一种用于防治奶牛乳腺炎的杀菌制剂及其制备方法 【技术领域】
本发明涉及一种杀菌制剂，尤其涉及一种含有抗菌肽的用以防治奶牛乳腺炎的杀菌制剂。
背景技术
奶牛业和牛奶食品加工业是畜牧业水平的重要标志，而奶牛乳腺炎却一直是困扰奶牛业发展的主要难题。我国奶牛乳腺炎的发生率达20-70％，个别牛群发病率更高。奶牛乳腺炎造成的经济损失包括兽医治疗花费高、产量下降、奶牛过早淘汰、牛奶品质差等。奶牛乳腺炎由金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和链球菌等细菌感染引起，国内外常以大剂量的抗生素(如青霉素、链霉素、庆大霉素、氯霉素、新霉素等)治疗奶牛乳腺感染，抗生素虽有一定的疗效，但由于上述致病菌大都产生了耐药性菌株，因此，疗效并不明显。反而造成牛奶中抗生素残留，将这些牛所产生的奶混入食用牛奶造成的后果是严重的。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)都建议，在奶牛接受抗生素治疗停药后至少3天内挤出的奶汁，不直接作为食用的奶原料(最好要停药5-7天)。而目前世界上对付乳腺炎除了使用抗生素别无它药。
因此，研制高效、安全的新药代替目前普遍使用的抗生素是防治奶牛乳腺炎的重要课题。
美国专利US 5762948公开了一种预防和治疗奶牛乳腺感染的湿巾，其成分以一种抗菌肽nisin为主，辅以酒精等其他抗菌成分。该湿巾能去除引起乳腺感染的各种致病菌，但对耐药性金黄色葡萄球菌的效果不明显。
【发明内容】
本发明需要解决地技术问题之一是提供一种用于防治奶牛乳腺炎的杀菌制剂，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明需要解决的另一个技术问题是提供一种杀菌制剂的制备方法。
本发明需要解决的再一个技术问题公开所述杀菌制剂在制备治疗奶牛乳腺炎的药物中的应用。
本发明的发明构思是这样的：
抗菌肽是生物体经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，一般由20-60个氨基酸组成，分子量在2000-7000D左右。随着医学免疫学和分子生物学的迅速发展，抗菌肽的研究越来越成为生物技术与生物医药领域中的热门课题。至今为止，在许多动物(尤其是昆虫)、植物、微生物和人体上已发现了超过200多种抗菌肽，这类短肽不仅对细菌、真菌有广谱的杀菌作用，而且对病毒、原虫及癌细胞也有攻击作用。临床试验也表明，在机体感染病菌或可能导致病菌感染的情况下，抗菌肽能快速杀灭已侵入的病菌，并且能阻止病菌的继续侵染。
具有杀菌作用的酶，特别是溶葡萄球菌酶(lysostaphin)，一种含锌的金属蛋白酶，专一降解细胞壁的甘氨酸肽键，能裂解金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的细胞壁，从而起到彻底杀死细菌的目的，不易产生耐药性，尤其对耐药性金黄色葡萄球菌等难以根除的致病菌的效果非常好。
发明人将抗菌肽GK和溶葡萄球菌酶进行复配，抗菌肽GK对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有杀灭作用，拓宽了杀菌谱，而加入溶葡萄球菌酶对耐药性金黄色葡萄球菌等难以根除的致病菌有很好的杀菌效果。两种都属于蛋白质，没有刺激也不会产生任何毒副作用，同时由于生产成本低，价格不贵。
消除和控制奶牛乳腺感染较有效的办法是杀灭引起感染的各种细菌，特别是乳区的各种致病菌，不但引起自身的乳腺感染，同时还会传染给其它的奶牛。发明人经过多次试验，将抗菌肽GK和溶葡萄球菌酶按一定比例复配，可以简便有效的杀灭奶牛乳区的各种致病菌，消除感染，同时还能起到防止复发和预防的作用。
本发明的技术方案是这样的：
一种杀菌制剂，包括一种或一种以上的抗菌肽GK和抗菌有效量的酶，所述及的酶包括溶菌酶或溶葡萄球菌酶中的一种或一种以上，溶葡萄球菌酶的含量以总量计为0.0001～0.1wt％，所述及的抗菌肽的含量为0.0001～0.01wt％；所述的杀菌制剂还包括稳定剂，所述及的稳定剂是聚乙二醇或壳聚糖中的一种，含量为1～15％。
一种杀菌制剂，包括溶葡萄球菌酶0.0001～0.1wt％，抗菌肽GK0.0001～0.01wt％，稳定剂1～15wt％，表面活性剂0.1～0.5wt％，水余量。
有关抗菌肽GK，详见本发明人在2002年9月2日申报的发明专利，发明名称为一组合成抗菌肽，申请号为02136766.3。
稳定剂的主要作用是保持酶和抗菌肽在水溶液状态下的稳定性，即保持它们的活性。
所述及的杀菌制剂的制备方法包括如下步骤：
按上述比例称取酶、抗菌肽GK，稳定剂与水混合。
本发明的制剂用于制备治疗奶牛乳腺炎的药物，可以乳房内注射，其剂量可根据奶牛的年龄、病情决定，一般为每日两次。可以杀灭引起奶牛乳腺感染的各种细菌，包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。特别是大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌和化脓棒状杆菌。可以治疗由这些细菌引起的各种乳腺炎。
也可以将上述的杀菌制剂负载于载体上，载体包括无纺材料或棉纱布，用于产奶前、后通过涂抹或擦拭奶牛乳区，进行消毒，保证乳区的清洁，减少感染的可能性。
杀菌制剂通过体外杀菌试验，证明它对引起奶牛乳腺感染的主要病原菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓棒状杆菌的杀菌效果十分理想，杀灭率均超过99％。
杀菌制剂对昆明小白鼠的急性毒性试验结果表明，动物经肌注7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明无毒性作用。
杀菌制剂对SD大鼠阴道黏膜刺激试验，参照消毒技术规范(第三版)1999.11中皮肤刺激反应强度的评分标准评分及皮肤刺激强度分级，进行对阴道黏膜刺激强度的评定。结果表明，杀菌制剂对大鼠阴道黏膜刺激反应最高总积分均值为0，属无刺激性。
杀菌制剂对乳区急性感染的治疗试验，并用青霉素G钾和链霉素作为对照，给药7天后，结果表明，杀菌制剂能有效杀灭引起乳腺感染的各种病原菌，尤其对金黄色葡萄球菌特别有效，而两种抗生素则不能有效的去除乳区的病原菌。
杀菌制剂预防乳腺感染的试验，可以看出，杀菌制剂能有效的预防奶牛乳区受到细菌感染，可以保持乳区的清洁。
【具体实施方式】
实施例1
杀菌湿巾的制备
1.配制100g杀菌制剂，其中溶葡萄球菌酶含量0.001g(0.001wt％)，抗菌肽GK-2(见申请号为02136766.3的发明专利申请文件)含量0.001g(0.001wt％)，聚乙二醇含量3g(3％)，水余量。
2.对桌面、仪器、器皿、配料桶消毒。
3.在电子天平上准确称取溶葡萄球菌酶、抗菌肽GK-2、聚乙二醇，置于配料桶中，按比例加水76.80g，搅拌均匀，并加热至60℃溶解，即为所需杀菌制剂。
实施例2
杀菌制剂体外杀菌试验
1、试验样品的制备：
(1)杀菌制剂：按实施例1的方法制备，其中溶葡萄球菌酶含量0.001wt％，抗菌肽GK-2含量0.001wt％，聚乙二醇含量3％。
(2)对照制剂：其中聚乙二醇含量3％。
将(1)(2)的制剂进行如下处理：将无纺布剪裁成8cm×8cm，经过紫外光消毒20分钟后，浸入上述溶液中，待浸透后捞出，滴去多余溶液，即可使用。
2、试验菌株：金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌和化脓棒状杆菌(以上菌株来自于沈阳军区军马防治研究所)。
3、试验步骤：
(1)将培养好的试验菌株用1％蛋白胨PBS洗下新鲜斜面，并稀释到适宜浓度，在107～108cfu/ml。
(2)将样品制剂和对照制剂制成1×3cm大小，并放置在无菌平皿中。
(3)取20ul菌液滴加到制剂上，涂抹均匀同时开始计时。
(4)作用到预定时间后用无菌镊子将制剂投入含5ml中和剂的试管中，充分振荡混匀。
(5)对照制剂投入中和剂试管，充分振荡后做适当稀释。
(6)取终液0.5ml进行倾注平板，37恒温倒置培养48小时。
(7)计算对照回收菌量及样品回收菌量，得出杀灭率。
4、试验结果
表1：杀菌湿巾体外杀菌试验杀灭率结果
试验菌株 杀菌制剂 对照制剂
大肠杆菌 99.92％ 0
金黄色葡萄球菌 99.98％ 0
无乳链球菌 99.92％ 0
停乳链球菌 99.97％ 0
乳房链球菌 99.56％ 0
化脓棒状杆菌 99.46％ 0
实施例3
杀菌制剂体外杀菌试验
1、试验样品的制备：
(1)杀菌制剂样品：按实施例1的方法制备，其中溶葡萄球菌酶含量0.001wt％，抗菌肽GK-3含量0.001wt％，聚乙二醇含量3％。
(2)对照制剂：其中聚乙二醇含量3％。
2、试验菌株：金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、大肠杆菌和化脓棒状杆菌(以上菌株来自于沈阳军区军马防治研究所)。
3、试验步骤：按实施例2进行。
4、试验结果
表2：杀菌制剂体外杀菌试验杀灭率结果
试验菌株 杀菌制剂 对照制剂
大肠杆菌 99.95％ 0
金黄色葡萄球菌 99.97％ 0
无乳链球菌 99.95％ 0
停乳链球菌 99.98％ 0
乳房链球菌 99.62％ 0
化脓棒状杆菌 99.67％ 0
实施例4
动物体内急性毒性试验
1、样品的制备：按实施例1中的方法配制杀菌制剂其中：其中溶葡萄球菌酶含量0.01wt％，抗菌肽GK-1含量0.001wt％，聚乙二醇含量5％。
2、试验动物：采用昆明小白鼠60只，雌雄各半，体重33.5±0.25g，由复旦大学实验动物部提供。
3、试验方法：每日一次连续7天经肌注小白鼠，观察动物在最大剂量下毒性反应。
实验结果表明，动物经肌注7天后，无异常反应，活动正常。经7天观察，60只小白鼠全部存活。证明无毒性作用。
实施例5
杀菌制剂对试验动物阴道黏膜刺激试验
1、样品制备：杀菌制剂的制备方法参照实施例1，其中：其中溶葡萄球菌酶含量0.01wt％，抗菌肽GK-3含量0.011wt％，聚乙二醇含量5％。
2、试验动物：SD大鼠，雌性，普通级，18只，体重230克-250克，随机分三组，杀菌制剂组、赋形剂组和空白对照组，每组6只，由复旦大学实验动物部提供。
3、试验方法：参照消毒技术规范(第三版)1999.11中的3.8条。将杀菌制剂置动物阴道内，与阴道黏膜接触4小时。赋形剂组用棉条0.01克浸以灭菌生理盐水作同样的试验。空白对照组不做任何处理。于24小时处死动物，取出局部阴道组织，观察有无充血、水肿现象。参照消毒技术规范(第三版)1999.11中皮肤刺激反应强度的评分标准评分及皮肤刺激强度分级，进行对阴道黏膜刺激强度的评定。
4、试验结果：
表3：杀菌制剂对试验动物阴道黏膜刺激试验
刺激反应评分
组别 动物数(只)
红斑 水肿 总分
杀菌制剂组 6 0 0 0
赋形剂组 6 0 0 0
空白对照组 6 0 0 0
杀菌制剂对大鼠阴道黏膜刺激反应最高总积分均值为0，属无刺激性。
实施例6
杀菌制剂对乳区急性感染的治疗试验
1、样品准备
杀菌制剂的制备：制备方法按实施例1，其中其中溶葡萄球菌酶含量0.008wt％，抗菌肽GK含量0.002wt％，聚乙二醇含量2％。用G-6垂熔玻璃滤器过滤灭菌，密封于安瓶中，置4冰箱中保存。
青霉素G钾：80万单位，华北制药厂
硫酸链霉素：100万单位，华北制药厂
2、试验动物的准备
选择泌乳期的4-8岁青、壮年高产、黑白花奶牛，共20头，急性乳腺感染引发炎症，，其症状为乳房肿胀，牛奶异常：有凝块，絮片或者以后有絮片。但是没有疼痛，没有其它症状。随机分为4小组，1小组为杀菌制剂治疗组，2小组为青霉素G钾治疗组，3小组为链霉素治疗组，4小组为空白对照组。
3、试验方案：
实验方法：
治疗组：杀菌制剂治疗组中第1组为一次给药，按40ml的剂量每一患乳区，乳房内一次注入，2、3小组：每天早晚各一次，于挤干乳后，按青霉素10万单位，链霉素10万单位乳房内注射给药。4小组：对照组，不进行任何治疗，给药7天。
4、观察指标：
(1)痊愈：临床乳腺炎的症状全部消失，乳房组织柔软，牛奶里没有凝块，牛奶的颜色和平时一样白。
有效：临床乳腺炎症状减轻，或者不再恶化，牛奶正常，但乳房肿胀没有完全消失。
(2)细菌学检测：对治疗前、后感染乳区的病原菌进行分离、培养、鉴定，其中因为奶牛乳腺感染以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、化脓棒状杆菌六种细菌为主，故本检测试验以上述六种细菌为主。具体操作步骤如下：
A、采样：同常规无菌采样进行，用10ml试管，每头牛每个乳区采集5-7ml鲜乳，注意的是前2-3把乳弃之不要，作好标记，尽可能快的放入4℃冰箱中保存。
B、培养、分离：培养同常规进行，温度37℃，相对温度在50％以上。所用培养基主要有：7％绵羊血琼脂；加入1％七叶甙的绵羊汤琼脂；却浦曼琼脂；叠氮钠结晶紫血琼脂；肉流培养基等。(以上培养基来自沈阳军区军马防治研究所)
C、鉴定
金黄色葡萄球菌的鉴定：采用试管法和玻片法进行，利用枸橼酸兔血浆凝固实验进行测定。
链球菌的鉴定：采用Camp试验进行，Camp试验阳性而七叶甙为阴性者即是无乳链球菌，Camp试验阳性而七叶甙为阳性者即是乳房链球菌，Camp试验阴性七叶甙也为阴性者即是停乳链球菌。
大肠杆菌的鉴定：采用伊红美兰培养基分离培养以及进行V、P试验和M、R试验，V、P试验阴性，M、R试验阳性者为大肠杆菌。
化脓棒状杆菌的鉴定：采用血琼脂培养基培养，36小时后，如见有直径约1-2cm，图形、凸起、乳白色、表面光滑有光泽，并出现β琼血圈的小菌落者，即为化脓棒状杆菌。
5、试验结果
表4：杀菌制剂对乳区急性感染的治疗试验结果
杀菌制剂组 青霉素G钾组 链霉素组 空白对照组
临床 痊愈(头数) 4 2 1 0
表现 有效(头数) 1 2 2 0
病原 大肠杆菌 99.8 97.1 92.2 0
菌杀
灭率
(％)
金黄色葡萄球菌 99.8 63.3 43.2 0
无乳链球菌 99.5 85.2 86.3 0
停乳链球菌 99.3 78.2 86.4 0
乳房链球菌 99.1 88.6 91.3 0
化脓棒状杆菌 99.4 78.5 87.9 0
从上表中可以看出，杀菌制剂能有效杀灭引起乳腺感染的各种病原菌，尤其对金黄色葡萄球菌特别有效，而两种抗生素则不能有效的去除乳区的病原菌。
实施例7
杀菌制剂预防乳腺感染的试验
1、样品准备
杀菌制剂的制备：制备方法按实施例1，其中其中溶葡萄球菌酶含量0.002wt％，抗菌肽GK-2含量0.002wt％，聚乙二醇含量3％，聚梨山醇酯20含量0.2wt％。
将制剂进行如下处理：将无纺布剪裁成8cm×8cm，经过紫外光消毒20分钟后，浸入上述溶液中，待浸透后捞出，滴去多余溶液，即可使用。
碘消灵溶液：100ml，浙江农业大学。
采样液：1％蛋白胨，0.5％硫代硫酸钠，2％吐温-80，0.5％卵磷脂的PBS，每管10ml。
2、试验动物的准备
选择泌乳期的4-8岁青、壮年高产、黑白花奶牛，正常无任何感染症状，共3头，1小组为杀菌制剂预防组，2小组为碘消灵组，3小组为空白对照组。
3、试验方法：
将一支无菌棉拭沾湿采样液采乳区，检测乳区每个采样样本的自然菌落数。1小组用杀菌制剂擦拭原采样的邻近部位后，1分钟，30分钟，2小时，各采一次样；2小组方法同1小组，检测作用后残留的自然菌数，计算作用前后的自然菌杀灭率。
4、试验结果
表5：杀菌制剂预防乳区感染的试验结果
杀灭率(％) 杀菌制剂组 碘消灵组 空白对照组
1分钟后 99.9 94.2 13.5
30分钟后 99.1 91.1 15.2
2小时后 98.4 62.3 14.6
从上述试验可以看出，杀菌制剂能有效的预防奶牛乳区受到细菌感染，可以保持乳区的清洁。