抗支原体药物和P37蛋白阻断剂 在制备抗肿瘤药物中的应用 【技术领域】
本发明涉及抗支原体药物或P37蛋白阻断剂在制备治疗或预防肿瘤或肿瘤转移的药物中的应用。本发明的抗支原体药物或P37蛋白阻断剂可以与常规抗肿瘤药物一起给药。因此，本发明还涉及含有抗支原体药物或P37蛋白阻断剂和常规抗肿瘤药物作为活性成分的药物组合物或药盒。
背景技术
支原体广泛存在于自然界，寄生于人类及其他哺乳动物、爬行动物、鱼类、节肢动物和植物。支原体通常表现为器官和组织特异性。由于AIDS引起免疫功能低下以及器官移植后全身免疫功能被抑制，支原体在这类患者组织特异性明显减小。细胞培养基是一个非自然环境下支原体的常见寄生地。从来自不同国家的文献报道中可以看出，实验室培养细胞中支原体污染从10％至87％不等，污染培养细胞的常见支原体菌株为猪鼻支原体、口腔支原体、精氨酸支原体以及莱氏支原体。
猪鼻支原体是一种动物致病原，它能引起关节炎，多浆膜炎及在其自然宿主豪猪体内引起慢性实验性关节炎，并且也是细胞培养中常见的感染源，在细胞表面寄生并增殖。
1995年，日本科学家从新鲜的胃癌标本中发现猪鼻支原体不仅在癌细胞系中存在，并且也在胃癌组织中存在，23份胃癌标本中11份有支原体感染，其中4份为猪鼻支原体。见Jpn.J.Cancer Res.86，791-794，1995年9月。
本申请人制备的胃癌特异性单抗PD4，最近证明为抗猪鼻支原体的单抗，利用该单抗对胃癌，肠癌，食管癌，肺癌进行免疫组化的检测发现阳性率均有50％以上，而在相应的正常组织中，阳性率明显低于癌症组织。
由于免疫组化可能存在抗原交叉反应，上述阳性结果不能作为肿瘤组织中存在猪鼻支原体的直接证据。
另外，虽然现有技术提示猪鼻支原体在一些肿瘤组织中的感染率较高。但这种高感染率可以解释为猪鼻支原体与这些肿瘤的单纯伴随关系或支原体的嗜瘤现象，或者猪鼻支原体直接导致肿瘤的发生。但现有技术中没有关于猪鼻支原体能直接导致肿瘤的可靠证据。
【发明内容】
本发明的发明人首次从肿瘤组织中分离培养获得了支原体，获得了肿瘤组织中存在支原体的直接证据。所分离的这些支原体猪鼻支原体和发酵支原体，在所有阳性培养标本中都有猪鼻支原体，部分肿瘤组织同时有发酵支原体。本发明人进一步研究发现，猪鼻支原体地P37蛋白能通过直接促进TNF-α的释放增强肿瘤细胞的浸润活性。
因此，本发明涉及一种预防或治疗肿瘤或肿瘤转移的方法，包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的抗支原体药物或P37蛋白阻断剂。
本发明还涉及抗支原体药物或P37蛋白阻断剂在制备用于预防或治疗肿瘤或肿瘤转移的药物中的应用。
本发明还涉及一种治疗肿瘤或肿瘤转移的方法，包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的常规抗肿瘤药物和抗支原体药物或P37蛋白阻断剂，所述抗支原体药物或P37蛋白阻断剂在给予常规抗肿瘤药物之前、同时或之后给予。
本发明还涉及抗支原体药物或P37蛋白阻断剂与常规抗肿瘤药物一起在制备用于治疗肿瘤或肿瘤转移的药物中的应用。
本发明还涉及一种治疗肿瘤或肿瘤转移的药物组合物，其含有抗支原体药物或P37蛋白阻断剂和一种常规抗肿瘤药物以及药用载体。
本发明还涉及一种药盒，其中含有装有抗支原体药物或P37阻断剂的容器、装有一种常规抗肿瘤药物的容器和任选的药物使用说明书。
本发明还涉及抗支原体药物或P37蛋白阻断剂在制备用于预防或治疗TNF-α过量分泌相关疾病的药物中的应用。
发明详述
本发明在严格无菌条件下收集新鲜胃癌标本，进行支原体的分离培养，同时用PCR和免疫组化方法进行鉴定，以证实胃癌组织中确实存在支原体的感染。本发明首次成功地从肿瘤组织中分离培养出了支原体。而且分离培养阳性结果与免疫组化染色、PCR扩增结果完全吻合率为87.5％(7/8)；61例标本的PCR结果和免疫组化检测结果，二者之间的吻合率达72.1％(44/61)。三种方法检测结果具有良好的一致性，从不同角度证实了胃癌中存在支原体的感染，且感染类型主要为猪鼻支原体和发酵支原体两种。国际上除有从AIDS病人的Karpasi肉瘤中分离出发酵和穿透支原体的报道外，迄今尚未见有从普通肿瘤中分离出支原体的报道。本发明首次从癌组织中分离得到支原体，为肿瘤组织中存在支原体的感染提供了直接证据。
另外，现有技术没有报道从人体组织中分离培养出猪鼻支原体。支原体对宿主、器官和组织有高度的特殊亲和性，从人体分离的支原体一般不寄生于动物。本发明的结果却显示，猪鼻支原体除了在自然宿主-猪的鼻腔内寄生之外，还可寄生在人体，特别是人类胃癌组织中。
为了寻找猪鼻支原体与肿瘤发生的关系，本发明利用猪鼻支原体感染小鼠的成纤维细胞32D，发现在感染10周后32D细胞在软琼脂上形成克隆的能力明显增加。本发明还用猪鼻支原体的主要抗原蛋白P37对人外周血单核细胞及胃癌细胞系N87进行了处理。结果发现，P37蛋白可促进上述不同细胞释放肿瘤坏死因子α(TNF-α)，而P37的抗体可中和P37的促TNF-α释放作用。TNF-α是目前公认的微生物感染所诱导的细胞因子中最重要的内源性促癌剂，与肿瘤的发生和转移相关。本发明还用boyd小室浸润试验观察了P37对胃癌细胞N87的浸润行为的影响，发现P37可以明显促进肿瘤细胞的浸润(类似于肿瘤细胞在体内的转移)，而P37抗体对此有中和作用。从而证明了猪鼻支原体及其主要抗原蛋白P37的导致肿瘤和肿瘤转移的直接证据，并且证明了猪鼻支原体和P37蛋白通过上调TNF-α诱发肿瘤和肿瘤转移的机制。
在现有技术中有大量关于肿瘤的研究，其中发现大量的微生物感染与肿瘤有这样那样的联系。但发现肿瘤的感染性病因并不是一件容易的事情，实际上迄今为止只有少数微生物的感染被认为能够引起肿瘤，如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、EB病毒(EBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、人疱疹病毒8(HHV8)、幽门螺杆菌、肝吸虫等(见H.KUPER等，Journal of Internal Medicine2000：248：171-183。虽然现有技术中有不少文献报道了支原体与肿瘤的关系，但本领域技术人员并不能依据这些报道得出支原体引起肿瘤的直接原因之一这样的结论。人们甚至对人体肿瘤中是否真的存在支原体、以及存在何种支原体(如果有的话)存有很大的疑问。支原体像其他大量的被怀疑与肿瘤有一定关系的微生物感染一样，并没有引起人们的足够关注。因此，在本发明之前，本领域技术人员不会想到利用抗支原体药物、特别是抗猪鼻支原体药物或P37蛋白阻断剂来治疗或预防肿瘤或肿瘤转移。由于本发明第一次从人体肿瘤组织分离到了猪鼻支原体，并且确切地证明了猪鼻支原体和P37蛋白的致瘤作用，自然得出了利用抗支原体药物、特别是抗猪鼻支原体药物或P37蛋白阻断剂治疗或预防肿瘤或肿瘤转移的技术方案。
本发明中所述的抗支原体药物可以是已知的杀支原体药物或支原体抑制剂。已知的抗支原体药物例如为：四环素类如四环素、土霉素、金霉素等；大环内酯类如红霉素、交沙霉素等；喹诺酮类如环丙沙星、诺氟沙星等。所述抗支原体药物也可以是抗支原体的多克隆或单克隆抗体。
本发明所述的P37蛋白阻断剂可以是抗P37蛋白的多克隆或单克隆抗体，也可以是任何可以阻断P37蛋白功能的其他物质。
本发明所述的常规抗肿瘤药物是指除本发明的抗支原体药物和P37蛋白阻断剂之外的其他抑制肿瘤生长或转移的药物。常规抗肿瘤药物例如可以是氯乙胺类，如苯达莫司汀、波呋莫司汀、卡莫司汀、牛磺莫司汀等；长春碱类，如长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、长春甘酯等；核毒性类，如米丁度胺、米托蒽醌、米托喹酮等；叶酸拮抗剂如甲氨蝶呤等；以及其他抗肿瘤药如阿西维辛、六甲蜜胺、卡铂、白消安、氮芥等。
在本发明的一个技术方案中，通过给予需要治疗的患者治疗有效量的抗支原体药物或P37蛋白阻断剂来预防或治疗肿瘤或肿瘤转移。
因此抗支原体药物或P37蛋白阻断剂可用于制备用于预防或治疗肿瘤或肿瘤转移的药物。
在本发明的另一技术方案中，通过联合给予需要治疗的患者治疗有效量的常规抗肿瘤药物和抗支原体药物或P37蛋白阻断剂来治疗肿瘤或肿瘤转移，所述抗支原体药物或P37蛋白阻断剂可以在给予常规抗肿瘤药物之前、同时或之后给予。
因此，抗支原体药物或P37蛋白阻断剂与常规抗肿瘤药物一起可用于制备用于治疗肿瘤或肿瘤转移的药物。
上述药物可以是一种治疗肿瘤或肿瘤转移的药物组合物，其含有抗支原体药物或P37蛋白阻断剂和一种常规抗肿瘤药物以及药用载体。
上述药物还可以是一种药盒的形式，其中含有装有抗支原体药物或P37阻断剂的容器、装有一种常规抗肿瘤药物的容器和任选的药物使用说明书。
本发明还涉及抗支原体药物或P37蛋白阻断剂在制备用于预防或治疗TNF-α过量分泌相关疾病的药物中的应用。
本发明的各种药物或阻断剂通常可经口服、非胃肠途径、舌下、透皮途径或肿瘤内注射途径给药。在根据本发明的方法治疗肿瘤或肿瘤转移时给药的活性成分的量取决于所治疗疾病的特性、严重性和病人的体重。具体的剂量可以由主治医师按常规方法确定。
在本发明用于口服、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、透皮、直肠内或肿瘤内给药的治疗肿瘤或肿瘤转移的药物组合物中，活性成分可以以剂量单位形式适用于人体。例如为冷冻干燥的形式或与常规药物载体混合的形式。适宜的剂量单位形式包括，口服形式，如可分散片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂和溶液或悬浮液；以及经舌下和颊内给药的形式；皮下、肌肉内、静脉内或肿瘤内给药的形式；局部给药或直肠给药的形式。
片剂形式的固体组合物通过将主要活性成分与药物赋形剂混合并压片而成。赋形剂例如为明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石、阿拉伯树胶等。片剂可以用蔗糖或其他物质包衣。还可以将片剂制成缓释片剂，以持续、延迟以及连续释放预定量的活性成分。
通过将活性成分与稀释剂混合并将混合物装入硬或软胶囊中，获得胶囊形式的制剂。
可用水分散的粉剂或颗粒剂可含有活性成分、分散剂或润湿剂、悬浮剂和调味剂等。
用于制成给药的栓剂可以用可可脂或聚乙二醇制得。
胃肠外给药使用的水溶液、盐溶液、油溶液、悬浮液或乳液可通过将活性成分溶解或分散在适当的注射用载体中而制得。
通过下列实施例和附图将更详细地阐述本发明，但本发明的范围并不限于这些实施例。
【附图说明】
图1A是用猪鼻支原体特异性引物PCR扩增阳性培养物DNA的结果。其中第1道为阳性对照；第2道为阴性对照；第3、4、6、8、9、10分别为3、4、6、8、9和10号培养物，其扩增结果为阳性。
图1B是用发酵支原体特异性引物PCR扩增阳性培养物中DNA的结果。其中第1道为阳性对照；第2道为阴性对照；第5、6、7道分别为第5、6、7号培养物，其扩增结果为阳性。
图2为RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析结果。其中：1.GST蛋白刺激组扩增产物，2.GST-P37蛋白刺激组扩增产物，3.GST-P37蛋白刺激组肿瘤坏死因子扩增片段HindIII酶切结果。
图3为表明P37蛋白剂量依赖性刺激外周血单核细胞释放肿瘤坏死因子：不同浓度的GST-P37和GST蛋白刺激单核细胞的上清对L929细胞的生长抑制。
图4表示PD4单抗中和GST-P37蛋白对外周血单核细胞的刺激作用。
图5表示用ELISA方法检测P37蛋白和细胞结合的结果。
图6表示免疫荧光法检测P37和AGS直接结合的结果。
图7 Northern blot分析P37蛋白刺激AGS细胞中TNF的表达：1.PBS，2.GST-P37+PD4，3.GST，4.GST-P37，5.GST-P37+mIgG，28s，18s为RNA标准对照。
图8显示Transwell Chamber方法检测P37蛋白对AGS细胞浸润能力影响的结果。图8A为各种情况下浸润细胞数的棒图；图8B为微孔膜中细胞的显微照片。
【具体实施方式】
实施例1
胃癌组织中猪鼻支原体的分离培养和鉴定
一、材料
1.胃癌标本：收集自2001年6月至2002年3月北京肿瘤医院手术切除胃癌标本共61例，术前均有组织学诊断。所有胃癌组织均在离体半小时内无菌操作取材，放入含葡萄糖的PPLO培养基中，4℃下尽快运送实验室。对部分胃癌组织立即进行分离培养，剩余癌组织分装，-70℃冻存，用于PCR检测。另收集上述胃癌的石蜡切片，用于免疫组化检测。
2.支原体培养基：
1)液体培养基：称取PPLO粉(DIFCO公司生产)21g，溶解于去离子水700ml，高压灭菌15min，分装为70ml/瓶，此为PPLO基础培养基。取基础培养基70ml，无菌添加灭活兔血清20ml、25％新鲜酵母浸液l0ml(pH值8.0)、50％葡萄糖2ml、0.4％酚红0.6ml、1N NaOH0.4ml、50mg/ml醋酸铊1.0ml和20万U/ml青霉素0.5ml，以上成分混匀后终末pH值调至7.8。
2)固体培养基：100ml液体培养基中含0.8g琼脂粉，分装至无菌的塑料平皿中，自然冷却凝固，4℃保存备用。
3.试剂盒：CLON-GEN支原体套式PCR试剂盒购自无锡市克隆遗传技术研究所，试剂盒提供能扩增8种支原体的外套通用引物及相应的内套特异性引物，可分别检测猪鼻支原体(Mhy)、发酵支原体(Mf)、肺炎支原体(Mp)、穿透支原体(Mpe)、生殖支原体(Mg)、解尿脲原体(Uu)、梨支原体(Mpi)和人型支原体(Mh)。T/A克隆试剂盒购自Promega公司。
4.免疫组化用抗体：鼠源性抗多种支原体单克隆抗体，由军事医学科学院微生物检测中心提供；Envision工作液购自GIBCO公司。
二、方法
1.支原体的分离培养：胃癌组织在离体半小时内无菌操作取材，取癌组织约0.5g，用无菌生理盐水清洗去除表面血块和坏死成分，剪为直径约1-2mm的碎块，转移至含有2.0ml PPLO液体培养基的试管中。吸取培养物0.2ml移至另一支含有1.8ml PPLO培养液的试管中，进行10倍系列稀释至10-3。用胶塞塞紧试管，放37℃温箱中培养。一周后自第一支试管中取0.2ml培养物用液体培养基10倍稀释后继续培养(即盲传)。此后每周从上一周的培养管中取0.2ml培养物稀释10倍后培养，连续8周。以PPLO液体培养基作为阴性对照，隔日观察所有培养管中液体的颜色和浊度变化，如颜色稍有变黄，即对其进行连续转种；若培养物颜色变黄且无混浊出现，经1-2次传代后，在其生长活力旺盛期(此时培养液由紫红色刚转为桔黄色)取1ul经40000倍稀释后，吸取100ul稀释液均匀涂种至固体培养基中(含抗生素和不含抗生素两种)，3-7天后观察菌落形态。
2.培养结果的判断标准：培养管内液体颜色由紫红色转向黄色且清亮透明，则提示培养阳性。转种至固体培养基上，如观察到“油煎蛋”样菌落形态，且在不含抗生素的培养基上无细菌菌落生长，则可除外细菌L型的可能，确认为支原体菌落。若培养液颜色变黄但伴有明显混浊和沉淀物生成则为细菌污染。培养液60天颜色无明显变化则判为培养阴性。
3.阳性培养物中DNA提取：取阳性培养物0.5ml，12000rpm离心5min，弃上清；沉淀物中加入1ml PBS混匀洗涤后，12000rpm离心5min，弃上清；沉淀中加入20μl去离子水，煮沸3min，12000rpm离心5min，此上清即可作为模板DNA。
4.胃癌组织中的DNA提取：取-70℃冻存的新鲜胃癌组织约1mm3，放入无菌的1.5ml E.P.管中，加裂解液(10mMTris-CL PH7.6，SDS 0.5％，10mM EDTA PH8.0，100mM NaCl)300μl，蛋白酶K(20mg/ml)10μl，55℃水浴过夜。待组织消化完全后分别用酚，酚、氯仿，氯仿抽提；吸取上清加入30μl 3M醋酸钠(pH5.2)及600μl无水乙醇，混匀，置-70℃冰箱1h；4℃ 12000rpm离心20min，弃上清；沉淀中加入600μl75％冷乙醇洗盐；4℃ 12000rpm离心20min，弃上清，真空抽干。加入20μl TE buffer，4℃保存备用。
5.套式PCR扩增：按试剂盒使用说明，将300μl反应液1和反应液2分别加入含有Taq酶的E.P.管中，混匀，分装为15μl/支。试剂盒中包含阳性对照模板DNA，以液体培养基或裂解液为阴性对照。首先进行外套PCR：取DNA 1-2μl，加入含有支原体通用引物的15μl反应液1管中，加入去离子H2O至20μl，进行PCR扩增，反应条件为：93℃预变性2min→93℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，35个循环后，72℃延伸5min；取一次PCR产物1μl，加去离子H2O至10μl，混匀后取5μl加入含有支原体特异引物的15μl反应液2中，进行扩增，反应条件同上。
6.PCR产物的测序：将PCR产物常规T/A克隆后，选取重组质粒测序。
7.免疫组化检测胃癌组织中的支原体：胃癌石蜡切片经脱蜡、入水，3％过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，1％BSA抗原封闭20min，用1％BSA以1∶1000稀释抗支原体单抗，正常小鼠IgG(1∶1000稀释)作阴性对照，4℃过夜。加二抗Envision室温下反应20min，DAB显色。结果判定：胃癌细胞胞浆内出现棕黄色着染颗粒判断为阳性，无棕黄色颗粒着染为阴性。
三、结果
1.胃癌组织支原体的分离培养：本研究共收集61例新鲜胃癌标本，9例在培养过程中被细菌污染，有效培养52例。2-8周后分别有8例液体培养基由紫红色转变为黄色，且液体清亮透明，提示有支原体生长。将培养物转种于固体培养基，3-7天可见到典型“油煎蛋”样菌落，无抗生素的固体培养基上未见细菌菌落生长，排除了L型细菌的可能性。故分离培养阳性率为15.4％(8/52)。从开始培养到出现阳性结果平均时间为33天。
2.阳性培养物中支原体类型的鉴定及克隆纯化：为了明确阳性培养物中的支原体类型，我们用不同种的支原体特异引物对阳性培养物的DNA进行扩增。结果表明，在8例阳性培养物中有5例猪鼻支原体DNA扩增阳性，2例发酵支原体DNA扩增阳性，另有1例该两种支原体DNA扩增均阳性(图1A，B)。
3.分离培养阳性结果与PCR、免疫组化检测结果的一致性比较：在8例支原体分离培养阳性的胃癌标本中，用免疫组化和PCR检测均为阳性的有7例，有1例PCR检测阳性，免疫组化检测阴性。分离培养阳性结果与免疫组化、PCR扩增结果的完全吻合率为87.5％(7/8)，与免疫组化检测结果的吻合率为87.5％(7/8)，与PCR扩增结果的吻合率为100％(8/8)。
三种方法检测结果具有良好的一致性，从不同角度证实了胃癌中存在支原体的感染，且感染类型主要为猪鼻支原体和发酵支原体两种。
实施例2
猪鼻支原体蛋白P37诱导人外周血单核细胞释放肿瘤坏死因子
一、材料
人胃癌细胞MGC-803细胞株、表达质粒pGEX-4T-1、大肠杆菌BL21-DE3可从商业来源获得。单克隆抗PD4是本申请人用胃癌细胞系MGC803细胞免疫BALB/c小鼠，经细胞筛选而获得的。后经研究证实，该单克隆抗体对应的抗原为猪鼻支原体抗原。L929细胞株由医科院病毒所惠赠。定点突变试剂盒、淋巴细胞分离液和M-MLV逆转录酶购自Promega公司。二氨基联苯胺(DAB)、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)、多粘菌素B、放线菌酮D和MTT购自Sigma公司。T4 DNA连接酶、Vent DNA聚合酶和各种限制性内切酶均为NEB公司产品。TNF-α为R&D公司产品。RPMI1640为GIBCO公司产品。RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司。
二、方法
1.GST-P37融合蛋白的表达、纯化和鉴定
由于支原体中色氨酸的编码子为TGA，在P37的全长编码序列中含有7个TGA编码子，为了获得全长p37在大肠杆菌中的成功表达，我们从提取的猪鼻支原体基因组中扩增P37基因全长后，利用突变试剂盒将7个色氨酸编码子TGA全部突变为TGG。将突变并经测序鉴定的P37基因片段，重组到原核表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌BL21-DE3后，在IPTG终浓度为0.2mM，30℃条件下诱导表达过夜。收集并裂解菌体，离心后取上清，用Glutathione-Sepharose-4B反复吸附、洗脱，含融合蛋白GST-P37的洗脱液经蔗糖浓缩及PBS透析后，行SDS-PAGE鉴定其纯度及含量，并经Western blot证实。
2.RT-PCR检测GST-P37融合蛋白上调外周血单核细胞表达肿瘤坏死因子实验
取健康人静脉血50mL至含有肝素的消毒离心管中，1∶1加入PBS轻轻混匀，按10mL分装于50mL离心管中，1∶1加入淋巴细胞分离液后，1500×g离心20min。缓慢吸取外周血单个核细胞(PBMC)层，PBS漂洗两遍后，重新悬浮于无血清1640培养基中。计数后，以107个PBMC/mL接种培养瓶，于37℃，5％CO2孵箱中培养2h。PBS漂洗4遍后，分别加入终浓度0.1μg/mL GST-P37融合蛋白和GST蛋白作用16h，用TRIZOL试剂按使用说明提取总RNA，并用Oligo(dt)作引物进行逆转录合成cDNA。取4μL cDNA作模板行PCR反应，肿瘤坏死因子上游引物为5’-CAGGCAGTCAGATCATCTTCTCA-3’(含有外显子2和外显子3部分序列，跨越400bp内含子)，下游引物为5’-CAAACATAAATAGAGGGAGCTGGC-3’(来自外显子4)[GenBankaccession number NM-000594，Z15026]。GAPDH作为内对照[17]，上游引物为5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物为5’-TCCACCACCCTGTTGCT GTA-3’。二者反应条件均为：94℃ 5min，94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min。
3.GST-P37融合蛋白刺激外周血单核细胞释放肿瘤坏死因子实验
分离PBMC，步骤同前。分离的PBMC以106个细胞/mL接种24孔板后，于37℃，5％CO2孵箱中培养2h。PBS漂洗4遍后，分别加入不同浓度的GST-P37融合蛋白和GST蛋白作用16h，同时以无血清1640刺激作对照，收集培养上清，10000×g离心2min后，上清-70℃冻存备用。L929细胞以104个细胞/100μL接种于96孔板内，24h后，分别加入上述冻存的上清50μL/孔和终浓度1μg/mL的放线菌酮D，24h后行MTT检测[18]。按下式计算细胞生长抑制率：
4.单抗PD4对P37蛋白刺激外周血单核细胞的中和作用。分离PBMC，步骤同前。分离的PBMC以106个细胞/mL接种24孔板后，分别加入0.1μg/mL的GST-P37融合蛋白、0.1μg/mL PD4单抗蛋白及二者37℃温育后的混合物刺激16h后，收集上清，同上作MTT实验。细胞生长抑制率计算方法同上。
三、结果：
1.P37蛋白能够上调外周血单核细胞表达肿瘤坏死因子的转录
以107个细胞/mL浓度接种5mL PBMC，37℃、5％CO2孵箱中培养2h，PBS漂洗后，分别加入0.1μg/mL的GST-P37和GST蛋白刺激16h，然后提取RNA进行反转录，并用特异引物通过PCR扩增肿瘤坏死因子(TNFα))的cDNA片段，结果显示，GST-P37融合蛋白刺激组经RT-PCR后能扩增出930bp左右的目的条带(图2第2泳道)，该条带经HindIII酶切，其结果与预期的片段大小一致(图2第3泳道)，GST蛋白刺激组未能扩增出相应的目的条带(图2第1泳道)，内对照GAPDH在两组均得到扩增(图2第1，2泳道)。说明GST-P37融合蛋白能够刺激肿瘤坏死因子的转录。
2.P37蛋白能够刺激外周血单核细胞释放肿瘤坏死因子
L929细胞对TNFα引起的细胞生长抑制反应敏感，因此，利用该细胞进行的MTT实验常用以对TNFα的检测。本实施例的实验结果表明，随着GST-P37蛋白浓度的增加，外周血单核细胞上清对L929细胞生长抑制作用也逐步提高，当浓度达0.1μg/ml时，该刺激的外周血单核细胞上清对L929细胞的生长抑制达47.8±0.3％，而相同浓度的GST蛋白刺激上清抑制率为12.5±0.4％。二者差异显著(P＜0.01，t检验)。说明GST-P37融合蛋白能够剂量依赖性地刺激肿瘤坏死因子的释放(见图3)。
3.单抗PD4能够中和P37蛋白对外周血单核细胞的刺激作用
我们将PD4和GST-P37与外周血单核细胞共处理，结果表明，单抗PD4在0.1μg/mL浓度时，对由0.1μg/mLGST-P37刺激所引起的外周血单核细胞释放TNFα活性有明显的抑制作用，而PD4本身对单核细胞释放肿瘤坏死因子的活性无明显影响。说明GST-P37融合蛋白诱导肿瘤坏死因子的活性由P37介导，同时提示P37与PD4相结合的部位(或其周围)可能与P37同外周血单核细胞的结合有关(图4)。
实施例3
P37蛋白和胃癌细胞AGS的结合
一、ELISA检测P37蛋白和胃癌细胞AGS的结合
将胃癌细胞AGS以每孔2×104细胞接种于96孔板中。培养过夜后，弃掉含血清的培养基，换无血清培养基。分别加入含GST蛋白和GST-P37蛋白(其制备方法见实施例2)的倍比稀释液(起始终浓度为64μg/ml)，于37℃、5％CO2孵箱中温育3小时。然后用PBS漂洗细胞2次，用戊二醛以0.125％(v/v)的比例室温固定10分钟，用3％BSA/PBS 4℃封闭过夜。再用PBS漂洗2次后，加入抗GST一抗，室温反应2小时。用Tween20-PBS漂洗5次后，加入HPR-标记的羊抗鼠二抗，室温反应2小时。Tween20/PBS漂洗5次后，用OPD显色，测定OD492。
结果如图5所示。结果显示，P37能与AGS-1细胞结合。
二、免疫荧光方法检测P37蛋白和胃癌细胞AGS的结合
将胃癌细胞AGS接种于置有盖玻片的6孔板中，让其爬片24小时。然后加入终浓度为10μg/ml的GST和GST-P37蛋白，37℃，温育1小时。用含1％BSA的PBS漂洗细胞2次，每次10分钟。加入TRITC标记的羊抗鼠二抗，37℃，反应1小时。然后用1％BSA/PBS漂洗2次后，荧光显微镜下观察结果。
结果如图6所示。结果显示，P37能与AGS细胞直接结合。
实施例4
Northern blot分析P37蛋白刺激AGS细胞中TNF的上调：
向培养于5瓶中的80％汇合的AGS细胞中分别加入PBS、GST蛋白、GST-P37蛋白(终浓度10μg/ml)、GST-P37与PD4预温育2小时的混合物(各为10μg/ml)及GST-P37和mIgG预温育的混合物(各为10μg/ml)。37℃，5％CO2孵箱条件下刺激24小时。分别提取总RNA，利用28s，18s RNA用分光光度计和跑胶上样调整样品后，跑RNA变性胶，转膜，利用α-32P-dCTP标记的TNF-α寡核苷酸探针杂交，检测TNF-α的表达情况。结果显示：P37蛋白能够上调TNF表达(见图7)。
实施例5
猪鼻支原体蛋白P37促进肿瘤细胞的浸润
80％汇合的AGS细胞经消化后，以106细胞/ml悬浮于无血清的F-12K培养基中。向各细胞悬液中分别加入PBS、GST、GST-P37、GST-P37+PD4(预处理)混合物、GST-P37+TNF-α多抗(预处理)混合物和GST-P37+mIgG(预处理)混合物。然后将各500μl的上述悬液分别加入Boyden chamber上室中，下室加入饥饿培养NIH3T3细胞的上清作为趋化因子。24小时后，将上下室间的微孔膜取出，用甲醇固定后，进行Gimsa染色。每张膜任意选取9个视野，显微镜下×200观察进行细胞记数。每组实验设3个平行孔，计算平均值。
结果见图8A和8B。与PBS和GST对照组相比，GST-P37蛋白组显著提高了浸润细胞数。这种由P37蛋白刺激的浸润细胞数升高作用可以大部分由抗猪鼻支原体蛋白的单克隆抗体中和，也可以被TNF-α多抗所中和。结果显示：P37蛋白通过上调TNF能明显增强AGS细胞的浸润能力。