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一种在检测身体样品中PDGF受体自身抗体的存在的体外方法，其适于诊断和预测自身免疫性疾病，尤其是系统性硬化病，以及相关的诊断试剂盒。ROS和/或Ras-ERK1/2的抑制剂用于制备治疗自身免疫性疾病或移植物抗宿主反应(GVHR)的药物的用途。包含有效量的ROS和/或Ras-ERK1/2的抑制剂，和适当的稀释剂，和/或赋形剂，和/或助剂的药物组合物。

1.  检测身体样品中PDGF受体自身抗体之存在的体外方法，其特征为：
a)将身体样品与有效量的该自身抗体的特异性配体在允许此二者结合和形成复合物的条件下孵育；
b)检测结合的自身抗体或复合物，如果存在的话。

2.  权利要求1的方法，其中特异性配体是PDGF受体，或其免疫反应性片段或衍生物。

3.  权利要求2的方法，其中所述免疫反应性片段属于PDGRA和/或PDGFRB的胞外区。

4.  权利要求3的方法，其中所述属于PDGRA和/或PDGFRB的胞外区的免疫反应性片段包括在人PDGFRA NP008197(SWProt P16234，SEQID No.7)和/或PDGFRB NPOO26000(SWProt P09619，SEQ ID No.8)氨基酸序列NH端的前550个氨基酸中。

5.  前述任一项权利要求的方法用于自身免疫性疾病的诊断和预后。

6.  权利要求5的方法，其中自身免疫性疾病是系统性硬化病。

7.  权利要求5的方法，用于鉴别雷诺现象和系统性硬化病。

8.  前述权利要求1-4任一项的方法，用于诊断移植物抗宿主反应(GVHR)。

9.  用于根据前述任一项权利要求的方法的诊断试剂盒，包含：
a)PDGF受体自身抗体的特异性配体；
b)检测结合的自身抗体或配体-自身抗体复合物的工具。

10.  权利要求9的试剂盒，其中特异性配体是PDGF受体，或其免疫反应性片段或衍生物。

11.  权利要求10的试剂盒，其中所述免疫反应性片段属于PDGRA和/或PDGFRB的胞外区。

12.  权利要求11的试剂盒，其中所述属于PDGRA和/或PDGFRB的胞外区的免疫反应性片段包括在人PDGFRA NP008197(SWProtP16234，SEQ ID No.7)和/或PDGFRB NPOO26000(SWProt P09619，SEQ ID No.8)氨基酸序列NH端的前550个氨基酸中。

13.  ROS和/或Ras-ERK1/2的抑制剂用于制备治疗自身免疫性疾病或移植物抗宿主反应(GVHR)的药物的用途。

14.  根据权利要求13的用途，其中自身免疫性疾病是系统性硬化病。

15.  根据权利要求13或14的用途，其中ROS和/或Ras-ERK1/2的抑制剂是抗PDGFR的抗体的特异性配体。

16.  权利要求15的用途，其中特异性配体是PDGF受体或其免疫反应性片段或衍生物。

17.  权利要求16的用途，其中所述免疫反应性片段属于PDGRA和/或PDGFRB的胞外区。

18.  权利要求17的用途，其中所述属于PDGRA和/或PDGFRB的胞外区的免疫反应性片段包括在人PDGFRA NP008197(SWProt P16234，SEQ ID No.7)和/或PDGFRB NPOO26000(SWProt P09619，SEQ ID No.8)氨基酸序列NH端的前550个氨基酸中。

19.  药物组合物，包含有效量的ROS和/或Ras-ERK1/2的抑制剂，和适当的稀释剂，和/或赋形剂，和/或助剂。

20.  权利要求19的药物组合物，其中ROS和/或Ras-ERK1/2的抑制剂是抗PDGFR的抗体的特异性配体。

21.  权利要求20的药物组合物，其中特异性配体是PDGF受体或其免疫反应性片段或衍生物。

22.  权利要求20的药物组合物，其中所述免疫反应性片段属于PDGRA和/或PDGFRB的胞外区。

23.  权利要求21的药物组合物，其中所述属于PDGRA和/或PDGFRB的胞外区的免疫反应性片段包括在人PDGFRA NP008197(SWProtP16234，SEQ ID No.7)和/或PDGFRB NPOO26000(SWProt P09619，SEQ ID No.8)氨基酸序列NH端的前550个氨基酸中。

PDGF受体的刺激性自身抗体作为病理学标记和治疗靶点
技术背景
患自体免疫性疾病，系统性硬化病或硬皮病的患者血清中含有人PDGF受体(PDGFR)的刺激性自身抗体。PDGFR是PDGFRANP008197(SWProt P16234)和PDGFRB NP0026000(SWProt P09619)的同型或异型二聚分子。这些抗体可被用作诊断疾病的工具。此外，使用抗-PDGFR的抑制剂治疗可以代表此疾病的一种治疗方法。
目前，尽管罕见(1/10,000)，此种疾病是致命性的并且没有特异疗法。诊断基本上根据临床症状并且没有特异检测方法。
这种自身抗体的检测可用于除系统性硬化病外的另两种更常见疾病：
-雷诺现象，在人群中的发病率是20％，尽管有些患者会进展为系统性硬化病，但其通常是良性的。抗体检测可以鉴别原发性和继发性雷诺现象，继发性雷诺是系统性硬化病的早期征象。
-移植物抗宿主反应(GVHR)，是一种经常发生于同种异体器官移植，主要是骨髓移植后的并发症。我们已经检测了所有伴慢性GVH和纤维化患者(15)(目前为止所分析的)中上述抗体的存在。
系统性硬化病(硬皮病；SSc)是以皮肤和内脏器官纤维化为特征的紊乱(1)。该疾病原发病因未知。目前为止，还没有明确和特异的假说能够解释该疾病的所有方面。
硬皮病的一些表型特征已经确立并且能够代表该疾病的特点：1.内皮细胞损伤和2.过量的胞外基质的产生(2)。细胞硬皮病表型以氧化应激和成纤维细胞产生的大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)为特征(3-6)。ROS是成纤维细胞增殖(7)和胶原蛋白基因表达(7)的关键细胞传感器(transducers)。经由Ha-Ras和ERK1-2产生的大量ROS诱导胶原蛋白基因转录和正常成纤维细胞老化(7)。血小板源性生长因子(PDGF)可诱导ROS和Ras-ERK1/2信号转导(9)；此外，来源于硬皮病患者的IgG(SSc IgG)被证实可与人成纤维细胞发生反应(10)。
发明描述
本发明的作者已探查了SSc患者血清中Ha-Ras/ERK1-2和ROS的刺激性分子。
他们提供证据表明，通过引发PDGFR活化，针对PDGF受体(PDGFR)的刺激性的IgG自身抗体，经Ha-Ras和ERK1-2信号转导诱导ROS，并造成成纤维细胞活化和内皮细胞凋亡，而它们是系统性硬化病的显著特征。
因此，他们发现了一个新水平的Ras蛋白调节，这依赖于ERK1/2信号转导。具体而言，他们发现PDGF和ROS诱导原代成纤维细胞中的Ha-Ras。这揭示了一种新的，迄今为止尚不知晓的途径，这一途径将ROS与Ras蛋白水平通过ERK1/2联系起来。他们在系统性硬化病患者来源的细胞中发现了这一在体环路的显著例子。这一信号转导途径经刺激PDGF受体而启动并由ROS-ERK1/2信号维持。系统性硬化病的细胞产生过量的ROS(12)并维持活性Ras-ERK1/2。这些细胞蓄积DNA损伤，活化ROS依赖性基因并易于发生应激诱发的凋亡。抑制ROS、Ras或ERK1/2可以下调在系统性硬化病成纤维细胞中的这一环路并恢复正常表型。这些数据指出Ras是细胞ROS的关键感受器并提示了一种诊断和治疗系统性硬化病的分子工具。
因此，本发明的一个目的是一种体外检测身体样品中PDGF受体自身抗体存在的方法，其特征为：
a)将身体样品与有效量的这种自身抗体的特异性配体在允许二者结合并形成复合物的条件下孵育；
b)检测结合的自身抗体或复合物，如果它们存在的话。
优选特异性配体是PDGF受体或其免疫反应性片段或衍生物。
更优选这种免疫反应性片段属于PDGRA和/或PDGFRB的胞外区，最优选它包括在人PDGFRA NP008197，(SWProt P16234，SEQ ID No.7)和/或PDGFRB NP0026000(SWProt P09619，SEQ ID No.8)氨基酸序列中NH端的前550个氨基酸中。
SWProt P16234，SEQ ID No.7
1    mgtshpaflv lgclltglsl ilcqlslpsi lpnenekvvq lnssfslrcf gesevswqyp
61   mseeessdve irneennsgl fvtvlevssa saahtglytc yynhtqteen elegrhiyiy
121  vpdpdvafvp lgmtdylviv edddsaiipc rttdpetpvt lhnsegvvpa sydsrqgfng
181  tftvgpyice atvkgkkfqt ipfnvyalka tseldlemea lktvyksget ivvtcavfnn
241  evvdlqwtyp gevkgkgitm leeikvpsik lvytltvpea tvkdsgdyec aarqatrevk
301  emkkvtisvh ekgfieikpt fsqleavnlh evkhfvvevr aypppriswl knnltlienl
361  teittdveki qeiryrsklk lirakeedsg hytivaqned avksytfell tqvpssildl
421  vddhhgstgg qtvrctaegt plpdiewmic kdikkcnnet swtilannvs niiteihsrd
481  rstvegrvtf akveetiavr claknllgae nrelklvapt lrseltvaaa vlvllvivii
541  slivlvviwk qkpryeirwr viesispdgh eyiyvdpmql pydsrwefpr dglvlgrvlg
601  sgafgkvveg tayglsrsqp vmkvavkmlk ptarssekqa lmselkimth lgphlnivnl
661  lgactksgpi yiiteycfyg dlvnylhknr dsflshhpek pkkeldifgl npadestrsy
721  vilsfenngd ymdmkqadtt qyvpmlerke vskysdiqrs lydrpasykk ksmldsevkn
781  llsddnsegl tlldllsfty qvargmefla skncvhrdla arnvllaqgk ivkicdfgla
841  rdimhdsnyv skgstflpvk wmapesifdn lyttlsdvws ygillweifs lggtpypgmm
901  vdstfynkik sgyrmakpdh atsevyeimv kcwnsepekr psfyhlseiv enllpgqykk
961  syekihldfl ksdhpavarm rvdsdnayig vtykneedkl kdweggldeq rlsadsgyii
1021 plpdidpvpe eedlgkrnrh ssqtseesai etgsssstfi kredetiedi dmmddigids
1081 sdlvedsfl
SWProt P09619，SEQ ID No.8
1    mrlpgampal alkgelllls lllllepqis qglvvtppgp elvlnvsstf vltcsgsapv
61   vwermsqepp qemakaqdgt fssvltltnl tgldtgeyfc thndsrglet derkrlyifv
121  pdptvgflpn daeelfiflt eiteitipcr vtdpqlvvtl hekkgdvalp vpydhqrgfs
181  gifedrsyic kttigdrevd sdayyvyrlq vssinvsvna vqtvvrqgen itlmcivign
241  evvnfewtyp rkesgrlvep vtdflldmpy hirsilhips aeledsgtyt cnvtesvndh
301  qdekainitv vesgyvrllg evgtlqfael hrsrtlqvvf eayppptvlw fkdnrtlgds
361  sageialstr nvsetryvse ltlvrvkvae aghytmrafh edaevqlsfq lqinvpvrvl
421  elseshpdsg eqtvrcrgrg mpqpniiwsa crdlkrcpre lpptllgnss eeesqlethv
481  tyweeeqefe vvstlrlqhv drplsvrctl rnavgqdtqe vivvphslpf kvvvisaila
541  lvvltiisli ilimlwqkkp ryeirwkvie svssdgheyi yvdpmqlpyd stwelprdql
601  vlgrtlgsga fgqvveatah glshsqatmk vavkmlksta rssekqalms elkimshlgp
661  hlnvvnllga ctkggpiyii teycrygdlv dylhrnkhtf lqhhsdkrrp psaelysnal
721  pvglplpshv sltgesdggy mdmskdesvd yvpmldmkgd vkyadiessn ymapydnyvp
781  sapertcrat linespvlsy mdlvgfsyqv angmeflask ncvhrdlaar nvlicegklv
841  kicdfglard imrdsnyisk gstflplkwm apesifnsly ttlsdvwsfg illweiftlg
901  gtpypelpmn eqfynaikrg yrmaqpahas deiyeimqkc weekfeirpp fsqlvlller
961  llgegykkky qqvdeeflrs dhpailrsqa rlpgfhglrs pldtssvlyt avqpnegdnd
1021 yiiplpdpkp evadegpleg spslasstln evntsstisc dsplepqdep epepqlelqv
1081 epepeleqlp dsgcpaprae aedsfl
本发明方法适于诊断和预测自身免疫性疾病，尤其是系统性硬化病。
本发明方法适于鉴别雷诺现象和系统性硬化病。
本发明方法适于诊断和预后移植物抗宿主反应(GVHR)。
本发明的另一目的是用于本发明方法的诊断试剂盒，含有：
a)PDGF受体自身抗体的特异性配体；
b)检测结合的自身抗体或配体-自身抗体复合物的工具。
优选的特异性配体是PDGF受体或其免疫反应性片段或衍生物。更优选这种免疫反应性片段属于PDGRA和/或PDGFRB的胞外区，最优选它包括在人PDGFRA NP008197，(SWProt P16234，SEQ ID No.7)和/或PDGFRB NP0026000(SWProt P09619，SEQ ID No.8)氨基酸序列中NH端的前550个氨基酸中。
本发明的另一个目的ROS和/或Ras-ERK1/2的抑制剂用于制备治疗自身免疫性疾病或治疗移植物抗宿主反应(GVHR)的药物的用途。优选自身免疫性疾病是系统性硬化病。优选ROS和/或Ras-ERK1/2的抑制剂是抗PDGFR的抗体的特异性配体。优选特异性配体是PDGF受体或其免疫反应性片段或衍生物。更优选这种免疫反应性片段属于PDGRA和/或PDGFRB的胞外区，最优选它包括在人PDGFRA NP008197，(SWProt P16234，SEQ ID No.7)和/或PDGFRB NP0026000(SWProtP09619，SEQ ID No.8)氨基酸序列中NH端的前550个氨基酸中。
本发明的另一个目的是一种药物组合物，含有有效量的ROS和/或Ras-ERK1/2的抑制剂，以及适宜的稀释剂，和/或赋形剂，和/或助剂。优选ROS和/或Ras-ERK1/2的抑制剂是抗PDGFR的抗体的特异性配体。优选特异性配体是PDGF受体或其免疫反应性片段或衍生物。更优选这种免疫反应性片段属于PDGRA和/或PDGFRB的胞外区，最优选它包括在人PDGFRA NP008197，(SWProt P16234，SEQ ID No.7)和/或PDGFRB NP0026000(SWProt P09619，SEQ ID No.8)氨基酸序列中NH端的前550个氨基酸中。
将以下列非限定性实施例来描述本发明。
附图说明
图1硬皮病患者中抗PDGF受体的抗体
图A.Fα和F-/-细胞与正常(N；n＝20)、硬皮病(SSc；n＝46)、原发性雷诺现象(PRP；n＝15)，系统性红斑狼疮(SLE；n＝15)以及类风湿性关节炎(RA；n＝15)IgG孵育后，细胞中活性氧的水平。F细胞也与PDGFR酪氨酸激酶的选择性抑制剂(AG 1296)预孵育。横坐标显示均值。图B.Fα，Fαβ和F-/-溶胞产物用纯化自SSc患者以及正常受试者的IgG进行免疫沉淀，随后与抗PDGFR α和β亚单位的特异抗体(WB)显色。右侧前两泳道是总蛋白的免疫印迹结果。只有SSc IgG能有效免疫沉淀PDGFR α和β亚单位。显示了3个实验中的1个代表性结果。图C.硬皮病IgG与表达PDGFRα链的Fα细胞孵育。细胞溶解物被离心后接受免疫沉淀。上清与αPDGFR胞外结构域混合并进行免疫沉淀。用F-/-细胞进行同样的程序。Fα细胞表达的PDGFR滴定自SSc IgG的抗PDGFR抗体。显示了3个实验中的一个代表性实验。
图2αβPDGF受体的SSc抗体刺激正常成纤维细胞中Ha-Ras-ERK 1/2-ROS信号传导
图A  与正常(N；n＝3)和SSc IgG(n＝3)(200μg/ml作用15分钟)孵育，和与EGFR或PDGFR选择性抑制剂(分别为AG 1478和AG 1296)以及FTI-277和PD98059预孵育的正常人成纤维细胞中的活性氧水平(均值±1SD)，以DCF荧光强度表示。图B.荧光显微观察和免疫印迹法测定正常人成纤维细胞在存在或缺乏选择性抑制剂(AG 1478和AG 1296 2μM作用2小时)时与正常和SSc IgG(200μg/ml作用15分钟)孵育后的Ha-Ras蛋白。AG 1478对Ha-Ras带的轻微抑制依赖于这一具体实验中所使用的高浓度(IC₅₀ EGF受体＝3nM)。显示了5次实验中的1个代表性结果。40倍放大。图C.细胞溶解物用纯化自2个SSc患者，1个SLE患者和2个正常受试者的IgG进行免疫沉淀，随后用抗PDGFR和EGFR的特异抗体(WB)显色。左侧的前2泳道是抽提自正常(N)和SSc成纤维细胞和用抗PDGFR和EGFR抗体探查的总蛋白的免疫印迹结果。显示了3个实验中的1个代表性实验。图D.正常人成纤维细胞用SSc IgG(200μg/ml作用15分钟)，PDGF(15ng/ml作用15分钟)刺激或在0.2％FCS中生长。细胞溶解物用抗PDGFR(β亚单位)的多克隆抗体进行免疫沉淀反应，并使用抗磷酸化酪氨酸的特异性抗体对免疫印迹进行显色。
图3抗PDGFR自身抗体的生物学效应
图A.存在或缺乏AG1296(2μM作用24小时)时，用PDGF(15ng/ml作用24小时)，正常人IgG(NIgG；200μg/ml作用24小时)和硬皮病IgG(SSc IgG；；200μg/ml作用24小时)刺激后的正常人成纤维细胞中α-SMA蛋白的诱导。显示的实验代表3个独立实验获得的典型的印迹结果。密度计分析结果列于下部。数据为3个独立实验的均值±SEM。
图B.在存在或缺乏AG1296(2μM作用24小时)时，正常人成纤维细胞与0.2％FCS孵育48小时，与PDGF(15ng/ml作用24小时)，正常人IgG(NIgG；200μg/ml作用24小时)和硬皮病IgG(SScIgG；；200μg/ml作用24小时)孵育后，I型胶原蛋白基因的表达。使用Northern印迹分析法检测α1(I)和α2(I)胶原蛋白mRNA。显示了3个独立实验的1个代表性结果。
图C.脐静脉内皮细胞与PDGF(15ng/ml过夜)，来自正常受试者(N)，系统性红斑狼疮(SLE)和硬皮病(SSc)(200μg/ml过夜)的IgG孵育。SSc也在存在AG1296(2μM过夜)时进行孵育。接着用FACS法分析膜联蛋白V-Cys 3染色细胞，以检测凋亡。该图显示了膜联蛋白V-Cys 3阳性细胞百分率。
图4原代成纤维细胞中PDGF诱导Ras蛋白
源自健康供体的原代成纤维细胞(2-5代)在0.2％的FCS中培养48小时，然后用15ng/ml PDGF刺激所标明的时间。
A.提取总蛋白，与pan-Ras抗体进行免疫沉淀和与Ha-fias和Ki-Ras特异性抗体进行免疫印迹。显示的免疫印迹是重复实施3次实验的代表性结果。纵坐标中的DU表示的是任意密度单位，已经对被设置为1的未经PDGF处理的Ha Ras条带进行标化。
B.在0.2％FCS中预孵育48小时和用PDGF(15ng/ml)刺激15分钟后的成纤维细胞的荧光显微照片。细胞被Ha-Ras和Ki-Ras特异性抗体的间接免疫荧光染色。5个实验中的1个代表性结果已显示出。Neg代表非免疫血清的免疫荧光。40倍放大。
C.用抗Ha-Ras抗体FACS分析按B中描述进行处理的细胞。显示了代表性实验的曲线图(hystogram)。数值为3次独立重复实验的均值±1SD。使用Ha-Ras的单克隆抗体(F235)和多克隆抗体(SC520)得到相同的结果(见材料和方法)。
D.在存在或缺乏亚胺环己酮(10μg/ml作用6小时)时用PDGF(15ng/ml)刺激正常成纤维细胞后Ha-Ras的表达。显示了3个实验中的代表性实验。
E.从用15ng PDGF刺激60分钟后的细胞中提取的RNA的半定量RT-PCR。反应按照材料和方法中的描述进行。在这里显示了3次反应(20个循环)中的代表性结果。在此条件下，特异性条带的强度与cDNA浓度呈线性相关。Kilong和short代表3’UTR长度不同的两个主要Ki4B mRNAs。
图5  ROS诱导原代成纤维细胞中的Ha-Ras
A.PDGF诱导ROS的时间曲线。源自健康供体的原代成纤维细胞(2-5代)在0.2％FCS中孵育48小时，然后用PDGF刺激标示的时间。DCF荧光法测定存在或缺乏PDGF(15ng/ml)时正常成纤维细胞中的ROS。数值代表5个独立重复实验的均数±1SD。
B.ROS抑制消除PDGF对Ha-Ras的诱导。原代成纤维细胞用NAC(20mM 5小时)和DPI(20μM作用1小时)处理，和用PDGF(15ng/ml作用15分钟)处理，并如图1A所示分析Ha和Ki-Ras水平。显示了3个实验中的代表性实验。
C.成纤维细胞以0.2％FCS预孵育48小时，用NAC(20mM)预处理5小时，及用PDGF(15ng/ml)作用15分钟后的荧光显微照片。细胞被Ha-Ras和Ki-Ras特异性抗体进行间接免疫荧光染色。显示了5个实验中的1个代表性结果。
D.PDGF经由ERK1/2介导而诱导Ha-Ras。成纤维细胞在0.2％FCS中孵育48小时，用PDGF(15ng/ml)处理前先用MEK抑制剂PD98059(40μM)处理2小时。通过图1A中所示的以pan-Ras抗体进行的免疫沉淀和免疫印迹测定Ha Ras水平。提取物也与抗-PDGFR β亚单位抗体以及pan-Ras抗体进行印迹法测定。
E.ROS介导PDGF对ERK1/2的诱导。成纤维细胞在0.2％FCS中孵育48小时，用NAC(20mM 5小时)和DPI(20μM作用1小时)预处理，用PDGF(15ng/ml作用30分钟)处理，如上所述分析P-ERK1/2水平。显示了3个实验的1个代表性实验。
图6ERK1/2介导ROS对Ras蛋白的作用。
ROS对Ras的诱导能够被MEK1抑制剂消除。
A.原代成纤维细胞用抗-Ha Ras抗体进行的荧光显微照片。在0.2％FCS中孵育48小时，接着在PD98059存在(40μM作用2小时)或缺乏时用H₂O₂处理(1μM作用15分钟)。显示了3个实验中的1个代表性结果。40倍放大。
B.细胞在0.2％FCS中孵育48小时后，用MEK抑制剂PD98059(40μM)和U0126(50μM)分别处理2小时和15分钟，之后用H₂O₂(1mM作用15分钟)处理。用抗总ERK(ERK 1/2)的抗体及抗其磷酸化形式(P ERK 1/2)的抗体进行免疫印迹分析。细胞溶解产物先前用单克隆抗pan-Ras抗体进行免疫沉淀，再用Ha-Ras和Ki-Ras的特异性抗体进行免疫印迹测定。非免疫血清(*)被作为对照。显示了3个实验中的一个代表性实验。Ha Ras水平的密度计分析显示于此面板的下部。3个实验的结果被标准化并以任意单位表示为均值±1SD。
C.用对照或携带MEK显性阴性变体pBABE-MKK-S217A(C.Marshall，CRC，ICR，UK)的表达载体瞬时转染原代成纤维细胞。Ha-Ras和P ERK1/2水平如说明的进行测定。3个实验的结果被标准化并以任意单位表示为均值±1SD。
D.在存在或缺乏染料木黄酮(1μg/ml作用1小时)时，用PDGF(15ng/ml作用15分钟)和H₂O₂(1mM作用15分钟)处理原代成纤维细胞。数值为3个独立重复实验的均值±1SD。
E.原代成纤维细胞用莫能菌素(MON)(0.1mM作用30min)或MG132(0.04mM作用30min)预处理，及用PDGF(15ng/ml作用15min)和H₂O₂(1mM作用15min)处理。数值为3个独立重复实验的均值±1SD。
图7硬皮病成纤维细胞中ROS-Ras信号放大
源自硬皮症损伤的原代成纤维细胞的ROS。MEK1和法尼基转移酶抑制剂降低ROS
A.3个正常(25)和3个SSc(黑)成纤维细胞系在与PD98059(在0.2％FCS孵育48小时后，40μM作用2小时)或与法尼基蛋白转移酶抑制剂FTI-277(20μM作用2小时)孵育之前(0.2％FCS中48小时)和之后进行ROS测定得到的以DCF荧光强度来表示的活性氧水平(任意单位)。显示了经超氧化物歧化酶-可抑制型细胞色素C还原试验测定的O₂^-的含量，和由高香草酸还原试验测定的H₂O₂。数据为3个独立重复实验的均值±1SD。
硬皮病细胞中升高的Ha-Ras水平和活性
B.左侧图.所示数据得自3个正常(N)和3个SSc成纤维细胞系。对单克隆抗pan-Ras抗体免疫沉淀的细胞溶解物进行抗Ha-Ras和Ki-Ras特异性抗体的免疫印迹检测。直方图表示来自同一样本3次独立实验的Ha/Ki的比值。非免疫血清被作为对照(*)。
右侧图.正常和硬皮病成纤维细胞与0.2％FCS孵育48小时后的荧光显微照片。细胞用抗Ha-Ras和Ki-Ras抗体经间接免疫荧光法染色。显示了3个实验中的1个代表性结果。40倍放大。
C.图上部显示了以抗pan-Ras抗体探测的，正常(N)和SSc成纤维细胞总溶解物和GST-RBD结合型Ras蛋白免疫印迹的结果。显示了3个实验中的一个代表性实验。SSc成纤维细胞也用阴性Ha-Ras变体RasN17转染。图下部显示了3个独立实验中条带的光密度分析结果(均值±1SD)。Ras抑制并不完全，因为只有一部分细胞表达外源性反式显性阴性Ras。
D.提取自正常和硬皮病成纤维细胞总蛋白(50μg)的免疫印迹分析。3个正常(N)和3个硬皮病(SSc)成纤维细胞系收集前在无血清(0.2％FCS作用48小时)或含血清(0.2％FCS作用48小时后加入10％FCS作用15分钟)培养基中培养。磷酸化形式的ERK1/2，AKT和JNK用磷酸特异抗体进行免疫印迹检测。显示了3个实验中的代表性结果。
图8.硬皮病成纤维细胞的加速老化。
A.硬皮病成纤维细胞中DNA损伤检查点的活化。用识别磷酸化组蛋白H2AX或p21WAF的特异性抗体行免疫印迹检测。显示了3个实验中的代表性结果。用一种抗ERK 1/2的多克隆抗体对负载的蛋白量进行标化。
B.硬皮病成纤维细胞中的染色体损伤。3个来自硬皮病损伤的原代成纤维细胞系的核型分析。这些细胞系被培养2代并经FTI-277(10μg/ml)处理48小时。每个细胞系，包括3个正常原代成纤维细胞系，对至少50个细胞分裂中期进行打分。在有或无FTI(48h，10μg/ml)时，正常细胞系的细胞分裂中期发生改变的频率接近4％±2(数据未显示)。由于在第一代细胞中即存在，由此这些发现的畸变并不是细胞体外生长而产生的假象。有些改变更加频繁，这取决于从培养最初一代到分析时所经过的时间。右侧图显示SSc细胞中代表性的染色体的改变。
C.硬皮病细胞中氧化应激诱导的凋亡。在MEK抑制剂PD 98059(40μM)存在或缺乏时，逐步增加H₂O₂浓度刺激正常(N)和SSc成纤维细胞2小时。对细胞进行膜联蛋白V-C染色后用FACS分析法检测细胞凋亡。图代表膜联蛋白V阳性细胞百分率。显示的数据是3个独立实验的均值±1SD。
D.硬皮病细胞中ROS可诱导基因的活化。SSc细胞中由ROS引起的胶原蛋白启动子的活化。用空载体(pGL3)或具有α2(I)胶原蛋白启动子的载体转染N或SSc细胞，该胶原蛋白启动子在表达人过氧化氢酶基因(pCat，10)的载体存在或缺乏的情况下驱动萤光素酶基因(Col1A2)的表达。Renilla与萤火虫萤光素酶的比值被用来标化共转染实验。数据表示为均值±1SD(n＝3)。
E.SSc成纤维细胞与PD98059(40μM作用24小时)，FTI-277(20μM作用24小时)孵育后或用携带人过氧化氢酶基因的表达载体转染后的α1(I)和α2(I)胶原mRNA。H₂O₂刺激(24小时)正常细胞中的胶原mRNAs。显示了3次实验中的1个代表性结果。
图9连接Ras和ROS的环路
示意图阐明了由PDGF始发，由NADPH氧化酶激发ROS产生的环路。ROS激活ERK1/2，后者又诱导Ha-Ras。一旦被激发，这一环路不再依赖PDGF信号。这一环路在硬皮病细胞中被放大。
试剂
Dulbecco′s改良Eagle培养基(DMEM)、FCS、L-谷氨酰胺和pen-strept-anfotB溶液购自Gibco(米兰，意大利)。重组的血小板源生长因子BB(PDGF-BB)购自Peprotech(Rocky Hill，NJ)；FTI-277，法尼基蛋白转化酶抑制剂H-Ampamb-Phe-Met-OH，和PD98059，购自Calbiochem(圣地亚哥，CA)。染料木黄酮得自ICNBiomedicals(奥罗拉，OH)。抗Ha-Ras(F235或SC520)，抗Ki-Ras(F234)，抗pan-Ras(F132)和抗Rac1抗体购自Santa Cruz(CA，USA)。抗磷酸-p44/42MapKinase，抗磷酸-SAPK/JNK和抗Akt来自Cell Signaling Technology(贝弗莉，MA)。抗H2AX和抗p21WAF抗体得自Upstate Biotechnology(Charlottesville，VA)；二亚苯基碘鎓(diphenylene iodonium，DPI)来自Alexis Biomedicals(Lansen，CH)，N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)和亚胺环己酮来自Sigma(St.Louis，MO)。U0126来自Promega(Madison，W1)，2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)来自Molecular Probes(Eugene，OR)。使用如下质粒：显性阴性Ha-RasN17，人Ha-Ras的V12阳性变体和人Ki-Ras的V12阳性变体(7)，显性阴性Rac变体(Rac1N17)，显性阳性Rac变体(Rac1V12)(13)，显性阴性MEK变体pBabe-MKK-S217A(大鼠基因库z30163)。胶原蛋白α1(I)的cDNA(Hf677克隆)和胶原α2(I)的cDNA(Hf32克隆)由Ch M.Lapiere博士惠赠(Laboratorie de Biologie des Tissues Conjonctifs，Universityof Liege，Belgium)。
患者
研究了46例继发性(consecutive)高加索种硬皮病患者(8名男性，38名女性)，中值年龄58岁(年龄范围35-77岁)。诊断依照ACR初步标准(11)，并且患者依照LeRoy等(12)的标准划分为弥散性和局限性SSc两个亚类。此外，弥散性SSc患者被分为早期(疾病持续时间2年或小于2年)和晚期(疾病持续时间大于2年)患者。患者在调查开始之前的6周内未接受任何处置。研究人群的人口统计学和临床特征列于表1。
表1：患者和对照的人口统计学特征

由于雷诺现象可能早发于硬皮病几年，本研究也将15名患有原发性雷诺现象(PRP)的患者纳入研究(表1)。PRP的诊断遵从在别处报道的诊断标准(13)。20名年龄、性别和种族相匹配的健康志愿者也被测评并被组成对照人群。对照组也包括15名性别和年龄相匹配的系统性红斑狼疮患者和15名类风湿性关节炎的患者，他们的诊断依从于已建立的诊断标准(14，15)。受试者知情同意后在21℃环境下适应30分钟，然后抽取患者和对照者血样，待血块形成后冷冻离心。收集上清并保存于-30℃直到试验时，通常在4周内进行试验。
细胞系
源自不表达PDGFRα和β链亚单位的PDGF受体敲除胚胎的小鼠胚胎成纤维细胞(F-/-细胞)以及用PDGFRα和β亚单位感染的F-/-细胞(Fα，Fβ和Fαβ)已在他处描述(16)。
原代成纤维细胞培养
人皮肤成纤维细胞得自取自正常志愿者的前臂和那些符合美国风湿病协会诊断系统性硬皮病初步诊断标准(14)的患者的受损皮肤的钻取活检组织。使用第4-6代传代的成纤维细胞进行所有实验。
IgG纯化
源自正常受试者，硬皮病患者，系统性红斑狼疮患者和类风湿性关节炎患者血清的IgG片段应用蛋白A/G-琼脂糖柱(Pierce，Rockford，IL)进行亲和层析纯化。蛋白浓度经分光光度法测定。所有样品经鲎变形细胞分析(Limulus amoebocyte assay)均没有内毒素。
抗PDGFR自身抗体的生物学鉴定
经由功能性生物学测定法测定患者和对照者的血清样本中PDGFR活化性的自身抗体的存在。该测定是基于感染了PDGFRα和/或β亚单位和在体外接触免疫纯化的IgG的小鼠胚胎成纤维细胞产生ROS。对照细胞为缺乏PDGFR的F-/-细胞。简言之，细胞一式两份以30,000个/1.83m²孔面积的密度铺板，在0.2％胎牛血清中37℃孵育24小时。接着用磷酸盐缓冲液冲洗孔板，用事先定量的对照或患者的IgG在37℃孵育15分钟，之后测定ROS产生的量。
细胞用二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA 10μM，Molecular Probes，PoortGebouw，The Nederlands)37℃孵育15分钟后由荧光测定法测定贴壁成纤维细胞产生的胞内ROS。DCF荧光强度由CytoFluor平板读数仪(PerkinElmer，Wallac，Finland)测定(激发光波长485nm；发射光波长530nm)(8)。每个孔从10个不同的点进行测定后计算平均值。每个IgG样本重复测定后记录平均值。结果以计算的DCF荧光强度来表示，是测试IgG的DCF荧光强度减去不含IgG时培养的细胞所得到的阴性对照的DCF荧光强度。板内和板间变异系数小于3％。如果SI超过正常组的均值加3个标准差，则将样品记录为阳性。
在选定实验中，加入PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂(AG 1296；2μM作用2小时)，表皮生长因子(EGF)受体酪氨酸激酶抑制剂((AG 1478；2μM作用2小时)，ERK 1/2信号转导化学抑制剂(PD 98059；40μM作用2小时)和法尼基蛋白转移酶抑制剂(FTI-277；20μM作用2小时)以阻断Ras法尼基化后测定ROS的产生。AG 1296，AG 1478，PD 98059和FTI-277得自Calbiochem(San Diego，CA)。
细胞溶解和免疫印迹
细胞培养板用0.3ml冷的RIPA缓冲液(1x PBS，1％NonidetP-40，0.5％去氧胆酸钠，0.1％SDS，2mM原钒酸钠，2μg/ml抑酞酶，1mMPMSF)溶解后进行(8)所描述的免疫印迹。
免疫沉淀分析
培养细胞用200μg IgG进行PDGF受体免疫沉淀。分离免疫复合物，接受电泳，与抗PDGFRα和β亚单位抗体(Santa Cruz)进行免疫印迹，经化学发光法(Amersham，Sweden)显像。
培养的成纤维细胞用抗pan Ras多克隆抗体(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA)按照制造商的推荐程序进行免疫沉淀Ras蛋白。分离免疫复合体，进行电泳，与抗Ha-Ras抗体进行免疫印迹，经化学发光法(Amersham，Sweden)显像。
免疫印迹
细胞培养板用0.3ml冷的RIPA缓冲液(1x PBS，1％NonidetP-40，0.5％去氧胆酸钠，0.1％SDS，2mM原钒酸钠，2μg/ml抑酞酶，1mM PMSF)溶解后如(14)所述进行处理。
自身抗体用重组PDGF受体吸收
硬皮病IgG(200μg/ml)与Fα细胞表达的重组PDGFR在4℃孵育2小时。然后离心此混合物(14,000g，15分钟，4℃)。上清被再次与作为抗原来源的PDGFRα亚单位胞外区(R&D Systems，Wiebaden，Germany)进行免疫沉淀以检测PDGFR带是否被去除。F-/-细胞被作为对照细胞，用抗PDGFRα和β亚单位抗体(Santa Cruz)进行免疫印迹，化学发光法(Amersham，Sweden)显像。
免疫荧光
培养于Lab-Tek室载玻片(Nalge-Nunc，IL，USA)上的成纤维细胞在刺激或添加抑制剂前进行营养剥夺48小时，用4％多聚甲醛(paraformaldheide)固定，0.1％Triton-X透化处理，用抗Ha-Ras的单克隆抗体，四甲基若丹明异硫氰酸盐(TRITC)结合的二抗(Molecular Probes，NL)染色。片子用Vectarshield(H-100；Vector，Burlingame，CA)封固，用BioRad(Hemel Hempstead，UK)的配有氩和氦/氖激光的微辐射共聚焦激光扫描显微镜观测。采集的图像用Laser Sharp Processing BioRad软件(版本3.2)进行分析。所有源自不同条件的片子都经双盲法采集。
RNA分离和Northern分析
细胞总RNA经Rneasy Mini试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)提取。接着用10微克总RNA按照所描述的程序进行Northern印迹测定(7)。
凋亡分析
从脐带分离内皮细胞。在存在和缺乏PDGFR和EGFR酪氨酸激酶活性抑制剂时，细胞用SSc IgG(200μg/ml)，正常IgG(200μg/ml)和PDGF(15ng/ml)刺激12小时。
正常和硬皮病成纤维细胞生长至汇合率为80-90％后用不同浓度的H₂O₂刺激2小时。必要时，细胞与PD 98059(40μmol/L)预孵育30分钟。
移除这些刺激物6小时后，用膜联蛋白V-Cy3(Clontech，PaloAlto CA)经FACS分析法测定细胞凋亡。
统计学分析
数值表示为均值±1SD。均值比较使用Student′s配对和非配对t检验。P值小于0.05被认为具有显著性意义。所有数值为双尾检测。
抗HaRas抗体的流式细胞分析
细胞在60mm培养皿中生长至半汇合。胰蛋白酶消化后5x10⁵细胞悬浮于1ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，用1％甲醛固定室温过夜。接下来，用0.1％TritonXI00于4℃时透化处理细胞40分钟，用含2％FBS，0.01％NaN₃，0.1％TritonX100的PBS(缓冲液A)2ml冲洗4次。与稀释度为1∶50的抗HaRas单克隆和多克隆抗体(Santa CruzBiotechnology，Santa Cruz，CA，USA)在4℃孵育45分钟。细胞用同样的缓冲液冲洗2次后与CY2-结合的抗小鼠IgG抗体(AmershamPharmacia Biotech，Milano，Italia)在4℃孵育45分钟，抗体稀释度为1∶50。对照细胞只与Cy2-结合的抗小鼠IgG抗体孵育。在缓冲液A中冲洗2次后，细胞重悬于PBS，然后用FACScan(BD，Heidelberg，Germany)和WinMDI软件进行流式细胞分析。
ROS测定
测定DCF荧光水平前，将细胞与DCFH-DA(10μM)在37℃作用15分钟，然后经荧光测定法测定成纤维细胞产生的胞内ROS(15)。
超氧化物阴离子的释放经由超氧化物岐化酶-抑制型细胞色素C还原来测定(12)。成纤维细胞释放到其介质的H₂O₂经改良的Valletta和Berton法(1987)(16)测定。存活的转染细胞中的氧化活性成像如所描述的进行测定(12，17)。
Ras活化分析
细胞用冰冷的PBS冲洗，每皿用0.5ml裂解缓冲液(20mM Hepes，pH 7.4，1％NP40，150mM NaCI，10mM MgCI₂，10％甘油，1mM EDTA，1mM矾酸钠，10mg/ml亮肽素和10mg/ml抑肽酶)裂解细胞。溶胞产物离心(13000rpm，4℃)并用裂解缓冲液稀释为1mg/ml。
用1mM IPTG作用1-2小时诱导转化的大肠杆菌中GST-RBD的表达，用谷胱甘肽-琼脂糖珠纯化融合蛋白。纯化珠用含有20mM Hepes，pH 7.4，120mM NaCI，10％甘油，0.5％NP40，2mM EDTA，1mM矾酸钠，10mg/ml亮肽素和10mg/ml抑肽酶的溶液进行冲洗。为进行亲和沉淀，溶胞产物与预先结合到谷胱甘肽-琼脂糖(30ml填充珠子)上的GST-RBD在4℃震摇孵育60分钟。结合蛋白用SDS-PAGE样品缓冲液洗脱，在12％丙烯酰胺凝胶上分离并进行Western印迹。印迹用抗Ras，克隆Ras 10(Upstate Biotechnology)探针测定。
转染
为进行转染实验，汇合的成纤维细胞铺在100mm表皿培养基中。24小时后，弃去培养基，换上新鲜的培养基并转染细胞。转染实验用脂质体法(Effectene，Qiagen，Hilden，Germany)重复进行。
在选择的实验中，经克隆人I型胶原α2链基因(COL1A2)(20)启动子获得的重组质粒pGbC1A2-P与携带人过氧化氢酶基因的PS3CAT(由The Johns Hopkins，Baltimore的Irani博士惠赠)或对照载体按照上述程序共转染。样本的萤虫素酶活性经TD-20/20光度计(Turner Design)测定，Renilla与萤火虫萤光素酶的比值被用来对共转染实验进行标化。
Ha-和Ki-Ras mRNA的RT-PCR
总RNA和cDNA合成如(18)描述的来进行。2μl cDNA产物(源自2.5μg总RNA)在生产商提供的不含MgCl₂的缓冲液中，在Ha-，Ki-Ras和肌动蛋白基因的特异性引物存在(见下)时，用1个单位的Ampli Taq Gold(PE Applied Biosystems)扩增。从逆转录反应延续下来的dNTPs的量对于进一步的扩增是充足的。反应在Gene Amp PCRsystem 9600中进行。首次循环条件为95℃作用10分钟，65℃作用45秒和72℃作用1分钟，随后是95℃作用45秒，65℃作用45秒和72℃作用1分钟，连续30个循环。选定测定条件以使被测定的cDNAs在扩增过程结束时没有达到平台，也就是说，它们位于扩增的指数相，并且每个反应中所使用的两组引物彼此没有发生竞争。每组反应总是包括一个无样本的阴性对照。我们通常用含RNA而不是cDNA的样本作为阴性对照以排除基因组DNA污染。使用如下的引物：
Ki-Ras长链，左侧引物：ACATCTCTTTGCTGCCCAAT；SEQ ID No.1
右侧引物：GAGCGAGACTCTGACACCAA；SEQ ID No.2.
Ki-Ras短链，左侧引物：TCGACACAGCAGGTCAAGAG；SEQ ID No.3
右侧引物：AGGCATCATCAACACCCTGT.SEQ ID No.4
Ha-Ras，左侧引物：CCAGCTGATCCAGAACCATT；SEQ ID No.5
右侧引物：AGGTCTCGATGTAGGGGATG.SEQ ID No.6
细胞遗传学分析
成纤维细胞的细胞遗传学研究在细胞与FTI-277(20μM)孵育24小时之前和之后进行。成纤维细胞培养置于35mm Petri皿中的盖玻片上。加入2ml ChangB之后，表皿在5％CO2孵箱中37℃孵育48小时，在加入秋水仙酰胺溶液(0，1μg/ml)作用90分钟后收集细胞。盖玻片遵照标准操作规程进行固定和Q-banded，使用荧光显微镜Zeiss Axioplan 2观测结果。图像用双通道照相机捕获，此照相机连接在运行MacKtype 5.4软件(Powergene Olympus Italy)的计算机上。染色体鉴别和染色体组型命名遵从人类细胞遗传学命名国际系统(ISCN)的标准进行。
染色质提取和H2AX磷酸化
细胞培养皿用0.2m1缓冲液((120mM NaCI，40mM Hepes，5mMMgCI2，1mM EGTA，0.5mM EDTA，0.6％Triton X 100，2mM原钒酸钠，2μg/ml抑酞酶，1mM PMSF)溶解后以14000×g在4℃离心15分钟，蛋白含量用Bio-Rad蛋白分析系统(12)测定。沉淀重悬浮于含80-100U DNA酶的40μl缓冲液中，在冰上孵育15分钟。提取物变性后在12％SDS PAGE中分离。如前描述进行特异性抗体的免疫印迹。
统计学分析
数据表示为均值±1SD。均值比较用Student′s配对和非配对t检验。P值小于0.05被认为有显著性意义。所有数值均为双尾检验。
结果
来自硬皮病患者的免疫球蛋白诱导ROS产生并与PDGF受体反应
体外SSc成纤维细胞自发释放ROS(7)，源自SSc患者的IgG与正常人成纤维细胞结合(10)。由于PDGF诱导ROS的蓄积(9)，作者调查了SSc患者中是否可能存在靶向PDGFR的激动性血清抗体。为了检验这一假说，他们从系统性硬化病患者中纯化了总IgG并通过测定下列内容确定了它们的生物学活性：1.ROS水平；2.PDGFR的酪氨酸磷酸化；3.在存在或缺乏特异的PDGFR抑制剂时ERK1/2的活化。作为靶细胞，他们使用小鼠胚胎细胞系，如参考文献所述，其携带无活性的α和βPDGFR亚单位副本。表达重组α或βPDGFR亚单位(Fα，Fβ和Fαβ)的相同细胞系用各种IgG部分来激发。细胞被营养剥夺，在用纯化的IgG处理以测定ROS前，先与过氧化物敏感的荧光团DCF孵育。
SSc IgG激发的ROS在Fα，Fβ和Fαβ细胞中的产生呈剂量依赖性。自加入IgG 15分钟后，ROS快速升至最高水平，在40-120分钟后恢复到基线水平。用Fα细胞和大约200μg/ml of IgG能获得正常和SSc IgG间的最佳辨别。除非特别指出，随后所有实验均遵循这些条件。
作者们接下来检测了一组46例不相关硬皮病患者中刺激性IgG的流行性。图1A显示由SSc IgG(200μg/ml作用15分钟/20000细胞；168.8±59)诱导的ROS水平显著高于与正常IgG(1.4±2.9)，PRP IgG，(5.1±7)，SLE IgG(4.8±9)，和RA IgG(2.7±7)孵育后产生的ROS(P＜0.0001)。使用95％作为正常值的上限，在所有硬皮病患者中发现刺激ROS水平的抗体，而在正常受试者中却没有(图.1A)。在原发性雷诺现象(PRP)患者，以及系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)患者中未检测到该抗体。SSC IgG的ROS诱导活性经PDGFR介导。此点由下述几点表明：1.细胞与PDGFR酪氨酸激酶抑制剂AG 1296(2μM作用2小时)预孵育抑制了Fα细胞与SScIgG孵育后诱导的ROS(图1A)；2.SSc IgG不刺激F-/-细胞中ROS的产生(图1A)；3.SSc IgG而不是源自正常受试者的IgG可免疫沉淀来自PDGFR-表达细胞的PDGFRα和β亚单位(图1B)；4.与Fα细胞预吸收可完全去除源自硬皮病IgG的PDGFR-相互作用抗体(图.1C)，相反的，与F-/-细胞预吸收则不能去除PDGFR相互作用抗体(图.1C)。此外，与Fα细胞吸收后的上清不能刺激ROS的产生(数据未显示)。
源自硬皮病患者的IgG引发正常成纤维细胞中Ras-ERK1/2-ROS级联反应
为剖析源自SSc患者的IgG引发的信号级联反应，作者分析了存在特异性抑制剂时SSc IgG的ROS生成活性(3例患者，3例正常对照)：1.EGFR信号传导抑制剂(AG1478，2μM作用2小时)；2.Ras附着于质膜所需的法尼基转移酶抑制剂FT-277(20μM作用2小时)3.MEK抑制剂，位于ERK1/2上游的激酶，PD98059(40μM作用2小时)。这些抑制剂阻止正常成纤维细胞中由SScIgG诱导ROS(图2A)。相反地，这些抑制剂显著降低源自硬化病损害的成纤维细胞中ROS水平(8)。为了探究SSc IgG经PDGFR引发的特异信号转导级联反应，作者们分析了SSc细胞或被SSc IgG挑战的正常细胞中的Ras的生物活性。他们发现了PDGF和SSc IgG均诱导原代细胞Ras蛋白水平。这一效应是ERK1/2依赖性的并且是原代细胞特异性的。图.2B显示源自SSc患者的IgG诱导Ha-Ras，并且经特异抗体的免疫荧光和免疫印迹证实这一诱导可以被PDGFR抑制剂阻断。
为更精确地确定SSc IgG靶标，作者们对2例SSc患者，1例SLE患者和2个正常受试者来源的IgG以同样蛋白浓度(200μg/ml)进行了免疫沉淀。免疫沉淀物在PAGE上分离并用真正的PDGFRα和β亚单位以及抗EGFR抗体进行了免疫印迹。图2C显示只有从SSc患者分离的IgG能有效免疫沉淀PDGFRα和β亚单位。从SSc患者血清分离的IgG不能经直接免疫印迹法识别重组的PDGFRα和β亚单位，提示这些抗体识别仅天然受体中才存在的构象(数据未显示)。
此外，为确定抗体-受体相互作用的刺激性性质，作者们用源自1例SSc患者的浓度不断增加的IgG挑战正常成纤维细胞15分钟，并测定PDGFR的酪氨酸磷酸化。来自SSc患者的IgG以剂量依赖性方式诱导PDGFR酪氨酸磷酸化(图.2D)。他们注意到：与PDGF相比，源自几个SSc患者(大约4个)的IgG诱导尽管强度较小，但时间却延长的PDGFR酪氨酸磷酸化(数据未显示)。
源自SSc患者的抗PDGFR激动性抗体的生物学效应
为了测定由SSc IgG诱导的生物学效应，作者们分析了接触SSCIgG后，正常人成纤维细胞中2个基因-α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和I型胶原蛋白的表达，它们的表达是系统性硬化病患者的成纤维细胞的特征。肌动蛋白(α-SMA)是肌成纤维细胞的区别性标志，该细胞是从成纤维细胞发展而来，而同时保持平滑肌细胞和成纤维细胞特征的间充质细胞。人成纤维细胞在进行免疫组织化学分析和免疫印迹测定α-SMA前，先在存在或缺乏AG1296(2nM作用24小时)下，用PDGF(15ng/ml作用24小时)，正常人IgG(NIgG；200μg/ml作用24小时)和硬皮病IgG(SSc IgG；；200μg/ml作用24小时)刺激。肌动蛋白(α-SMA)被SSc IgG而不是正常IgG刺激(图.3A)。I型和II型胶原蛋白mRNAs被SSc IgG而不是正常IgG强力诱导(图.3B)。
最后，作者们检测了内皮细胞对SSc IgG诱导的凋亡的敏感性。当SSc细胞被应激和接触SSC IgG(200μg/ml过夜)时，它们较对照细胞更易凋亡。细胞与PDGFR抑制剂孵育后可阻止凋亡。要注意的是在同样的条件下，PDGF不能诱导凋亡((图.3C)。
讨论
系统性硬化病中PDGF受体的刺激性抗体。
本研究证明了硬皮病(SSC)患者血清中存在PDGFR刺激性抗体。5个独立实验证据支持这一结论：1.源自SSC患者的纯化的免疫球蛋白部分能诱导PDGFR+而不是PDGF-/-细胞的ROS水平；2.源自SSC患者的免疫球蛋白部分识别和免疫沉淀天然构象的PDGFR(α和β链)；3.SSC IgG的PDGFR结合和ROS产生活性可被PDGFR表达细胞而不是PDGF-/-细胞的预吸附消除；4.源自SSC患者的免疫球蛋白部分在正常成纤维细胞中诱导肌成纤维细胞转化以及I型胶原蛋白和ROS的产生。5.最后，但相当重要的是，作者们发现在迄今为止分析的(46)所有系统性硬化病患者中存在而在正常(20)对照中决不存在这些抗体。SSC免疫球蛋白的ROS-诱导活性可被PDGFR抑制剂抑制。这些抗体在原发性雷诺现象，系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎患者中检测不到。尽管如此，他们选择性地在同种异体骨髓移植后呈现硬皮病样皮肤损害的移植物抗宿主反应(GVHD)的患者中发现了具有上述特征的抗体。基于这些发现，这些抗体的存在是疾病特异性的，并且是系统性硬化病患者的标志。
抗体，活性PDGF-R和ROS
系统性硬化病的发作可能是这些抗体在血液中的蓄积所引发的。作者们鉴定了由PDGF和这些抗体始发的级联反应，并且他们发现了由生长因子和ROS进行的一个新的Ras蛋白调节。在正常原代细胞中，Ras蛋白经由不断的降解维持在低水平。PDGF可短暂诱导ROS，ROS刺激ERK1/2，最终阻止Ras蛋白经由蛋白酶体进行降解。ROS经ERK1/2抑制这些信号，PDGF通过增加ROS水平稳定Ras蛋白(8)。
PDGF和源自SSC患者的抗体均诱导ROS并稳定Ras(图2B)。然而，它们在受体活化动力学上显示出重要的区别。与PDGF相比，因为抗体的效果持续时间长，所以是长时作用的PDGFR刺激因子。由SSCIgG诱导的ROS可持续60-120分钟，然而PDGF诱导的ROS在15-30分钟内恢复到基线水平。持续的ROS蓄积使得Ras-ERK1/2-ROS维持在高于正常对照的水平，这也许可以解释体外低血清中的SSC细胞中ROS的水平高。尽管由SSC IgG诱导的酪氨酸磷酸化水平相对低于PDGF，但是它持续的时间较长(60比15分钟)(图2D，以及未显示的数据)。
与PDGF相比，PDGF受体的抗体在胞膜上可以保持更长时间并产生尽管强度较小但却是持续性的刺激。
早期和晚期系统性硬化病的表型。
作者们分析了正常细胞中SSc IgG的短期和长期生物学效应。其表型很近似地重现了系统性硬化病体内的特征。由SSC IgG诱导的高ROS水平由于Ha Ras蛋白和活性ERK1/2处于高水平，导致成纤维细胞和内皮细胞对血清和其他生长因子应答性更强。胶原基因和肌动蛋白(α-SMA)的转录活化导致了肌成纤维细胞和纤维化的出现。另一方面，当内皮细胞接受ROS应激时变得更加易于凋亡。然而，作者们注意到，暴露于ROS和IgG SSc后的细胞表型可能能够解释此种疾病的远期后果。源自SSC患者的成纤维细胞会快速衰老并蓄积DNA和染色体异常(8)。这也许可以解释在慢性损害中的细胞丢失。我们的数据提供了系统性硬化病表型的机理性解释。被自身抗体识别的PDGFR上的表位可能与诊断测试的敏感性增加和麻烦程度较小相关，也与研制靶向特异性治疗有关，以及与解释在自身抗体结合PDGFR上的不同表位的情况下，硬皮病患者的临床差异有关。
这一领域的专家应该领会可以采用本领域已知的很多方法来鉴定表位，例如噬菌体展示库。由于内皮细胞损伤是硬化病临床史的早期事件，因此血管内皮细胞损伤延长导致的表位暴露可能诱导自体免疫。在此情形中，尽管发病机制上与血管和纤维化特征的持续相关，抗PDGFR自身抗体起因于一原发的，独特的事件。或者，可以假定自身抗体是原发性事件。这一问题的答案应可能来自对最终发展为明显系统性硬化病的雷诺现象患者的纵向研究。无论如何，原发性雷诺现象患者没有自身抗体提示自身抗体在这种血管痉挛性紊乱的致病中不起作用，并且可以利用它的检测以鉴别原发性雷诺现象患者和系统性硬化病患者。
通常硬化病最相关的自身抗体包括抗着丝粒和抗拓扑异构酶-I抗体，它们分别以20-30％和9-20％存在(28)。尽管它们对于鉴别高危人群特异临床表现的诊断和预测有帮助，但这些自身抗体是否在致病中有真实作用仍存在很多争议。
在众多的自身免疫性疾病中，只有Grave′s病，一种器官特异性自身免疫性疾病，其特征为一种抗(TSH)受体的刺激性自身抗体。我们的工作首次报道了结缔组织病中的类似发现。而且，我们的数据将体液免疫和Th2-依赖性免疫应答推进到硬化病的核心病因(29)，这与硬化病皮肤中的基因表达分析(30)相一致。
总之，作者们已经鉴定了硬化病患者中的抗PDGF受体的抗体，它们具有激动活性。这些抗体引发胞内包括Ha-Ras-ERK1-2-ROS的环路，此环路导致内皮细胞损伤和胶原基因表达增加。最近，作者们成功地纯化了抗PDGFR ROS刺激性抗体并测定了它们的纯化克隆的生物学活性。这些强力表明了它们在系统性硬化病发作中作为病原的作用。在此所示数据得到的一个重要暗示是确定了诊断和靶向治疗系统性硬化病的可能工具。
PDGF和活性氧(ROS)经ERK1/2调节人原代成纤维细胞中的Ras蛋白水平。
结果
PDGF诱导Ras蛋白水平
在静止的原代人成纤维细胞中Ha-Ras蛋白几乎不能测出。为了精确测定Ki和Ha Ras蛋白水平，作者们将总细胞蛋白溶解于0.1％SDS(RIPA缓冲液)，用pan Ras抗体对它们进行了免疫沉淀。免疫沉淀物用凝胶电泳进行分离并用特异Ras同种型抗体进行了免疫印迹。用PDGF刺激细胞15分钟足以诱导Ha-Ras蛋白，尽管存在生长因子，但Ha-Ras蛋白会在刺激后120分钟降至最初水平。Ki-Ras蛋白水平也同样可被PDGF刺激，但效率较低，并且具有不同的动力学。Ki-Ras较少被诱导并且缓慢消退(PDGF刺激后3小时)(图4A)。荧光显微镜检查(图4B)或用抗-Ha-Ras单克隆或多克隆特异性抗体的FACS分析(图4C)也可观察到Ha-Ras诱导。
用翻译抑制剂亚胺环己酮处理细胞不能阻止PDGF诱导Ha-Ras(图.4D)。此外，PDGF处理不会改变Ki和Ha-Ras的mRNA水平(图.4E)。为了排除由PDGF诱导的Ha-Ras与富脂膜组分相关并且不能通过免疫沉淀程序有效提取，作者们用50mM环糊精处理细胞以在免疫沉淀前去除胆固醇。使用环糊精处理不能消除PDGF对Ha-Ras的诱导(图4补充资料)。
总结在一起，这些数据表明原代成纤维细胞中Ha和Ki-Ras蛋白水平被PDGF翻译后调节。作者们从几个实验中推测由PDGF诱导的Ha-Ras蛋白的半衰期大约是40分钟(图4A，及未显示的数据)。
PDGF刺激ROS和ERK1/2
PDGF通过刺激NADPH氧化酶来激活ROS的产生(3a，19a)(图.5A)。PDGF刺激后ROS产生的动力学复现了诱导Ha Ra s的动力学(图.4和图.5A)。为了测定ROS是否参与PDGF诱导Ha-Ras，作者们用非特异性ROS清除剂(N-乙酰基-半胱氨酸，NAC)或NADPH氧化酶抑制剂(DPI)处理细胞后，在存在或缺乏PDGF时测定Ha-Ras水平。图5B显示NAC和DPI显著抑制PDGF诱导的Ha-Ras水平。用抗Ha-Ras抗体的免疫荧光法也表明了这点(图5C)。正常细胞中PDGF诱导Ha-Ras的动力学曲线也复现了ERK1-2激活曲线(数据未显示)，提示在MEK-ERK1/2和Ha-Ras诱导间存在关系。为了洞察这一过程，他们测定了ERK 1-2信号转导化学抑制剂(PD 98059)预处理的细胞中的Ha-Ras，此抑制剂抑制MEK(MAPKK)-一种位于ERK 1/2MAPK上游的激酶。细胞用PD98059处理后抑制了由PDGF诱导Ha Ras(图5D)。在进行抗Ras抗体免疫沉淀的同样的提取物中，他们测定了PDGF受体。图2D显示PDGF处理不依赖于ERK1/2激活而下调了此受体(图5D)。为了测定PDGF激活ERK1/2是否也对ROS缺失敏感，他们在存在一般性ROS清除剂(NAC)或NADPH氧化酶抑制剂(DPI)时用PDGF处理细胞。图5E显示由PDGF激活的ERK1/2对NAC和DPI敏感，这提示ROS缺失干扰PDGF对ERK1/2的激活。时间进程实验显示ERK1/2的早期激活(PDGF刺激5分钟)不需要ROS。然而，它们在PDGF刺激15-20分钟后放大了MEK-ERK1/2活性(图5E)。
ROS诱导Ha Ras水平
上述数据显示在原代成纤维细胞中PDGF经ROS和ERK1/2诱导Ha-Ras蛋白水平。为了研究PDGF和ROS间的机制和关联，作者们在存在ERK 1-2信号转导化学性和生物学抑制剂时用H₂O₂刺激细胞。为此，他们用1.抑制MEK(MAPKK)的PD 98059和U0126(分别孵育2小时和15分钟)，和2.抑制细胞MEK的显性阴性MEK变体(见材料和方法)。图6A，6B和6C所示结果证明H₂O₂诱导Ha-Ras可经MEK抑制而消除。为了证实H₂O₂是PDGF的下游，他们在存在PDGF或H₂O₂时，用酪氨酸激酶抑制剂--染料木黄酮处理细胞。图6D所示数据提示H₂O₂也在存在染料木黄酮时是Ha Ras的强力诱导剂。如期望的，该药物抑制PDGF对Ha-Ras的诱导。然而，在存在染料木黄酮时进行长时间(90分钟)的孵育抑制H₂O₂对Ha-Ra s和ERK1/2的诱导，提示H₂O₂的长期效应需要活性PDGF受体(数据未显示)。将图5和图6阐明的数据归纳起来提示PDGF经ERK1/2和ROS诱导Ha-Ras蛋白。由于它们不依赖于受体的激活而诱导Ha-Ras，因此ROS是PDGF受体的下游。然而，ROS诱导的Ha Ras蛋白在缺乏活性PDGF受体时是短暂的(数据未显示)。ERK1/2下调(图5D，5E和图6)降低Ha Ras水平。经由表达组成型活性Ha-Ras或显性阳性MEK蛋白以维持ERK1/2高水平，此时，ROS产生处于高水平并且内源性Ha Ras不消退(数据未显示)。原代成纤维细胞中，由于ERK1-2抑制仅轻微影响Ki-Ras水平，因此这一过程对Ha-Ras特异。更为重要的是，由于稳态细胞，如3T3成纤维细胞，CHO，PC12和COS7含有稳定和高水平的对ERK1/2抑制不敏感(数据未显示)的Ha-Ras，因此Ha-Ras稳态只为原代细胞所特有。
上述列出的数据没有清楚表明PDGF-ROS-ERK1/2诱导的Ha Ras稳定的机制。为此，作者们用一种广泛应用的蛋白酶体抑制剂MG132和一种已知能够经抑制内涵体酸化来抑制受体再循环的毒素-莫能菌素来处理细胞。图6E显示MG132诱导Ha Ras且当与PDGF或H₂O₂同用时，它的效应不是累加的。相反的，莫能菌素单独或与PDGF或H₂O₂同用时对Ha Ras水平没有作用。
硬皮病成纤维细胞中体内ROS-Ras信号转导的放大
为了明确体内连接ROS和Ras的信号转导途径是否相关，作者们采用了源自患有系统性硬化病患者的成纤维细胞。这些细胞产生高水平的ROS(12a)并且因它们的血清中存在刺激性抗-PDGF受体的抗体，经受PDGF信号转导的组成型体内刺激。图7A显示源自这些患者的3个成纤维细胞系含有高水平的ROS，超氧化物和H₂O₂水平。ROS能够被法尼基转移酶，MEK和Ras(未显示)抑制剂强力抑制(图7A)。此外，与正常对照相比，这些细胞含有高水平的Ha Ras蛋白(图7B)。Ras活性相对于正常对照细胞也升高了(图7C)。作者们最近完成了对46例系统性硬化病患者的分析，在所有病例中，Ha/Ki比值高于2。对Ras下游效应器(AKT和ERK1/2)的分析显示只有ERK1/2被选择性激活(图7D)。ROS、Ras和ERK1/2激活是关联的，因为MEK抑制剂，ROS清除剂或法尼基转移酶抑制剂能够降低Ras P-ERK1/2和ROS水平(图7A)。以低血清浓度培养的细胞中，ROS，Ha Ras和活性ERK1/2缓慢衰退，1-2天后恢复到基线水平(数据未显示)。
体内Ha Ras稳定的生物学后果：高ROS，高ERK，DNA损伤，胶原合成，老化
作者们接下来问ROS-Ras扩大是否影响这些细胞系的表型。为此，他们测定了：1.DNA损伤检查点的活化，或直接的染色体改变；2.应激诱导的凋亡；3.ROS引起的胶原基因转录活化。图8显示硬化病细胞含有：1.活化的ATM，这是通过组蛋白H2AX磷酸化分析的；2.p21WAF的蓄积(图8A)，和3.染色体损伤(图8B)。在培养中扩大之前，染色体异常就在体内存在并且在培养后继续产生。这些改变被ROS放大并且导致了对这些细胞的阴性选择(数据未显示)。这些解释了为什么在培养的第1和2天，细胞与法尼基转移酶抑制剂或ROS清除剂孵育显著降低分裂中期改变的数目(图8B)。这些细胞对氧化应激诱导的凋亡极其敏感，此种凋亡能够被与MEK抑制剂-PD98059预孵育所抑制(图8C)。最后，对ROS极其敏感的胶原基因的转录被强烈刺激(图8D和8E)。用MEK或法尼基转移酶抑制剂或ROS清除剂处理细胞抑制所有这些特征(图8B，8C，8D，8E)。截止目前，他们已经在大约15个源自系统性硬化病患者的独立成纤维细胞系中重复了这些数据(数据未显示)。
作为补充途径，他们用与硬化病细胞中存在比例(3∶1)几乎相同比例的Ha或Ki Ras对正常成纤维细胞进行转染。作者们发现Ha-Ras表达显著刺激ROS产生。他们通过以相对于Ki Ras 5∶1的比例表达Ha Ras重复了所有图8中列出的特性(胶原诱导，DNA损伤，H₂O₂诱导的凋亡)(图5补充资料和参考文献15)。
这些数据在ROS-Ras放大和体内硬皮病成纤维细胞复杂表型间建立了联系。此外，他们为此种目前尚无法治愈的疾病提供了可能的诊断和靶向治疗工具。
讨论
这些数据显示了一种新的以前不知道的Ras蛋白调节水平。在已建立的和永生细胞系中，Ras仅受GTP-GDP结合活性调节。由于在发育或成年器官中无法承受Ha或Ki Ras的广泛表达，在原代细胞中这些蛋白保持在低水平(20a)。在原代成纤维细胞中，Ras蛋白通过蛋白酶体的降解维持低水平(图6E)。
由生长因子和ROS诱导Ras并不是原代成纤维细胞独特的，而是也存在于人外周淋巴细胞，原代神经元和原代小鼠星形胶质细胞中。在这些细胞中，H₂O₂刺激Ha和Ki Ras。
在原代成纤维细胞中Ras蛋白的蓄积经PDGF和ERK1/2引发(图4和5)。PDGF诱导的ROS维持ERK1/2处于活化(图5)。ROS诱导Ras不依赖于PDGF刺激并且可被ROS维持(图6)。然而，如果没有PDGF刺激，H₂O₂不能更长时间(2小时)维持高Ha Ras水平。
至于由PDGF和ROS诱导Ha-Ras的潜在机制，显示于图6E的数据表明Ha Ras蛋白经26S蛋白酶体降解并且ERK1/2可以保护Ha Ras免于降解。类似地，c-myc经蛋白酶体降解(21a)并且被MEKK1引起的应激所稳定(22a)。ROS和Ha-Ras蛋白水平之间联系的示意图见图9。作者们提出ROS增力Ras蛋白水平并且放大PDGF信号转导。对Ras蛋白水平的调节保护原代细胞免受生长因子的过度刺激，此种刺激可能导致凋亡或DNA损伤和氧化应激。
体内ROS-Ras信号转导的放大
所描述的途径在体内是相关的，因为作者们在自系统性硬化病患者损伤处分离的细胞中发现了它。系统性硬化病是一种自身免疫性疾病，其特征为成纤维细胞过度产生胶原(23a)所致的皮肤和内脏的过度纤维化。源自系统性硬化病患者的成纤维细胞含有高水平的HaRas和ROS以及ERK1/2组成型活化。这些特征都是作者们已经描述的正常成纤维细胞被H₂O₂刺激后信号转导的标志。系统性硬化病患者合成PDGF受体的刺激性抗体。这些抗体刺激成纤维细胞和单核细胞产生高水平ROS(14a)，这使得ERK1/2爆发并诱导Ha Ras(Svegliati等.，提交的)。对此环路(ERK1/2，Ras，ROS)中任何成分的抑制会下调此系统并消除Ras-ROS激活的生物学效应，例如细胞的加速老化，细胞加速老化是系统性硬化病细胞表型的特征(23a，24a)。这些细胞1.易于凋亡，2.DNA严重受损，3.被ROS诱导的基因的转录被强力诱导。在此框架中，细胞丢失(凋亡)和胶原沉积的后果是纤维化(23a，24a)。最初由PDGF受体刺激引发的环路变得相对自主，因为Ras-ERK1/2激活NADPH氧化酶后产生的ROS(24)维持其水平。这解释了为什么对ROS，或ERK1/2或Ras的抑制使得硬皮病细胞转化为正常成纤维细胞。然而，由于抑制PDGF受体4-12小时会降低Ras-ROS-ER1/2-胶原水平(数据未显示)，因此长时的ROS产生需要PDGF信号传导。在有生理性刺激存在时，对Ras蛋白水平的调节可以保护原代细胞免于过度的或不适当的刺激。ROS与Ras的偶联强调了Ras蛋白作为氧化还原信号传导传感器和调节器的最初作用。原代细胞的不同周转和Ha和Ki Ras对ROS水平的不同作用(7a)提示这2个同工型的激活将产生的ROS类型和水平的信号传导到不同的细胞区。Ras-ERK1/2信号系统的组成型或突变激活导致了此种类型调节的丧失。这可能可以解释表达Ras2val19或Ras2野生型Ras的酿酒酵母(S.cerevisiae)生命周期的相反表型(11a)。在原代细胞中，老化或生长或分化很可能依赖于此环路的完整性。
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22a.Alarcon-Vargasi，D.，Tansey，W.P.and Ronai Z.(2002)Oncogene(2002)21，4384+-4391
23a.Kahari，V.M.，Vuorio，T.，Nanto-Salonen，K.&Vuorio，E.(1984)Biochim Biophys Acta 781，183-6.
24a.Ohtsuka，T.(1998)Dermatology 190，204-7.
25a.Piccinini，G.，Golay，J.，Flora，A.，Songia.S.，Luchetti，M.，Gabrielli，A.&Introna，M.(1999)J InvestDermatol 112，191-6.
序列表
<110>Avvedimento et al.
     Avvedimento，Vittorio Enrico
     Santillo，Mariarosaria
     Funaro，Ada
     Lucchetti，Michele
     Svegliati Baroni，Silvia
     Gabrielli，Armando
<120>PDGF受体的刺激性自身抗体作为病理学标记和治疗靶点
：    
<130>PCT 94780
<150>US 60/703,377
<151>2005-07-28
<160>8
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>智人
<400>1
acatctcttt gctgcccaat    20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>智人
<400>2
gagcgagact ctgacaccaa    20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>智人
<400>3
tcgacacagc aggtcaagag    20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>智人
<400>4
aggcatcatc aacaccctgt    20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>智人
<400>5
ccagctgatc cagaaccatt    20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>智人
<400>6
aggtctcgat gtaggggatg    20
<210>7
<211>1089
<212>PRT
<213>智人
<400>7
Met Gly Thr Ser His Pro Ala Phe Leu Val Leu Gly Cys Leu Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Leu Ile Leu Cys Gln Leu Ser Leu Pro Ser Ile Leu Pro
            20                  25                  30
Asn Glu Asn Glu Lys Val Val Gln Leu Asn Ser Ser Phe Ser Leu Arg
        35                  40                  45
Cys Phe Gly Glu Ser Glu Val Ser Trp Gln Tyr Pro Met Ser Glu Glu
    50                  55                  60
Glu Ser Ser Asp Val Glu Ile Arq Asn Glu Glu Asn Asn Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Phe Val Thr Val Leu Glu Val Ser Ser Ala Ser Ala Ala His Thr Gly
                85                  90                  95
Leu Tyr Thr Cys Tyr Tyr Asn His Thr Gln Thr Glu Glu Asn Glu Leu
            100                 105                 110
Glu Gly Arg His Ile Tyr Ile Tyr Val Pro Asp Pro Asp Val Ala Phe
        115                 120                 125
Val Pro Leu Gly Met Thr Asp Tyr Leu Val Ile Val Glu Asp Asp Asp
    130                 135                 140
Ser Ala Ile Ile Pro Cys Arg Thr Thr Asp Pro Glu Thr Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Leu His Asn Ser Glu Gly Val Val Pro Ala Ser Tyr Asp Ser Arg Gln
                165                 170                 175
Gly Phe Asn Gly Thr Phe Thr Val Gly Pro Tyr Ile Cys Glu Ala Thr
            180                 185                 190
Val Lys Gly Lys Lys Phe Gln Thr Ile Pro Phe Asn Val Tyr Ala Leu
        195                 200                 205
Lys Ala Thr Ser Glu Leu Asp Leu Glu Met Glu Ala Leu Lys Thr Val
    210                 215                 220
Tyr Lys Ser Gly Glu Thr Ile Val Val Thr Cys Ala Val Phe Asn Asn
225                 230                 235                 240
Glu Val Val Asp Leu Gln Trp Thr Tyr Pro Gly Glu Val Lys Gly Lys
                245                 250                 255
Gly Ile Thr Met Leu Glu Glu Ile Lys Val Pro Ser Ile Lys Leu Val
            260                 265                 270
Tyr Thr Leu Thr Val Pro Glu Ala Thr Val Lys Asp Ser Gly Asp Tyr
        275                 280                 285
Glu Cys Ala Ala Arg Gln Ala Thr Arg Glu Val Lys Glu Met Lys Lys
    290                 295                 300
Val Thr Ile Ser Val His Glu Lys Gly Phe Ile Glu Ile Lys Pro Thr
305                 310                 315                 320
Phe Ser Gln Leu Glu Ala Val Asn Leu His Glu Val Lys His Phe Val
                325                 330                 335
Val Glu Val Arg Ala Tyr Pro Pro Pro Arg Ile Ser Trp Leu Lys Asn
            340                 345                 350
Asn Leu Thr Leu Ile Glu Asn Leu Thr Glu Ile Thr Thr Asp Val Glu
        355                 360                 365
Lys Ile Gln Glu Ile Arg Tyr Arg Ser Lys Leu Lys Leu Ile Arg Ala
    370                 375                 380
Lys Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Thr Ile Val Ala Gln Asn Glu Asp
385                 390                 395                 400
Ala Val Lys Ser Tyr Thr Phe Glu Leu Leu Thr Gln Val Pro Ser Ser
                405                 410                 415
Ile Leu Asp Leu Val Asp Asp His His Gly Ser Thr Gly Gly Gln Thr
            420                 425                 430
Val Arg Cys Thr Ala Glu Gly Thr Pro Leu Pro Asp Ile Glu Trp Met
        435                 440                 445
Ile Cys Lys Asp Ile Lys Lys Cys Asn Asn Glu Thr Ser Trp Thr Ile
    450                 455                 460
Leu Ala Asn Asn Val Ser Asn Ile Ile Thr Glu Ile His Ser Arg Asp
465                 470                 475                 480
Arg Ser Thr Val Glu Gly Arg Val Thr Phe Ala Lys Val Glu Glu Thr
                485                 490                 495
Ile Ala Val Arg Cys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gly Ala Glu Asn Arg
            500                 505                 510
Glu Leu Lys Leu Val Ala Pro Thr Leu Arg Ser Glu Leu Thr Val Ala
        515                 520                 525
Ala Ala Val Leu Val Leu Leu Val Ile Val Ile Ile Ser Leu Ile Val
    530                 535                 540
Leu Val Val Ile Trp Lys Gln Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Arg
545                 550                 555                 560
Val Ile Glu Ser Ile Ser Pro Asp Gly His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp
                565                 570                 575
Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Arg Trp Glu Phe Pro Arg Asp Gly
            580                 585                 590
Leu Val Leu Gly Arg Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Lys Val Val
        595                 600                 605
Glu Gly Thr Ala Tyr Gly Leu Ser Arg Ser Gln Pro Val Met Lys Val
    610                 615                 620
Ala Val Lys Met Leu Lys Pro Thr Ala Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala
625                 630                 635                 640
Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Thr His Leu Gly Pro His Leu Asn
                645                 650                 655
Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Ser Gly Pro Ile Tyr Ile
            660                 665                 670
Ile Thr Glu Tyr Cys Phe Tyr Gly Asp Leu Val Asn Tyr Leu His Lys
        675                 680                 685
Asn Arg Asp Ser Phe Leu Ser His His Pro Glu Lys Pro Lys Lys Glu
    690                 695                 700
Leu Asp Ile Phe Gly Leu Asn Pro Ala Asp Glu Ser Thr Arg Ser Tyr
705                 710                 715                 720
Val Ile Leu Ser Phe Glu Asn Asn Gly Asp Tyr Met Asp Met Lys Gln
                725                 730                 735
Ala Asp Thr Thr Gln Tyr Val Pro Met Leu Glu Arg Lys Glu Val Ser
            740                 745                 750
Lys Tyr Ser Asp Ile Gln Arg Ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr
        755                 760                 765
Lys Lys Lys Ser Met Leu Asp Ser Glu Val Lys Asn Leu Leu Ser Asp
    770                 775                 780
Asp Asn Ser Glu Gly Leu Thr Leu Leu Asp Leu Leu Ser Phe Thr Tyr
785                 790                 795                 800
Gln Val Ala Arg Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His
                805                 810                 815
Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Ala Gln Gly Lys Ile Val
            820                 825                 830
Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Met His Asp Ser Asn
        835                 840                 845
Tyr Val Ser Lys Gly Ser Thr Phe Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro
    850                 855                 860
Glu Ser Ile Phe Asp Asn Leu Tyr Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser
865                 870                 875                 880
Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Gly Thr Pro Tyr
                885                 890                 895
Pro Gly Met Met Val Asp Ser Thr Phe Tyr Asn Lys Ile Lys Ser Gly
            900                 905                 910
Tyr Arg Met Ala Lys Pro Asp His Ala Thr Ser Glu Val Tyr Glu Ile
        915                 920                 925
Met Val Lys Cys Trp Asn Ser Glu Pro Glu Lys Arg Pro Ser Phe Tyr
    930                 935                 940
His Leu Ser Glu Ile Val Glu Asn Leu Leu Pro Gly Gln Tyr Lys Lys
945                 950                 955                 960
Ser Tyr Glu Lys Ile His Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp His Pro Ala
                965                 970                 975
Val Ala Arg Met Arg Val Asp Ser Asp Asn Ala Tyr Ile Gly Val Thr
            980                 985                 990
Tyr Lys Asn Glu Glu Asp Lys Leu Lys Asp Trp Glu Gly Gly Leu Asp
        995                 1000                1005
Glu Gln Arg Leu Ser Ala Asp Ser Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Pro
    1010                1015                1020
Asp Ile Asp Pro Val Pro Glu Glu Glu Asp Leu Gly Lys Arg Asn
    1025                1030                1035
Arg His Ser Ser Gln Thr Ser Glu Glu Ser Ala Ile Glu Thr Gly
    1040                1045                1050
Ser Ser Ser Ser Thr Phe Ile Lys Arg Glu Asp Glu Thr Ile Glu
    1055                1060                1065
Asp Ile Asp Met Met Asp Asp Ile Gly Ile Asp Ser Ser Asp Leu
    1070                1075                1080
Val Glu Asp Ser Phe Leu
    1085
<210>8
<211>1106
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Met Arg Leu Pro Gly Ala Met Pro Ala Leu Ala Leu Lys Gly Glu Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Glu Pro Gln Ile Ser Gln Gly
            20                  25                  30
Leu Val Val Thr Pro Pro Gly Pro Glu Leu Val Leu Asn Val Ser Ser
        35                  40                  45
Thr Phe Val Leu Thr Cys Ser Gly Ser Ala Pro Val Val Trp Glu Arg
    50                  55                  60
Met Ser Gln Glu Pro Pro Gln Glu Met Ala Lys Ala Gln Asp Gly Thr
65                  70                  75                  80
Phe Ser Ser Val Leu Thr Leu Thr Asn Leu Thr Gly Leu Asp Thr Gly
                85                  90                  95
Glu Tyr Phe Cys Thr His Asn Asp Ser Arg Gly Leu Glu Thr Asp Glu
            100                 105                 110
Arg Lys Arg Leu Tyr Ile Phe Val Pro Asp Pro Thr Val Gly Phe Leu
        115                 120                 125
Pro Asn Asp Ala Glu Glu Leu Phe Ile Phe Leu Thr Glu Ile Thr Glu
    130                 135                 140
Ile Thr Ile Pro Cys Arg Val Thr Asp Pro Gln Leu Val Val Thr Leu
145                 150                 155                 160
His Glu Lys Lys Gly Asp Val Ala Leu Pro Val Pro Tyr Asp His Gln
                165                 170                 175
Arg Gly Phe Ser Gly Ile Phe Glu Asp Arg Ser Tyr Ile Cys Lys Thr
            180                 185                 190
Thr Ile Gly Asp Arg Glu Val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr Val Tyr Arg
        195                 200                 205
Leu Gln Val Ser Ser Ile Asn Val Ser Val Asn Ala Val Gln Thr Val
    210                 215                 220
Val Arg Gln Gly Glu Asn Ile Thr Leu Met Cys Ile Val Ile Gly Asn
225                 230                 235                 240
Glu Val Val Asn Phe Glu Trp Thr Tyr Pro Ang Lys Glu Ser Gly Arg
                245                 250                 255
Leu Val Glu Pro Val Thr Asp Phe Leu Leu Asp Met Pro Tyr His Ile
            260                 265                 270
Arg Ser Ile Leu His Ile Pro Ser Ala Glu Leu Glu Asp Ser Gly Thr
        275                 280                 285
Tyr Thr Cys Asn Val Thr Glu Ser Val Asn Asp His Gln Asp Glu Lys
    290                 295                 300
Ala Ile Asn Ile Thr Val Val Glu Ser Gly Tyr Val Arg Leu Leu Gly
305                 310                 315                 320
Glu Val Gly Thr Leu Gln Phe Ala Glu Leu His Arg Ser Arg Thr Leu
                325                 330                 335
Gln Val Val Phe Glu Ala Tyr Pro Pro Pro Thr Val Leu Trp Phe Lys
            340                 345                 350
Asp Asn Arg Thr Leu Gly Asp Ser Ser Ala Gly Glu Ile Ala Leu Ser
        355                 360                 365
Thr Arg Asn Val Ser Glu Thr Arg Tyr Val Ser Glu Leu Thr Leu Val
    370                 375                 380
Arg Val Lys Val Ala Glu Ala Gly His Tyr Thr Met Arg Ala Phe His
385                 390                 395                 400
Glu Asp Ala Glu Val Gln Leu Ser Phe Gln Leu Gln Ile Asn Val Pro
                405                 410                 415
Val Arg Val Leu Glu Leu Ser Glu Ser His Pro Asp Ser Gly Glu Gln
            420                 425                 430
Thr Val Arg Cys Arg Gly Arg Gly Met Pro Gln Pro Asn Ile Ile Trp
        435                 440                 445
Ser Ala Cys Arg Asp Leu Lys Arg Cys Pro Arg Glu Leu Pro Pro Thr
    450                 455                 460
Leu Leu Gly Asn Ser Ser Glu Glu Glu Ser Gln Leu Glu Thr Asn Val
465                 470                 475                 480
Thr Tyr Trp Glu Glu Glu Gln Glu Phe Glu Val Val Ser Thr Leu Arg
                485                 490                 495
Leu Gln His Val Asp Arg Pro Leu Ser Val Arg Cys Thr Leu Arg Asn
            500                 505                 510
Ala Val Gly Gln Asp Thr Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu
        515                 520                 525
Pro Phe Lys Val Val Val Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu
    530                 535                 540
Thr Ile Ile Ser Leu Ile Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro
545                 550                 555                 560
Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Lys Val Ile Glu Ser Val Ser Ser Asp Gly
                565                 570                 575
His Glu Tyr Ile Tyr Val Asp Pro Met Gln Leu Pro Tyr Asp Ser Thr
            580                 585                 590
Trp Glu Leu Pro Arg Asp Gln Leu Val Leu Gly Arg Thr Leu Gly Ser
        595                 600                 605
Gly Ala Phe Gly Gln Val Val Glu Ala Thr Ala His Gly Leu Ser His
    610                 615                 620
Ser Gln Ala Thr Met Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala
625                 630                 635                 640
Arg Ser Ser Glu Lys Gln Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser
                645                 650                 655
His Leu Gly Pro His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr
            660                 665                 670
Lys Gly Gly Pro Ile Tyr Ile Ile Thr Glu Tyr Cys Arg Tyr Gly Asp
        675                 680                 685
Leu Val Asp Tyr Leu His Arg Asn Lys His Thr Phe Leu Gln His His
    690                 695                 700
Ser Asp Lys Arg Arg Pro Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ser Asn Ala Leu
705                 710                 715                 720
Pro Val Gly Leu Pro Leu Pro Ser His Val Ser Leu Thr Gly Glu Ser
                725                 730                 735
Asp Gly Gly Tyr Mer Asp Met Ser Lys Asp Glu Ser Val Asp Tyr Val
            740                 745                 750
Pro Met Leu Asp Met Lys Gly Asp Val Lys Tyr Ala Asp Ile Glu Ser
        755                 760                 765
Ser Asn Tyr Met Ala Pro Tyr Asp Asn Tyr Val Pro Ser Ala Pro Glu
    770                 775                 780
Arg Thr Cys Arg Ala Thr Leu Ile Asn Glu Ser Pro Val Leu Ser Tyr
785                 790                 795                 800
Met Asp Leu Val Gly Phe ser Tyr Gln Val Ala Asn Gly Met Glu Phe
                805                 810                 815
Leu Ala Ser Lys Asn Cys Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val
            820                 825                 830
Leu Ile Cys Glu Gly Lys Leu Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala
        835                 840                 845
Arg Asp Ile Met Arg Asp Ser Asn Tyr Ile Ser Lys Gly Ser Thr Phe
    850                 855                 860
Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asn Ser Leu Tyr
865                 870                 875                 880
Thr Thr Leu Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile
                885                 890                 895
Phe Thr Leu Gly Gly Thr Pro Tyr Pro Glu Leu Pro Met Asn Glu Gln
            900                 905                 910
Phe Tyr Asn Ala Ile Lys Arg Gly Tyr Arg Met Ala Gln Pro Ala His
        915                 920                 925
Ala Ser Asp Glu Ile Tyr Glu Ile Met Gln Lys Cys Trp Glu Glu Lys
    930                 935                 940
Phe Glu Ile Arg Pro Pro Phe Ser Gln Leu Val Leu Leu Leu Glu Arg
945                 950                 955                 960
Leu Leu Gly Glu Gly Tyr Lys Lys Lys Tyr Gln Gln Val Asp Glu Glu
                965                 970                 975
Phe Leu Arg Ser Asp His Pro Ala Ile Leu Arg Ser Gln Ala Arg Leu
            980                 985                 990
Pro Gly Phe His Gly Leu Arg Ser Pro Leu Asp Thr Ser Ser Val Leu
        995                 1000                1005
Tyr Thr Ala Val Gln Pro Asn Glu Gly Asp Asn Asp Tyr Ile Ile
    1010                1015                1020
Pro Leu Pro Asp Pro Lys Pro Glu Val Ala Asp Glu Gly Pro Leu
    1025                1030                1035
Glu Gly Ser Pro Ser Leu Ala Ser Ser Thr Leu Asn Glu Val Asn
    1040                1045                1050
Thr Ser Ser Thr Ile Ser Cys Asp Ser Pro Leu Glu Pro Gln Asp
    1055                1060                1065
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Gln Leu Glu Leu Gln Val Glu Pro Glu
    1070                1075                1080
Pro Glu Leu Glu Gln Leu Pro Asp Ser Gly Cys Pro Ala Pro Arg
    1085                1090                1095
Ala Glu Ala Glu Asp Ser Phe Leu
    1100                1105