MO) 和 Degree (Monsanto， St.Louis， MO) 的除草剂， 以 保持地块无杂草。在整个实验中， 如果在未处理的检查中观察到杂草出现， 则通过手工除 草或者出土后施用 PERMIT(Monsanto， St.Louis， MO) 或者 (Bayer， Research Triangle Park， NC) 控制杂草。
当在 V3 阶段用 0.5lb/a 麦草畏处理接着在 V8 阶段用 1lb/a 麦草畏处理时， 通过 测量支柱根损伤来测试用包含 DMO 转基因的 DNA 构建体转化的玉米近交系的麦草畏耐受 性。通过计数一排中与 “手指样” 结构的典型形态相比显示支柱根融合的 “非典型” 形态的 植物的数量， 目视评价支柱根损伤。如表 4 所示， 用编码未与 CTP 连接的 DMO 的 DNA 构建体 (pMON73699、 pMON73704) 转化的玉米植物显示较高水平的支柱根损伤， 即， 麦草畏处理后的 低水平保护。编码连接到 CTP 上的 DMO 的 DNA 构建体 (pMON73716、 pMON73700、 pMON73715、 pMON73703) 显示较低水平的支柱根损伤， 即， 麦草畏处理后较高水平的保护。 表 4. 用携带 DMO 的 DNA 构建体转化的转基因玉米在测试麦草畏耐受性时显示出 的支柱根损伤百分比。
近交 / 构建体 01CSI6 LH244 pMON73699 pMON73704 pMON73716 pMON73700 pMON73715 pMON73703 详情 对麦草畏敏感的近交系 对麦草畏耐受的近交系 PC1SV/I-OsAct1/DMO-Wmc/TaHsp17 e35S/I-OsAct1/DMO-Wmc/TaHsp17 PC1SV/I-OsAct1/TaWaxy/DMO-Wmc/TaHsp17 PC1SV/I-OsAct1/CTP1/DMO-Wmc/TaHsp17 PC1SV/I-OsAct1/CTP2syn/DMO-Wmc/TaHsp17 e35S/I-OsAct1/CTP1/DMO-Wmc/TaHsp17 支柱根损伤 95.4 93.8 93.2 91.3 78.8 74.4 68.2 68.8从在不同的植物物种中进行的这些研究 ( 另外， 例如， 实施例 3、 4 和 8) 可见， 叶绿 体转运肽可用于 DMO 的高效靶向和 DMO 活性的完全产生， 导致对麦草畏较高的耐受性。此 外， 在玉米中 CTP-DMO 的表达提供了对麦草畏的出土前耐受性。
实施例 7
有效 DMO 表达单元的构建
一些遗传元件可以影响基因的有效表达， 如启动子、 叶绿体转运肽序列、 内含子、 5’ UTR、 基因的编码区、 3’ UTR。 然而， 不清楚哪些组合运行最好。 需要有效的 DMO 表达单元或 者构建体来产生改进的产物如耐受麦草畏的种子和植物。通过可操作地连接各种启动子、 CTP、 DMO 变体和 3’ UTR 中的各一种来构建几个 DMO 表达单元， 以获得用于产品开发的有效的 DMO 表达单元。 通过本领域已知的方法将这些构建体转化到大豆中 ( 例如， U.S.6,384,301、 U.S.7,002,058 或 Zhang 等人， 1999)。 获得转基因种子， 并检测出土前和出土后对麦草畏除 草剂的耐受性。 表 5 显示了当种子和植物在出土前用 0.5lb/ 英亩麦草畏处理接着在出土后 V6 阶段用 2lb/ 英亩的麦草畏处理时， 由麦草畏造成的损伤百分比 ( 较低的损伤意味着较 高的耐受性 )。用不携带 CTP 的 DNA 构建体 pMON68939 和 pMON73723 转化的种子不能耐受 麦草畏的出土前施用， 表明为了获得对麦草畏的出土前耐受性， 需要将 DMO 靶向至叶绿体。 用 pMON68939 和 pMON73723( 不含 CTP) 转化的植物， 在 V3 后阶段用麦草畏以 1lb/a 的量处 理后， 分别显示类似于野生型大豆 (60％ ) 的 55％和 57％的损伤率， 而用 pMON68938( 含有 CTP) 转化的植物显示很低的损伤率。这些结果表明， 在大豆中获得对麦草畏的出土前和出 土后耐受性需要 CTP。
表 5. 用特异性 DMO 表达单元转化并在出土前和出土后用麦草畏处理的大豆植物 显示的损伤百分比。
表达单元 PC1SV/CTP2syn/DMO-Wat(A)/nos e35S/CTP1/DMO-Wat(L)/nos PC1SV/RbcSnoc/DMO-Wat(A)/nos PC1SV/RbcSnoc/DMO-Wat(L)/nos PCSV/CTP1/DMO-Wat(A)/nos PC1SV/CTP2syn/DMO-Wat(L)/nos ANT1/CTP1/DMO-Wat(L)/nos PC1SV/RbcSnoc/DMO-Wat(A)/nos PC1SV/RbcS-CTP/DMO-Cnat(A)/nos pMON 名称 73724 68938 73725 73728 73729 73727 68945 73730 68934 ％损伤 9 12 12 12 13 13 14 15 1723102321632 A CN 102321639 Act7/CTP1/DMO-Wat(L)/nos说明书68942 68940 84254 68941 68943 68937 68946 68939 73723 17 17 20 29 60 62 73 100( 前 ) 100( 前 )22/28 页FMV.35S-EF1a/CTP1/DMO-Wat(L)/nos PC1SV/RbcS-CTP/DMO-Cnat(A)/E9 FMV/CTP1/DMO-Wat(L)/nos eIF4A10/CTP1/DMO-Wat(L)/nos e35S/CTP1/DMO-Cat(A)/nos e35S/CTP1/DMO-Cnat(L)/nos e35S/DMO-Wat(A)/nos PC1SV/DMO-Wat(A)/nos
实施例 8
耐受麦草畏的转基因棉花植物的产生
为了测试 DMO 基因在给棉花提供麦草畏耐受性方面的用途， 产生转基因棉花植 物。产生了几个 DNA 构建体， 它们携带在植物基因表达元件如启动子 ( 例如， PC1SV、 FMV 或 e35S) 和 3’ UTR( 例如， E6 ； 登记号 #U30508) 控制下的具有转运肽 ( 例如， PsRbcS CTP、 CTP1、 CTP2) 的 DMO 编码区 ( 例如， SEQ ID NO ： 23、 25、 27、 29、 31、 35)， 并如下所述转化到棉 花 ( 陆地棉 (Gossypium hirsutum)) 中。所用的培养基在表 6 中列出。
棉花 cv Coker130 的幼苗离体生长， 并切下胚轴部分， 并接种于携带 DNA 构建体的 根癌土壤杆菌的液体悬浮液， 印迹干燥 (blot dried)， 并共培养 2 天。 然后将接种的胚轴外 植体转移到葡萄糖选择培养基中 4 周， 蔗糖选择培养基中 1 周， 葡萄糖选择培养基中再培养 4 周， 来诱导愈伤组织。在 16/8( 光 / 暗 ) 循环和 28℃下孵育培养物。然后将卡那霉素抗 性愈伤组织转移到 UMO 培养基中， 并在 28-30℃、 黑暗条件下培养 16-24 周来诱导生胚愈伤 组织。然后从这些愈伤组织中收获生胚愈伤组织， 并在 28-30℃、 黑暗条件下、 在 TRP+ 培养 基上维持长达 4-16 周。收获来自生胚愈伤组织的小胚， 并在 SHSU 培养基上、 在 28-30℃温 度下和 6/8( 光 / 暗 ) 循环条件下发芽。然后将看起来正常的小植株转移到土壤中以获得 成熟的棉花植物。转化株的转基因性质通过 DNA 检测来证实。
表 6. 用于棉花转化的各种培养基的组成。
在 V4-5 生 长 阶 段 以 561g ae/ha(0.5lb/a) 的 量 用 麦 草 畏 (BASF，Raleigh， NC) 处理包含这样的 DNA 构建体的转化的棉花植物作为出土后处理， 每个 DNA 构 建体包含 DMO 编码区与转运肽、 启动子和 3’ UTR 的不同的组合， 发现有耐受性， 而未转化的 棉花植物显示 79％ -86％的损伤率。选择显示超过 95％的耐受性 ( 等于少于 5％的损伤 ) 的转基因植物用于进一步研究。转基因植物也对随后的麦草畏出土后处理具有耐受性。例 如， 在 V3-4 阶段用 0.5lb/ 英亩的麦草畏处理随后在 V5 阶段或者更晚的阶段用 1 或 2lb/ 英亩的麦草畏处理的植物依然对麦草畏耐受。该实施例显示 DMO 基因可以向各个生长阶段 的棉花提供麦草畏耐受性， 因而能够在各个阶段施用麦草畏以获得有效的杂草控制。 实施例 9
提高玉米直立能力的方法
如玉米的某些单子叶植物产生支柱根， 支柱根从地表以上的节点生长， 并有助于 支撑植物和在生殖阶段从土壤上层吸收水分和营养。如果植物遇到大风或者由于根线虫 感染或者地下水缺乏使得地下根系统变得较弱时， 健康的支柱根系统变得重要。为了控制 阔叶杂草， 允许对如玉米的单子叶植物使用如麦草畏和 2， 4-D 的合成除草剂。对于玉米的 出土后杂草控制， 麦草畏是第五广泛施用的除草剂。尽管用于控制阔叶杂草的最优量是 280-560 克 / 公顷 (g/h) 或者 0.25-0.5lb/ 英亩， 但是玉米中的平均使用量是 168g/h 或者
0.15lb/ 英亩， 因为在更高的施用量和如热天的某些环境条件下， 麦草畏能够损伤玉米。此 外， 几种玉米杂交体， 如 DKC61-42、 DKC64-77、 DKC6346、 DKC66-21 和 DKC61-44， 以及近交体， 如 01CSI6、 16IUL2、 70LDL5 和 90LCL6， 对麦草畏施用敏感。敏感性以多种方式表现， 如出现 洋葱剥离 (onion leafing)、 穗畸形、 株高降低或者不正常的支柱根的形成， 例如融合或者 扭曲的根的形成。支柱根变得多瘤节， 趋向于成长在一起， 并且不向土壤中生长来支撑植 物。 这可能导致较弱的玉米作物直立能力、 较高的易倒伏性和最终的产量损失。 一些含有麦 草畏的除草剂产品， 例如 BANVEL、 MARKSMAN、 DISTINCT、 NORTHSTAR 和 CELEBRITY PLUS， 可以导致这些效应。提高玉米对麦草畏的耐受性在保护较接近耐受麦草畏的农作物 种类 ( 如大豆、 棉花 ) 种植的玉米地也是有用的， 而且其中允许更高的麦草畏施用量。
本实施例提供了一种改进玉米和其它单子叶植物的直立能力的方法， 包括在玉米 中引入 DMO 基因并用麦草畏处理玉米。在一个实施方案中， DMO 基因在组成型启动子的控 制下表达， 所述组成型启动子也能够在节点区域和 / 或支柱根中表达 DMO。 在另一个实施方 案中， DMO 基因在一种嵌合组成型和节点 / 支柱根特异性启动子的控制下表达。在另一个 实施方案中， DMO 基因在根特异性启动子如 RCc3 或者其变体 ( 例如， 在 US20060101541 中 发现的 SEQ ID NOs ： 1-6) 的控制下表达。DMO 在支柱根中的表达导致支柱根没有或者有较 少的损伤， 导致玉米的较高的直立能力、 较少的倒伏， 因而导致较高的产量。 来自用各种 DMO 构建体 ( 在表 7 中列出 ) 转化的玉米植物的 3 个单拷贝事件的 R1 或者 F1 种子在 4.0”托盘中发芽。将健康植物移植到大约 10”的罐中。发芽和生长 培养基包括 Redi-earthTM(Scotts-Sierra Horticultural Products Co.， Marysville， Ohio)。将罐放在 35 英寸 ×60 英寸的玻璃纤维浇水托盘中的毛细管垫上， 用于在测试期间 进行亚浇灌， 从而保持对于植物生长而言最佳的土壤含水量。用 Osmocote(14-14-14 缓释 ； Scotts-Sierra Horticultural Products Co.， Marysville， Ohio) 以 100gm/cu.ft. 的量 对罐施肥， 以在温室试验期间维持植物生长。植物在 29℃ /21℃的昼 / 夜温度、 25％ -75％ 的相对湿度的温室中生长， 以模拟晚春温暖季节的生长条件。按照需要， 为最少 14 小时的 光照周期提供大约 600μE 的补充光。
使 用 具 有 设 定 为 最 小 24psi(165kpa) 的 大 气 压 的 Teejet 9501E 平 扇 喷 嘴 (Spraying Systems Co， Wheaton， IL)， 用轨道喷雾器来施用麦草畏。喷嘴保持在比植物顶 端高大约 16 英寸的位置进行喷雾。喷雾体积是 10 加仑 / 英亩或者 93 升 / 公顷。当植物 达到 V4-5 叶阶段时， 开始施用。
通过在 V4-5 阶段用 2lb/ 英亩或者 4lb/ 英亩的麦草畏处理， 并在处理后 24 天评估 植物的支柱根损伤 (0％ ； 没有可见的损伤， 到 100％， 植物完全死亡 ) 和倒伏 ( 倾斜程度 )， 来检测用包含 DMO 表达单元的 DNA 构建体转化的玉米近交系的植物的支柱根损伤和倒伏情 况。
如表 7 所示， 与未被转化的对照近交系和只用选择性标记表达单元 (pMON73746) 转化的植物相比较， 用含有 DMO 表达单元的 DNA 构建体转化的玉米植物显示没有或者几乎 没有支柱根损伤和倒伏。本实施例显示当用麦草畏处理时， 包含 DMO 的植物可以被用来提 供提高的直立能力。
表 7. 当用麦草畏处理时， 用各种 DMO 构建体转化的玉米植物显示没有或者几乎没 有支柱根损伤和倒伏。
参考文献
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美国专利公开 20060236420。美国临时申请 60/811,152 ； 美国临时申请 60/884,854 Akashi 等人， FEBS Lett.431 ： 39-44， 1998. Becker 等人， Plant Mol.Biol.20 ： 49， 1992. Bevan 等人， Nature， 304 ： 184-187， 1983. Bohlmann 等人， Plant J.， 7(3) ： 491-501， 1995. Carrington 和 Freed， J.of Virology 64 ： 1590-1597， 1990. Chalfie 等人， Science， 263(5148) ： 802-805， 1994. Chandler 等人， Plant Cell， 1： 1175-1183， 1989. Chu 等人 Scientia Sinica 18 ： 659， 1975. Clark 等人， Plant Mol.Biol.， 16(6) ： 1099-1101， 1991. Clough 和 Bent， Plant J.， 16 ： 735-743， 1998. Cork 和 Khalil， Adv.Appl.Microbiol.， 40 ： 289-321， 1995. Cork 和 Krueger， Adv.Appl.Microbiol.， 36 ： 1-66， 1991. Coruzzi 等人， EMBO J.， 3： 1671-1679， 1984. Creissen 等人， Plant J.， 2(1) ： 129-131， 1992. Creissen 等人， Plant J.8 ： 167-175， 1995. De Block 等人， EMBO J.， 3(8) ： 1681-1689， 1984. Depicker 等人， J.Mol.Appl.Genet.1 ： 561-573， 1982. Ebert 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 84 ： 5745-5749， 1987. 欧洲申请 646643 欧洲申请 553494 Fraley 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 80 ： 4803-4807， 1983. Gardiner 等人， Plant Physiol.， 134 ： 1317-1326， 2004. Gasser 等人， J.Biol.Chem.， 263 ： 4280-4287， 1988. Haseloff 和 Amos， Trends Genet.， 11(8) ： 328-329， 1995. Herman 等人， J.Biol.Chem.， 280(26) ： 24759-24767， 2005. Ingelbrecht 等人， Plant Cell， 1： 671-680， 1989. Jefferson， Plant Mol.Biol.Rep.， 5： 387-405， 1987. Klee 等人， Mol.Gen.Genet.， 210 ： 437-442， 1987. Koncz 等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 84(1) ： 131-135， 1987. Kyte 和 Doolittle， J.Mol.Biol.， 157(1) ： 105-132， 1982. Lawton 等人， Plant Mol.Biol.9 ： 315-324， 1987. Mazur 等人， Nucleic Acids Res.， 13(7) ： 2373-2386， 1985. Miki 和 McHugh， J.Biotechnol.107 ： 193-232， 2004. Miki 等人， In ： Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology， Glick 和 Thompson( 编 )， CRC Press， 67-88， 1993. Moberg 等人， Plant J.36 ： 616-628， 2003. Murashige 和 Skoog， Physiol Plant 15 ： 473-497， 1962. Odell 等人， Nature， 313 ： 810-812， 1985.Okagaki， Plant Mol.Biol.， 19 ： 513-516， 1992.
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发明背景
本申请要求于 2007 年 2 月 26 日提交的美国临时专利申请 60/891,675 和 2007 年 6 月 5 日提交的美国专利申请 11/758,659 的优先权， 本文完整引入其公开内容作为参考。
发明领域 本发明涉及植物生物技术领域。更具体的说， 本发明涉及允许有效加工和定位植 物中的麦草畏单加氧酶的叶绿体转运肽的鉴定和用途。
相关技术描述
DMO( 麦草畏单加氧酶 ) 在植物中催化除草剂麦草畏 (3， 6- 二氯 - 邻茴香酸 ) 降解 为无毒的 3， 6- 二氯水杨酸 (3， 6-DCSA)， 从而赋予除草剂耐受性。DMO 的活性需要用于将电 子从 NADH 向麦草畏转移的两种中间蛋白质 ： 还原酶和铁氧还蛋白 ( 美国专利 7,022,896 ； Herman 等人， 2005)。 然而， 转基因植物中的麦草畏耐受性已通过单独用 DMO 转化得到证明， 表明植物内源性的还原酶和铁氧还蛋白可以在电子转移中代替。 参与电子转移的植物铁氧 还蛋白位于质体中。因此， 为了获得 DMO 的高效性能并因此获得提高的麦草畏耐受性， 需要 将 DMO 靶向至叶绿体。
在许多情况下， 这种靶向可以通过被称作叶绿体转运肽 (CTP) 或者质体转运肽的 N- 末端延伸的存在而实现。如果表达的多肽将要在植物质体 ( 如叶绿体 ) 中区室化， 细菌 来源的染色体转基因必须具有与编码表达的多肽的序列相融合的编码 CTP 序列的序列。因 此， 将外源多肽定位到叶绿体中通常是借助于将编码 CTP 序列的多核苷酸序列可操作地连 接到编码外源多肽的多核苷酸的 5’ 区域上来完成的。CTP 在向质体内转移过程中通过加工 步骤被去除。但是， 加工效率可能受 CTP 的氨基酸序列和肽氨基端附近的序列影响。
Weeks 等人 ( 美国专利 7,022,896) 描述了玉米 cab-m7 信号序列 ( 参见， Becker 等人， 1992 和 PCT WO 97/41228 ； GenBank 登记号 X53398) 和豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列 (Creissen 等人， 1992 和 PCT WO 97/41228) 在将 DMO 靶向至植物质体方面的潜在用途， 但 是没有给出关于加工或者靶向效率的数据。含有包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶 (Rubisco) 小亚基编码序列的 27 个氨基酸序列的豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚 基 (RbcS)CTP， 也已经用于将 DMO 靶向至叶绿体 ( 例如， 美国临时申请 60/811,152)。然而， 已经在蛋白质印迹 (Western blot) 分析过程中发现， 这种豌豆 RbcS CTP 产生一个正确加 工的 DMO 蛋白质条带 ( ～ 38 kDa)， 但是还产生一个与 DMO 和 RbcS 编码区的 27 个氨基酸 相对应的较大的条带 ( ～ 41kDa)。额外的氨基酸可能不利地影响 DMO 的活性。此外， 由于 DMO 的不完全加工， 转基因产品中额外的蛋白质造成监管方面的障碍， 为了使产品在政府机 构注册的目的， 还需要在产品表征方面投入额外的努力， 由此增加了产品注册的费用。因 此， 需要鉴定有效地产生正确加工的 DMO 的 CTP， 从而提供完全的 DMO 活性以及易于表征产 品的优点。
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DMO( 麦草畏单加氧酶 ) 在植物中催化除草剂麦草畏 (3， 6- 二氯 - 邻茴香酸 ) 降解 为无毒的 3， 6- 二氯水杨酸 (3， 6-DCSA)， 从而赋予除草剂耐受性。DMO 的活性需要用于将电 子从 NADH 向麦草畏转移的两种中间蛋白质 ： 还原酶和铁氧还蛋白 ( 美国专利 7,022,896 ； Herman 等人， 2005)。 然而， 转基因植物中的麦草畏耐受性已通过单独用 DMO 转化得到证明， 表明植物内源性的还原酶和铁氧还蛋白可以在电子转移中代替。 参与电子转移的植物铁氧 还蛋白位于质体中。因此， 为了获得 DMO 的高效性能并因此获得提高的麦草畏耐受性， 需要 将 DMO 靶向至叶绿体。
在许多情况下， 这种靶向可以通过被称作叶绿体转运肽 (CTP) 或者质体转运肽的 N- 末端延伸的存在而实现。如果表达的多肽将要在植物质体 ( 如叶绿体 ) 中区室化， 细菌 来源的染色体转基因必须具有与编码表达的多肽的序列相融合的编码 CTP 序列的序列。因 此， 将外源多肽定位到叶绿体中通常是借助于将编码 CTP 序列的多核苷酸序列可操作地连 接到编码外源多肽的多核苷酸的 5’ 区域上来完成的。CTP 在向质体内转移过程中通过加工 步骤被去除。但是， 加工效率可能受 CTP 的氨基酸序列和肽氨基端附近的序列影响。
Weeks 等人 ( 美国专利 7,022,896) 描述了玉米 cab-m7 信号序列 ( 参见， Becker 等人， 1992 和 PCT WO 97/41228 ； GenBank 登记号 X53398) 和豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列 (Creissen 等人， 1992 和 PCT WO 97/41228) 在将 DMO 靶向至植物质体方面的潜在用途， 但 是没有给出关于加工或者靶向效率的数据。含有包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶 (Rubisco) 小亚基编码序列的 27 个氨基酸序列的豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚 基 (RbcS)CTP， 也已经用于将 DMO 靶向至叶绿体 ( 例如， 美国临时申请 60/811,152)。然而， 已经在蛋白质印迹 (Western blot) 分析过程中发现， 这种豌豆 RbcS CTP 产生一个正确加 工的 DMO 蛋白质条带 ( ～ 38 kDa)， 但是还产生一个与 DMO 和 RbcS 编码区的 27 个氨基酸 相对应的较大的条带 ( ～ 41kDa)。额外的氨基酸可能不利地影响 DMO 的活性。此外， 由于 DMO 的不完全加工， 转基因产品中额外的蛋白质造成监管方面的障碍， 为了使产品在政府机 构注册的目的， 还需要在产品表征方面投入额外的努力， 由此增加了产品注册的费用。因 此， 需要鉴定有效地产生正确加工的 DMO 的 CTP， 从而提供完全的 DMO 活性以及易于表征产 品的优点。
发明概述
本发明的一方面涉及一种重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加 氧酶的核苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 其中， 该核苷酸序列编码包括选 自 SEQ ID NOs ： 1-11 的序列的叶绿体转运肽。在某些实施方案中， 重组 DNA 分子包括选自 SEQ ID NOs ： 12-22 的核苷酸序列。在某些实施方案中， 重组 DNA 分子包括编码选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。包括与在植物细 胞中具有功能的启动子可操作地连接的 DNA 分子的 DNA 构建体也是本发明的一方面。
另一方面， 本发明包括用 DNA 分子转化的植物细胞， 所述 DNA 分子包括可操作地连 接到编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 其中， 叶绿 体转运肽序列选自 SEQ ID NOs ： 1-11。在某些实施方案中， 重组 DNA 分子包括选自 SEQ ID NOs ： 12-22 的核苷酸序列。在某些实施方案中， DNA 分子包括编码选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列， 其中， DNA 分子可操作地连接到 在植物细胞中具有功能的启动子上。在特定的实施方案中， DNA 分子包括选自 SEQ ID NOs ： 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37 和 39 的核苷酸序列。
在某些实施方案中， 植物细胞是双子叶植物细胞。 在其它实施方案中， 植物细胞是 单子叶植物细胞。 在特定的实施方案中， 植物细胞是大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽植物细胞。 本发明也涉及包括这样的细胞的植物组织培养物， 涉及包括这样的细胞的转基因种子和转 基因植物。 在某些实施方案中， 转基因种子或者植物是双子叶种子或植物。 在其它实施方案 中， 转基因种子或者植物是单子叶种子或者植物。转基因种子或者植物可以是大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽种子或者植物。
本发明进一步涉及产生耐受麦草畏的植物的方法， 包括 ： 将重组 DNA 分子引入植 物细胞中， 并由其再生植物， 所述 DNA 分子包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的核 苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的序列选自 SEQ ID NOs ： 12-22。 在某些实施方案中， 重组 DNA 分子包含编码选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。DNA 分子可以可操作地连接到在植物 细胞中具有功能的启动子上。 该方法可以进一步包括通过将亲本植株与它自身或者第二植 株杂交产生耐受麦草畏的植物， 其中亲本植株和 / 或第二植株包括所述 DNA 构建体， 并且耐 受麦草畏的植物从所述的亲本植株和 / 或第二植株遗传了该 DNA 构建体。
一种在植物细胞中表达麦草畏单加氧酶的方法是本发明的进一步的方面， 该方法 包括将选择的 CTP 可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的序列上。
另一方面， 本发明涉及一种在农作物生长环境中控制杂草生长的方法， 包括 ： 种植 这样的植物或其种子， 并向农作物生长环境施用有效控制杂草生长的量的麦草畏除草剂。 麦草畏除草剂可以自上方向农作物生长环境施用， 由此麦草畏除草剂的量不损伤所述的植 物或其种子， 却损伤与该植物或其种子基因型相同但是缺乏构建体的植物或者种子。
本发明的进一步的方面涉及生产食物、 饲料或者工业产品的方法， 包括 ：
a) 获得植物， 该植物包括按照 5’ 到 3’ 的方向可操作地连接到编码叶绿体转运肽 的核苷酸序列和编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列或其部分上的编码在植物细胞中具有 功能的启动子的核苷酸序列 ； b) 从所述植物或其部分制备食物、 饲料、 纤维或者工业产品。
在该方法的某些实施方案中， 食物或者饲料是谷物、 粗粉、 油、 淀粉、 面粉或者蛋白质。 在该方法的其它的实施方案中， 工业产品是生物燃料、 纤维、 工业化学品、 药物或者营养 品。
针对出土前 (pre emergence) 施用麦草畏提供保护的、 包括可操作地连接到编码 麦草畏单加氧酶的 DNA 上的编码叶绿体转运肽的 DNA 的耐受麦草畏的种子， 是本发明的进 一步的方面。 在某些实施方案中， 耐受麦草畏的种子包括编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 例如选自 SEQ ID NOs ： 12-22 的核苷酸序列。耐受麦草畏的种子可以进一步包括编码选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及提高单子叶植物的直立能力 (standability) 的方法， 包 括： a) 获得并培育通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂交产生的植物， 其中该亲本植 株和 / 或第二植株包含所述 DNA 构建体并且耐受麦草畏的植物从所述的亲本植株和 / 或第 二植株遗传了该 DNA 构建体 ； b) 用麦草畏处理植物。在某些实施方案中， 植物是玉米植物。 在其它的实施方式中， 可以测量包括支柱根的形状、 数量、 长度和 / 或结构、 倒伏百分比和 产量的与直立能力相关的参数。
本发明提供以下实施方案 ：
1. 一种重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列 上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列编码选自 SEQ ID NOs ： 1-11 的序列。
2. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其中， 所述编码叶绿体转运肽的 DNA 序列包括选 自 SEQ ID NOs ： 12-22 的序列。
3. 一种重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列 上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列编码选自拟南 芥 5- 烯醇丙酮酰莽草酸 -3- 磷酸合酶 CTP2 叶绿体转运肽序列和豌豆核酮糖二磷酸羧化 酶 - 加氧酶小亚基叶绿体转运肽序列的序列。
4. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列编码选自 SEQ ID NOs ： 2-7 的序列。
5. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列编码选自 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5 的序列。
6. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列包括选自 SEQ ID NOs ： 13-18 的序列。
7. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列包括选自 SEQ ID NOs ： 13、 15 和 16 的序列。
8. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其中， 所述编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列编码 选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的多肽。
9. 如第 8 项所述的重组 DNA 分子， 其中， 所述 DNA 序列选自 SEQ ID NOs ： 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37 和 39。10. 一种 DNA 构建体， 其包括与启动子可操作地连接的如第 1 项所述的 DNA 分子。
11. 如第 5 项所述的 DNA 构建体， 其中， 所述启动子选自 FMV35S 启动子、 At.ANT1 启动子、 FMV.35S-EF1a 启动子、 eIF4A10 启动子、 AGRtu.nos 启动子、 水稻胞质磷酸丙糖异构 酶 (OsTPI) 启动子、 水稻肌动蛋白 15 基因 (OsAct15) 启动子和 γ- 薏苡醇溶蛋白启动子。
12. 如第 10 项所述的构建体， 其中， 所述启动子在植物细胞中是具有功能的。
13. 用第 10 项所述的 DNA 构建体转化的植物细胞。
14. 如第 13 项所述的细胞， 其中， 所述植物细胞是双子叶植物细胞。
15. 如第 13 项所述的细胞， 其中， 所述植物细胞是单子叶植物细胞。
16. 如第 13 项所述的细胞， 其中， 所述植物细胞是大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽植 物细胞。
17. 一种植物组织培养物， 其包含第 13 项所述的细胞。
18. 如第 17 项所述的植物组织培养物， 其包含双子叶植物细胞。
19. 如第 17 项所述的植物组织培养物， 其包含单子叶植物细胞。
20. 如第 17 项所述的植物组织培养物， 其包含大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽植物细 胞。
21. 用第 10 项所述的 DNA 构建体转化的转基因植物。 22. 如第 21 项所述的转基因植物， 其中， 所述植物是双子叶植物。 23. 如第 21 项所述的转基因植物， 其中， 所述植物是单子叶植物。 24. 如第 21 项所述的转基因植物， 其中， 所述植物是大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽植物。 25. 一种产生耐受麦草畏的植物的方法， 包括将第 10 项所述的构建体引入植物细 胞中， 并由其再生包含第 10 项所述的构建体的植物。
26. 如第 25 项所述的方法， 进一步包括通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂 交产生耐受麦草畏的植物， 其中， 所述亲本植株和 / 或第二植株包含 DNA 构建体， 并且耐受 麦草畏的植物从所述的亲本植株和 / 或第二植株遗传了 DNA 构建体。
27. 一种在植物细胞中表达麦草畏单加氧酶的方法， 包括将选择的 CTP 可操作地 连接到编码麦草畏单加氧酶的序列上。
28. 一种在农作物生长环境中控制杂草生长的方法， 包括第 20 项所述的植物或其 种子， 并向农作物生长环境施用有效控制杂草生长的量的麦草畏除草剂。
29. 如第 28 项所述的方法， 其中， 所述麦草畏除草剂自上方向农作物生长环境施 用。
30. 如第 28 项所述的方法， 其中， 所述麦草畏除草剂的量不损伤第 21 项所述的植 物或其种子， 却损伤与第 20 项所述的植物的基因型相同但是缺乏第 10 项所述的构建体的 植物。
31. 一种生产食物、 饲料或者工业产品的方法， 包括 ：
a) 获得第 21 项所述的植物或其部分 ； 和
b) 从该植物或者其部分制备食物、 饲料、 纤维或者工业产品。
32. 如第 31 项所述的方法， 其中， 所述食物或者饲料是谷物、 粗粉、 油、 淀粉、 面粉 或者蛋白质。
33. 如第 31 项所述的方法， 其中， 所述工业产品是生物燃料、 纤维、 工业化学品、 药 物或者营养品。
34. 一种针对出土前施用麦草畏提供保护的耐受麦草畏的种子， 其包含可操作地 连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 上的编码叶绿体转运肽的 DNA。
35. 如第 34 项所述的耐受麦草畏的种子， 其中， 所述 DNA 编码选自 SEQ ID NOs ： 1-11 的叶绿体转运肽。
36. 如第 35 项所述的耐受麦草畏的种子， 其中， 所述编码叶绿体转运肽的 DNA 包含 选自 SEQ ID NOs ： 12-22 的序列。
37. 如第 34 项所述的耐受麦草畏的种子， 其中， 所述 DNA 编码包含选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的序列的麦草畏单加氧酶。
38. 一种提高单子叶植物的直立能力的方法， 包括 ： a) 培育通过第 26 项所述的方 法产生的植物或种子 ； 和 b) 用麦草畏处理该植物或种子。
39. 如第 38 项所述的方法， 进一步包括 ： c) 测量选自支柱根的数量、 形状、 长度或 结构、 倒伏百分比和产量的与直立能力相关的参数。
附图简述 图1： CTP-DMO 构建体在 DMO 的正确加工和提供麦草畏耐受性中的应用。
发明详述
根据本发明， 提供了用于在植物细胞中更有效地表达和向叶绿体转运麦草畏单加 氧酶 (DMO) 多肽的组合物和方法。因此本发明的组合物和方法在增强植物和细胞对除草剂 麦草畏的耐受性方面有用。尤其通过用叶绿体转运肽 (CTP) 将 DMO 靶向至叶绿体， 可以实 现提高的 DMO 表达和对麦草畏的耐受性。
然而， 令人惊奇的是， 本发明人已经发现某些 CTP 与 DMO 组合不能很好地发挥功 能。例如， 一些 CTP 不能导致足够的蛋白质表达。这包括蛋白质的不正确表达， 以及改变大 小的蛋白质的产生和不完全的体内活性。 这会导致不完全的除草剂耐受性并且使注册审批 变得复杂。 本发明提供 CTP， 当该 CTP 与 DMO 联合使用时， 提供意想不到的益处， 包括但不限 于： 提高的转运至叶绿体的水平、 在表达 DMO 的转基因植物中增强的除草剂耐受性、 正确大 小的蛋白质表达的理想水平和适当的翻译后修饰。当与 DMO 组合后提供意想不到的益处的 CTP 的一个例子是转运肽 CTP2， 包括 SEQ ID NO ： 4 或 5 的核酸， 并且包括编码 SEQ ID NOs ： 15 和 16 的序列。在其它实施方案中， 使用豌豆 (Pisum sativum) 核酮糖二磷酸羧化酶 - 加 氧酶小亚基 CTP 编码序列， 例如由 SEQ ID NO ： 2 所代表的或者编码 SEQ ID NO ： 13。因此， 包括可操作地连接到 CTP2 和 / 或豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚基 CTP 转运肽编 码序列上的 DMO 编码序列的 DNA 构建体构成本发明的一个方面， 由其编码的蛋白质也构成 本发明的一个方面。
嗜 麦 芽 假 单 胞 菌 (Pseudomonas maltophilia) 菌 株 DI6 的 麦 草 畏 单 加 氧 酶 (Herman 等人， 2005 ； 美国专利公开 20030115626 ； GenBank 登记 AY786443， 本文引入其编码 DMO 的序列作为参考 ) 催化除草剂麦草畏的解毒。DMO 是用于将麦草畏解毒成无毒的 3， 6- 二氯水杨酸 (3， 6-DCSA) 的三组分体系中的一部分， 且如上所述需要还原酶和铁氧还蛋 白功能来转移电子。由于参与电子转移的内源性植物铁氧还蛋白定位于质体中， 为了获得 DMO 的有效活性和例如在双子叶植物中的麦草畏耐受性或者例如在单子叶植物中增强的麦
草畏耐受性， 优选 DMO 靶向至质体 ( 例如叶绿体 )。
测试叶绿体转运肽 (CTP) 在将 DMO 靶向至质体和 DMO 加工中的效率。与这些 CTP 有关的 DMO 的质体定位和加工从没有或部分到完全不等。发现只有一些 CTP 允许将 DMO 完 全加工成正确的大小。因此， 基于它的蛋白质或者核苷酸序列， 任意给定的 CTP 提供完全和 有效的 DMO 加工的能力是难以预料和出人意料的。
此外， 也已经在拟南芥中发现， 在没有合适的 CTP 的情况下， 几乎没有或者没有 DMO 的表达与几乎没有或者没有麦草畏耐受性相关。这表明叶绿体靶向对于麦草畏的解毒 进而对于耐受性是重要的。允许有效加工 DMO 的 CTP 在将 DMO 靶向至农作物的质体例如叶 绿体方面是有用的， 因此提供以下优势 ： 完全的 DMO 活性和对麦草畏的较高的耐受性， 以及 易于表征产品和降低注册费用。
包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 上的编码叶绿体转运肽的 DNA 的 嵌合 DNA 分子可以通过本领域技术人员熟知的分子生物学方法制备 ( 例如， Sambrook 等人， 1989)。本发明提供了可操作地连接到已知的编码 DMO( 包括表 1 中列出的那些 ) 的 DNA 分 子上的 CTP， 用于提高植物中 DMO 的表达。
来自在细胞核中编码的任何基因并且其产物可将多肽靶向至叶绿体的叶绿体转 运肽， 可以进行 DMO 有效表达的检测。 可以分离或者合成叶绿体转运肽序列。 为了在双子叶 植物、 单子叶植物或者这两者中表达， 可以优化编码 CTP 的核苷酸序列。通过将每一个可操 作地连接到 DMO 编码序列上， 测试下面的转运肽 ： PsRbcS- 衍生的 CTPs(SEQ ID NO ： 1和2： 豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚基 CTP ； Coruzzi 等人， 1984) ； AtRbcS CTP (SEQ ID NO ： 3： 拟南芥核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚基 1A CTP ； CTP1 ； 美国专利 5,728,925) ； AtShkG CTP(SEQ ID NO ： 4： 拟南芥 5- 烯醇丙酮酰莽草酸 -3- 磷酸合酶 (EPSPS) ； CTP2 ； Klee 等人， 1987) ； AtShkGZm CTP(SEQ ID NO ： 5： CTP2 合成的 ； 为单子叶植物表达进行密码子优 化； WO04009761 的 SEQ ID NO ： 14) ； PhShkG CTP(SEQ ID NO ： 6： 矮牵牛 (Petunia hybrida) EPSPS ； CTP4 ； 为单子叶植物表达进行密码子优化 ； Gasser 等人， 1988) ； TaWaxy CTP(SEQ ID NO ： 7： 小麦 (Triticum aestivum) 结合颗粒的淀粉合酶 CTP 合成的， 为玉米表达进行密码子 优化 ： Clark 等人， 1991) ： OsWaxy CTP(SEQ ID NO ： 8： 水稻 (Oryza sativa) 淀粉合酶 CTP ； Okagaki， 1992) ； NtRbcS CTP(SEQ ID NO ： 9： 烟草 (Nicotiana tabacum) 核酮糖 1， 5- 二磷 酸羧化酶小亚基叶绿体转运肽 ； Mazur， 等人， 1985) ； ZmAS CTP(SEQ ID NO ： 10 ： 玉米 (Zea mays) 邻氨基苯甲酸合酶 α2 亚单位基因 CTP ； Gardiner 等人， 2004) ； 和 RgASCTP(SEQ ID NO ： 11 ： 芸香 (Ruta graveolens) 邻氨基苯甲酸合酶 CTP ； Bohlmann， 等人， 1995)。编码 SEQ ID NO ： 1-SEQ ID NO ： 11 的核苷酸序列分别在 SEQ ID NO ： 12-SEQ ID NO ： 22 中给出。
可能有用的其它转运肽包括玉米 cab-m7 信号序列 (Becker 等人， 1992 ； PCT WO 97/41228) 和豌豆 (Pisum sativum) 谷胱甘肽还原酶信号序列 (Creissen 等人， 1995 ； PCT WO 97/41228)。具有来自于基因编码区的额外氨基酸的 CTP( 所述氨基酸是该基因编码区 的一部分或与它融合 )， 例如 AtRbcS CTP( 其包含转运肽， 成熟核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧 酶蛋白的 24 个氨基酸， 然后是转运肽的最后 6 个氨基酸的重复 )， 可以被用来产生 DMO。 ZmAS CTP7 也包含来自于基因编码区的额外 18 个氨基酸。其它 CTP 也可以用来产生 DMO， 它们具 有来自于基因编码区的额外的氨基酸 ( 例如 27 个氨基酸 )( 所述氨基酸是该基因编码区的 一部分 )， 例如 PsRbcS CTP， 紧接着是通过克隆方法引入的氨基酸 ( 例如 3 个氨基酸 )。具有较少的编码全长 CTP 的氨基酸 ( 例如 21 个氨基酸 ) 的 CTP， 例如 RgAs CTP， 也可以被用来 产生 DMO。优选地， 使用编码全长 CTP 的核苷酸序列。可以包括一个或者多个核苷酸添加或 者缺失， 以便于 CTP 的克隆。这些添加或者缺失可以在其它表达元件和编码区的前面或者 后面， 导致一个或者多个编码氨基酸的修饰， 例如在限制性酶识别位点处或者位于其附近。
在一个实施方案中， 本发明涉及编码叶绿体转运肽的核酸序列， 该叶绿体转运肽 与 SEQ ID NOs ： 1-11 中的任意一个或者多个多肽序列至少具有 70％的同一性， 包括与这些 序列有至少大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％、 99％或者更高的序列同一性， 包 括 100％的同一性。 在特定的实施方案中， 所述核酸序列编码与 SEQ ID NOs ： 1-11 中的一个 相同的叶绿体转运肽。在另一个实施方案中， 编码 CTP 的核酸序列与 SEQ ID NOs ： 12-22 中 的任意一个或者多个核酸序列具有至少 70％的序列同一性， 包括与这些序列中的一个或者 多个至少有大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％、 99％或者更大的序列同一性， 包 括 100％的同一性。这些序列和本文所述的任意其它序列的多肽或者多核苷酸比较和同一 性的确定可以如本领域公知的那样进行， 例如， 使用 MEGAlign(DNAStar， Inc.， 1228S.Park St.， Madison， WI)， 采用缺省参数。这样的软件通过确定相似性或者同一性的程度， 匹配相 似的序列。
通过使用前序列可以将 DMO 靶向至其它细胞器例如线粒体， 以利用存在于该细胞 器中的铁氧还蛋白氧化还原系统。或者， 通过双靶向肽可以将 DMO 靶向至叶绿体和线粒体 两者， 以利用两个铁氧还蛋白氧化还原系统， 使工作更加有效。 这样的元件是本领域的技术 人员已知的。例如， 线粒体前序列在 Silva Filho 等人， (1996) 中有描述。编码双靶向肽序 列的核酸序列可以从编码下述已知能被靶向至叶绿体和线粒体两者的蛋白质的核苷酸序 列中被鉴定出来 ： Zn-MP(Moberg 等人， 2003)、 谷胱甘肽还原酶 (Rudhe 等人， 2002 ； Creissen 等人， 1995) 和组氨酰 -tRNA 合成酶 (Akashi 等人， 1998)。例如， 如表 1 所示， 在编码 SEQ IDNOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40 多肽的序列中， 发现可以用于这方面的 DMO 编码序列 的例子。
表 1. 使用的 DMO 和 DMO 变体。
在某些实施方案中， 编码麦草畏单加氧酶的核酸与编码 SEQ IDNOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 中任意一个多肽的序列具有至少 70％的同一性， 包括与这些序列具有 至少大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％、 99％和更高的序列同一性。在某些实施 方案中， 核酸与 SEQ ID NOs ： 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37 或 39 中的任意一个核酸序列具有 至少 70％的序列同一性， 包括与这些序列中的一个具有至少大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％、 99％和更大的序列同一性。 在进一步的实施方案中， 麦草畏单加氧酶可以 是任一个这样的序列的变体和 / 或可以是工程化的合成 DMO 分子， 例如， 如在 2007 年 1 月 12 日提交的名称为 “DMO Methods And Compositions” 的美国临时申请 60/884,854 中描述 的， 本文特别引入其完整公开内容作为参考。
具有降解植物生长素样除草剂的能力的 DMO 的变体， 以及草甘膦或者其它除草 剂耐受基因， 可以根据标准方法容易地制备， 并测定其活性。也可以通过本领域已知的技 术， 例如， 从合适的生物体中鉴定这些序列， 所述生物体包括能够降解例如麦草畏的生物 素样除草剂或者其它除草剂的细菌 ( 美国专利 5,445,962 ； Cork 和 Krueger， 1991 ； Cork 和 Khalil， 1995)。一种分离 DMO 或者其它序列的方法是通过例如与由来源生物体构建的 文库进行核酸杂交， 或者使用来自来源生物体的 mRNA 和基于公开的去饱和酶的引物进行 RT-PCR。本发明因此包括在严格条件下与本文所述的 DMO 编码序列杂交的核酸的应用。本 领域的技术人员理解通过增加盐浓度和降低温度可以提供严格性较低的条件。因此， 杂交 条件可以容易地控制， 并且一般是根据预期的结果选择的方法。高严格性条件的一个例子 50％甲酰胺和 42℃。通过在这样的条件下洗涤例如 10 分钟， 可以除去那些在这 是 5X SSC、 些条件下不与特定靶序列杂交的序列。
变体也可以化学合成， 例如， 根据本领域众所周知的技术， 利用已知的 DMO 多核苷 酸序列合成。 例如， DNA 序列可以通过亚磷酰胺化学法 (phosphoroamidite) 在自动 DNA 合成 仪上合成。化学合成有许多优势。特别是， 化学合成是合乎需要的， 因为将要表达 DNA 序列 的宿主所偏好的密码子可以用来优化表达。 并非所有的密码子都需要改变来获得改进的表 达， 但是优选地至少将那些在宿主中很少用到的密码子改变为宿主偏好的密码子。通过改 变超过大约 50％， 最优选至少大约 80％的密码子成为宿主偏好的密码子， 可以得到高水平 的表达。 许多宿主细胞的密码子偏好是已知的 ( 例如， PCT WO 97/31115 ； PCT WO 97/11086 ； EP 646643 ； EP 553494 ； 和美国专利： 5,689,052 ； 5,567,862 ； 5,567,600 ； 5,552,299 和 5,017,692)。可以通过本领域已知的方法， 推导出其它宿主细胞的密码子偏好。此外， 利用 化学合成， 可以容易地改变 DNA 分子的序列或者其编码的蛋白质， 例如用来优化表达 ( 例 如， 消除干扰转录或翻译的 mRNA 二级结构 )、 在方便的位点加入独特的限制性位点、 以及删 除蛋白酶酶切位点。
在根据需要保留或者改变酶活性的同时， 可以对蛋白质的多肽序列， 如本文提供 的 DMO 序列， 进行修饰和改变。在 2007 年 1 月 12 日提交的美国临时申请 60/884,854 中提 供了产生 DMO 序列的示例性的方法。下面是基于改变蛋白质的氨基酸来产生相当的或甚 至改进的、 修饰的多肽和相应的编码序列的讨论。已知， 例如， 在蛋白质结构中某些氨基酸 可以被其它氨基酸代替， 却不会明显损失与底物分子上诸如结合位点的结构相互结合的能 力。因为蛋白质的相互作用能力和性质限定了蛋白质的生物学功能活性， 所以可以在蛋白 质序列中， 当然也可以在其 DNA 编码序列中， 进行某些氨基酸序列置换， 而仍然获得具有相 似性质的蛋白质。因此设想 ： 可以对本文描述的 DMO 肽序列或者其它除草剂耐受性多肽和 相应的 DNA 编码序列进行各种改变， 而不会明显减弱它们的生物学效用或者活性。
进行这样的改变时， 需要考虑氨基酸的亲水指数。本领域中一般理解亲水氨基酸 指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性 (Kyte 等人， 1982)。普遍认为， 氨基 酸的相对亲水特性对产生的蛋白质的二级结构具有贡献， 而蛋白质的二级结构又限定了蛋 白质与例如酶、 底物、 受体、 DNA、 抗体、 抗原等其它分子的相互作用。基于它们的疏水性和 电荷特性， 每种氨基酸已被分配了亲水指数 (Kyte 等人， 1982)， 这些是 ： 异亮氨酸 (+4.5) ； 缬氨酸 (+4.2) ； 亮氨酸 (+3.8) ； 苯丙氨酸 (+2.8) ； 半胱氨酸 / 胱氨酸 (+2.5) ； 甲硫氨酸 (+1.9) ； 丙氨酸 (+1.8) ； 甘氨酸 (-0.4) ； 苏氨酸 (-0.7) ； 丝氨酸 (-0.8) ； 色氨酸 (-0.9) ； 酪 氨酸 (-1.3) ； 脯氨酸 (-1.6) ； 组氨酸 (-3.2) ； 谷氨酸 (-3.5) ； 谷氨酰胺 (-3.5) ； 天冬氨酸 (-3.5) ； 天冬酰胺 (-3.5) ； 赖氨酸 (-3.9) 和精氨酸 (-4.5)。
本领域已知， 氨基酸可以被其它具有相似亲水指数或者得分的氨基酸代替， 而仍 然产生具有相似生物学活性的蛋白质， 即， 仍然获得生物学功能相当的蛋白质。 进行这样的 转变时， 优选其亲水指数在 ±2 之内的氨基酸置换， 尤其优选在 ±1 之内的氨基酸置换， 甚 至更优选在 ±0.5 之内的氨基酸置换。
本领域中也理解在亲水性的基础上可以有效进行相似氨基酸的置换。美国专利 4,554,101 提出， 受到邻近氨基酸亲水性控制的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的 生物学性质相关。如美国专利 4,554,101 所述， 下面的亲水性值被分配给氨基酸残基 ： 精 氨酸 (+3.0) ； 赖氨酸 (+3.0) ； 天冬氨酸 (+3.0±1) ； 谷氨酸 (+3.0±1) ； 丝氨酸 (+0.3) ； 天 冬酰胺 (+0.2) ； 谷氨酰胺 (+0.2) ； 甘氨酸 (0) ； 苏氨酸 (-0.4) ； 脯氨酸 (-0.5±1) ； 丙氨酸 (-0.5) ； 组氨酸 (-0.5) ； 半胱氨酸 (-1.0) ； 甲硫氨酸 (-1.3) ； 缬氨酸 (-1.5) ； 亮氨酸 (-1.8) ； 异亮氨酸 (-1.8) ； 酪氨酸 (-2.3) ； 苯丙氨酸 (-3.5) ； 色氨酸 (-3.4)。应当理解 ： 氨 基酸可以被另一种具有相似亲水性值的氨基酸代替， 而仍然获得生物学相当的蛋白质。在 这样的改变中， 优选其亲水性值在 ±2 之内的氨基酸置换， 尤其优选在 ±1 之内的氨基酸置 换， 甚至更优选在 ±0.5 之内的氨基酸置换。将这些和各种上述特征考虑在内的示例性的 置换是本领域的技术人员熟知的， 且包括 ： 精氨酸和赖氨酸， 谷氨酸和天冬氨酸， 丝氨酸和 苏氨酸， 谷氨酰胺和天冬酰胺， 及缬氨酸、 亮氨酸和异亮氨酸。
包括可操作地连接到 DMO 序列上的 CTP 序列的 DNA 构建体可以通过被可操作地连 接到在植物中具有功能的启动子上而在诸如原生质体、 瞬时或者稳定转化的植物细胞等测 试系统中表达。描述这样的启动子的例子包括美国专利 6,437,217( 玉米 RS81 启动子 )、 美国专利 5,641,876( 水稻肌动蛋白启动子 ； OsAct1)、 美国专利 6,426,446( 玉米 RS324 启 动子 )、 美国专利 6,429,362( 玉米 PR-1 启动子 )、 美国专利 6,232,526( 玉米 A3 启动子 )、 美国专利 6,177,611( 组成型玉米启动子 )、 美国专利 5,322,938、 5,352,605、 5,359,142 和 5,530,196(35S 启动子 )、 美国专利 6,433,252( 玉米 L3 油质蛋白启动子 )、 美国专利 6,429,357( 水稻肌动蛋白 2 启动子以及水稻肌动蛋白 2 内含子 )、 美国专利 5,837,848( 根 特异性启动子 )、 美国专利 6,294,714( 光诱导型启动子 )、 美国专利 6,140,078( 盐诱导型 启动子 )、 美国专利 6,252,138( 病原体诱导型启动子 )、 美国专利 6,175,060( 磷缺乏诱导 型启动子 )、 美国专利 6,388,170( 例如， PC1SV 启动子 )、 SEQ ID NO ： 41 的 PC1SV 启动子、 美国专利 6,635,806(γ- 薏苡醇溶蛋白 (coixin) 启动子 ) 和美国专利 7,151,204( 玉米 叶绿体醛缩酶启动子 )。可以使用的其它启动子是胭脂氨酸合酶 (NOS) 启动子 (Ebert 等 人， 1987)、 章鱼氨酸合酶 (OCS) 启动子 ( 其在根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 的肿瘤诱导的质粒中携带 )、 花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒 (CaMV)19S 启 动子 (Lawton 等人， 1987)、 CaMV 35S 启动子 (Odell 等人， 1985)、 玄参花叶病毒 35S- 启 动 子 (Walker 等 人， 1987)、 蔗 糖 合 酶 启 动 子 (Yang 等 人， 1990)、 R 基因复合体启动子 (Chandler 等人， 1989) 和叶绿素 a/b 结合蛋白基因启动子等。在本发明中， 具 有增强 子 序 列 的 CaMV35S(e35S ； 美 国 专 利 5,322,938 ； 5,352,605 ； 5,359,142 和 5,530,196)、 FMV35S( 美国专利 6,051,753 ； 5,378,619)、 花生褪绿条纹花椰菜花叶病毒 (PC1SV ； 美国 专利 5,850,019)、 At.Act 7( 登记号 #U27811)、 At.ANT1( 美国专利申请 20060236420)、 FMV.35S-EF1a( 美 国 专 利 申 请 20050022261)、 eIF4A10( 登 记 号 #X79008) 和 AGRtu. nos(GenBank 登记号 V00087 ； Depicker 等人， 1982 ； Bevan 等人， 1983)、 水稻胞质磷酸丙糖 异构酶 (OsTPI ； 美国专利 7,132,528) 和水稻肌动蛋白 15 基因 (OsAct15 ； 美国专利申请 2006-0162010) 启动子可能特别有用。
作为翻译前导序列起作用的 5’ UTR 是位于基因的启动子序列和编码序列之间的 DNA 遗传元件， 可以被包括在启动子和 CTP-DMO 序列之间。 翻译前导序列存在于翻译启动序 列上游的完全加工的 mRNA 之中。 翻译前导序列可以影响初级转录物向 mRNA 的加工、 mRNA 稳 定性或者翻译效率。翻译前导序列的例子包括玉米和矮牵牛花热休克蛋白前导序列 ( 美国 专利 5,362,865)、 植物病毒外壳蛋白前导序列、 植物核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶前导序 列、 GmHsp( 美国专利 5,659,122)、 PhDnaK( 美国专利 5,362,865)、 AtAnt1、 TEV(Carrington 和 Freed， 1990) 和 AGRtunos(GenBank 登 记 号 V00087 ； Bevan 等 人， 1983) 等 (Turner 和Foster， 1995)。在本发明中， 可能尤其有益的 5’ UTR 是 GmHsp1( 美国专利 5,659,122)、 PhDnaK( 美 国 专 利 5,362,865)、 AtAnt1、 TEV(Carrington 和 Freed， 1990)、 OsAct1( 美 国 专 利 5641876)、 OsTPI( 美 国 专 利 7,132,528)、 OsAct15( 美 国 公 开 20060162010) 和 AGRtunos(GenBank 登记号 V00087 ； Bevan 等人， 1983)。
3’ 非翻译序列、 3’ 转录终止区或者多腺苷酸化区域意思是连接到并位于结构多核 苷酸分子下游的 DNA 分子， 并且包括提供能够影响转录、 mRNA 加工或者基因表达的多腺苷 酸化信号和其它调控信号的多核苷酸。多腺苷酸化信号在植物中发挥功能， 以导致向 mRNA 前体的 3’ 末端增加多聚腺苷酸。多腺苷酸化序列可以来源于天然基因、 多种植物基因或者 T-DNA 基因。 这些序列可以包含于 CTP-DMO 序列的下游。 3’ 转录终止区的例子是胭脂氨酸合 酶 3’ 区 (nos 3’ ； Fraley 等人， 1983)。举例说明了不同的 3’ 非翻译区的应用 (Ingelbrecht 等人， 1989)。 来自豌豆 RbcS2 基因 (Ps.RbcS2-E9 ； Coruzzi 等人， 1984)、 AGRtu.nos(Genbank 登记号 E01312)、 E6( 登记号 #U30508) 和 TaHsp17( 小麦低分子量热休克蛋白基因 ； 登记号 #X13431) 的多腺苷酸化分子特别有利地用于本发明。
除了上述的表达元件以外， 为了尤其在单子叶植物中表达编码区， 在启动子和 3’ UTR 之间可能需要内含子。 “内含子” 指的是多核苷酸分子， 其可以从基因的基因组拷贝 的间插序列分离或者鉴定， 而且一般可以被定义为在翻译前 mRNA 加工过程中被剪切掉的 区域。或者， 内含子可以合成产生。内含子本身可以包含影响可操作地连接的基因的转录 的亚元件例如顺式元件或者增强子区域。 “植物内含子” 是在植物细胞中发挥功能的天然或 者非天然的内含子。 植物内含子可以用作调控元件来调节可操作地连接的一种或多种基因 的表达。转化构建体中的多核苷酸分子序列可以包含内含子。相对于可以转录的多核苷酸 序列， 内含子可以是异源的。 内含子的例子包括玉米肌动蛋白内含子 ( 美国专利 5641876)、 玉米 HSP70 内含子 (ZmHSP70 ； 美国专利 5,859,347 ； 美国专利 5,424,412) 和水稻 TPI 内含 子 (OsTPI ； 美国专利 7,132,528)， 并且在实施本发明中是有益的。
可以通过植物组织培养和转化领域的技术人员所知的方法， 在如原生质体或者 瞬时或稳定转化的单子叶或双子叶植物细胞的测试系统中测试 CTP-DMO 构建体是否提供 DMO 的正确加工。按照本发明， 可以使用本领域中已知的任一种将转基因构建体导入植物 的技术 ( 参见， 例如， Miki 等人， 1993)。据信， 合适的植物转化方法实际上包括任一种可将 DNA 导入细胞中的方法， 如美国专利 5,384,253 所描述的电穿孔法 ； 美国专利 5,015,580、 5,550,318、 5,538,880、 6,160,208、 6,399,861 和 6,403,865 所 描 述 的 微 粒 轰 击 法 ； 美国 专利 5,635,055、 5,824,877、 5,591,616、 5,981,840 和 6,384,301 所描述的土壤杆菌介导 转化法 ； 和美国专利 5,508,184 描述的原生质体转化法。通过应用如这些方法的技术， 实 际上任何植物种的细胞都可以稳定地转化， 而且这些细胞可以发育成转基因植物。美国 专利 5,846,797、 5,159,135、 5,004,863 和 6,624,344 公开了在棉花转化中特别有用的技 术。例如， 在美国专利 5,750,871 中特别公开了转化芸苔属 (Brassica) 植物的技术 ； 例如， 在 Zhang 等人， 1999、 美国专利 6,384,301 和 US 7,002,058 中公开了转化大豆的技术。在 WO9506722 中公开了转化玉米的技术。可以用于本发明的植物的一些非限制性例子包括苜 蓿、 大麦、 豆类、 甜菜、 花茎甘蓝、 卷心菜、 胡萝卜、 油菜、 花椰菜、 芹菜、 大白菜、 玉米、 棉花、 黄 瓜、 干豆、 茄子、 茴香、 青刀豆、 葫芦、 韭菜、 莴苣、 甜瓜、 燕麦、 黄秋葵、 洋葱、 豌豆、 胡椒、 南瓜、 花生、 马铃薯、 南瓜、 萝卜、 水稻、 高粱、 大豆、 菠菜、 倭瓜、 甜玉米、 甜菜、 向日葵、 西红柿、 西瓜和小麦。 实现将外源 DNA 导入接受体细胞后， 产生转基因植物的下一步一般涉及鉴定用于 进一步的培养和植物再生的转化的细胞。为了提高鉴定转化体的能力， 可能需要与按照本 发明制备的转化载体一起使用可选择或可筛选的标记基因。在这种情况下， 一般接下来通 过将细胞暴露于一种或多种选择剂检测可能转化的细胞群， 或者针对需要的标记基因的性 状筛选细胞。
在暴露于选择剂后存活的细胞， 或者在筛选试验中评分为阳性的细胞， 可以在支 持植物再生的培养基上继续培养。任何合适的植物组织培养基， 例如， MS 或者 N6 培养基 (Murashige 和 Skoog， 1962 ； Chu 等人， 1975)， 可以通过包含如生长调节剂的其它物质进行 改变。可以在含有生长调节剂的基础培养基上维持组织， 直到获得足够的组织来开始植物 再生工作， 或者进行反复几轮人工选择， 直到组织的形态适合再生， 典型地至少两周， 然后 转移到有助于幼苗形成的培养基上。定期转移培养物， 直到发生足够的幼苗形成。一旦幼 苗形成， 就将它们转移到有助于根形成的培养基上。 一旦形成足够的根， 就可以将植物转移 到土壤中进一步生长和成熟。
为了证实外源 DNA 或者 “转基因” 在再生植物中的存在， 可以进行多种试验。这样 的试验包括， 例如， “分子生物学” 试验， 如 DNA 印迹法和 RNA 印迹法和 PCRTM ； “生物化学” 试 验， 如检测蛋白质产物的存在， 例如， 通过免疫学方法 (ELISA 和蛋白质印迹法 ) 或者通过酶 功能 ； 植物部分试验， 如叶或者根试验 ； 以及， 通过分析整个再生植物的表型。
一旦转基因被导入植物中， 就可以通过杂交将该基因导入到任何与该第一植物性 相容的植物中， 而根本不需要直接转化第二种植物。因此， 本文中使用的术语 “后代” 指的 是按照本发明制备的亲本植株的任何一代后代， 其中， 该后代包含按照本发明制备的选择 的 DNA 构建体。因此， “转基因植物” 可以是任何一代。如本文公开的， “杂交” 一种植物以 提供相对于初始植物系具有一个或者多个添加的转基因或者等位基因的植物系， 被定义为 通过将初始系与包含本发明的转基因或者等位基因的供体植物系杂交从而导致特定的序 列被导入植物系中的技术。为了实现这一点， 例如， 可以进行如下步骤 ： (a) 种植第一 ( 初 始系 ) 和第二 ( 包含需要的转基因或者等位基因的供体植物系 ) 亲本植株的种子 ； (b) 将 第一和第二亲本植株的种子培育成有花的植物 ； (c) 用第二亲本植物的花粉对第一亲本植 物的花授粉 ； 和 (d) 收获具有已受精的花的亲本植物上产生的种子。
可以测试稳定转化的植物组织和植物是否通过 DMO 蛋白质的正确加工提供麦草 畏耐受性。 在农作物植物中提供麦草畏耐受性可以用来设计控制生长环境中的杂草生长的 方法， 包括 ： 向农作物生长环境施用有效控制杂草生长的量的麦草畏除草剂。 麦草畏除草剂 以一定的量自上方向农作物生长环境施用， 所述麦草畏除草剂的量不损伤用 CTP-DMO 构建 体转化的农作物植物或种子， 却损伤具有同样的基因型但是缺乏 CTP-DMO 构建体的农作物 植物。
基于公开的内容， 用于本发明的除草剂组合物的制备对于本领域的技术人员来说 是显而易见的。这样的可商购的组合物除了活性成分外， 典型地还包含如表面活性剂、 固 体或液体载体、 溶剂和粘合剂等组分。可用于向植物施用的表面活性剂的例子包括以下物 质的碱金属盐、 碱土金属盐或铵盐 ： 芳香族磺酸类， 例如， 木素磺酸、 苯酚磺酸、 萘磺酸和二 丁基萘磺酸， 和脂肪酸、 芳基磺酸酯、 烷基醚、 月桂基醚、 脂肪醇硫酸盐和脂肪醇二醇醚硫酸
盐， 磺化萘及其衍生物与甲醛的缩合物、 萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物、 苯酚或苯酚磺 酸与甲醛的缩合物、 苯酚与甲醛和亚硫酸钠的缩合物、 聚氧乙烯辛基苯基醚、 乙氧基化的异 辛基 -、 辛基 - 或壬基苯酚、 三丁基苯基聚二醇醚、 烷基芳基聚醚醇、 异十三烷醇、 乙氧基化 的蓖麻油、 乙氧基化的三芳基苯酚、 磷酸化的三芳基苯酚乙氧基化物的盐、 月桂醇聚二醇醚 乙酸酯、 山梨醇酯、 木质素 - 亚硫酸盐废液或甲基纤维素， 或它们的混合物。表面活性剂应 用的常见实例是大约 0.25 重量％ -1.0 重量％， 更常用地为大约 0.25 重量％ -0.5 重量％。
向植物施用的组合物可以是固体或液体。使用固体组合物时， 可能需要包含一种 或多种载体材料和活性化合物。载体的例子包括矿物土， 如硅石、 硅胶、 硅酸盐、 滑石、 高 岭土、 镁质粘土 (attaclay)、 石灰石 (limestone)、 白垩 (chalk)、 黄土 (loess)、 粘土、 白 云石 (dolomite)、 硅藻土 (diatomaceous earth)、 硫酸钙、 硫酸镁、 氧化镁、 磨碎的合成材 料， 肥料， 如硫酸铵、 磷酸铵、 硝酸铵、 硫脲和脲， 植物来源的产品， 如谷物粗粉、 树皮粗粉、 木 粉和坚果壳粗粉、 纤维素粉、 硅镁土 (attapulgites)、 蒙脱石 (montmorillonites)、 云母 (mica)、 蛭石 (vermiculites)、 合成的二氧化硅和合成的硅酸钙， 或它们的混合物。
对于液体溶液， 可以包含水溶性的化合物或盐， 如硫酸钠、 硫酸钾、 氯化钠、 氯化 钾、 醋酸钠、 硫酸氢铵、 氯化铵、 醋酸铵、 甲酸铵、 草酸铵、 碳酸铵、 碳酸氢铵、 硫代硫酸铵、 二 磷酸氢铵、 磷酸二氢铵、 磷酸氢铵钠、 硫氰酸铵、 氨基磺酸铵或氨基甲酸铵。 除草剂组合物中的其它示例性的成分包括 ： 粘合剂， 如聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙烯 醇、 部分水解的聚醋酸乙烯酯、 羧甲基纤维素、 淀粉、 乙烯吡咯烷酮 / 醋酸乙烯酯共聚物和 聚醋酸乙烯酯或它们的混合物 ； 润滑剂， 如硬脂酸镁、 硬脂酸钠、 滑石或聚乙二醇或它们的 混合物 ； 防泡剂， 如乳化硅油、 长链醇、 磷酸酯、 乙炔二醇、 脂肪酸或有机氟化合物 ； 和螯合 剂， 如： 乙二胺四乙酸 (EDTA) 的盐、 三次氮基三乙酸的盐或聚磷酸的盐或它们的混合物。
可以使用从大约 2.5g/ha 到大约 10,080g/ha 的麦草畏， 包括大约 2.5g/ha- 大约 5,040g/ha、 大约 5g/ha- 大约 2,020g/ha、 大约 10g/a- 大约 820g/h 和大约 50g/ha- 大约 1,000g/ha、 大约 100g/ha- 大约 800g/ha 和大约 250g/ha- 大约 800g/ha。
CTP-DMO 构建体可以连接到包含用于可筛选 / 可评分 / 可选择的标记和 / 或赋予 另一种需要的性状的遗传元件的一个或者多个多核苷酸分子上。 通常用来筛选推测转化的 细胞的基因包括 β- 葡糖醛酸糖苷酶 (GUS)、 β- 半乳糖苷酶、 萤光素酶和氯霉素乙酰转移 酶 (Jefferson， 1987 ； Teeri 等人， 1989 ； Koncz 等人 1987 ； De Block 等人， 1984)、 绿色荧光 蛋白 (GFP)(Chalfie 等人， 1994 ； Haseloff 和 Amos， 1995 ； 和 PCT 申请 WO97/41228)。例如， 在 Miki 和 McHugh， 2004 中描述了选择性标记基因的非限制例子。
赋予另一种需要的性状的核苷酸分子包括， 但不限于 ： 提供需要的与植物形 态、 生理、 生长和发育、 产量、 营养强化、 抗病性或抗虫性、 或环境或化学耐受性有关的特 性的基因， 还可以包括遗传元件， 包括 ： 除草剂抗性 ( 美国专利 6,803,501 ； 6,448,476 ； 6,248,876 ； 6,225,114 ； 6,107,549 ； 5,866,775 ； 5,804,425 ； 5,633,435 ； 5,463,175) 、 增 加 的 产 量 ( 美 国 专 利 RE38,446 ； 6,716,474 ； 6,663,906 ； 6,476,295 ； 6,441,277 ； 6,423,828 ； 6,399,330 ； 6,372,211 ； 6,235,971 ； 6,222,098 ； 5,716,837)、 害虫控制 ( 美国 专 利 6,809,078 ； 6,713,063 ； 6,686,452 ； 6,657,046 ； 6,645,497 ； 6,642,030 ； 6,639,054 ； 6,620,988 ； 6,593,293 ； 6,555,655 ； 6,538,109 ； 6,537,756 ； 6,521,442 ； 6,501,009 ； 6,468,523 ； 6,326,351 ； 6,313,378 ； 6,284,949 ； 6,281,016 ； 6,248,536 ； 6,242,241 ；
6,221,649 ； 6,177,615 ； 6,156,573 ； 6f,153,814 ； 6,110,464 ； 6,093,695 ； 6,063,756 ； 6,063,597 ； 6,023,013 ； 5,959,091 ； 5,942,664 ； 5,942,658,5,880,275 ； 5,763,245 ； 5,763,241)、 真 菌 病 抗 性 ( 美 国 专 利 6,653,280 ； 6,573,361 ； 6,506,962 ； 6,316,407 ； 6,215,048 ； 5,516,671 ； 5,773,696 ； 6,121,436 ； 6,316,407 ； 6,506,962)、病 毒 抗 性 ( 美 国 专 利 6,617,496 ； 6,608,241 ； 6,015,940 ； 6,013,864 ； 5,850,023 ； 5,304,730)、 线虫抗 性 ( 美国专利 6,228,992)、 细菌性疾病抗性 ( 美国专利 5,516,671)、 植物生长发育 ( 美 国专利 6,723,897 ； 6,518,488)、 淀粉生产 ( 美国专利 6,538,181 ； 6,538,179 ； 6,538,178 ； 5,750,876 ； 6,476,295)、 改变的油的生产 ( 美国专利 6,444,876 ； 6,426,447 ； 6,380,462)、 高 油 产 量 ( 美 国 专 利 6,495,739 ； 5,608,149 ； 6,483,008 ； 6,476,295)、 改变的脂肪酸含 量 ( 美 国 专 利 6,828,475 ； 6,822,141 ； 6,770,465 ； 6,706,950 ； 6,660,849 ； 6,596,538 ； 6,589,767 ； 6,537,750 ； 6,489,461 ； 6,459,018)、 高蛋白质产量 ( 美国专利 6,380,466)、 果 实成熟 ( 美国专利 5,512,466)、 加强的动物和人的营养 ( 美国专利 6,723,837 ； 6,653,530 ； 6,541,259 ； 5,985,605 ； 6,171,640)、生 物 聚 合 物 ( 美 国 专 利 RE37,543 ； 6,228,623 ； 5,958,745 和美国专利公开 US20030028917)、 环境应激耐受性 ( 美国专利 6,072,103)、 药 物肽和可分泌的肽 ( 美国专利 6,812,379 ； 6,774,283 ； 6,140,075 ； 6,080,560)、 改进的加 工性状 ( 美国专利 6,476,295)、 提高的可消化性 ( 美国专利 6,531,648)、 低水平的棉子 糖 ( 美国专利 6,166,292)、 工业酶生产 ( 美国专利 5,543,576)、 改进的香味 ( 美国专利 6,011,199)、 固氮 ( 美国专利 5,229,114)、 杂交种子生产 ( 美国专利 5,689,041)、 纤维生 产 ( 美国专利 6,576,818 ； 6,271,443 ； 5,981,834 ； 5,869,720) 和生物燃料生产 ( 美国专利 5,998,700)。 这些或者其它的遗传元件、 方法和转基因中的任一种可以用于本发明， 是本领 域的技术人员基于本公开内容可以理解的。
另外， 一个或者多个连接到 CTP-DMO 构建体上的多核苷酸分子通过编码导致内源 基因表达的靶向抑制 ( 例如经过反义、 抑制性 RNA(RNAi) 或者共抑制介导的机制 ) 的 RNA 分 子， 可以实现上面提到的植物特性或者表型。RNA 也可以是催化性的 RNA 分子 ( 即核酶 )， 设计用来切割需要的内源性 mRNA 产物。因此， 任何编码影响感兴趣的表型或者形态学改变 的转录 RNA 分子的多核苷酸分子可以用于实践本发明。
本发明也公开了生产食物、 饲料或工业产品的方法， 包括包含 CTP-DMO 构建体的 植物或者这种植物的一部分， 以及从植物或者其部分制备食物、 饲料、 纤维或工业产品， 其 中， 食物或饲料是谷物、 粗粉、 油、 淀粉、 面粉或蛋白质， 且工业产品是生物燃料、 纤维、 工业 化学品、 药物或营养品。
本发明的另一方面涉及改进单子叶植物的直立能力的方法， 包括 ： a) 获得并种植 通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂交产生的植物， 其中亲本植株和 / 或第二植株包 含所述 DNA 构建体， 并且耐受麦草畏的植物从所述的亲本植株和 / 或第二植株遗传了该 DNA 构建体 ； 和 b) 用麦草畏处理该植物。可以测量包括支柱根的数量、 形状、 长度或结构、 倒伏 百分比和产量的与直立能力相关的参数。在某些实施方案中， 植物是玉米植物。 实施例
下述这些实施例用来说明本发明的实施方案。本领域的技术人员应该理解 ： 下 面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现的、 在本发明的实践中良好地发挥作用的技术。 然而， 本领域的技术人员根据本发明的公开内容应该理解， 可以对公开的特定的实施方 案进行许多改变， 仍然获得相同或类似的结果， 而没有偏离本发明的概念、 精神和范围。更 具体地说， 显然某些化学和生理学相关的试剂可以代替本文中所述的试剂， 而将获得相同 或相似的结果。所有这些对于本领域技术人员明显的类似的代替和修改， 被认为是在所附 的权利要求书限定的本发明的精神、 范围和概念之内。
实施例 1
用于转化的 CTP-DMO 构建体的制备
按照标准方法 ( 例如 Sambrook 等人， 1989) 制备表 2 中所示的 DNA 构建体， 该 DNA 构建体在植物启动子和多腺苷酸化信号序列之间包含与 DMO 基因或其变体可操作地连接 的 CTP。 如下所述， 在玉米原生质体系统或在稳定转化的拟南芥或者大豆植物中测试这些构 建体。
实施例 2 玉米原生质体中的 CTP-DMO 构建体的分析从 12 天的黄化幼苗 ( 来自 LH200×LH5 杂交 ) 制备玉米叶叶肉原生质体。将第 二叶的中间部分 ( 大约 6cm 长 ) 用刀片切割成 0.5mm 的条， 并且在真空过滤 30 分钟后， 在 烧瓶中用含有 2％ (w/v) 纤维素酶 RS、 0.3％ (w/v) 离析酶 R10( 都来自 Karlan Research Products Corp， SantaRosa， CA)、 0.6M 甘露醇、 10mM MES(pH 5.7) 和 1mM CaCl2 的酶溶液在 23℃消化不超过 2 小时。来自过滤的和消化的叶组织的原生质体通过用手摇动烧瓶 5 分钟 释放， 并通过 60-μm 尼龙网过滤分离。原生质体通过以 150g 离心 2 分钟收集， 用 0.6M 冷 6 甘露醇溶液洗涤一次， 离心， 以 2×10 /mL 再悬浮于冷 0.6M 甘露醇中。然后使用聚乙二醇 (PEG)， 以 12.5μgDNA 转化原生质体， 并在室温下孵育 16-20 小时。
原生质体存储于 -80℃， 直到通过蛋白质印迹法 (western blot) 分析。原生质体 在冰上融化， 并将 1-3 倍体积的含有 5.0％ β-ME 的 2xLaemmli 样品缓冲液 / 染料 (BioRad) 加到原生质体。然后将原生质体蛋白质样本的等分试样加热到大约 100℃保持 5 分钟， 并 加样到预制的 Tris-HCL 10％聚丙烯酰胺凝胶上。在大约 80-100Amps 的恒定电流下电泳 大约 35 分钟。然后将蛋白质在 100V 恒定电压下从凝胶电转移至 0.2 微米的硝酸纤维素 膜上进行 1-3 小时。膜用 TBST 中的 5％ (w/v) 奶粉在室温下封闭 1 小时或者在 4℃下封闭 过夜。用在 TBST 中 1 ∶ 200 稀释的山羊抗 -DMO 抗体探测膜 1 小时。使用 TBS 冲洗 3 次， 每次 5 分钟， 以除去过量的抗体。用在含 0.5％ (w/v) 奶粉的 TBST 中以 1 ∶ 7,500 比例稀 释的过氧化物酶偶联的兔抗山羊 IgG(Sigma， St.Louis， MO) 探测膜 1 小时。用 TBST 冲洗 3 次， 每次 5 分钟， 以除去过量的过氧化物酶偶联物。除了那些特别指出的以外， 所有的程序， 包括封闭和所有的其它孵育， 在室温下进行。使用 ECL 检测系统 (Amersham Biosciences， Piscataway， NJ) 显示免疫活性的条带， 并在 Kodak BioMaxTM MS 胶片上曝光。适当大小的 免疫活性条带的存在表明 DMO 的正确加工和定位 ( 表 1)。 因此， 例如， 使用可操作地连接到 DMO 上并转化到玉米原生质体中的 CTP4 在蛋白质印迹分析后产生 38kDa 的免疫活性条带。
实施例 3
各种 CTP-DMO 构建体在拟南芥中的测试
按照 Clough 和 Bent(1998) 开发的方法， 转化拟南芥哥伦比亚生态型植物。将通 过这种方法获得的种子接种到含有 0.5、 1.0 到 2.0 或 4.0 毫克 / 升的多种浓度麦草畏的植 物选择培养基上。将这些板在 4℃孵育 48 小时， 然后转移到设定为 23.5℃、 具有 16 小时光 周期的 Percival 孵箱中。用 CTP-DMO 构建体转化的种子在含有麦草畏的培养基上生长成 植物， 并长出初生叶和次生叶， 而未转化的种子和阴性分离子 (segregants) 死亡或者没有 长出初生叶和次生叶。通过 PCR 试验检测为 3’ UTR 阳性的转基因植物用于进一 步分析。
来自转基因拟南芥植物的 3-5 个叶穿孔用于蛋白质印迹分析。在 Harbil paint 振摇器中用 500-1000μl PSBT 和 4 个玻璃珠进行蛋白质提取 3 分钟。在 4℃下以 3000rpm 旋转样本 3 分钟。向上清液的等分试样中加入等体积的含有 5.0％ β-ME 的 2x Laemmli 样 品缓冲液 / 染料 (cat.No.161-0737 BioRad)。 蛋白质印迹分析的其余步骤与实施例 2 中一 样。正确大小的免疫活性条带的存在表明 DMO 的正确加工和定位 ( 表 2)。例如， 如表 2 所 示， 在用 pMON73749 或者 pMON73725 转化拟南芥后可见的条带的比较中， 使用缺少来自豌豆 核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶的 27 个氨基酸的编码序列的 RbcSnoc-CTP 产生定位于叶绿 体的正确加工的 DMO， 而使用包含 27 个氨基酸的编码序列的 RbcS CTP 则产生 2 个免疫活性条带。 实施例 4
CTP-DMO 构建体在大豆中的测试
使 用 标 准 程 序 通 过 土 壤 杆 菌 介 导 的 大 豆 转 化 ( 例 如， Zhang 等 人， 1999 ； US 7,002,058) 获得转基因大豆 ( 例如， cvs.Thorne， NE3001 和 A3525) 植物。来自转基因大 豆植物的 3-5 个叶穿孔用于蛋白质印迹分析。在 Harbil paint 振摇器中用 500-1000μl PSBT 和 4 个玻璃珠进行蛋白质提取 3 分钟。在 4℃下以 3000rpm 旋转样本 3 分钟。向上清 液的等分试样中加入等体积的 2x Laemmli 样品缓冲液 / 染料 (BioRad)/5.0％ β-ME。蛋 白质印迹分析的其余步骤与实施例 2 中一样。正确大小的免疫活性条带的存在表明 DMO 的 正确加工和定位 ( 表 2)。
用构建体 ( 其编码连接到附着有核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶编码区的另外 24 个氨基酸和由于引入限制性酶识别位点而添加的 3 个氨基酸的豌豆核酮糖二磷酸羧化 酶 - 加氧酶转运肽上的 DMO) 转化的大豆植物， 当在出土前阶段用 0.51b 的麦草畏处理接着 在出土后 (V6) 阶段用 21b 麦草畏处理时， 显示 17-20％的损伤率。将其与用编码只连接到 豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶转运肽上的 DMO 的构建体转化的大豆植物进行比较， 后 者显示大约 12％的损伤率。 这些结果表明使用没有额外氨基酸的转运肽导致单一 DMO 活性 的产生 ( 而不是多个部分或不同加工的多肽 ) 和对麦草畏的较高的耐受性。单一形式的酶 的产生也导致易于表征产品和降低注册费用。
实施例 5
DMO 的高效生产和较高的麦草畏耐受性需要 CTP
用如实施例 3 所述的几种构建体 ( 图 1) 转化拟南芥哥伦比亚生态型植物。在包 含从 0.5、 1.0 到 2.0 毫克 / 升的各种浓度的麦草畏的植物组织培养基上选择转化的种子。 用 CTP-DMO 构建体转化的种子在含有麦草畏的培养基上生长成植物， 并长出初生叶和次生 叶， 而未转化的种子和阴性分离子死亡或者没有长出初生叶和次生叶。生长并检测为 DMO 基因阳性的转基因植物用于进一步分析。
如图 1 所示， 用不含 CTP 的构建体转化的植物几乎没有或者没有表现出对麦草畏 的耐受性。当在出土前阶段用 0.5lb/a 的麦草畏处理接着在出土后 (V6) 阶段用 2lb/a 的 麦草畏处理时， 用编码没有连接到 CTP 上的 DMO 的 DNA 构建体转化的大豆植物没有显示出 土前耐受性， 而用其中 DMO 连接到 CTP 上的构建体转化的植物显示出土前和出土后对麦草 畏的耐受性。
实施例 6
耐受麦草畏的转基因玉米植物的产生
为了测试 DMO 基因在向单子叶植物提供麦草畏耐受性方面的用途， 在植物基因表 达元件如启动子 ( 例如， PC1SV、 e35S、 OsAct1、 OsTPI、 OsAct15) 和内含子 ( 例如， OsAct1、 OsAct15、 OsTPI、 ZmHSP70) 的控制下， 产生了转基因玉米植物， 其包含 DMO 基因 ( 例如， SEQ ID NOS ： 29、 33、 35、 37、 39)， 具有或者不具有转运肽 ( 例如， TaWaxy、 CTP1、 CTP2 合成、 CTP4)。 该表达元件包含来自水稻肌动蛋白 1 基因的第一内含子和侧翼 UTR 外显子序列， 还在 5’ 端 包含外显子 1 的 12nt 和在 3’ 端包含外显子 2 的 7nt， 还有 3’ UTR( 例如， TaHsp17)。
转基因玉米植物基本上通过美国专利申请 20040244075 所述的方法产生。在单一
位置重复试验中评价具有单一拷贝的转基因玉米事件的麦草畏耐受性。使用来自 6 个构建 体中的每一个的 6 个事件。 实验设计如下 ： 列 / 项目 ： 1； 处理 ： 在 V3 阶段的 0.5lb/a 麦草畏， 接着在 V8 阶段的 1lb/a 麦草畏 ( BASF， Raleigh， NC) ； 重复 ： 2； 行距 ： 30 英寸 ； 地 决长度 ： 最小 20 英尺 ； 植物密度 ： 大约 30 株 /17.5 英尺 ； 通道 (alley) ： 2.5 英尺。 整个地块 均匀施肥以获得农艺学上可接受的农作物。为了控制玉米根虫， 在耕种时期施用每排 1000 3G(Syngenta Crop Protection， Greensboro， NC， USA)。 英尺 5 盎司土壤杀虫剂， 如 如果观察到小地老虎 (black cutworm) 的侵扰， 以每英亩 4-8 盎司的量施用 3.2EC(FMC Corporation， Philadelphia， PA)。此外， 使用喷洒杀虫剂计划以控制所有地上 的鳞翅目害虫， 包括欧洲玉米螟、 玉米耳虫和秋季粘虫。每 3 周以每英亩 4-8 盎司的量施 用 3.2EC 以控制鳞翅目害虫 ； 大约施用 4 次。出土前施用如 Xtra 5.6L(Monsanto， St.Louis， MO) 和 Degree (Monsanto， St.Louis， MO) 的除草剂， 以 保持地块无杂草。在整个实验中， 如果在未处理的检查中观察到杂草出现， 则通过手工除 草或者出土后施用 PERMIT(Monsanto， St.Louis， MO) 或者 (Bayer， Research Triangle Park， NC) 控制杂草。
当在 V3 阶段用 0.5lb/a 麦草畏处理接着在 V8 阶段用 1lb/a 麦草畏处理时， 通过 测量支柱根损伤来测试用包含 DMO 转基因的 DNA 构建体转化的玉米近交系的麦草畏耐受 性。通过计数一排中与 “手指样” 结构的典型形态相比显示支柱根融合的 “非典型” 形态的 植物的数量， 目视评价支柱根损伤。如表 4 所示， 用编码未与 CTP 连接的 DMO 的 DNA 构建体 (pMON73699、 pMON73704) 转化的玉米植物显示较高水平的支柱根损伤， 即， 麦草畏处理后的 低水平保护。编码连接到 CTP 上的 DMO 的 DNA 构建体 (pMON73716、 pMON73700、 pMON73715、 pMON73703) 显示较低水平的支柱根损伤， 即， 麦草畏处理后较高水平的保护。 表 4. 用携带 DMO 的 DNA 构建体转化的转基因玉米在测试麦草畏耐受性时显示出 的支柱根损伤百分比。
近交 / 构建体 01CSI6 LH244 pMON73699 pMON73704 pMON73716 pMON73700 pMON73715 pMON73703 详情 对麦草畏敏感的近交系 对麦草畏耐受的近交系 PC1SV/I-OsAct1/DMO-Wmc/TaHsp17 e35S/I-OsAct1/DMO-Wmc/TaHsp17 PC1SV/I-OsAct1/TaWaxy/DMO-Wmc/TaHsp17 PC1SV/I-OsAct1/CTP1/DMO-Wmc/TaHsp17 PC1SV/I-OsAct1/CTP2syn/DMO-Wmc/TaHsp17 e35S/I-OsAct1/CTP1/DMO-Wmc/TaHsp17 支柱根损伤 95.4 93.8 93.2 91.3 78.8 74.4 68.2 68.8从在不同的植物物种中进行的这些研究 ( 另外， 例如， 实施例 3、 4 和 8) 可见， 叶绿 体转运肽可用于 DMO 的高效靶向和 DMO 活性的完全产生， 导致对麦草畏较高的耐受性。此 外， 在玉米中 CTP-DMO 的表达提供了对麦草畏的出土前耐受性。
实施例 7
有效 DMO 表达单元的构建
一些遗传元件可以影响基因的有效表达， 如启动子、 叶绿体转运肽序列、 内含子、 5’ UTR、 基因的编码区、 3’ UTR。 然而， 不清楚哪些组合运行最好。 需要有效的 DMO 表达单元或 者构建体来产生改进的产物如耐受麦草畏的种子和植物。通过可操作地连接各种启动子、 CTP、 DMO 变体和 3’ UTR 中的各一种来构建几个 DMO 表达单元， 以获得用于产品开发的有效的 DMO 表达单元。 通过本领域已知的方法将这些构建体转化到大豆中 ( 例如， U.S.6,384,301、 U.S.7,002,058 或 Zhang 等人， 1999)。 获得转基因种子， 并检测出土前和出土后对麦草畏除 草剂的耐受性。 表 5 显示了当种子和植物在出土前用 0.5lb/ 英亩麦草畏处理接着在出土后 V6 阶段用 2lb/ 英亩的麦草畏处理时， 由麦草畏造成的损伤百分比 ( 较低的损伤意味着较 高的耐受性 )。用不携带 CTP 的 DNA 构建体 pMON68939 和 pMON73723 转化的种子不能耐受 麦草畏的出土前施用， 表明为了获得对麦草畏的出土前耐受性， 需要将 DMO 靶向至叶绿体。 用 pMON68939 和 pMON73723( 不含 CTP) 转化的植物， 在 V3 后阶段用麦草畏以 1lb/a 的量处 理后， 分别显示类似于野生型大豆 (60％ ) 的 55％和 57％的损伤率， 而用 pMON68938( 含有 CTP) 转化的植物显示很低的损伤率。这些结果表明， 在大豆中获得对麦草畏的出土前和出 土后耐受性需要 CTP。
表 5. 用特异性 DMO 表达单元转化并在出土前和出土后用麦草畏处理的大豆植物 显示的损伤百分比。
表达单元 PC1SV/CTP2syn/DMO-Wat(A)/nos e35S/CTP1/DMO-Wat(L)/nos PC1SV/RbcSnoc/DMO-Wat(A)/nos PC1SV/RbcSnoc/DMO-Wat(L)/nos PCSV/CTP1/DMO-Wat(A)/nos PC1SV/CTP2syn/DMO-Wat(L)/nos ANT1/CTP1/DMO-Wat(L)/nos PC1SV/RbcSnoc/DMO-Wat(A)/nos PC1SV/RbcS-CTP/DMO-Cnat(A)/nos pMON 名称 73724 68938 73725 73728 73729 73727 68945 73730 68934 ％损伤 9 12 12 12 13 13 14 15 1723102321632 A CN 102321639 Act7/CTP1/DMO-Wat(L)/nos说明书68942 68940 84254 68941 68943 68937 68946 68939 73723 17 17 20 29 60 62 73 100( 前 ) 100( 前 )22/28 页FMV.35S-EF1a/CTP1/DMO-Wat(L)/nos PC1SV/RbcS-CTP/DMO-Cnat(A)/E9 FMV/CTP1/DMO-Wat(L)/nos eIF4A10/CTP1/DMO-Wat(L)/nos e35S/CTP1/DMO-Cat(A)/nos e35S/CTP1/DMO-Cnat(L)/nos e35S/DMO-Wat(A)/nos PC1SV/DMO-Wat(A)/nos
实施例 8
耐受麦草畏的转基因棉花植物的产生
为了测试 DMO 基因在给棉花提供麦草畏耐受性方面的用途， 产生转基因棉花植 物。产生了几个 DNA 构建体， 它们携带在植物基因表达元件如启动子 ( 例如， PC1SV、 FMV 或 e35S) 和 3’ UTR( 例如， E6 ； 登记号 #U30508) 控制下的具有转运肽 ( 例如， PsRbcS CTP、 CTP1、 CTP2) 的 DMO 编码区 ( 例如， SEQ ID NO ： 23、 25、 27、 29、 31、 35)， 并如下所述转化到棉 花 ( 陆地棉 (Gossypium hirsutum)) 中。所用的培养基在表 6 中列出。
棉花 cv Coker130 的幼苗离体生长， 并切下胚轴部分， 并接种于携带 DNA 构建体的 根癌土壤杆菌的液体悬浮液， 印迹干燥 (blot dried)， 并共培养 2 天。 然后将接种的胚轴外 植体转移到葡萄糖选择培养基中 4 周， 蔗糖选择培养基中 1 周， 葡萄糖选择培养基中再培养 4 周， 来诱导愈伤组织。在 16/8( 光 / 暗 ) 循环和 28℃下孵育培养物。然后将卡那霉素抗 性愈伤组织转移到 UMO 培养基中， 并在 28-30℃、 黑暗条件下培养 16-24 周来诱导生胚愈伤 组织。然后从这些愈伤组织中收获生胚愈伤组织， 并在 28-30℃、 黑暗条件下、 在 TRP+ 培养 基上维持长达 4-16 周。收获来自生胚愈伤组织的小胚， 并在 SHSU 培养基上、 在 28-30℃温 度下和 6/8( 光 / 暗 ) 循环条件下发芽。然后将看起来正常的小植株转移到土壤中以获得 成熟的棉花植物。转化株的转基因性质通过 DNA 检测来证实。
表 6. 用于棉花转化的各种培养基的组成。
在 V4-5 生 长 阶 段 以 561g ae/ha(0.5lb/a) 的 量 用 麦 草 畏 (BASF，Raleigh， NC) 处理包含这样的 DNA 构建体的转化的棉花植物作为出土后处理， 每个 DNA 构 建体包含 DMO 编码区与转运肽、 启动子和 3’ UTR 的不同的组合， 发现有耐受性， 而未转化的 棉花植物显示 79％ -86％的损伤率。选择显示超过 95％的耐受性 ( 等于少于 5％的损伤 ) 的转基因植物用于进一步研究。转基因植物也对随后的麦草畏出土后处理具有耐受性。例 如， 在 V3-4 阶段用 0.5lb/ 英亩的麦草畏处理随后在 V5 阶段或者更晚的阶段用 1 或 2lb/ 英亩的麦草畏处理的植物依然对麦草畏耐受。该实施例显示 DMO 基因可以向各个生长阶段 的棉花提供麦草畏耐受性， 因而能够在各个阶段施用麦草畏以获得有效的杂草控制。 实施例 9
提高玉米直立能力的方法
如玉米的某些单子叶植物产生支柱根， 支柱根从地表以上的节点生长， 并有助于 支撑植物和在生殖阶段从土壤上层吸收水分和营养。如果植物遇到大风或者由于根线虫 感染或者地下水缺乏使得地下根系统变得较弱时， 健康的支柱根系统变得重要。为了控制 阔叶杂草， 允许对如玉米的单子叶植物使用如麦草畏和 2， 4-D 的合成除草剂。对于玉米的 出土后杂草控制， 麦草畏是第五广泛施用的除草剂。尽管用于控制阔叶杂草的最优量是 280-560 克 / 公顷 (g/h) 或者 0.25-0.5lb/ 英亩， 但是玉米中的平均使用量是 168g/h 或者
0.15lb/ 英亩， 因为在更高的施用量和如热天的某些环境条件下， 麦草畏能够损伤玉米。此 外， 几种玉米杂交体， 如 DKC61-42、 DKC64-77、 DKC6346、 DKC66-21 和 DKC61-44， 以及近交体， 如 01CSI6、 16IUL2、 70LDL5 和 90LCL6， 对麦草畏施用敏感。敏感性以多种方式表现， 如出现 洋葱剥离 (onion leafing)、 穗畸形、 株高降低或者不正常的支柱根的形成， 例如融合或者 扭曲的根的形成。支柱根变得多瘤节， 趋向于成长在一起， 并且不向土壤中生长来支撑植 物。 这可能导致较弱的玉米作物直立能力、 较高的易倒伏性和最终的产量损失。 一些含有麦 草畏的除草剂产品， 例如 BANVEL、 MARKSMAN、 DISTINCT、 NORTHSTAR 和 CELEBRITY PLUS， 可以导致这些效应。提高玉米对麦草畏的耐受性在保护较接近耐受麦草畏的农作物 种类 ( 如大豆、 棉花 ) 种植的玉米地也是有用的， 而且其中允许更高的麦草畏施用量。
本实施例提供了一种改进玉米和其它单子叶植物的直立能力的方法， 包括在玉米 中引入 DMO 基因并用麦草畏处理玉米。在一个实施方案中， DMO 基因在组成型启动子的控 制下表达， 所述组成型启动子也能够在节点区域和 / 或支柱根中表达 DMO。 在另一个实施方 案中， DMO 基因在一种嵌合组成型和节点 / 支柱根特异性启动子的控制下表达。在另一个 实施方案中， DMO 基因在根特异性启动子如 RCc3 或者其变体 ( 例如， 在 US20060101541 中 发现的 SEQ ID NOs ： 1-6) 的控制下表达。DMO 在支柱根中的表达导致支柱根没有或者有较 少的损伤， 导致玉米的较高的直立能力、 较少的倒伏， 因而导致较高的产量。 来自用各种 DMO 构建体 ( 在表 7 中列出 ) 转化的玉米植物的 3 个单拷贝事件的 R1 或者 F1 种子在 4.0”托盘中发芽。将健康植物移植到大约 10”的罐中。发芽和生长 培养基包括 Redi-earthTM(Scotts-Sierra Horticultural Products Co.， Marysville， Ohio)。将罐放在 35 英寸 ×60 英寸的玻璃纤维浇水托盘中的毛细管垫上， 用于在测试期间 进行亚浇灌， 从而保持对于植物生长而言最佳的土壤含水量。用 Osmocote(14-14-14 缓释 ； Scotts-Sierra Horticultural Products Co.， Marysville， Ohio) 以 100gm/cu.ft. 的量 对罐施肥， 以在温室试验期间维持植物生长。植物在 29℃ /21℃的昼 / 夜温度、 25％ -75％ 的相对湿度的温室中生长， 以模拟晚春温暖季节的生长条件。按照需要， 为最少 14 小时的 光照周期提供大约 600μE 的补充光。
使 用 具 有 设 定 为 最 小 24psi(165kpa) 的 大 气 压 的 Teejet 9501E 平 扇 喷 嘴 (Spraying Systems Co， Wheaton， IL)， 用轨道喷雾器来施用麦草畏。喷嘴保持在比植物顶 端高大约 16 英寸的位置进行喷雾。喷雾体积是 10 加仑 / 英亩或者 93 升 / 公顷。当植物 达到 V4-5 叶阶段时， 开始施用。
通过在 V4-5 阶段用 2lb/ 英亩或者 4lb/ 英亩的麦草畏处理， 并在处理后 24 天评估 植物的支柱根损伤 (0％ ； 没有可见的损伤， 到 100％， 植物完全死亡 ) 和倒伏 ( 倾斜程度 )， 来检测用包含 DMO 表达单元的 DNA 构建体转化的玉米近交系的植物的支柱根损伤和倒伏情 况。
如表 7 所示， 与未被转化的对照近交系和只用选择性标记表达单元 (pMON73746) 转化的植物相比较， 用含有 DMO 表达单元的 DNA 构建体转化的玉米植物显示没有或者几乎 没有支柱根损伤和倒伏。本实施例显示当用麦草畏处理时， 包含 DMO 的植物可以被用来提 供提高的直立能力。
表 7. 当用麦草畏处理时， 用各种 DMO 构建体转化的玉米植物显示没有或者几乎没 有支柱根损伤和倒伏。
参考文献
以下列出的文献引入本文作为参考， 以补充、 解释、 提供背景或教导本文采用的方 法、 技术和 / 或组合物。
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本发明的一方面涉及一种重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加 氧酶的核苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 其中， 该核苷酸序列编码包括选 自 SEQ ID NOs ： 1-11 的序列的叶绿体转运肽。在某些实施方案中， 重组 DNA 分子包括选自 SEQ ID NOs ： 12-22 的核苷酸序列。在某些实施方案中， 重组 DNA 分子包括编码选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。包括与在植物细 胞中具有功能的启动子可操作地连接的 DNA 分子的 DNA 构建体也是本发明的一方面。
另一方面， 本发明包括用 DNA 分子转化的植物细胞， 所述 DNA 分子包括可操作地连 接到编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 其中， 叶绿 体转运肽序列选自 SEQ ID NOs ： 1-11。在某些实施方案中， 重组 DNA 分子包括选自 SEQ ID NOs ： 12-22 的核苷酸序列。在某些实施方案中， DNA 分子包括编码选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列， 其中， DNA 分子可操作地连接到 在植物细胞中具有功能的启动子上。在特定的实施方案中， DNA 分子包括选自 SEQ ID NOs ： 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37 和 39 的核苷酸序列。
在某些实施方案中， 植物细胞是双子叶植物细胞。 在其它实施方案中， 植物细胞是 单子叶植物细胞。 在特定的实施方案中， 植物细胞是大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽植物细胞。 本发明也涉及包括这样的细胞的植物组织培养物， 涉及包括这样的细胞的转基因种子和转 基因植物。 在某些实施方案中， 转基因种子或者植物是双子叶种子或植物。 在其它实施方案 中， 转基因种子或者植物是单子叶种子或者植物。转基因种子或者植物可以是大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽种子或者植物。
本发明进一步涉及产生耐受麦草畏的植物的方法， 包括 ： 将重组 DNA 分子引入植 物细胞中， 并由其再生植物， 所述 DNA 分子包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的核 苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的序列选自 SEQ ID NOs ： 12-22。 在某些实施方案中， 重组 DNA 分子包含编码选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。DNA 分子可以可操作地连接到在植物 细胞中具有功能的启动子上。 该方法可以进一步包括通过将亲本植株与它自身或者第二植 株杂交产生耐受麦草畏的植物， 其中亲本植株和 / 或第二植株包括所述 DNA 构建体， 并且耐 受麦草畏的植物从所述的亲本植株和 / 或第二植株遗传了该 DNA 构建体。
一种在植物细胞中表达麦草畏单加氧酶的方法是本发明的进一步的方面， 该方法 包括将选择的 CTP 可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的序列上。
另一方面， 本发明涉及一种在农作物生长环境中控制杂草生长的方法， 包括 ： 种植 这样的植物或其种子， 并向农作物生长环境施用有效控制杂草生长的量的麦草畏除草剂。 麦草畏除草剂可以自上方向农作物生长环境施用， 由此麦草畏除草剂的量不损伤所述的植 物或其种子， 却损伤与该植物或其种子基因型相同但是缺乏构建体的植物或者种子。
本发明的进一步的方面涉及生产食物、 饲料或者工业产品的方法， 包括 ：
a) 获得植物， 该植物包括按照 5’ 到 3’ 的方向可操作地连接到编码叶绿体转运肽 的核苷酸序列和编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列或其部分上的编码在植物细胞中具有 功能的启动子的核苷酸序列 ； b) 从所述植物或其部分制备食物、 饲料、 纤维或者工业产品。
在该方法的某些实施方案中， 食物或者饲料是谷物、 粗粉、 油、 淀粉、 面粉或者蛋白质。 在该方法的其它的实施方案中， 工业产品是生物燃料、 纤维、 工业化学品、 药物或者营养 品。
针对出土前 (pre emergence) 施用麦草畏提供保护的、 包括可操作地连接到编码 麦草畏单加氧酶的 DNA 上的编码叶绿体转运肽的 DNA 的耐受麦草畏的种子， 是本发明的进 一步的方面。 在某些实施方案中， 耐受麦草畏的种子包括编码叶绿体转运肽的核苷酸序列， 例如选自 SEQ ID NOs ： 12-22 的核苷酸序列。耐受麦草畏的种子可以进一步包括编码选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。
本发明的另一方面涉及提高单子叶植物的直立能力 (standability) 的方法， 包 括： a) 获得并培育通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂交产生的植物， 其中该亲本植 株和 / 或第二植株包含所述 DNA 构建体并且耐受麦草畏的植物从所述的亲本植株和 / 或第 二植株遗传了该 DNA 构建体 ； b) 用麦草畏处理植物。在某些实施方案中， 植物是玉米植物。 在其它的实施方式中， 可以测量包括支柱根的形状、 数量、 长度和 / 或结构、 倒伏百分比和 产量的与直立能力相关的参数。
本发明提供以下实施方案 ：
1. 一种重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列 上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列编码选自 SEQ ID NOs ： 1-11 的序列。
2. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其中， 所述编码叶绿体转运肽的 DNA 序列包括选 自 SEQ ID NOs ： 12-22 的序列。
3. 一种重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列 上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列编码选自拟南 芥 5- 烯醇丙酮酰莽草酸 -3- 磷酸合酶 CTP2 叶绿体转运肽序列和豌豆核酮糖二磷酸羧化 酶 - 加氧酶小亚基叶绿体转运肽序列的序列。
4. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列编码选自 SEQ ID NOs ： 2-7 的序列。
5. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列编码选自 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 4 和 SEQ ID NO ： 5 的序列。
6. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列包括选自 SEQ ID NOs ： 13-18 的序列。
7. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列上的编码叶绿体转运肽的 DNA 序列， 其中， 编码叶绿体转运肽的 DNA 序列包括选自 SEQ ID NOs ： 13、 15 和 16 的序列。
8. 如第 1 项所述的重组 DNA 分子， 其中， 所述编码麦草畏单加氧酶的 DNA 序列编码 选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的多肽。
9. 如第 8 项所述的重组 DNA 分子， 其中， 所述 DNA 序列选自 SEQ ID NOs ： 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37 和 39。10. 一种 DNA 构建体， 其包括与启动子可操作地连接的如第 1 项所述的 DNA 分子。
11. 如第 5 项所述的 DNA 构建体， 其中， 所述启动子选自 FMV35S 启动子、 At.ANT1 启动子、 FMV.35S-EF1a 启动子、 eIF4A10 启动子、 AGRtu.nos 启动子、 水稻胞质磷酸丙糖异构 酶 (OsTPI) 启动子、 水稻肌动蛋白 15 基因 (OsAct15) 启动子和 γ- 薏苡醇溶蛋白启动子。
12. 如第 10 项所述的构建体， 其中， 所述启动子在植物细胞中是具有功能的。
13. 用第 10 项所述的 DNA 构建体转化的植物细胞。
14. 如第 13 项所述的细胞， 其中， 所述植物细胞是双子叶植物细胞。
15. 如第 13 项所述的细胞， 其中， 所述植物细胞是单子叶植物细胞。
16. 如第 13 项所述的细胞， 其中， 所述植物细胞是大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽植 物细胞。
17. 一种植物组织培养物， 其包含第 13 项所述的细胞。
18. 如第 17 项所述的植物组织培养物， 其包含双子叶植物细胞。
19. 如第 17 项所述的植物组织培养物， 其包含单子叶植物细胞。
20. 如第 17 项所述的植物组织培养物， 其包含大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽植物细 胞。
21. 用第 10 项所述的 DNA 构建体转化的转基因植物。 22. 如第 21 项所述的转基因植物， 其中， 所述植物是双子叶植物。 23. 如第 21 项所述的转基因植物， 其中， 所述植物是单子叶植物。 24. 如第 21 项所述的转基因植物， 其中， 所述植物是大豆、 棉花、 玉米或者油菜籽植物。 25. 一种产生耐受麦草畏的植物的方法， 包括将第 10 项所述的构建体引入植物细 胞中， 并由其再生包含第 10 项所述的构建体的植物。
26. 如第 25 项所述的方法， 进一步包括通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂 交产生耐受麦草畏的植物， 其中， 所述亲本植株和 / 或第二植株包含 DNA 构建体， 并且耐受 麦草畏的植物从所述的亲本植株和 / 或第二植株遗传了 DNA 构建体。
27. 一种在植物细胞中表达麦草畏单加氧酶的方法， 包括将选择的 CTP 可操作地 连接到编码麦草畏单加氧酶的序列上。
28. 一种在农作物生长环境中控制杂草生长的方法， 包括第 20 项所述的植物或其 种子， 并向农作物生长环境施用有效控制杂草生长的量的麦草畏除草剂。
29. 如第 28 项所述的方法， 其中， 所述麦草畏除草剂自上方向农作物生长环境施 用。
30. 如第 28 项所述的方法， 其中， 所述麦草畏除草剂的量不损伤第 21 项所述的植 物或其种子， 却损伤与第 20 项所述的植物的基因型相同但是缺乏第 10 项所述的构建体的 植物。
31. 一种生产食物、 饲料或者工业产品的方法， 包括 ：
a) 获得第 21 项所述的植物或其部分 ； 和
b) 从该植物或者其部分制备食物、 饲料、 纤维或者工业产品。
32. 如第 31 项所述的方法， 其中， 所述食物或者饲料是谷物、 粗粉、 油、 淀粉、 面粉 或者蛋白质。
33. 如第 31 项所述的方法， 其中， 所述工业产品是生物燃料、 纤维、 工业化学品、 药 物或者营养品。
34. 一种针对出土前施用麦草畏提供保护的耐受麦草畏的种子， 其包含可操作地 连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 上的编码叶绿体转运肽的 DNA。
35. 如第 34 项所述的耐受麦草畏的种子， 其中， 所述 DNA 编码选自 SEQ ID NOs ： 1-11 的叶绿体转运肽。
36. 如第 35 项所述的耐受麦草畏的种子， 其中， 所述编码叶绿体转运肽的 DNA 包含 选自 SEQ ID NOs ： 12-22 的序列。
37. 如第 34 项所述的耐受麦草畏的种子， 其中， 所述 DNA 编码包含选自 SEQ ID NOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 的序列的麦草畏单加氧酶。
38. 一种提高单子叶植物的直立能力的方法， 包括 ： a) 培育通过第 26 项所述的方 法产生的植物或种子 ； 和 b) 用麦草畏处理该植物或种子。
39. 如第 38 项所述的方法， 进一步包括 ： c) 测量选自支柱根的数量、 形状、 长度或 结构、 倒伏百分比和产量的与直立能力相关的参数。
附图简述 图1： CTP-DMO 构建体在 DMO 的正确加工和提供麦草畏耐受性中的应用。
发明详述
根据本发明， 提供了用于在植物细胞中更有效地表达和向叶绿体转运麦草畏单加 氧酶 (DMO) 多肽的组合物和方法。因此本发明的组合物和方法在增强植物和细胞对除草剂 麦草畏的耐受性方面有用。尤其通过用叶绿体转运肽 (CTP) 将 DMO 靶向至叶绿体， 可以实 现提高的 DMO 表达和对麦草畏的耐受性。
然而， 令人惊奇的是， 本发明人已经发现某些 CTP 与 DMO 组合不能很好地发挥功 能。例如， 一些 CTP 不能导致足够的蛋白质表达。这包括蛋白质的不正确表达， 以及改变大 小的蛋白质的产生和不完全的体内活性。 这会导致不完全的除草剂耐受性并且使注册审批 变得复杂。 本发明提供 CTP， 当该 CTP 与 DMO 联合使用时， 提供意想不到的益处， 包括但不限 于： 提高的转运至叶绿体的水平、 在表达 DMO 的转基因植物中增强的除草剂耐受性、 正确大 小的蛋白质表达的理想水平和适当的翻译后修饰。当与 DMO 组合后提供意想不到的益处的 CTP 的一个例子是转运肽 CTP2， 包括 SEQ ID NO ： 4 或 5 的核酸， 并且包括编码 SEQ ID NOs ： 15 和 16 的序列。在其它实施方案中， 使用豌豆 (Pisum sativum) 核酮糖二磷酸羧化酶 - 加 氧酶小亚基 CTP 编码序列， 例如由 SEQ ID NO ： 2 所代表的或者编码 SEQ ID NO ： 13。因此， 包括可操作地连接到 CTP2 和 / 或豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚基 CTP 转运肽编 码序列上的 DMO 编码序列的 DNA 构建体构成本发明的一个方面， 由其编码的蛋白质也构成 本发明的一个方面。
嗜 麦 芽 假 单 胞 菌 (Pseudomonas maltophilia) 菌 株 DI6 的 麦 草 畏 单 加 氧 酶 (Herman 等人， 2005 ； 美国专利公开 20030115626 ； GenBank 登记 AY786443， 本文引入其编码 DMO 的序列作为参考 ) 催化除草剂麦草畏的解毒。DMO 是用于将麦草畏解毒成无毒的 3， 6- 二氯水杨酸 (3， 6-DCSA) 的三组分体系中的一部分， 且如上所述需要还原酶和铁氧还蛋 白功能来转移电子。由于参与电子转移的内源性植物铁氧还蛋白定位于质体中， 为了获得 DMO 的有效活性和例如在双子叶植物中的麦草畏耐受性或者例如在单子叶植物中增强的麦
草畏耐受性， 优选 DMO 靶向至质体 ( 例如叶绿体 )。
测试叶绿体转运肽 (CTP) 在将 DMO 靶向至质体和 DMO 加工中的效率。与这些 CTP 有关的 DMO 的质体定位和加工从没有或部分到完全不等。发现只有一些 CTP 允许将 DMO 完 全加工成正确的大小。因此， 基于它的蛋白质或者核苷酸序列， 任意给定的 CTP 提供完全和 有效的 DMO 加工的能力是难以预料和出人意料的。
此外， 也已经在拟南芥中发现， 在没有合适的 CTP 的情况下， 几乎没有或者没有 DMO 的表达与几乎没有或者没有麦草畏耐受性相关。这表明叶绿体靶向对于麦草畏的解毒 进而对于耐受性是重要的。允许有效加工 DMO 的 CTP 在将 DMO 靶向至农作物的质体例如叶 绿体方面是有用的， 因此提供以下优势 ： 完全的 DMO 活性和对麦草畏的较高的耐受性， 以及 易于表征产品和降低注册费用。
包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的 DNA 上的编码叶绿体转运肽的 DNA 的 嵌合 DNA 分子可以通过本领域技术人员熟知的分子生物学方法制备 ( 例如， Sambrook 等人， 1989)。本发明提供了可操作地连接到已知的编码 DMO( 包括表 1 中列出的那些 ) 的 DNA 分 子上的 CTP， 用于提高植物中 DMO 的表达。
来自在细胞核中编码的任何基因并且其产物可将多肽靶向至叶绿体的叶绿体转 运肽， 可以进行 DMO 有效表达的检测。 可以分离或者合成叶绿体转运肽序列。 为了在双子叶 植物、 单子叶植物或者这两者中表达， 可以优化编码 CTP 的核苷酸序列。通过将每一个可操 作地连接到 DMO 编码序列上， 测试下面的转运肽 ： PsRbcS- 衍生的 CTPs(SEQ ID NO ： 1和2： 豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚基 CTP ； Coruzzi 等人， 1984) ； AtRbcS CTP (SEQ ID NO ： 3： 拟南芥核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶小亚基 1A CTP ； CTP1 ； 美国专利 5,728,925) ； AtShkG CTP(SEQ ID NO ： 4： 拟南芥 5- 烯醇丙酮酰莽草酸 -3- 磷酸合酶 (EPSPS) ； CTP2 ； Klee 等人， 1987) ； AtShkGZm CTP(SEQ ID NO ： 5： CTP2 合成的 ； 为单子叶植物表达进行密码子优 化； WO04009761 的 SEQ ID NO ： 14) ； PhShkG CTP(SEQ ID NO ： 6： 矮牵牛 (Petunia hybrida) EPSPS ； CTP4 ； 为单子叶植物表达进行密码子优化 ； Gasser 等人， 1988) ； TaWaxy CTP(SEQ ID NO ： 7： 小麦 (Triticum aestivum) 结合颗粒的淀粉合酶 CTP 合成的， 为玉米表达进行密码子 优化 ： Clark 等人， 1991) ： OsWaxy CTP(SEQ ID NO ： 8： 水稻 (Oryza sativa) 淀粉合酶 CTP ； Okagaki， 1992) ； NtRbcS CTP(SEQ ID NO ： 9： 烟草 (Nicotiana tabacum) 核酮糖 1， 5- 二磷 酸羧化酶小亚基叶绿体转运肽 ； Mazur， 等人， 1985) ； ZmAS CTP(SEQ ID NO ： 10 ： 玉米 (Zea mays) 邻氨基苯甲酸合酶 α2 亚单位基因 CTP ； Gardiner 等人， 2004) ； 和 RgASCTP(SEQ ID NO ： 11 ： 芸香 (Ruta graveolens) 邻氨基苯甲酸合酶 CTP ； Bohlmann， 等人， 1995)。编码 SEQ ID NO ： 1-SEQ ID NO ： 11 的核苷酸序列分别在 SEQ ID NO ： 12-SEQ ID NO ： 22 中给出。
可能有用的其它转运肽包括玉米 cab-m7 信号序列 (Becker 等人， 1992 ； PCT WO 97/41228) 和豌豆 (Pisum sativum) 谷胱甘肽还原酶信号序列 (Creissen 等人， 1995 ； PCT WO 97/41228)。具有来自于基因编码区的额外氨基酸的 CTP( 所述氨基酸是该基因编码区 的一部分或与它融合 )， 例如 AtRbcS CTP( 其包含转运肽， 成熟核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧 酶蛋白的 24 个氨基酸， 然后是转运肽的最后 6 个氨基酸的重复 )， 可以被用来产生 DMO。 ZmAS CTP7 也包含来自于基因编码区的额外 18 个氨基酸。其它 CTP 也可以用来产生 DMO， 它们具 有来自于基因编码区的额外的氨基酸 ( 例如 27 个氨基酸 )( 所述氨基酸是该基因编码区的 一部分 )， 例如 PsRbcS CTP， 紧接着是通过克隆方法引入的氨基酸 ( 例如 3 个氨基酸 )。具有较少的编码全长 CTP 的氨基酸 ( 例如 21 个氨基酸 ) 的 CTP， 例如 RgAs CTP， 也可以被用来 产生 DMO。优选地， 使用编码全长 CTP 的核苷酸序列。可以包括一个或者多个核苷酸添加或 者缺失， 以便于 CTP 的克隆。这些添加或者缺失可以在其它表达元件和编码区的前面或者 后面， 导致一个或者多个编码氨基酸的修饰， 例如在限制性酶识别位点处或者位于其附近。
在一个实施方案中， 本发明涉及编码叶绿体转运肽的核酸序列， 该叶绿体转运肽 与 SEQ ID NOs ： 1-11 中的任意一个或者多个多肽序列至少具有 70％的同一性， 包括与这些 序列有至少大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％、 99％或者更高的序列同一性， 包 括 100％的同一性。 在特定的实施方案中， 所述核酸序列编码与 SEQ ID NOs ： 1-11 中的一个 相同的叶绿体转运肽。在另一个实施方案中， 编码 CTP 的核酸序列与 SEQ ID NOs ： 12-22 中 的任意一个或者多个核酸序列具有至少 70％的序列同一性， 包括与这些序列中的一个或者 多个至少有大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％、 99％或者更大的序列同一性， 包 括 100％的同一性。这些序列和本文所述的任意其它序列的多肽或者多核苷酸比较和同一 性的确定可以如本领域公知的那样进行， 例如， 使用 MEGAlign(DNAStar， Inc.， 1228S.Park St.， Madison， WI)， 采用缺省参数。这样的软件通过确定相似性或者同一性的程度， 匹配相 似的序列。
通过使用前序列可以将 DMO 靶向至其它细胞器例如线粒体， 以利用存在于该细胞 器中的铁氧还蛋白氧化还原系统。或者， 通过双靶向肽可以将 DMO 靶向至叶绿体和线粒体 两者， 以利用两个铁氧还蛋白氧化还原系统， 使工作更加有效。 这样的元件是本领域的技术 人员已知的。例如， 线粒体前序列在 Silva Filho 等人， (1996) 中有描述。编码双靶向肽序 列的核酸序列可以从编码下述已知能被靶向至叶绿体和线粒体两者的蛋白质的核苷酸序 列中被鉴定出来 ： Zn-MP(Moberg 等人， 2003)、 谷胱甘肽还原酶 (Rudhe 等人， 2002 ； Creissen 等人， 1995) 和组氨酰 -tRNA 合成酶 (Akashi 等人， 1998)。例如， 如表 1 所示， 在编码 SEQ IDNOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40 多肽的序列中， 发现可以用于这方面的 DMO 编码序列 的例子。
表 1. 使用的 DMO 和 DMO 变体。
在某些实施方案中， 编码麦草畏单加氧酶的核酸与编码 SEQ IDNOs ： 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38 和 40 中任意一个多肽的序列具有至少 70％的同一性， 包括与这些序列具有 至少大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％、 99％和更高的序列同一性。在某些实施 方案中， 核酸与 SEQ ID NOs ： 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37 或 39 中的任意一个核酸序列具有 至少 70％的序列同一性， 包括与这些序列中的一个具有至少大约 75％、 80％、 85％、 90％、 95％、 97％、 98％、 99％和更大的序列同一性。 在进一步的实施方案中， 麦草畏单加氧酶可以 是任一个这样的序列的变体和 / 或可以是工程化的合成 DMO 分子， 例如， 如在 2007 年 1 月 12 日提交的名称为 “DMO Methods And Compositions” 的美国临时申请 60/884,854 中描述 的， 本文特别引入其完整公开内容作为参考。
具有降解植物生长素样除草剂的能力的 DMO 的变体， 以及草甘膦或者其它除草 剂耐受基因， 可以根据标准方法容易地制备， 并测定其活性。也可以通过本领域已知的技 术， 例如， 从合适的生物体中鉴定这些序列， 所述生物体包括能够降解例如麦草畏的生物 素样除草剂或者其它除草剂的细菌 ( 美国专利 5,445,962 ； Cork 和 Krueger， 1991 ； Cork 和 Khalil， 1995)。一种分离 DMO 或者其它序列的方法是通过例如与由来源生物体构建的 文库进行核酸杂交， 或者使用来自来源生物体的 mRNA 和基于公开的去饱和酶的引物进行 RT-PCR。本发明因此包括在严格条件下与本文所述的 DMO 编码序列杂交的核酸的应用。本 领域的技术人员理解通过增加盐浓度和降低温度可以提供严格性较低的条件。因此， 杂交 条件可以容易地控制， 并且一般是根据预期的结果选择的方法。高严格性条件的一个例子 50％甲酰胺和 42℃。通过在这样的条件下洗涤例如 10 分钟， 可以除去那些在这 是 5X SSC、 些条件下不与特定靶序列杂交的序列。
变体也可以化学合成， 例如， 根据本领域众所周知的技术， 利用已知的 DMO 多核苷 酸序列合成。 例如， DNA 序列可以通过亚磷酰胺化学法 (phosphoroamidite) 在自动 DNA 合成 仪上合成。化学合成有许多优势。特别是， 化学合成是合乎需要的， 因为将要表达 DNA 序列 的宿主所偏好的密码子可以用来优化表达。 并非所有的密码子都需要改变来获得改进的表 达， 但是优选地至少将那些在宿主中很少用到的密码子改变为宿主偏好的密码子。通过改 变超过大约 50％， 最优选至少大约 80％的密码子成为宿主偏好的密码子， 可以得到高水平 的表达。 许多宿主细胞的密码子偏好是已知的 ( 例如， PCT WO 97/31115 ； PCT WO 97/11086 ； EP 646643 ； EP 553494 ； 和美国专利： 5,689,052 ； 5,567,862 ； 5,567,600 ； 5,552,299 和 5,017,692)。可以通过本领域已知的方法， 推导出其它宿主细胞的密码子偏好。此外， 利用 化学合成， 可以容易地改变 DNA 分子的序列或者其编码的蛋白质， 例如用来优化表达 ( 例 如， 消除干扰转录或翻译的 mRNA 二级结构 )、 在方便的位点加入独特的限制性位点、 以及删 除蛋白酶酶切位点。
在根据需要保留或者改变酶活性的同时， 可以对蛋白质的多肽序列， 如本文提供 的 DMO 序列， 进行修饰和改变。在 2007 年 1 月 12 日提交的美国临时申请 60/884,854 中提 供了产生 DMO 序列的示例性的方法。下面是基于改变蛋白质的氨基酸来产生相当的或甚 至改进的、 修饰的多肽和相应的编码序列的讨论。已知， 例如， 在蛋白质结构中某些氨基酸 可以被其它氨基酸代替， 却不会明显损失与底物分子上诸如结合位点的结构相互结合的能 力。因为蛋白质的相互作用能力和性质限定了蛋白质的生物学功能活性， 所以可以在蛋白 质序列中， 当然也可以在其 DNA 编码序列中， 进行某些氨基酸序列置换， 而仍然获得具有相 似性质的蛋白质。因此设想 ： 可以对本文描述的 DMO 肽序列或者其它除草剂耐受性多肽和 相应的 DNA 编码序列进行各种改变， 而不会明显减弱它们的生物学效用或者活性。
进行这样的改变时， 需要考虑氨基酸的亲水指数。本领域中一般理解亲水氨基酸 指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性 (Kyte 等人， 1982)。普遍认为， 氨基 酸的相对亲水特性对产生的蛋白质的二级结构具有贡献， 而蛋白质的二级结构又限定了蛋 白质与例如酶、 底物、 受体、 DNA、 抗体、 抗原等其它分子的相互作用。基于它们的疏水性和 电荷特性， 每种氨基酸已被分配了亲水指数 (Kyte 等人， 1982)， 这些是 ： 异亮氨酸 (+4.5) ； 缬氨酸 (+4.2) ； 亮氨酸 (+3.8) ； 苯丙氨酸 (+2.8) ； 半胱氨酸 / 胱氨酸 (+2.5) ； 甲硫氨酸 (+1.9) ； 丙氨酸 (+1.8) ； 甘氨酸 (-0.4) ； 苏氨酸 (-0.7) ； 丝氨酸 (-0.8) ； 色氨酸 (-0.9) ； 酪 氨酸 (-1.3) ； 脯氨酸 (-1.6) ； 组氨酸 (-3.2) ； 谷氨酸 (-3.5) ； 谷氨酰胺 (-3.5) ； 天冬氨酸 (-3.5) ； 天冬酰胺 (-3.5) ； 赖氨酸 (-3.9) 和精氨酸 (-4.5)。
本领域已知， 氨基酸可以被其它具有相似亲水指数或者得分的氨基酸代替， 而仍 然产生具有相似生物学活性的蛋白质， 即， 仍然获得生物学功能相当的蛋白质。 进行这样的 转变时， 优选其亲水指数在 ±2 之内的氨基酸置换， 尤其优选在 ±1 之内的氨基酸置换， 甚 至更优选在 ±0.5 之内的氨基酸置换。
本领域中也理解在亲水性的基础上可以有效进行相似氨基酸的置换。美国专利 4,554,101 提出， 受到邻近氨基酸亲水性控制的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的 生物学性质相关。如美国专利 4,554,101 所述， 下面的亲水性值被分配给氨基酸残基 ： 精 氨酸 (+3.0) ； 赖氨酸 (+3.0) ； 天冬氨酸 (+3.0±1) ； 谷氨酸 (+3.0±1) ； 丝氨酸 (+0.3) ； 天 冬酰胺 (+0.2) ； 谷氨酰胺 (+0.2) ； 甘氨酸 (0) ； 苏氨酸 (-0.4) ； 脯氨酸 (-0.5±1) ； 丙氨酸 (-0.5) ； 组氨酸 (-0.5) ； 半胱氨酸 (-1.0) ； 甲硫氨酸 (-1.3) ； 缬氨酸 (-1.5) ； 亮氨酸 (-1.8) ； 异亮氨酸 (-1.8) ； 酪氨酸 (-2.3) ； 苯丙氨酸 (-3.5) ； 色氨酸 (-3.4)。应当理解 ： 氨 基酸可以被另一种具有相似亲水性值的氨基酸代替， 而仍然获得生物学相当的蛋白质。在 这样的改变中， 优选其亲水性值在 ±2 之内的氨基酸置换， 尤其优选在 ±1 之内的氨基酸置 换， 甚至更优选在 ±0.5 之内的氨基酸置换。将这些和各种上述特征考虑在内的示例性的 置换是本领域的技术人员熟知的， 且包括 ： 精氨酸和赖氨酸， 谷氨酸和天冬氨酸， 丝氨酸和 苏氨酸， 谷氨酰胺和天冬酰胺， 及缬氨酸、 亮氨酸和异亮氨酸。
包括可操作地连接到 DMO 序列上的 CTP 序列的 DNA 构建体可以通过被可操作地连 接到在植物中具有功能的启动子上而在诸如原生质体、 瞬时或者稳定转化的植物细胞等测 试系统中表达。描述这样的启动子的例子包括美国专利 6,437,217( 玉米 RS81 启动子 )、 美国专利 5,641,876( 水稻肌动蛋白启动子 ； OsAct1)、 美国专利 6,426,446( 玉米 RS324 启 动子 )、 美国专利 6,429,362( 玉米 PR-1 启动子 )、 美国专利 6,232,526( 玉米 A3 启动子 )、 美国专利 6,177,611( 组成型玉米启动子 )、 美国专利 5,322,938、 5,352,605、 5,359,142 和 5,530,196(35S 启动子 )、 美国专利 6,433,252( 玉米 L3 油质蛋白启动子 )、 美国专利 6,429,357( 水稻肌动蛋白 2 启动子以及水稻肌动蛋白 2 内含子 )、 美国专利 5,837,848( 根 特异性启动子 )、 美国专利 6,294,714( 光诱导型启动子 )、 美国专利 6,140,078( 盐诱导型 启动子 )、 美国专利 6,252,138( 病原体诱导型启动子 )、 美国专利 6,175,060( 磷缺乏诱导 型启动子 )、 美国专利 6,388,170( 例如， PC1SV 启动子 )、 SEQ ID NO ： 41 的 PC1SV 启动子、 美国专利 6,635,806(γ- 薏苡醇溶蛋白 (coixin) 启动子 ) 和美国专利 7,151,204( 玉米 叶绿体醛缩酶启动子 )。可以使用的其它启动子是胭脂氨酸合酶 (NOS) 启动子 (Ebert 等 人， 1987)、 章鱼氨酸合酶 (OCS) 启动子 ( 其在根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 的肿瘤诱导的质粒中携带 )、 花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒 (CaMV)19S 启 动子 (Lawton 等人， 1987)、 CaMV 35S 启动子 (Odell 等人， 1985)、 玄参花叶病毒 35S- 启 动 子 (Walker 等 人， 1987)、 蔗 糖 合 酶 启 动 子 (Yang 等 人， 1990)、 R 基因复合体启动子 (Chandler 等人， 1989) 和叶绿素 a/b 结合蛋白基因启动子等。在本发明中， 具 有增强 子 序 列 的 CaMV35S(e35S ； 美 国 专 利 5,322,938 ； 5,352,605 ； 5,359,142 和 5,530,196)、 FMV35S( 美国专利 6,051,753 ； 5,378,619)、 花生褪绿条纹花椰菜花叶病毒 (PC1SV ； 美国 专利 5,850,019)、 At.Act 7( 登记号 #U27811)、 At.ANT1( 美国专利申请 20060236420)、 FMV.35S-EF1a( 美 国 专 利 申 请 20050022261)、 eIF4A10( 登 记 号 #X79008) 和 AGRtu. nos(GenBank 登记号 V00087 ； Depicker 等人， 1982 ； Bevan 等人， 1983)、 水稻胞质磷酸丙糖 异构酶 (OsTPI ； 美国专利 7,132,528) 和水稻肌动蛋白 15 基因 (OsAct15 ； 美国专利申请 2006-0162010) 启动子可能特别有用。
作为翻译前导序列起作用的 5’ UTR 是位于基因的启动子序列和编码序列之间的 DNA 遗传元件， 可以被包括在启动子和 CTP-DMO 序列之间。 翻译前导序列存在于翻译启动序 列上游的完全加工的 mRNA 之中。 翻译前导序列可以影响初级转录物向 mRNA 的加工、 mRNA 稳 定性或者翻译效率。翻译前导序列的例子包括玉米和矮牵牛花热休克蛋白前导序列 ( 美国 专利 5,362,865)、 植物病毒外壳蛋白前导序列、 植物核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶前导序 列、 GmHsp( 美国专利 5,659,122)、 PhDnaK( 美国专利 5,362,865)、 AtAnt1、 TEV(Carrington 和 Freed， 1990) 和 AGRtunos(GenBank 登 记 号 V00087 ； Bevan 等 人， 1983) 等 (Turner 和Foster， 1995)。在本发明中， 可能尤其有益的 5’ UTR 是 GmHsp1( 美国专利 5,659,122)、 PhDnaK( 美 国 专 利 5,362,865)、 AtAnt1、 TEV(Carrington 和 Freed， 1990)、 OsAct1( 美 国 专 利 5641876)、 OsTPI( 美 国 专 利 7,132,528)、 OsAct15( 美 国 公 开 20060162010) 和 AGRtunos(GenBank 登记号 V00087 ； Bevan 等人， 1983)。
3’ 非翻译序列、 3’ 转录终止区或者多腺苷酸化区域意思是连接到并位于结构多核 苷酸分子下游的 DNA 分子， 并且包括提供能够影响转录、 mRNA 加工或者基因表达的多腺苷 酸化信号和其它调控信号的多核苷酸。多腺苷酸化信号在植物中发挥功能， 以导致向 mRNA 前体的 3’ 末端增加多聚腺苷酸。多腺苷酸化序列可以来源于天然基因、 多种植物基因或者 T-DNA 基因。 这些序列可以包含于 CTP-DMO 序列的下游。 3’ 转录终止区的例子是胭脂氨酸合 酶 3’ 区 (nos 3’ ； Fraley 等人， 1983)。举例说明了不同的 3’ 非翻译区的应用 (Ingelbrecht 等人， 1989)。 来自豌豆 RbcS2 基因 (Ps.RbcS2-E9 ； Coruzzi 等人， 1984)、 AGRtu.nos(Genbank 登记号 E01312)、 E6( 登记号 #U30508) 和 TaHsp17( 小麦低分子量热休克蛋白基因 ； 登记号 #X13431) 的多腺苷酸化分子特别有利地用于本发明。
除了上述的表达元件以外， 为了尤其在单子叶植物中表达编码区， 在启动子和 3’ UTR 之间可能需要内含子。 “内含子” 指的是多核苷酸分子， 其可以从基因的基因组拷贝 的间插序列分离或者鉴定， 而且一般可以被定义为在翻译前 mRNA 加工过程中被剪切掉的 区域。或者， 内含子可以合成产生。内含子本身可以包含影响可操作地连接的基因的转录 的亚元件例如顺式元件或者增强子区域。 “植物内含子” 是在植物细胞中发挥功能的天然或 者非天然的内含子。 植物内含子可以用作调控元件来调节可操作地连接的一种或多种基因 的表达。转化构建体中的多核苷酸分子序列可以包含内含子。相对于可以转录的多核苷酸 序列， 内含子可以是异源的。 内含子的例子包括玉米肌动蛋白内含子 ( 美国专利 5641876)、 玉米 HSP70 内含子 (ZmHSP70 ； 美国专利 5,859,347 ； 美国专利 5,424,412) 和水稻 TPI 内含 子 (OsTPI ； 美国专利 7,132,528)， 并且在实施本发明中是有益的。
可以通过植物组织培养和转化领域的技术人员所知的方法， 在如原生质体或者 瞬时或稳定转化的单子叶或双子叶植物细胞的测试系统中测试 CTP-DMO 构建体是否提供 DMO 的正确加工。按照本发明， 可以使用本领域中已知的任一种将转基因构建体导入植物 的技术 ( 参见， 例如， Miki 等人， 1993)。据信， 合适的植物转化方法实际上包括任一种可将 DNA 导入细胞中的方法， 如美国专利 5,384,253 所描述的电穿孔法 ； 美国专利 5,015,580、 5,550,318、 5,538,880、 6,160,208、 6,399,861 和 6,403,865 所 描 述 的 微 粒 轰 击 法 ； 美国 专利 5,635,055、 5,824,877、 5,591,616、 5,981,840 和 6,384,301 所描述的土壤杆菌介导 转化法 ； 和美国专利 5,508,184 描述的原生质体转化法。通过应用如这些方法的技术， 实 际上任何植物种的细胞都可以稳定地转化， 而且这些细胞可以发育成转基因植物。美国 专利 5,846,797、 5,159,135、 5,004,863 和 6,624,344 公开了在棉花转化中特别有用的技 术。例如， 在美国专利 5,750,871 中特别公开了转化芸苔属 (Brassica) 植物的技术 ； 例如， 在 Zhang 等人， 1999、 美国专利 6,384,301 和 US 7,002,058 中公开了转化大豆的技术。在 WO9506722 中公开了转化玉米的技术。可以用于本发明的植物的一些非限制性例子包括苜 蓿、 大麦、 豆类、 甜菜、 花茎甘蓝、 卷心菜、 胡萝卜、 油菜、 花椰菜、 芹菜、 大白菜、 玉米、 棉花、 黄 瓜、 干豆、 茄子、 茴香、 青刀豆、 葫芦、 韭菜、 莴苣、 甜瓜、 燕麦、 黄秋葵、 洋葱、 豌豆、 胡椒、 南瓜、 花生、 马铃薯、 南瓜、 萝卜、 水稻、 高粱、 大豆、 菠菜、 倭瓜、 甜玉米、 甜菜、 向日葵、 西红柿、 西瓜和小麦。 实现将外源 DNA 导入接受体细胞后， 产生转基因植物的下一步一般涉及鉴定用于 进一步的培养和植物再生的转化的细胞。为了提高鉴定转化体的能力， 可能需要与按照本 发明制备的转化载体一起使用可选择或可筛选的标记基因。在这种情况下， 一般接下来通 过将细胞暴露于一种或多种选择剂检测可能转化的细胞群， 或者针对需要的标记基因的性 状筛选细胞。
在暴露于选择剂后存活的细胞， 或者在筛选试验中评分为阳性的细胞， 可以在支 持植物再生的培养基上继续培养。任何合适的植物组织培养基， 例如， MS 或者 N6 培养基 (Murashige 和 Skoog， 1962 ； Chu 等人， 1975)， 可以通过包含如生长调节剂的其它物质进行 改变。可以在含有生长调节剂的基础培养基上维持组织， 直到获得足够的组织来开始植物 再生工作， 或者进行反复几轮人工选择， 直到组织的形态适合再生， 典型地至少两周， 然后 转移到有助于幼苗形成的培养基上。定期转移培养物， 直到发生足够的幼苗形成。一旦幼 苗形成， 就将它们转移到有助于根形成的培养基上。 一旦形成足够的根， 就可以将植物转移 到土壤中进一步生长和成熟。
为了证实外源 DNA 或者 “转基因” 在再生植物中的存在， 可以进行多种试验。这样 的试验包括， 例如， “分子生物学” 试验， 如 DNA 印迹法和 RNA 印迹法和 PCRTM ； “生物化学” 试 验， 如检测蛋白质产物的存在， 例如， 通过免疫学方法 (ELISA 和蛋白质印迹法 ) 或者通过酶 功能 ； 植物部分试验， 如叶或者根试验 ； 以及， 通过分析整个再生植物的表型。
一旦转基因被导入植物中， 就可以通过杂交将该基因导入到任何与该第一植物性 相容的植物中， 而根本不需要直接转化第二种植物。因此， 本文中使用的术语 “后代” 指的 是按照本发明制备的亲本植株的任何一代后代， 其中， 该后代包含按照本发明制备的选择 的 DNA 构建体。因此， “转基因植物” 可以是任何一代。如本文公开的， “杂交” 一种植物以 提供相对于初始植物系具有一个或者多个添加的转基因或者等位基因的植物系， 被定义为 通过将初始系与包含本发明的转基因或者等位基因的供体植物系杂交从而导致特定的序 列被导入植物系中的技术。为了实现这一点， 例如， 可以进行如下步骤 ： (a) 种植第一 ( 初 始系 ) 和第二 ( 包含需要的转基因或者等位基因的供体植物系 ) 亲本植株的种子 ； (b) 将 第一和第二亲本植株的种子培育成有花的植物 ； (c) 用第二亲本植物的花粉对第一亲本植 物的花授粉 ； 和 (d) 收获具有已受精的花的亲本植物上产生的种子。
可以测试稳定转化的植物组织和植物是否通过 DMO 蛋白质的正确加工提供麦草 畏耐受性。 在农作物植物中提供麦草畏耐受性可以用来设计控制生长环境中的杂草生长的 方法， 包括 ： 向农作物生长环境施用有效控制杂草生长的量的麦草畏除草剂。 麦草畏除草剂 以一定的量自上方向农作物生长环境施用， 所述麦草畏除草剂的量不损伤用 CTP-DMO 构建 体转化的农作物植物或种子， 却损伤具有同样的基因型但是缺乏 CTP-DMO 构建体的农作物 植物。
基于公开的内容， 用于本发明的除草剂组合物的制备对于本领域的技术人员来说 是显而易见的。这样的可商购的组合物除了活性成分外， 典型地还包含如表面活性剂、 固 体或液体载体、 溶剂和粘合剂等组分。可用于向植物施用的表面活性剂的例子包括以下物 质的碱金属盐、 碱土金属盐或铵盐 ： 芳香族磺酸类， 例如， 木素磺酸、 苯酚磺酸、 萘磺酸和二 丁基萘磺酸， 和脂肪酸、 芳基磺酸酯、 烷基醚、 月桂基醚、 脂肪醇硫酸盐和脂肪醇二醇醚硫酸
盐， 磺化萘及其衍生物与甲醛的缩合物、 萘或萘磺酸与苯酚和甲醛的缩合物、 苯酚或苯酚磺 酸与甲醛的缩合物、 苯酚与甲醛和亚硫酸钠的缩合物、 聚氧乙烯辛基苯基醚、 乙氧基化的异 辛基 -、 辛基 - 或壬基苯酚、 三丁基苯基聚二醇醚、 烷基芳基聚醚醇、 异十三烷醇、 乙氧基化 的蓖麻油、 乙氧基化的三芳基苯酚、 磷酸化的三芳基苯酚乙氧基化物的盐、 月桂醇聚二醇醚 乙酸酯、 山梨醇酯、 木质素 - 亚硫酸盐废液或甲基纤维素， 或它们的混合物。表面活性剂应 用的常见实例是大约 0.25 重量％ -1.0 重量％， 更常用地为大约 0.25 重量％ -0.5 重量％。
向植物施用的组合物可以是固体或液体。使用固体组合物时， 可能需要包含一种 或多种载体材料和活性化合物。载体的例子包括矿物土， 如硅石、 硅胶、 硅酸盐、 滑石、 高 岭土、 镁质粘土 (attaclay)、 石灰石 (limestone)、 白垩 (chalk)、 黄土 (loess)、 粘土、 白 云石 (dolomite)、 硅藻土 (diatomaceous earth)、 硫酸钙、 硫酸镁、 氧化镁、 磨碎的合成材 料， 肥料， 如硫酸铵、 磷酸铵、 硝酸铵、 硫脲和脲， 植物来源的产品， 如谷物粗粉、 树皮粗粉、 木 粉和坚果壳粗粉、 纤维素粉、 硅镁土 (attapulgites)、 蒙脱石 (montmorillonites)、 云母 (mica)、 蛭石 (vermiculites)、 合成的二氧化硅和合成的硅酸钙， 或它们的混合物。
对于液体溶液， 可以包含水溶性的化合物或盐， 如硫酸钠、 硫酸钾、 氯化钠、 氯化 钾、 醋酸钠、 硫酸氢铵、 氯化铵、 醋酸铵、 甲酸铵、 草酸铵、 碳酸铵、 碳酸氢铵、 硫代硫酸铵、 二 磷酸氢铵、 磷酸二氢铵、 磷酸氢铵钠、 硫氰酸铵、 氨基磺酸铵或氨基甲酸铵。 除草剂组合物中的其它示例性的成分包括 ： 粘合剂， 如聚乙烯吡咯烷酮、 聚乙烯 醇、 部分水解的聚醋酸乙烯酯、 羧甲基纤维素、 淀粉、 乙烯吡咯烷酮 / 醋酸乙烯酯共聚物和 聚醋酸乙烯酯或它们的混合物 ； 润滑剂， 如硬脂酸镁、 硬脂酸钠、 滑石或聚乙二醇或它们的 混合物 ； 防泡剂， 如乳化硅油、 长链醇、 磷酸酯、 乙炔二醇、 脂肪酸或有机氟化合物 ； 和螯合 剂， 如： 乙二胺四乙酸 (EDTA) 的盐、 三次氮基三乙酸的盐或聚磷酸的盐或它们的混合物。
可以使用从大约 2.5g/ha 到大约 10,080g/ha 的麦草畏， 包括大约 2.5g/ha- 大约 5,040g/ha、 大约 5g/ha- 大约 2,020g/ha、 大约 10g/a- 大约 820g/h 和大约 50g/ha- 大约 1,000g/ha、 大约 100g/ha- 大约 800g/ha 和大约 250g/ha- 大约 800g/ha。
CTP-DMO 构建体可以连接到包含用于可筛选 / 可评分 / 可选择的标记和 / 或赋予 另一种需要的性状的遗传元件的一个或者多个多核苷酸分子上。 通常用来筛选推测转化的 细胞的基因包括 β- 葡糖醛酸糖苷酶 (GUS)、 β- 半乳糖苷酶、 萤光素酶和氯霉素乙酰转移 酶 (Jefferson， 1987 ； Teeri 等人， 1989 ； Koncz 等人 1987 ； De Block 等人， 1984)、 绿色荧光 蛋白 (GFP)(Chalfie 等人， 1994 ； Haseloff 和 Amos， 1995 ； 和 PCT 申请 WO97/41228)。例如， 在 Miki 和 McHugh， 2004 中描述了选择性标记基因的非限制例子。
赋予另一种需要的性状的核苷酸分子包括， 但不限于 ： 提供需要的与植物形 态、 生理、 生长和发育、 产量、 营养强化、 抗病性或抗虫性、 或环境或化学耐受性有关的特 性的基因， 还可以包括遗传元件， 包括 ： 除草剂抗性 ( 美国专利 6,803,501 ； 6,448,476 ； 6,248,876 ； 6,225,114 ； 6,107,549 ； 5,866,775 ； 5,804,425 ； 5,633,435 ； 5,463,175) 、 增 加 的 产 量 ( 美 国 专 利 RE38,446 ； 6,716,474 ； 6,663,906 ； 6,476,295 ； 6,441,277 ； 6,423,828 ； 6,399,330 ； 6,372,211 ； 6,235,971 ； 6,222,098 ； 5,716,837)、 害虫控制 ( 美国 专 利 6,809,078 ； 6,713,063 ； 6,686,452 ； 6,657,046 ； 6,645,497 ； 6,642,030 ； 6,639,054 ； 6,620,988 ； 6,593,293 ； 6,555,655 ； 6,538,109 ； 6,537,756 ； 6,521,442 ； 6,501,009 ； 6,468,523 ； 6,326,351 ； 6,313,378 ； 6,284,949 ； 6,281,016 ； 6,248,536 ； 6,242,241 ；
6,221,649 ； 6,177,615 ； 6,156,573 ； 6f,153,814 ； 6,110,464 ； 6,093,695 ； 6,063,756 ； 6,063,597 ； 6,023,013 ； 5,959,091 ； 5,942,664 ； 5,942,658,5,880,275 ； 5,763,245 ； 5,763,241)、 真 菌 病 抗 性 ( 美 国 专 利 6,653,280 ； 6,573,361 ； 6,506,962 ； 6,316,407 ； 6,215,048 ； 5,516,671 ； 5,773,696 ； 6,121,436 ； 6,316,407 ； 6,506,962)、病 毒 抗 性 ( 美 国 专 利 6,617,496 ； 6,608,241 ； 6,015,940 ； 6,013,864 ； 5,850,023 ； 5,304,730)、 线虫抗 性 ( 美国专利 6,228,992)、 细菌性疾病抗性 ( 美国专利 5,516,671)、 植物生长发育 ( 美 国专利 6,723,897 ； 6,518,488)、 淀粉生产 ( 美国专利 6,538,181 ； 6,538,179 ； 6,538,178 ； 5,750,876 ； 6,476,295)、 改变的油的生产 ( 美国专利 6,444,876 ； 6,426,447 ； 6,380,462)、 高 油 产 量 ( 美 国 专 利 6,495,739 ； 5,608,149 ； 6,483,008 ； 6,476,295)、 改变的脂肪酸含 量 ( 美 国 专 利 6,828,475 ； 6,822,141 ； 6,770,465 ； 6,706,950 ； 6,660,849 ； 6,596,538 ； 6,589,767 ； 6,537,750 ； 6,489,461 ； 6,459,018)、 高蛋白质产量 ( 美国专利 6,380,466)、 果 实成熟 ( 美国专利 5,512,466)、 加强的动物和人的营养 ( 美国专利 6,723,837 ； 6,653,530 ； 6,541,259 ； 5,985,605 ； 6,171,640)、生 物 聚 合 物 ( 美 国 专 利 RE37,543 ； 6,228,623 ； 5,958,745 和美国专利公开 US20030028917)、 环境应激耐受性 ( 美国专利 6,072,103)、 药 物肽和可分泌的肽 ( 美国专利 6,812,379 ； 6,774,283 ； 6,140,075 ； 6,080,560)、 改进的加 工性状 ( 美国专利 6,476,295)、 提高的可消化性 ( 美国专利 6,531,648)、 低水平的棉子 糖 ( 美国专利 6,166,292)、 工业酶生产 ( 美国专利 5,543,576)、 改进的香味 ( 美国专利 6,011,199)、 固氮 ( 美国专利 5,229,114)、 杂交种子生产 ( 美国专利 5,689,041)、 纤维生 产 ( 美国专利 6,576,818 ； 6,271,443 ； 5,981,834 ； 5,869,720) 和生物燃料生产 ( 美国专利 5,998,700)。 这些或者其它的遗传元件、 方法和转基因中的任一种可以用于本发明， 是本领 域的技术人员基于本公开内容可以理解的。
另外， 一个或者多个连接到 CTP-DMO 构建体上的多核苷酸分子通过编码导致内源 基因表达的靶向抑制 ( 例如经过反义、 抑制性 RNA(RNAi) 或者共抑制介导的机制 ) 的 RNA 分 子， 可以实现上面提到的植物特性或者表型。RNA 也可以是催化性的 RNA 分子 ( 即核酶 )， 设计用来切割需要的内源性 mRNA 产物。因此， 任何编码影响感兴趣的表型或者形态学改变 的转录 RNA 分子的多核苷酸分子可以用于实践本发明。
本发明也公开了生产食物、 饲料或工业产品的方法， 包括包含 CTP-DMO 构建体的 植物或者这种植物的一部分， 以及从植物或者其部分制备食物、 饲料、 纤维或工业产品， 其 中， 食物或饲料是谷物、 粗粉、 油、 淀粉、 面粉或蛋白质， 且工业产品是生物燃料、 纤维、 工业 化学品、 药物或营养品。
本发明的另一方面涉及改进单子叶植物的直立能力的方法， 包括 ： a) 获得并种植 通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂交产生的植物， 其中亲本植株和 / 或第二植株包 含所述 DNA 构建体， 并且耐受麦草畏的植物从所述的亲本植株和 / 或第二植株遗传了该 DNA 构建体 ； 和 b) 用麦草畏处理该植物。可以测量包括支柱根的数量、 形状、 长度或结构、 倒伏 百分比和产量的与直立能力相关的参数。在某些实施方案中， 植物是玉米植物。 实施例
下述这些实施例用来说明本发明的实施方案。本领域的技术人员应该理解 ： 下 面的实施例中公开的技术代表了本发明人发现的、 在本发明的实践中良好地发挥作用的技术。 然而， 本领域的技术人员根据本发明的公开内容应该理解， 可以对公开的特定的实施方 案进行许多改变， 仍然获得相同或类似的结果， 而没有偏离本发明的概念、 精神和范围。更 具体地说， 显然某些化学和生理学相关的试剂可以代替本文中所述的试剂， 而将获得相同 或相似的结果。所有这些对于本领域技术人员明显的类似的代替和修改， 被认为是在所附 的权利要求书限定的本发明的精神、 范围和概念之内。
实施例 1
用于转化的 CTP-DMO 构建体的制备
按照标准方法 ( 例如 Sambrook 等人， 1989) 制备表 2 中所示的 DNA 构建体， 该 DNA 构建体在植物启动子和多腺苷酸化信号序列之间包含与 DMO 基因或其变体可操作地连接 的 CTP。 如下所述， 在玉米原生质体系统或在稳定转化的拟南芥或者大豆植物中测试这些构 建体。
实施例 2 玉米原生质体中的 CTP-DMO 构建体的分析从 12 天的黄化幼苗 ( 来自 LH200×LH5 杂交 ) 制备玉米叶叶肉原生质体。将第 二叶的中间部分 ( 大约 6cm 长 ) 用刀片切割成 0.5mm 的条， 并且在真空过滤 30 分钟后， 在 烧瓶中用含有 2％ (w/v) 纤维素酶 RS、 0.3％ (w/v) 离析酶 R10( 都来自 Karlan Research Products Corp， SantaRosa， CA)、 0.6M 甘露醇、 10mM MES(pH 5.7) 和 1mM CaCl2 的酶溶液在 23℃消化不超过 2 小时。来自过滤的和消化的叶组织的原生质体通过用手摇动烧瓶 5 分钟 释放， 并通过 60-μm 尼龙网过滤分离。原生质体通过以 150g 离心 2 分钟收集， 用 0.6M 冷 6 甘露醇溶液洗涤一次， 离心， 以 2×10 /mL 再悬浮于冷 0.6M 甘露醇中。然后使用聚乙二醇 (PEG)， 以 12.5μgDNA 转化原生质体， 并在室温下孵育 16-20 小时。
原生质体存储于 -80℃， 直到通过蛋白质印迹法 (western blot) 分析。原生质体 在冰上融化， 并将 1-3 倍体积的含有 5.0％ β-ME 的 2xLaemmli 样品缓冲液 / 染料 (BioRad) 加到原生质体。然后将原生质体蛋白质样本的等分试样加热到大约 100℃保持 5 分钟， 并 加样到预制的 Tris-HCL 10％聚丙烯酰胺凝胶上。在大约 80-100Amps 的恒定电流下电泳 大约 35 分钟。然后将蛋白质在 100V 恒定电压下从凝胶电转移至 0.2 微米的硝酸纤维素 膜上进行 1-3 小时。膜用 TBST 中的 5％ (w/v) 奶粉在室温下封闭 1 小时或者在 4℃下封闭 过夜。用在 TBST 中 1 ∶ 200 稀释的山羊抗 -DMO 抗体探测膜 1 小时。使用 TBS 冲洗 3 次， 每次 5 分钟， 以除去过量的抗体。用在含 0.5％ (w/v) 奶粉的 TBST 中以 1 ∶ 7,500 比例稀 释的过氧化物酶偶联的兔抗山羊 IgG(Sigma， St.Louis， MO) 探测膜 1 小时。用 TBST 冲洗 3 次， 每次 5 分钟， 以除去过量的过氧化物酶偶联物。除了那些特别指出的以外， 所有的程序， 包括封闭和所有的其它孵育， 在室温下进行。使用 ECL 检测系统 (Amersham Biosciences， Piscataway， NJ) 显示免疫活性的条带， 并在 Kodak BioMaxTM MS 胶片上曝光。适当大小的 免疫活性条带的存在表明 DMO 的正确加工和定位 ( 表 1)。 因此， 例如， 使用可操作地连接到 DMO 上并转化到玉米原生质体中的 CTP4 在蛋白质印迹分析后产生 38kDa 的免疫活性条带。
实施例 3
各种 CTP-DMO 构建体在拟南芥中的测试
按照 Clough 和 Bent(1998) 开发的方法， 转化拟南芥哥伦比亚生态型植物。将通 过这种方法获得的种子接种到含有 0.5、 1.0 到 2.0 或 4.0 毫克 / 升的多种浓度麦草畏的植 物选择培养基上。将这些板在 4℃孵育 48 小时， 然后转移到设定为 23.5℃、 具有 16 小时光 周期的 Percival 孵箱中。用 CTP-DMO 构建体转化的种子在含有麦草畏的培养基上生长成 植物， 并长出初生叶和次生叶， 而未转化的种子和阴性分离子 (segregants) 死亡或者没有 长出初生叶和次生叶。通过 PCR 试验检测为 3’ UTR 阳性的转基因植物用于进一 步分析。
来自转基因拟南芥植物的 3-5 个叶穿孔用于蛋白质印迹分析。在 Harbil paint 振摇器中用 500-1000μl PSBT 和 4 个玻璃珠进行蛋白质提取 3 分钟。在 4℃下以 3000rpm 旋转样本 3 分钟。向上清液的等分试样中加入等体积的含有 5.0％ β-ME 的 2x Laemmli 样 品缓冲液 / 染料 (cat.No.161-0737 BioRad)。 蛋白质印迹分析的其余步骤与实施例 2 中一 样。正确大小的免疫活性条带的存在表明 DMO 的正确加工和定位 ( 表 2)。例如， 如表 2 所 示， 在用 pMON73749 或者 pMON73725 转化拟南芥后可见的条带的比较中， 使用缺少来自豌豆 核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶的 27 个氨基酸的编码序列的 RbcSnoc-CTP 产生定位于叶绿 体的正确加工的 DMO， 而使用包含 27 个氨基酸的编码序列的 RbcS CTP 则产生 2 个免疫活性条带。 实施例 4
CTP-DMO 构建体在大豆中的测试
使 用 标 准 程 序 通 过 土 壤 杆 菌 介 导 的 大 豆 转 化 ( 例 如， Zhang 等 人， 1999 ； US 7,002,058) 获得转基因大豆 ( 例如， cvs.Thorne， NE3001 和 A3525) 植物。来自转基因大 豆植物的 3-5 个叶穿孔用于蛋白质印迹分析。在 Harbil paint 振摇器中用 500-1000μl PSBT 和 4 个玻璃珠进行蛋白质提取 3 分钟。在 4℃下以 3000rpm 旋转样本 3 分钟。向上清 液的等分试样中加入等体积的 2x Laemmli 样品缓冲液 / 染料 (BioRad)/5.0％ β-ME。蛋 白质印迹分析的其余步骤与实施例 2 中一样。正确大小的免疫活性条带的存在表明 DMO 的 正确加工和定位 ( 表 2)。
用构建体 ( 其编码连接到附着有核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶编码区的另外 24 个氨基酸和由于引入限制性酶识别位点而添加的 3 个氨基酸的豌豆核酮糖二磷酸羧化 酶 - 加氧酶转运肽上的 DMO) 转化的大豆植物， 当在出土前阶段用 0.51b 的麦草畏处理接着 在出土后 (V6) 阶段用 21b 麦草畏处理时， 显示 17-20％的损伤率。将其与用编码只连接到 豌豆核酮糖二磷酸羧化酶 - 加氧酶转运肽上的 DMO 的构建体转化的大豆植物进行比较， 后 者显示大约 12％的损伤率。 这些结果表明使用没有额外氨基酸的转运肽导致单一 DMO 活性 的产生 ( 而不是多个部分或不同加工的多肽 ) 和对麦草畏的较高的耐受性。单一形式的酶 的产生也导致易于表征产品和降低注册费用。
实施例 5
DMO 的高效生产和较高的麦草畏耐受性需要 CTP
用如实施例 3 所述的几种构建体 ( 图 1) 转化拟南芥哥伦比亚生态型植物。在包 含从 0.5、 1.0 到 2.0 毫克 / 升的各种浓度的麦草畏的植物组织培养基上选择转化的种子。 用 CTP-DMO 构建体转化的种子在含有麦草畏的培养基上生长成植物， 并长出初生叶和次生 叶， 而未转化的种子和阴性分离子死亡或者没有长出初生叶和次生叶。生长并检测为 DMO 基因阳性的转基因植物用于进一步分析。
如图 1 所示， 用不含 CTP 的构建体转化的植物几乎没有或者没有表现出对麦草畏 的耐受性。当在出土前阶段用 0.5lb/a 的麦草畏处理接着在出土后 (V6) 阶段用 2lb/a 的 麦草畏处理时， 用编码没有连接到 CTP 上的 DMO 的 DNA 构建体转化的大豆植物没有显示出 土前耐受性， 而用其中 DMO 连接到 CTP 上的构建体转化的植物显示出土前和出土后对麦草 畏的耐受性。
实施例 6
耐受麦草畏的转基因玉米植物的产生
为了测试 DMO 基因在向单子叶植物提供麦草畏耐受性方面的用途， 在植物基因表 达元件如启动子 ( 例如， PC1SV、 e35S、 OsAct1、 OsTPI、 OsAct15) 和内含子 ( 例如， OsAct1、 OsAct15、 OsTPI、 ZmHSP70) 的控制下， 产生了转基因玉米植物， 其包含 DMO 基因 ( 例如， SEQ ID NOS ： 29、 33、 35、 37、 39)， 具有或者不具有转运肽 ( 例如， TaWaxy、 CTP1、 CTP2 合成、 CTP4)。 该表达元件包含来自水稻肌动蛋白 1 基因的第一内含子和侧翼 UTR 外显子序列， 还在 5’ 端 包含外显子 1 的 12nt 和在 3’ 端包含外显子 2 的 7nt， 还有 3’ UTR( 例如， TaHsp17)。
转基因玉米植物基本上通过美国专利申请 20040244075 所述的方法产生。在单一
位置重复试验中评价具有单一拷贝的转基因玉米事件的麦草畏耐受性。使用来自 6 个构建 体中的每一个的 6 个事件。 实验设计如下 ： 列 / 项目 ： 1； 处理 ： 在 V3 阶段的 0.5lb/a 麦草畏， 接着在 V8 阶段的 1lb/a 麦草畏 ( BASF， Raleigh， NC) ； 重复 ： 2； 行距 ： 30 英寸 ； 地 决长度 ： 最小 20 英尺 ； 植物密度 ： 大约 30 株 /17.5 英尺 ； 通道 (alley) ： 2.5 英尺。 整个地块 均匀施肥以获得农艺学上可接受的农作物。为了控制玉米根虫， 在耕种时期施用每排 1000 3G(Syngenta Crop Protection， Greensboro， NC， USA)。 英尺 5 盎司土壤杀虫剂， 如 如果观察到小地老虎 (black cutworm) 的侵扰， 以每英亩 4-8 盎司的量施用 3.2EC(FMC Corporation， Philadelphia， PA)。此外， 使用喷洒杀虫剂计划以控制所有地上 的鳞翅目害虫， 包括欧洲玉米螟、 玉米耳虫和秋季粘虫。每 3 周以每英亩 4-8 盎司的量施 用 3.2EC 以控制鳞翅目害虫 ； 大约施用 4 次。出土前施用如 Xtra 5.6L(Monsanto， St.Louis， MO) 和 Degree (Monsanto， St.Louis， MO) 的除草剂， 以 保持地块无杂草。在整个实验中， 如果在未处理的检查中观察到杂草出现， 则通过手工除 草或者出土后施用 PERMIT(Monsanto， St.Louis， MO) 或者 (Bayer， Research Triangle Park， NC) 控制杂草。
当在 V3 阶段用 0.5lb/a 麦草畏处理接着在 V8 阶段用 1lb/a 麦草畏处理时， 通过 测量支柱根损伤来测试用包含 DMO 转基因的 DNA 构建体转化的玉米近交系的麦草畏耐受 性。通过计数一排中与 “手指样” 结构的典型形态相比显示支柱根融合的 “非典型” 形态的 植物的数量， 目视评价支柱根损伤。如表 4 所示， 用编码未与 CTP 连接的 DMO 的 DNA 构建体 (pMON73699、 pMON73704) 转化的玉米植物显示较高水平的支柱根损伤， 即， 麦草畏处理后的 低水平保护。编码连接到 CTP 上的 DMO 的 DNA 构建体 (pMON73716、 pMON73700、 pMON73715、 pMON73703) 显示较低水平的支柱根损伤， 即， 麦草畏处理后较高水平的保护。 表 4. 用携带 DMO 的 DNA 构建体转化的转基因玉米在测试麦草畏耐受性时显示出 的支柱根损伤百分比。
近交 / 构建体 01CSI6 LH244 pMON73699 pMON73704 pMON73716 pMON73700 pMON73715 pMON73703 详情 对麦草畏敏感的近交系 对麦草畏耐受的近交系 PC1SV/I-OsAct1/DMO-Wmc/TaHsp17 e35S/I-OsAct1/DMO-Wmc/TaHsp17 PC1SV/I-OsAct1/TaWaxy/DMO-Wmc/TaHsp17 PC1SV/I-OsAct1/CTP1/DMO-Wmc/TaHsp17 PC1SV/I-OsAct1/CTP2syn/DMO-Wmc/TaHsp17 e35S/I-OsAct1/CTP1/DMO-Wmc/TaHsp17 支柱根损伤 95.4 93.8 93.2 91.3 78.8 74.4 68.2 68.8从在不同的植物物种中进行的这些研究 ( 另外， 例如， 实施例 3、 4 和 8) 可见， 叶绿 体转运肽可用于 DMO 的高效靶向和 DMO 活性的完全产生， 导致对麦草畏较高的耐受性。此 外， 在玉米中 CTP-DMO 的表达提供了对麦草畏的出土前耐受性。
实施例 7
有效 DMO 表达单元的构建
一些遗传元件可以影响基因的有效表达， 如启动子、 叶绿体转运肽序列、 内含子、 5’ UTR、 基因的编码区、 3’ UTR。 然而， 不清楚哪些组合运行最好。 需要有效的 DMO 表达单元或 者构建体来产生改进的产物如耐受麦草畏的种子和植物。通过可操作地连接各种启动子、 CTP、 DMO 变体和 3’ UTR 中的各一种来构建几个 DMO 表达单元， 以获得用于产品开发的有效的 DMO 表达单元。 通过本领域已知的方法将这些构建体转化到大豆中 ( 例如， U.S.6,384,301、 U.S.7,002,058 或 Zhang 等人， 1999)。 获得转基因种子， 并检测出土前和出土后对麦草畏除 草剂的耐受性。 表 5 显示了当种子和植物在出土前用 0.5lb/ 英亩麦草畏处理接着在出土后 V6 阶段用 2lb/ 英亩的麦草畏处理时， 由麦草畏造成的损伤百分比 ( 较低的损伤意味着较 高的耐受性 )。用不携带 CTP 的 DNA 构建体 pMON68939 和 pMON73723 转化的种子不能耐受 麦草畏的出土前施用， 表明为了获得对麦草畏的出土前耐受性， 需要将 DMO 靶向至叶绿体。 用 pMON68939 和 pMON73723( 不含 CTP) 转化的植物， 在 V3 后阶段用麦草畏以 1lb/a 的量处 理后， 分别显示类似于野生型大豆 (60％ ) 的 55％和 57％的损伤率， 而用 pMON68938( 含有 CTP) 转化的植物显示很低的损伤率。这些结果表明， 在大豆中获得对麦草畏的出土前和出 土后耐受性需要 CTP。
表 5. 用特异性 DMO 表达单元转化并在出土前和出土后用麦草畏处理的大豆植物 显示的损伤百分比。
表达单元 PC1SV/CTP2syn/DMO-Wat(A)/nos e35S/CTP1/DMO-Wat(L)/nos PC1SV/RbcSnoc/DMO-Wat(A)/nos PC1SV/RbcSnoc/DMO-Wat(L)/nos PCSV/CTP1/DMO-Wat(A)/nos PC1SV/CTP2syn/DMO-Wat(L)/nos ANT1/CTP1/DMO-Wat(L)/nos PC1SV/RbcSnoc/DMO-Wat(A)/nos PC1SV/RbcS-CTP/DMO-Cnat(A)/nos pMON 名称 73724 68938 73725 73728 73729 73727 68945 73730 68934 ％损伤 9 12 12 12 13 13 14 15 1723102321632 A CN 102321639 Act7/CTP1/DMO-Wat(L)/nos说明书68942 68940 84254 68941 68943 68937 68946 68939 73723 17 17 20 29 60 62 73 100( 前 ) 100( 前 )22/28 页FMV.35S-EF1a/CTP1/DMO-Wat(L)/nos PC1SV/RbcS-CTP/DMO-Cnat(A)/E9 FMV/CTP1/DMO-Wat(L)/nos eIF4A10/CTP1/DMO-Wat(L)/nos e35S/CTP1/DMO-Cat(A)/nos e35S/CTP1/DMO-Cnat(L)/nos e35S/DMO-Wat(A)/nos PC1SV/DMO-Wat(A)/nos
实施例 8
耐受麦草畏的转基因棉花植物的产生
为了测试 DMO 基因在给棉花提供麦草畏耐受性方面的用途， 产生转基因棉花植 物。产生了几个 DNA 构建体， 它们携带在植物基因表达元件如启动子 ( 例如， PC1SV、 FMV 或 e35S) 和 3’ UTR( 例如， E6 ； 登记号 #U30508) 控制下的具有转运肽 ( 例如， PsRbcS CTP、 CTP1、 CTP2) 的 DMO 编码区 ( 例如， SEQ ID NO ： 23、 25、 27、 29、 31、 35)， 并如下所述转化到棉 花 ( 陆地棉 (Gossypium hirsutum)) 中。所用的培养基在表 6 中列出。
棉花 cv Coker130 的幼苗离体生长， 并切下胚轴部分， 并接种于携带 DNA 构建体的 根癌土壤杆菌的液体悬浮液， 印迹干燥 (blot dried)， 并共培养 2 天。 然后将接种的胚轴外 植体转移到葡萄糖选择培养基中 4 周， 蔗糖选择培养基中 1 周， 葡萄糖选择培养基中再培养 4 周， 来诱导愈伤组织。在 16/8( 光 / 暗 ) 循环和 28℃下孵育培养物。然后将卡那霉素抗 性愈伤组织转移到 UMO 培养基中， 并在 28-30℃、 黑暗条件下培养 16-24 周来诱导生胚愈伤 组织。然后从这些愈伤组织中收获生胚愈伤组织， 并在 28-30℃、 黑暗条件下、 在 TRP+ 培养 基上维持长达 4-16 周。收获来自生胚愈伤组织的小胚， 并在 SHSU 培养基上、 在 28-30℃温 度下和 6/8( 光 / 暗 ) 循环条件下发芽。然后将看起来正常的小植株转移到土壤中以获得 成熟的棉花植物。转化株的转基因性质通过 DNA 检测来证实。
表 6. 用于棉花转化的各种培养基的组成。
在 V4-5 生 长 阶 段 以 561g ae/ha(0.5lb/a) 的 量 用 麦 草 畏 (BASF，Raleigh， NC) 处理包含这样的 DNA 构建体的转化的棉花植物作为出土后处理， 每个 DNA 构 建体包含 DMO 编码区与转运肽、 启动子和 3’ UTR 的不同的组合， 发现有耐受性， 而未转化的 棉花植物显示 79％ -86％的损伤率。选择显示超过 95％的耐受性 ( 等于少于 5％的损伤 ) 的转基因植物用于进一步研究。转基因植物也对随后的麦草畏出土后处理具有耐受性。例 如， 在 V3-4 阶段用 0.5lb/ 英亩的麦草畏处理随后在 V5 阶段或者更晚的阶段用 1 或 2lb/ 英亩的麦草畏处理的植物依然对麦草畏耐受。该实施例显示 DMO 基因可以向各个生长阶段 的棉花提供麦草畏耐受性， 因而能够在各个阶段施用麦草畏以获得有效的杂草控制。 实施例 9
提高玉米直立能力的方法
如玉米的某些单子叶植物产生支柱根， 支柱根从地表以上的节点生长， 并有助于 支撑植物和在生殖阶段从土壤上层吸收水分和营养。如果植物遇到大风或者由于根线虫 感染或者地下水缺乏使得地下根系统变得较弱时， 健康的支柱根系统变得重要。为了控制 阔叶杂草， 允许对如玉米的单子叶植物使用如麦草畏和 2， 4-D 的合成除草剂。对于玉米的 出土后杂草控制， 麦草畏是第五广泛施用的除草剂。尽管用于控制阔叶杂草的最优量是 280-560 克 / 公顷 (g/h) 或者 0.25-0.5lb/ 英亩， 但是玉米中的平均使用量是 168g/h 或者
0.15lb/ 英亩， 因为在更高的施用量和如热天的某些环境条件下， 麦草畏能够损伤玉米。此 外， 几种玉米杂交体， 如 DKC61-42、 DKC64-77、 DKC6346、 DKC66-21 和 DKC61-44， 以及近交体， 如 01CSI6、 16IUL2、 70LDL5 和 90LCL6， 对麦草畏施用敏感。敏感性以多种方式表现， 如出现 洋葱剥离 (onion leafing)、 穗畸形、 株高降低或者不正常的支柱根的形成， 例如融合或者 扭曲的根的形成。支柱根变得多瘤节， 趋向于成长在一起， 并且不向土壤中生长来支撑植 物。 这可能导致较弱的玉米作物直立能力、 较高的易倒伏性和最终的产量损失。 一些含有麦 草畏的除草剂产品， 例如 BANVEL、 MARKSMAN、 DISTINCT、 NORTHSTAR 和 CELEBRITY PLUS， 可以导致这些效应。提高玉米对麦草畏的耐受性在保护较接近耐受麦草畏的农作物 种类 ( 如大豆、 棉花 ) 种植的玉米地也是有用的， 而且其中允许更高的麦草畏施用量。
本实施例提供了一种改进玉米和其它单子叶植物的直立能力的方法， 包括在玉米 中引入 DMO 基因并用麦草畏处理玉米。在一个实施方案中， DMO 基因在组成型启动子的控 制下表达， 所述组成型启动子也能够在节点区域和 / 或支柱根中表达 DMO。 在另一个实施方 案中， DMO 基因在一种嵌合组成型和节点 / 支柱根特异性启动子的控制下表达。在另一个 实施方案中， DMO 基因在根特异性启动子如 RCc3 或者其变体 ( 例如， 在 US20060101541 中 发现的 SEQ ID NOs ： 1-6) 的控制下表达。DMO 在支柱根中的表达导致支柱根没有或者有较 少的损伤， 导致玉米的较高的直立能力、 较少的倒伏， 因而导致较高的产量。 来自用各种 DMO 构建体 ( 在表 7 中列出 ) 转化的玉米植物的 3 个单拷贝事件的 R1 或者 F1 种子在 4.0”托盘中发芽。将健康植物移植到大约 10”的罐中。发芽和生长 培养基包括 Redi-earthTM(Scotts-Sierra Horticultural Products Co.， Marysville， Ohio)。将罐放在 35 英寸 ×60 英寸的玻璃纤维浇水托盘中的毛细管垫上， 用于在测试期间 进行亚浇灌， 从而保持对于植物生长而言最佳的土壤含水量。用 Osmocote(14-14-14 缓释 ； Scotts-Sierra Horticultural Products Co.， Marysville， Ohio) 以 100gm/cu.ft. 的量 对罐施肥， 以在温室试验期间维持植物生长。植物在 29℃ /21℃的昼 / 夜温度、 25％ -75％ 的相对湿度的温室中生长， 以模拟晚春温暖季节的生长条件。按照需要， 为最少 14 小时的 光照周期提供大约 600μE 的补充光。
使 用 具 有 设 定 为 最 小 24psi(165kpa) 的 大 气 压 的 Teejet 9501E 平 扇 喷 嘴 (Spraying Systems Co， Wheaton， IL)， 用轨道喷雾器来施用麦草畏。喷嘴保持在比植物顶 端高大约 16 英寸的位置进行喷雾。喷雾体积是 10 加仑 / 英亩或者 93 升 / 公顷。当植物 达到 V4-5 叶阶段时， 开始施用。
通过在 V4-5 阶段用 2lb/ 英亩或者 4lb/ 英亩的麦草畏处理， 并在处理后 24 天评估 植物的支柱根损伤 (0％ ； 没有可见的损伤， 到 100％， 植物完全死亡 ) 和倒伏 ( 倾斜程度 )， 来检测用包含 DMO 表达单元的 DNA 构建体转化的玉米近交系的植物的支柱根损伤和倒伏情 况。
如表 7 所示， 与未被转化的对照近交系和只用选择性标记表达单元 (pMON73746) 转化的植物相比较， 用含有 DMO 表达单元的 DNA 构建体转化的玉米植物显示没有或者几乎 没有支柱根损伤和倒伏。本实施例显示当用麦草畏处理时， 包含 DMO 的植物可以被用来提 供提高的直立能力。
表 7. 当用麦草畏处理时， 用各种 DMO 构建体转化的玉米植物显示没有或者几乎没 有支柱根损伤和倒伏。
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