用于DMO的有效靶向的叶绿体转运肽及其用途.pdf

1、10申请公布号CN102321632A43申请公布日20120118CN102321632ACN102321632A21申请号201110275957322申请日2007060660/891,67520070226US11/758,65920070605US200780052290220070606C12N15/29200601C12N5/10200601C12N15/84200601A01H5/00200601A01M21/0420060171申请人孟山都技术公司地址美国密苏里州72发明人PCC冯M玛尔文S弗拉辛斯基74专利代理机构北京市金杜律师事务所11256代理人陈文平尚继栋54发明名称

2、用于DMO的有效靶向的叶绿体转运肽及其用途57摘要本发明提供了用于有效加工和定位转基因植物中的麦草畏单加氧酶DMO的某些叶绿体转运肽的鉴定和用途。本发明也提供了产生耐受麦草畏的植物的方法、控制杂草生长的方法和产生食物、饲料和其它产品的方法，以及当出土前或出土后施用麦草畏时提供麦草畏耐受性的种子。30优先权数据62分案原申请数据51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书28页序列表28页附图1页CN102321639A1/1页21一种重组DNA分子，其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA序列上的编码叶绿体转运肽的DNA序列，其中，编码叶绿体转运肽的

3、DNA序列编码SEQIDNO4或5的多肽序列。2如权利要求1所述的重组DNA分子，其中，所述编码叶绿体转运肽的DNA序列包括SEQIDNO15或16的核苷酸序列。3如权利要求1所述的重组DNA分子，其中，所述编码麦草畏单加氧酶的DNA序列编码选自SEQIDNO24、26、28、30、32、34、36、38和40的多肽。4如权利要求3所述的重组DNA分子，其中，所述DNA序列选自SEQIDNO23、25、27、29、31、33、35、37和39。5如权利要求1所述的重组DNA分子，进一步包含启动子。6一种转基因植物细胞，其包括包含可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA序列上的编码叶绿体转运肽的

4、DNA序列的重组DNA分子，其中，编码叶绿体转运肽的DNA序列编码SEQIDNO4或5的序列。7一种产生耐受麦草畏的植物的方法，包括将包含可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA序列上的编码叶绿体转运肽的DNA序列的重组DNA分子引入植物细胞中，其中，编码叶绿体转运肽的DNA序列编码SEQIDNO4或5的序列；并由该植物细胞再生包含该重组DNA分子的植物。8如权利要求7所述的方法，其中，所述植物是双子叶植物。9如权利要求7所述的方法，其中，所述植物是单子叶植物。10一种控制田地中的杂草的方法，包括培育包含重组DNA分子的转基因植物，该重组DNA分子包含可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA序

5、列上的编码叶绿体转运肽的DNA序列，其中，编码叶绿体转运肽的DNA序列编码SEQIDNO4或5的序列；并向所述田地中施用有效控制杂草生长而不损伤所述转基因植物的量的麦草畏除草剂。权利要求书CN102321632ACN102321639A1/28页3用于DMO的有效靶向的叶绿体转运肽及其用途0001本申请是申请日为2007年6月6日、申请号为2007800522902、发明名称为“用于DMO的有效靶向的叶绿体转运肽及其用途”的发明专利申请的分案申请。0002发明背景0003本申请要求于2007年2月26日提交的美国临时专利申请60/891,675和2007年6月5日提交的美国专利申请11/758

6、,659的优先权，本文完整引入其公开内容作为参考。发明领域0004本发明涉及植物生物技术领域。更具体的说，本发明涉及允许有效加工和定位植物中的麦草畏单加氧酶的叶绿体转运肽的鉴定和用途。0005相关技术描述0006DMO麦草畏单加氧酶在植物中催化除草剂麦草畏3，6二氯邻茴香酸降解为无毒的3，6二氯水杨酸3，6DCSA，从而赋予除草剂耐受性。DMO的活性需要用于将电子从NADH向麦草畏转移的两种中间蛋白质还原酶和铁氧还蛋白美国专利7,022,896；HERMAN等人，2005。然而，转基因植物中的麦草畏耐受性已通过单独用DMO转化得到证明，表明植物内源性的还原酶和铁氧还蛋白可以在电子转移中代替。参

7、与电子转移的植物铁氧还蛋白位于质体中。因此，为了获得DMO的高效性能并因此获得提高的麦草畏耐受性，需要将DMO靶向至叶绿体。0007在许多情况下，这种靶向可以通过被称作叶绿体转运肽CTP或者质体转运肽的N末端延伸的存在而实现。如果表达的多肽将要在植物质体如叶绿体中区室化，细菌来源的染色体转基因必须具有与编码表达的多肽的序列相融合的编码CTP序列的序列。因此，将外源多肽定位到叶绿体中通常是借助于将编码CTP序列的多核苷酸序列可操作地连接到编码外源多肽的多核苷酸的5区域上来完成的。CTP在向质体内转移过程中通过加工步骤被去除。但是，加工效率可能受CTP的氨基酸序列和肽氨基端附近的序列影响。0008

8、WEEKS等人美国专利7,022,896描述了玉米CABM7信号序列参见，BECKER等人，1992和PCTWO97/41228；GENBANK登记号X53398和豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列CREISSEN等人，1992和PCTWO97/41228在将DMO靶向至植物质体方面的潜在用途，但是没有给出关于加工或者靶向效率的数据。含有包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶RUBISCO小亚基编码序列的27个氨基酸序列的豌豆核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶小亚基RBCSCTP，也已经用于将DMO靶向至叶绿体例如，美国临时申请60/811,152。然而，已经在蛋白质印迹WESTERNBLOT分析过程中发现，这种豌豆

9、RBCSCTP产生一个正确加工的DMO蛋白质条带38KDA，但是还产生一个与DMO和RBCS编码区的27个氨基酸相对应的较大的条带41KDA。额外的氨基酸可能不利地影响DMO的活性。此外，由于DMO的不完全加工，转基因产品中额外的蛋白质造成监管方面的障碍，为了使产品在政府机构注册的目的，还需要在产品表征方面投入额外的努力，由此增加了产品注册的费用。因此，需要鉴定有效地产生正确加工的DMO的CTP，从而提供完全的DMO活性以及易于表征产品的优点。说明书CN102321632ACN102321639A2/28页40009发明概述0010本发明的一方面涉及一种重组DNA分子，其包括可操作地连接到编码

10、麦草畏单加氧酶的核苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列，其中，该核苷酸序列编码包括选自SEQIDNOS111的序列的叶绿体转运肽。在某些实施方案中，重组DNA分子包括选自SEQIDNOS1222的核苷酸序列。在某些实施方案中，重组DNA分子包括编码选自SEQIDNOS24、26、28、30、32、34、36、38和40的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。包括与在植物细胞中具有功能的启动子可操作地连接的DNA分子的DNA构建体也是本发明的一方面。0011另一方面，本发明包括用DNA分子转化的植物细胞，所述DNA分子包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列，其

11、中，叶绿体转运肽序列选自SEQIDNOS111。在某些实施方案中，重组DNA分子包括选自SEQIDNOS1222的核苷酸序列。在某些实施方案中，DNA分子包括编码选自SEQIDNOS24、26、28、30、32、34、36、38和40的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列，其中，DNA分子可操作地连接到在植物细胞中具有功能的启动子上。在特定的实施方案中，DNA分子包括选自SEQIDNOS23、25、27、29、31、33、35、37和39的核苷酸序列。0012在某些实施方案中，植物细胞是双子叶植物细胞。在其它实施方案中，植物细胞是单子叶植物细胞。在特定的实施方案中，植物细胞是大豆、棉花、玉米或者油菜籽植

12、物细胞。本发明也涉及包括这样的细胞的植物组织培养物，涉及包括这样的细胞的转基因种子和转基因植物。在某些实施方案中，转基因种子或者植物是双子叶种子或植物。在其它实施方案中，转基因种子或者植物是单子叶种子或者植物。转基因种子或者植物可以是大豆、棉花、玉米或者油菜籽种子或者植物。0013本发明进一步涉及产生耐受麦草畏的植物的方法，包括将重组DNA分子引入植物细胞中，并由其再生植物，所述DNA分子包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列上的编码叶绿体转运肽的核苷酸序列，其中，编码叶绿体转运肽的序列选自SEQIDNOS1222。在某些实施方案中，重组DNA分子包含编码选自SEQIDNOS24、2

13、6、28、30、32、34、36、38和40的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。DNA分子可以可操作地连接到在植物细胞中具有功能的启动子上。该方法可以进一步包括通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂交产生耐受麦草畏的植物，其中亲本植株和/或第二植株包括所述DNA构建体，并且耐受麦草畏的植物从所述的亲本植株和/或第二植株遗传了该DNA构建体。0014一种在植物细胞中表达麦草畏单加氧酶的方法是本发明的进一步的方面，该方法包括将选择的CTP可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的序列上。0015另一方面，本发明涉及一种在农作物生长环境中控制杂草生长的方法，包括种植这样的植物或其种子，并向农作物生长环境施用有效控制

14、杂草生长的量的麦草畏除草剂。麦草畏除草剂可以自上方向农作物生长环境施用，由此麦草畏除草剂的量不损伤所述的植物或其种子，却损伤与该植物或其种子基因型相同但是缺乏构建体的植物或者种子。0016本发明的进一步的方面涉及生产食物、饲料或者工业产品的方法，包括0017A获得植物，该植物包括按照5到3的方向可操作地连接到编码叶绿体转运肽的核苷酸序列和编码麦草畏单加氧酶的核苷酸序列或其部分上的编码在植物细胞中具有功能的启动子的核苷酸序列；B从所述植物或其部分制备食物、饲料、纤维或者工业产品。0018在该方法的某些实施方案中，食物或者饲料是谷物、粗粉、油、淀粉、面粉或者蛋白说明书CN102321632ACN1

15、02321639A3/28页5质。在该方法的其它的实施方案中，工业产品是生物燃料、纤维、工业化学品、药物或者营养品。0019针对出土前PREEMERGENCE施用麦草畏提供保护的、包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA上的编码叶绿体转运肽的DNA的耐受麦草畏的种子，是本发明的进一步的方面。在某些实施方案中，耐受麦草畏的种子包括编码叶绿体转运肽的核苷酸序列，例如选自SEQIDNOS1222的核苷酸序列。耐受麦草畏的种子可以进一步包括编码选自SEQIDNOS24、26、28、30、32、34、36、38和40的麦草畏单加氧酶的核苷酸序列。0020本发明的另一方面涉及提高单子叶植物的直立能力S

16、TANDABILITY的方法，包括A获得并培育通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂交产生的植物，其中该亲本植株和/或第二植株包含所述DNA构建体并且耐受麦草畏的植物从所述的亲本植株和/或第二植株遗传了该DNA构建体；B用麦草畏处理植物。在某些实施方案中，植物是玉米植物。在其它的实施方式中，可以测量包括支柱根的形状、数量、长度和/或结构、倒伏百分比和产量的与直立能力相关的参数。0021本发明提供以下实施方案00221一种重组DNA分子，其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA序列上的编码叶绿体转运肽的DNA序列，其中，编码叶绿体转运肽的DNA序列编码选自SEQIDNOS111的序列。002

17、32如第1项所述的重组DNA分子，其中，所述编码叶绿体转运肽的DNA序列包括选自SEQIDNOS1222的序列。00243一种重组DNA分子，其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA序列上的编码叶绿体转运肽的DNA序列，其中，编码叶绿体转运肽的DNA序列编码选自拟南芥5烯醇丙酮酰莽草酸3磷酸合酶CTP2叶绿体转运肽序列和豌豆核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶小亚基叶绿体转运肽序列的序列。00254如第1项所述的重组DNA分子，其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA序列上的编码叶绿体转运肽的DNA序列，其中，编码叶绿体转运肽的DNA序列编码选自SEQIDNOS27的序列。00265如第1项所

18、述的重组DNA分子，其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA序列上的编码叶绿体转运肽的DNA序列，其中，编码叶绿体转运肽的DNA序列编码选自SEQIDNO2、SEQIDNO4和SEQIDNO5的序列。00276如第1项所述的重组DNA分子，其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA序列上的编码叶绿体转运肽的DNA序列，其中，编码叶绿体转运肽的DNA序列包括选自SEQIDNOS1318的序列。00287如第1项所述的重组DNA分子，其包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA序列上的编码叶绿体转运肽的DNA序列，其中，编码叶绿体转运肽的DNA序列包括选自SEQIDNOS13、15和1

19、6的序列。00298如第1项所述的重组DNA分子，其中，所述编码麦草畏单加氧酶的DNA序列编码选自SEQIDNOS24、26、28、30、32、34、36、38和40的多肽。00309如第8项所述的重组DNA分子，其中，所述DNA序列选自SEQIDNOS23、25、27、29、31、33、35、37和39。说明书CN102321632ACN102321639A4/28页6003110一种DNA构建体，其包括与启动子可操作地连接的如第1项所述的DNA分子。003211如第5项所述的DNA构建体，其中，所述启动子选自FMV35S启动子、ATANT1启动子、FMV35SEF1A启动子、EIF4A10

20、启动子、AGRTUNOS启动子、水稻胞质磷酸丙糖异构酶OSTPI启动子、水稻肌动蛋白15基因OSACT15启动子和薏苡醇溶蛋白启动子。003312如第10项所述的构建体，其中，所述启动子在植物细胞中是具有功能的。003413用第10项所述的DNA构建体转化的植物细胞。003514如第13项所述的细胞，其中，所述植物细胞是双子叶植物细胞。003615如第13项所述的细胞，其中，所述植物细胞是单子叶植物细胞。003716如第13项所述的细胞，其中，所述植物细胞是大豆、棉花、玉米或者油菜籽植物细胞。003817一种植物组织培养物，其包含第13项所述的细胞。003918如第17项所述的植物组织培养物，

21、其包含双子叶植物细胞。004019如第17项所述的植物组织培养物，其包含单子叶植物细胞。004120如第17项所述的植物组织培养物，其包含大豆、棉花、玉米或者油菜籽植物细胞。004221用第10项所述的DNA构建体转化的转基因植物。004322如第21项所述的转基因植物，其中，所述植物是双子叶植物。004423如第21项所述的转基因植物，其中，所述植物是单子叶植物。004524如第21项所述的转基因植物，其中，所述植物是大豆、棉花、玉米或者油菜籽植物。004625一种产生耐受麦草畏的植物的方法，包括将第10项所述的构建体引入植物细胞中，并由其再生包含第10项所述的构建体的植物。004726如第

22、25项所述的方法，进一步包括通过将亲本植株与它自身或者第二植株杂交产生耐受麦草畏的植物，其中，所述亲本植株和/或第二植株包含DNA构建体，并且耐受麦草畏的植物从所述的亲本植株和/或第二植株遗传了DNA构建体。004827一种在植物细胞中表达麦草畏单加氧酶的方法，包括将选择的CTP可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的序列上。004928一种在农作物生长环境中控制杂草生长的方法，包括第20项所述的植物或其种子，并向农作物生长环境施用有效控制杂草生长的量的麦草畏除草剂。005029如第28项所述的方法，其中，所述麦草畏除草剂自上方向农作物生长环境施用。005130如第28项所述的方法，其中，所述麦草畏

23、除草剂的量不损伤第21项所述的植物或其种子，却损伤与第20项所述的植物的基因型相同但是缺乏第10项所述的构建体的植物。005231一种生产食物、饲料或者工业产品的方法，包括0053A获得第21项所述的植物或其部分；和0054B从该植物或者其部分制备食物、饲料、纤维或者工业产品。005532如第31项所述的方法，其中，所述食物或者饲料是谷物、粗粉、油、淀粉、面粉或者蛋白质。说明书CN102321632ACN102321639A5/28页7005633如第31项所述的方法，其中，所述工业产品是生物燃料、纤维、工业化学品、药物或者营养品。005734一种针对出土前施用麦草畏提供保护的耐受麦草畏的种子

24、，其包含可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA上的编码叶绿体转运肽的DNA。005835如第34项所述的耐受麦草畏的种子，其中，所述DNA编码选自SEQIDNOS111的叶绿体转运肽。005936如第35项所述的耐受麦草畏的种子，其中，所述编码叶绿体转运肽的DNA包含选自SEQIDNOS1222的序列。006037如第34项所述的耐受麦草畏的种子，其中，所述DNA编码包含选自SEQIDNOS24、26、28、30、32、34、36、38和40的序列的麦草畏单加氧酶。006138一种提高单子叶植物的直立能力的方法，包括A培育通过第26项所述的方法产生的植物或种子；和B用麦草畏处理该植物或种子。

25、006239如第38项所述的方法，进一步包括C测量选自支柱根的数量、形状、长度或结构、倒伏百分比和产量的与直立能力相关的参数。0063附图简述0064图1CTPDMO构建体在DMO的正确加工和提供麦草畏耐受性中的应用。0065发明详述0066根据本发明，提供了用于在植物细胞中更有效地表达和向叶绿体转运麦草畏单加氧酶DMO多肽的组合物和方法。因此本发明的组合物和方法在增强植物和细胞对除草剂麦草畏的耐受性方面有用。尤其通过用叶绿体转运肽CTP将DMO靶向至叶绿体，可以实现提高的DMO表达和对麦草畏的耐受性。0067然而，令人惊奇的是，本发明人已经发现某些CTP与DMO组合不能很好地发挥功能。例如，

26、一些CTP不能导致足够的蛋白质表达。这包括蛋白质的不正确表达，以及改变大小的蛋白质的产生和不完全的体内活性。这会导致不完全的除草剂耐受性并且使注册审批变得复杂。本发明提供CTP，当该CTP与DMO联合使用时，提供意想不到的益处，包括但不限于提高的转运至叶绿体的水平、在表达DMO的转基因植物中增强的除草剂耐受性、正确大小的蛋白质表达的理想水平和适当的翻译后修饰。当与DMO组合后提供意想不到的益处的CTP的一个例子是转运肽CTP2，包括SEQIDNO4或5的核酸，并且包括编码SEQIDNOS15和16的序列。在其它实施方案中，使用豌豆PISUMSATIVUM核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶小亚基CTP编码

27、序列，例如由SEQIDNO2所代表的或者编码SEQIDNO13。因此，包括可操作地连接到CTP2和/或豌豆核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶小亚基CTP转运肽编码序列上的DMO编码序列的DNA构建体构成本发明的一个方面，由其编码的蛋白质也构成本发明的一个方面。0068嗜麦芽假单胞菌PSEUDOMONASMALTOPHILIA菌株DI6的麦草畏单加氧酶HERMAN等人，2005；美国专利公开20030115626；GENBANK登记AY786443，本文引入其编码DMO的序列作为参考催化除草剂麦草畏的解毒。DMO是用于将麦草畏解毒成无毒的3，6二氯水杨酸3，6DCSA的三组分体系中的一部分，且如上所述需要

28、还原酶和铁氧还蛋白功能来转移电子。由于参与电子转移的内源性植物铁氧还蛋白定位于质体中，为了获得DMO的有效活性和例如在双子叶植物中的麦草畏耐受性或者例如在单子叶植物中增强的麦说明书CN102321632ACN102321639A6/28页8草畏耐受性，优选DMO靶向至质体例如叶绿体。0069测试叶绿体转运肽CTP在将DMO靶向至质体和DMO加工中的效率。与这些CTP有关的DMO的质体定位和加工从没有或部分到完全不等。发现只有一些CTP允许将DMO完全加工成正确的大小。因此，基于它的蛋白质或者核苷酸序列，任意给定的CTP提供完全和有效的DMO加工的能力是难以预料和出人意料的。0070此外，也已经

29、在拟南芥中发现，在没有合适的CTP的情况下，几乎没有或者没有DMO的表达与几乎没有或者没有麦草畏耐受性相关。这表明叶绿体靶向对于麦草畏的解毒进而对于耐受性是重要的。允许有效加工DMO的CTP在将DMO靶向至农作物的质体例如叶绿体方面是有用的，因此提供以下优势完全的DMO活性和对麦草畏的较高的耐受性，以及易于表征产品和降低注册费用。0071包括可操作地连接到编码麦草畏单加氧酶的DNA上的编码叶绿体转运肽的DNA的嵌合DNA分子可以通过本领域技术人员熟知的分子生物学方法制备例如，SAMBROOK等人，1989。本发明提供了可操作地连接到已知的编码DMO包括表1中列出的那些的DNA分子上的CTP，用

30、于提高植物中DMO的表达。0072来自在细胞核中编码的任何基因并且其产物可将多肽靶向至叶绿体的叶绿体转运肽，可以进行DMO有效表达的检测。可以分离或者合成叶绿体转运肽序列。为了在双子叶植物、单子叶植物或者这两者中表达，可以优化编码CTP的核苷酸序列。通过将每一个可操作地连接到DMO编码序列上，测试下面的转运肽PSRBCS衍生的CTPSSEQIDNO1和2豌豆核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶小亚基CTP；CORUZZI等人，1984；ATRBCSCTPSEQIDNO3拟南芥核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶小亚基1ACTP；CTP1；美国专利5,728,925；ATSHKGCTPSEQIDNO4拟南芥5烯醇丙酮酰

31、莽草酸3磷酸合酶EPSPS；CTP2；KLEE等人，1987；ATSHKGZMCTPSEQIDNO5CTP2合成的；为单子叶植物表达进行密码子优化；WO04009761的SEQIDNO14；PHSHKGCTPSEQIDNO6矮牵牛PETUNIAHYBRIDAEPSPS；CTP4；为单子叶植物表达进行密码子优化；GASSER等人，1988；TAWAXYCTPSEQIDNO7小麦TRITICUMAESTIVUM结合颗粒的淀粉合酶CTP合成的，为玉米表达进行密码子优化CLARK等人，1991OSWAXYCTPSEQIDNO8水稻ORYZASATIVA淀粉合酶CTP；OKAGAKI，1992；NTRB

32、CSCTPSEQIDNO9烟草NICOTIANATABACUM核酮糖1，5二磷酸羧化酶小亚基叶绿体转运肽；MAZUR，等人，1985；ZMASCTPSEQIDNO10玉米ZEAMAYS邻氨基苯甲酸合酶2亚单位基因CTP；GARDINER等人，2004；和RGASCTPSEQIDNO11芸香RUTAGRAVEOLENS邻氨基苯甲酸合酶CTP；BOHLMANN，等人，1995。编码SEQIDNO1SEQIDNO11的核苷酸序列分别在SEQIDNO12SEQIDNO22中给出。0073可能有用的其它转运肽包括玉米CABM7信号序列BECKER等人，1992；PCTWO97/41228和豌豆PISUM

33、SATIVUM谷胱甘肽还原酶信号序列CREISSEN等人，1995；PCTWO97/41228。具有来自于基因编码区的额外氨基酸的CTP所述氨基酸是该基因编码区的一部分或与它融合，例如ATRBCSCTP其包含转运肽，成熟核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶蛋白的24个氨基酸，然后是转运肽的最后6个氨基酸的重复，可以被用来产生DMO。ZMASCTP7也包含来自于基因编码区的额外18个氨基酸。其它CTP也可以用来产生DMO，它们具有来自于基因编码区的额外的氨基酸例如27个氨基酸所述氨基酸是该基因编码区的一部分，例如PSRBCSCTP，紧接着是通过克隆方法引入的氨基酸例如3个氨基酸。具说明书CN10232163

34、2ACN102321639A7/28页9有较少的编码全长CTP的氨基酸例如21个氨基酸的CTP，例如RGASCTP，也可以被用来产生DMO。优选地，使用编码全长CTP的核苷酸序列。可以包括一个或者多个核苷酸添加或者缺失，以便于CTP的克隆。这些添加或者缺失可以在其它表达元件和编码区的前面或者后面，导致一个或者多个编码氨基酸的修饰，例如在限制性酶识别位点处或者位于其附近。0074在一个实施方案中，本发明涉及编码叶绿体转运肽的核酸序列，该叶绿体转运肽与SEQIDNOS111中的任意一个或者多个多肽序列至少具有70的同一性，包括与这些序列有至少大约75、80、85、90、95、97、98、99或者更

35、高的序列同一性，包括100的同一性。在特定的实施方案中，所述核酸序列编码与SEQIDNOS111中的一个相同的叶绿体转运肽。在另一个实施方案中，编码CTP的核酸序列与SEQIDNOS1222中的任意一个或者多个核酸序列具有至少70的序列同一性，包括与这些序列中的一个或者多个至少有大约75、80、85、90、95、97、98、99或者更大的序列同一性，包括100的同一性。这些序列和本文所述的任意其它序列的多肽或者多核苷酸比较和同一性的确定可以如本领域公知的那样进行，例如，使用MEGALIGNDNASTAR，INC，1228SPARKST，MADISON，WI，采用缺省参数。这样的软件通过确定相似

36、性或者同一性的程度，匹配相似的序列。0075通过使用前序列可以将DMO靶向至其它细胞器例如线粒体，以利用存在于该细胞器中的铁氧还蛋白氧化还原系统。或者，通过双靶向肽可以将DMO靶向至叶绿体和线粒体两者，以利用两个铁氧还蛋白氧化还原系统，使工作更加有效。这样的元件是本领域的技术人员已知的。例如，线粒体前序列在SILVAFILHO等人，1996中有描述。编码双靶向肽序列的核酸序列可以从编码下述已知能被靶向至叶绿体和线粒体两者的蛋白质的核苷酸序列中被鉴定出来ZNMPMOBERG等人，2003、谷胱甘肽还原酶RUDHE等人，2002；CREISSEN等人，1995和组氨酰TRNA合成酶AKASHI等人

37、，1998。例如，如表1所示，在编码SEQIDNOS24、26、28、30、32、34、36、38、40多肽的序列中，发现可以用于这方面的DMO编码序列的例子。0076表1使用的DMO和DMO变体。0077说明书CN102321632ACN102321639A8/28页100078在某些实施方案中，编码麦草畏单加氧酶的核酸与编码SEQIDNOS24、26、28、30、32、34、36、38和40中任意一个多肽的序列具有至少70的同一性，包括与这些序列具有至少大约75、80、85、90、95、97、98、99和更高的序列同一性。在某些实施方案中，核酸与SEQIDNOS23、25、27、29、31

38、、33、35、37或39中的任意一个核酸序列具有至少70的序列同一性，包括与这些序列中的一个具有至少大约75、80、85、90、95、97、98、99和更大的序列同一性。在进一步的实施方案中，麦草畏单加氧酶可以是任一个这样的序列的变体和/或可以是工程化的合成DMO分子，例如，如在2007年1月12日提交的名称为“DMOMETHODSANDCOMPOSITIONS”的美国临时申请60/884,854中描述的，本文特别引入其完整公开内容作为参考。0079具有降解植物生长素样除草剂的能力的DMO的变体，以及草甘膦或者其它除草剂耐受基因，可以根据标准方法容易地制备，并测定其活性。也可以通过本领域已知的

39、技术，例如，从合适的生物体中鉴定这些序列，所述生物体包括能够降解例如麦草畏的生物素样除草剂或者其它除草剂的细菌美国专利5,445,962；CORK和KRUEGER，1991；CORK和KHALIL，1995。一种分离DMO或者其它序列的方法是通过例如与由来源生物体构建的文库进行核酸杂交，或者使用来自来源生物体的MRNA和基于公开的去饱和酶的引物进行RTPCR。本发明因此包括在严格条件下与本文所述的DMO编码序列杂交的核酸的应用。本领域的技术人员理解通过增加盐浓度和降低温度可以提供严格性较低的条件。因此，杂交条件可以容易地控制，并且一般是根据预期的结果选择的方法。高严格性条件的一个例子是5XSS

40、C、50甲酰胺和42。通过在这样的条件下洗涤例如10分钟，可以除去那些在这些条件下不与特定靶序列杂交的序列。说明书CN102321632ACN102321639A9/28页110080变体也可以化学合成，例如，根据本领域众所周知的技术，利用已知的DMO多核苷酸序列合成。例如，DNA序列可以通过亚磷酰胺化学法PHOSPHOROAMIDITE在自动DNA合成仪上合成。化学合成有许多优势。特别是，化学合成是合乎需要的，因为将要表达DNA序列的宿主所偏好的密码子可以用来优化表达。并非所有的密码子都需要改变来获得改进的表达，但是优选地至少将那些在宿主中很少用到的密码子改变为宿主偏好的密码子。通过改变超过

41、大约50，最优选至少大约80的密码子成为宿主偏好的密码子，可以得到高水平的表达。许多宿主细胞的密码子偏好是已知的例如，PCTWO97/31115；PCTWO97/11086；EP646643；EP553494；和美国专利5,689,052；5,567,862；5,567,600；5,552,299和5,017,692。可以通过本领域已知的方法，推导出其它宿主细胞的密码子偏好。此外，利用化学合成，可以容易地改变DNA分子的序列或者其编码的蛋白质，例如用来优化表达例如，消除干扰转录或翻译的MRNA二级结构、在方便的位点加入独特的限制性位点、以及删除蛋白酶酶切位点。0081在根据需要保留或者改变酶活

42、性的同时，可以对蛋白质的多肽序列，如本文提供的DMO序列，进行修饰和改变。在2007年1月12日提交的美国临时申请60/884,854中提供了产生DMO序列的示例性的方法。下面是基于改变蛋白质的氨基酸来产生相当的或甚至改进的、修饰的多肽和相应的编码序列的讨论。已知，例如，在蛋白质结构中某些氨基酸可以被其它氨基酸代替，却不会明显损失与底物分子上诸如结合位点的结构相互结合的能力。因为蛋白质的相互作用能力和性质限定了蛋白质的生物学功能活性，所以可以在蛋白质序列中，当然也可以在其DNA编码序列中，进行某些氨基酸序列置换，而仍然获得具有相似性质的蛋白质。因此设想可以对本文描述的DMO肽序列或者其它除草剂

43、耐受性多肽和相应的DNA编码序列进行各种改变，而不会明显减弱它们的生物学效用或者活性。0082进行这样的改变时，需要考虑氨基酸的亲水指数。本领域中一般理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物学功能方面的重要性KYTE等人，1982。普遍认为，氨基酸的相对亲水特性对产生的蛋白质的二级结构具有贡献，而蛋白质的二级结构又限定了蛋白质与例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等其它分子的相互作用。基于它们的疏水性和电荷特性，每种氨基酸已被分配了亲水指数KYTE等人，1982，这些是异亮氨酸45；缬氨酸42；亮氨酸38；苯丙氨酸28；半胱氨酸/胱氨酸25；甲硫氨酸19；丙氨酸18；甘氨酸04；苏氨酸07

44、；丝氨酸08；色氨酸09；酪氨酸13；脯氨酸16；组氨酸32；谷氨酸35；谷氨酰胺35；天冬氨酸35；天冬酰胺35；赖氨酸39和精氨酸45。0083本领域已知，氨基酸可以被其它具有相似亲水指数或者得分的氨基酸代替，而仍然产生具有相似生物学活性的蛋白质，即，仍然获得生物学功能相当的蛋白质。进行这样的转变时，优选其亲水指数在2之内的氨基酸置换，尤其优选在1之内的氨基酸置换，甚至更优选在05之内的氨基酸置换。0084本领域中也理解在亲水性的基础上可以有效进行相似氨基酸的置换。美国专利4,554,101提出，受到邻近氨基酸亲水性控制的蛋白质的最大局部平均亲水性与蛋白质的生物学性质相关。如美国专利4,5

45、54,101所述，下面的亲水性值被分配给氨基酸残基精氨酸30；赖氨酸30；天冬氨酸301；谷氨酸301；丝氨酸03；天冬酰胺02；谷氨酰胺02；甘氨酸0；苏氨酸04；脯氨酸051；丙氨说明书CN102321632ACN102321639A10/28页12酸05；组氨酸05；半胱氨酸10；甲硫氨酸13；缬氨酸15；亮氨酸18；异亮氨酸18；酪氨酸23；苯丙氨酸35；色氨酸34。应当理解氨基酸可以被另一种具有相似亲水性值的氨基酸代替，而仍然获得生物学相当的蛋白质。在这样的改变中，优选其亲水性值在2之内的氨基酸置换，尤其优选在1之内的氨基酸置换，甚至更优选在05之内的氨基酸置换。将这些和各种上述特征

46、考虑在内的示例性的置换是本领域的技术人员熟知的，且包括精氨酸和赖氨酸，谷氨酸和天冬氨酸，丝氨酸和苏氨酸，谷氨酰胺和天冬酰胺，及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。0085包括可操作地连接到DMO序列上的CTP序列的DNA构建体可以通过被可操作地连接到在植物中具有功能的启动子上而在诸如原生质体、瞬时或者稳定转化的植物细胞等测试系统中表达。描述这样的启动子的例子包括美国专利6,437,217玉米RS81启动子、美国专利5,641,876水稻肌动蛋白启动子；OSACT1、美国专利6,426,446玉米RS324启动子、美国专利6,429,362玉米PR1启动子、美国专利6,232,526玉米A3启动子、美国专

47、利6,177,611组成型玉米启动子、美国专利5,322,938、5,352,605、5,359,142和5,530,19635S启动子、美国专利6,433,252玉米L3油质蛋白启动子、美国专利6,429,357水稻肌动蛋白2启动子以及水稻肌动蛋白2内含子、美国专利5,837,848根特异性启动子、美国专利6,294,714光诱导型启动子、美国专利6,140,078盐诱导型启动子、美国专利6,252,138病原体诱导型启动子、美国专利6,175,060磷缺乏诱导型启动子、美国专利6,388,170例如，PC1SV启动子、SEQIDNO41的PC1SV启动子、美国专利6,635,806薏苡醇溶

48、蛋白COIXIN启动子和美国专利7,151,204玉米叶绿体醛缩酶启动子。可以使用的其它启动子是胭脂氨酸合酶NOS启动子EBERT等人，1987、章鱼氨酸合酶OCS启动子其在根癌土壤杆菌AGROBACTERIUMTUMEFACIENS的肿瘤诱导的质粒中携带、花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒CAMV19S启动子LAWTON等人，1987、CAMV35S启动子ODELL等人，1985、玄参花叶病毒35S启动子WALKER等人，1987、蔗糖合酶启动子YANG等人，1990、R基因复合体启动子CHANDLER等人，1989和叶绿素A/B结合蛋白基因启动子等。在本发明中，具有增强子序列的CAMV

49、35SE35S；美国专利5,322,938；5,352,605；5,359,142和5,530,196、FMV35S美国专利6,051,753；5,378,619、花生褪绿条纹花椰菜花叶病毒PC1SV；美国专利5,850,019、ATACT7登记号U27811、ATANT1美国专利申请20060236420、FMV35SEF1A美国专利申请20050022261、EIF4A10登记号X79008和AGRTUNOSGENBANK登记号V00087；DEPICKER等人，1982；BEVAN等人，1983、水稻胞质磷酸丙糖异构酶OSTPI；美国专利7,132,528和水稻肌动蛋白15基因OSACT15；美国专利申请20060162010启动子可能特别有用。0086作为翻译前导序列起作用的5UTR是位于基因的启动子序列和编码序列之间的DNA遗传元件，可以被包括在启动子和CTPDMO序列之间。翻译前导序列存在于翻译启动序列上游的完全加工的MRNA之中。翻译前导序列可以影响初级转录物向MRNA的加工、MRNA稳定性或者翻译效率。翻译前导序列的例子包括玉米和矮牵牛花热休克蛋白前导序列美国专利5,362,865、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物核酮糖二磷酸羧化酶加氧酶前导序列、G