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1、(10)申请公布号 CN 103013845 A (43)申请公布日 2013.04.03 CN 103013845 A *CN103013845A* (21)申请号 201210351731.1 (22)申请日 2012.09.20 CGMCC NO.4494 2010.12.20 C12N 1/16(2006.01) C12C 12/04(2006.01) C12C 11/02(2006.01) C12R 1/84(2006.01) (71)申请人 山东轻工业学院 地址 250014 山东省济南市历下区解放东路 58 号 (72)发明人 刘天明 赵修报 王会会 (74)专利代理机构 济南金。
2、迪知识产权代理有限 公司 37219 代理人 王绪银 (54) 发明名称 一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株及其培 养方法与应用 (57) 摘要 本发明涉及一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 菌株及其培养方法与应用， 克鲁维毕赤酵母克鲁 维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌株 SS1-5， 在2010年12月20日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京 市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中科院微生物研究 所， 保藏号CGMCC NO ： 4494。 该菌株可以酿造低醇 饮料， 该饮料果香味浓， 酒精含量低， 口感甜润， 风 味和营养与无。
3、醇啤酒接近 ； 此外， 该低醇饮料， 能 够更好地保留麦芽汁中的有机营养， 生产工艺简 化， 成本和能耗降低， 减轻环境污染。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1.一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var.kluyveri)菌株SS1-5， 在 2010 年 12 月 20 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京市 朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中。
4、科院微生物研究所， 保藏号 CGMCC NO ： 4494。 2.权利要求1所述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种(Picchia kluyveri var.kluyveri)菌 株 SS1-5 的培养方法， 其特征在于， 步骤如下 ： （1） 用接种环取克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株 SS1-5， 接种于 YEPD 固体培养基， 在 25 28条件下， 活化培养 40 48h， 制得活化菌株 ； （2） 将步骤 （1） 制得的活化菌株接种于 YEPD 液体培养基中， 在 25 28条件下， 培养 15 20h， 制得种子液 ； （3） 将步骤 （2） 制得的种子液按照 2 5%（v/v） 接种于麦芽汁液。
5、体培养基中， 在 25 28条件下， 培养 32 40h， 即得生产用种子液。 3. 如权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中的 YEPD 固体培养基每 升组分如下 ： 葡萄糖 20 克， 酵母粉 10 克， 蛋白胨 10 克， 琼脂 20 克， 用蒸馏水定容至 1000 毫 升， pH 值自然， 115灭菌 30min。 4. 如权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中的 YEPD 液体培养基每 升组分如下 ： 葡萄糖 20 克， 酵母粉 10 克， 蛋白胨 10 克， 用蒸馏水定容至 1000 毫升， pH 值自 然， 115灭菌 30。
6、min。 5. 如权利要求 2 所述的培养方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 中的麦芽汁液体培养基组 分如下 ： 麦芽汁浓度 11 13 P， 115灭菌 30min， pH 值自然。 6. 权利要求 1 所述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌 株 SS1-5 在制备低醇饮料中的应用。 7. 如权利要求 6 所述的应用， 其特征在于， 步骤如下 ： （i） 将原料大麦芽经糖化后， 按照24g/kg的添加量添加酒花， 糖化液温度7080 时静置 20 40min， 分离酒花糟及热凝固物， 冷却， 制得麦芽汁糖度为 11 13 P ； （。
7、ii） 按照体积比为 2 5% 的添加量向步骤 （1） 制得的麦芽汁中添加克鲁维毕赤酵母 克鲁维变种(Pichia kluyveri var.kluyveri)菌株SS1-5的生产用种子液， 在2024、 通氧量为 0.1m3/min 条件下发酵培养 7 9d， 制得发酵液 ； （iii） 将步骤 （1） 制得的发酵液， 经过滤、 杀菌后， 制得低醇饮料。 8. 如权利要求 7 所述的应用， 其特征在于， 所述步骤 （i） 中的糖化， 步骤如下 ： 将原料大麦芽在 50 55条件下投料至水中， 保持 35 45min ； 升温至 63 68， 保持5565min ； 然后升温至7075， 保持。
8、1218min， 碘验 ； 7580保持812min ； 煮沸时间 65 75min， 煮沸强度不低于 8%。 9. 如权利要求 8 所述的应用， 其特征在于， 所述大麦芽与水的质量比为 1:（4.5 5.5） 。 权 利 要 求 书 CN 103013845 A 2 1/5 页 3 一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株及其培养方法与应用 技术领域 0001 本发明涉及一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株及其培养方法与应用， 特别涉及 一种产香的克鲁维毕赤氏酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌株 SS1-5 及其培养方法与应用， 属于微生物技术领域。 背景技。
9、术 0002 我国是啤酒饮料生产和消费大国， 啤酒饮料消费人数众多， 但酒中乙醇及微量甲 醇、 甲醛对消费者健康的危害引起社会的普遍关注， 特别是过量嗜酒习惯对消费者危害极 大， 易因酒驾导致交通肇事 , 醉酒引发家庭矛盾等。为此 , 开发无醇或低醇饮品， 提高营养 水平， 既满足消费者需求， 也有利于人体健康， 又可扩大消费人群， 符合我国食品发展方向 和世界饮料发展潮流。为此低醇或无醇啤酒饮料应运而生， 具有广阔的发展市场。低醇饮 料需要在保持普通啤酒风味品质的同时， 还要求乙醇含量应低于0.5%vol。 目前无醇啤酒饮 料生产方法主要有 : 脱醇法、 控制发酵法和路德类酵母发酵法 , 但。
10、随之带来工艺流程和生 产成本的增加， 使得其推广受到限制。 0003 如中国专利文献 CN86104029A（申请号 86104029） 公开了生产低醇饮料的方法， 是 使高醇饮料， 加入的水和再循环的滞留液之混合物通过反渗透系统， 形成渗透物和滞留物。 从系统中排除主要含有醇和水的渗透物， 小部分滞留物经回收后作为产品， 同时将大部分 滞留物再循环到反渗透系统， 与新加入的饮料和水混合， 这一技术工序复杂， 能耗高。 因此， 通过筛选新的菌株， 优化生产工艺来生产低醇饮料是解决上述问题的经济而有效途径。 发明内容 0004 本发明针对现有技术的不足， 提供一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株及其。
11、培养 方法与应用。 0005 术语说明 0006 低醇饮料 ： 乙醇含量低于 0.5（w/w） 的啤酒饮料。 0007 本发明的技术方案如下 ： 0008 一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌株 SS1-5， 2010 年 12 月 20 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京市 朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中科院微生物研究所， 保藏号 CGMCC NO ： 4494。 0009 上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌株 SS1-5 分离自新压榨的。
12、鲜葡萄汁中， 菌落边缘及中心都呈奶油色， 球状突起， 表面皱褶粗糙， 不透 明， 不反光， 边缘不整齐， 毛绒状， 白色暗淡 ； 细胞呈椭圆形。 液体YPD培养基培养2-3d， 有沉 淀和绒状膜出现。该菌株耐 45， 耐 pH2.5-12.0， 耐 SO2 400mg/L， 耐酒精 8%(vol)， 耐 NaCl 为 100.0g/L， 耐葡萄糖 500.0g/L。 0010 上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌株 SS1-5 的培养方法， 步骤如下 ： 说 明 书 CN 103013845 A 3 2/5 页 4 0011 （1） 取。
13、克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株 SS1-5， 接种于 YEPD 固体培养基， 在 25 28 条件下， 活化培养 40 48h， 制得活化菌株 ； 0012 （2） 将步骤 （1） 制得的活化菌株接种于 YEPD 液体培养基中， 在 25 28条件下， 培养 15 20h， 制得种子液 ； 0013 （3） 将步骤 （2） 制得的种子液按照体积比 2% 5% 接种于麦芽汁液体培养基中， 在 25 28条件下， 培养 32 40h， 即得生产用种子液。 0014 根据本发明优选的， 所述步骤 （1） 中的 YEPD 固体培养基每升组分如下 ： 葡萄糖 20 克， 酵母粉 10 克， 蛋白胨 10 。
14、克， 琼脂 20 克， 用蒸馏水定容至 1000 毫升， pH 值自然， 115灭 菌 30min。 0015 根据本发明优选的， 所述步骤 （2） 中的 YEPD 液体培养基每升组分如下 ： 葡萄糖 20 克， 酵母粉 10 克， 蛋白胨 10 克， 用蒸馏水定容至 1000 毫升， pH 值自然， 115灭菌 30min。 0016 根据本发明优选的， 所述步骤 （3） 中的麦芽汁液体培养基组分如下 ： 麦芽汁浓度 11 13 P， 115灭菌 30min， pH 值自然。 0017 上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌株 SS1-。
15、5 在制备低醇饮料中的应用。 0018 上述应用， 步骤如下 ： 0019 （i） 将原料大麦芽经糖化后， 按照24g/kg的添加量添加酒花， 静置2040min， 分离酒花糟及热凝固物， 冷却， 制得糖度为 11 13 P 的麦芽汁 ； 0020 （ii） 按照体积比为 2% 5% 的添加量向步骤 （1） 制得的麦芽汁中添加克鲁维毕赤 酵母克鲁维变种(Pichia kluyveri var.kluyveri)菌株SS1-5， 在2024、 通氧量100L/ min 的条件下发酵培养 7 9d， 制得发酵液 ； 0021 （iii） 将步骤 （1） 制得的发酵液， 经过滤、 杀菌后， 制得低醇。
16、饮料。 0022 根据本发明优选的， 所述步骤 （i） 中的糖化， 步骤如下 ： 0023 将原料大麦芽在 50 55条件下投料至水中， 保持 35 45min ； 升温至 63 68， 保持5565min ； 然后升温至7075， 保持1218min， 碘验 ； 7580保持8 12min ； 煮沸时间 65 75min， 煮沸强度不低于 8%。 0024 进一步优选的， 所述大麦芽与水的质量比为 1:（4.5 5.5） 。 0025 有益效果 0026 本发明所述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌株 SS1-5 可以酿造低醇饮料， 该。
17、饮料果香味浓， 酒精含量低， 口感甜润， 风味和营养与无醇啤酒 接近 ； 此外， 该低醇饮料， 能够最大限度地保留麦芽汁中的有机营养成分， 生产工艺简化 , 成本和能显著耗低， 减轻环境污染。 附图说明 0027 图 1 是实施例 3 制得的低醇饮料中挥发性物质的 GC-MS 总离子流气相色谱图 ； 0028 图 2 是实施例 3 制得的低醇饮料中氨基酸分析色谱图。 具体实施方式 0029 下面结合实施例对本发明做进一步阐述， 但本发明所保护范围不限于此。 说 明 书 CN 103013845 A 4 3/5 页 5 0030 本实施例中所述大麦芽购自兰州黄河麦芽有限公司， 该麦芽质量符合啤酒。
18、麦芽国 家标准 （GB/T1686-2008） ； 0031 啤酒花购自新疆绿宝酒花有限公司 ； 0032 克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌株 SS1-5， 在 2010 年 12 月 20 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京市 朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中科院微生物研究所， 保藏号 CGMCC NO ： 4494 ； 0033 其他原料均为本行业常规市售产品。 0034 实施例 1 0035 一种克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌株 SS1。
19、-5， 在 2010 年 12 月 20 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 地址 ： 北京 市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中科院微生物研究所， 保藏号 CGMCC NO ： 4494。 0036 上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌株 SS1-5 分离自新压榨的鲜葡萄汁中， 菌落边缘及中心都呈奶油色， 球状突起， 表面皱褶粗糙， 不透 明， 不反光， 边缘不整齐， 毛绒状， 白色暗淡 ； 细胞呈椭圆形。YEPD 液体培养 2-3d， 有沉淀和 绒状膜出现。该菌株耐温 45， 耐 pH2.5 12.0， 耐 SO2。
20、 400mg/L， 耐乙醇 8%(vol)， 耐 NaCl 为 100g/L， 耐葡萄糖 500g/L。 0037 实施例 2 0038 实施例 1 所述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌 株 SS1-5 的培养方法， 步骤如下 ： 0039 （1） 用接种针取克鲁维毕赤酵母克鲁维变种菌株 SS1-5， 划线接种于 YEPD 固体培 养基， 在 28条件下， 活化培养 40 48h， 制得活化菌株 ； 0040 （2） 将步骤 （1） 制得的活化菌株接种于 YEPD 液体培养基中， 在 28条件下， 120r/ min 摇床培养 18 2。
21、2h， 制得种子液 ； 0041 （3） 将步骤 （2） 制得的种子液按照体积百比 5% 接种于麦芽汁液体培养基中， 在 25条件下， 培养 34 36h， 即得生产用种子液。 0042 所述步骤 （1） 中的 YEPD 固体培养基每升组分如下 ： 葡萄糖 20 克， 酵母粉 10 克， 蛋 白胨 10 克， 琼脂 20 克， 用蒸馏水定容至 1000 毫升， pH 值自然， 115灭菌 30min。 0043 所述步骤 （2） 中的 YEPD 液体培养基每升组分如下 ： 葡萄糖 20 克， 酵母粉 10 克， 蛋 白胨 10 克， 用蒸馏水定容至 1000 毫升， pH 值自然， 115灭菌。
22、 30min。 0044 所述步骤 （3） 中的麦芽汁液体培养基组分如下 ： 12 P 麦芽汁， 115灭菌 30min， pH 值自然。 0045 实施例 3 0046 上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌株 SS1-5 在制备低醇饮料中的应用， 步骤如下 ： 0047 （i） 将原料大麦芽按重量比 1:5 的比例在 52投料至水中， 保持 40min ； 升温至 65， 保持 60min ； 然后升温至 72， 保持 15min， 碘验 ； 78保持 10min ； 完全糖化后， 分两 次洗糟， 洗糟水温 78； 煮沸时间 70mi。
23、n， 煮沸强度不低于 8%， 将原料大麦芽经糖化后， 按照 24g/kg的添加量添加酒花， 酒花分三次添加， 静置30min， 分离酒花糟及热凝固物， 冷却， 制得糖度为 120.3 P 的麦芽汁 ； 说 明 书 CN 103013845 A 5 4/5 页 6 0048 （ii） 按照体积比为 5% 的添加量向步骤 （1） 制得的麦芽汁中添加克鲁维毕赤酵母 克鲁维变种 (Pichia kluyveri var.kluyveri) 菌株 SS1-5 的生产用种子液， 在 21、 通氧 量 100L/min 的条件下发酵培养 8d， 制得发酵液 ； 0049 （iii） 将步骤 （1） 制得的发。
24、酵液， 经过滤、 巴氏杀菌 （杀菌温度 68， 持续 30min） 后， 制得低醇饮料。 0050 采用无醇啤酒检测国家标准方法， 对低醇饮料基本生化指标进行检测。 0051 还原糖测定用斐林试剂法， 参照国标 GB/T15038-2006， 经 SGD- 全自动还原糖测 定仪测定样品还原糖含量 （仪器购自山东省科学院生物中心） ； 经检测， 残糖量为 35g/L ； 0052 总酸测定用氢氧化钠滴定法， 参照国标 GB/T15038-2006 葡萄酒、 果酒通用分析方 法 ； 经检测， 总酸为 0.052mol/L ； 0053 双乙酰按照 GB/T4928-2008 法测定 ； 经检测， 。
25、双乙酰 0.06mg/L ； 0054 乙醇测定用气相色谱 - 氢离子火焰法 （刘迎春， 陈杰， 吉华贵， 等 . 直接稀释 - 气相 色谱法测定血液中的乙醇含量 . 华西医学， 2011,26（04） ： 572-575） ， 乙醇含量约为 0.46 （vol） 0055 Vc 测定参照 GB/T5009.86.2003 标准 ； Vc 含量为 17.5mg/kg ； 0056 游离氨基酸含量测定参照 GB/T5009.124.2003 标准方法， 结果如图 2 所示 ； 经检 测， 游离氨基酸的含量 ：（单位 ： %） 0057 天门冬氨酸 0.05、 谷氨酸 0.10、 丝氨酸 0.05。
26、、 甘氨酸 0.03、 组氨酸 0.02、 精氨酸 0.04、 苏氨酸 0.03、 丙氨酸 0.04、 脯氨酸 0.10、 酪氨酸 0.02、 缬氨酸 0.02、 蛋氨酸 0.01、 胱 氨酸 0.02、 异亮氨酸 0.03、 亮氨酸 0.04、 苯丙氨酸 0.47、 赖氨酸 0.13， 氨基酸总量 1.19。 0058 香味分析用 GC-MS 法， 仪器为日本岛津 GC-MS-QP2010 气相色谱质谱联用仪， 结果 如图 1 所示 ； 经检测分析， 香味成分主要有 ： 0059 酯类 6 种 ： 异丁酸丁酯、 丁酸异丁酯、 丁酸丁酯、 山梨醇六乙酸酯、 生育酚乙酸酯、 三乙基 2- 丁基丙。
27、烯酯 ； 0060 酸类 3 种 ： 亚甲基双硫代乙酸、 鹅去氧胆酸、 2,4- 二甲氧基肉桂酸 ； 0061 高级醇 3 种 ： 4,4- 二甲基 -5- 胆甾 -3- 醇、 胆固醇、 4- 正癸醇 ； 0062 酚醛类 3 种 ： 二甲基叔辛基酚、 3,5- 二 -(1,1- 二甲基乙基 )-1,2- 苯二酚、 异丁醛 二乙基乙缩醛。 0063 实施例 4 0064 如实施例 3 所述的应用， 不同之处在于按 3% 的接种量 （v/v) 向 5L 糖度为 11.50.3 P 的麦芽汁中添加上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var. kluyveri) 菌株 S。
28、S1-5 的生产用种子液， 所得低醇饮料的相关指标如下 ： 0065 表 1 发酵产品中基本生化指标分析结果 0066 说 明 书 CN 103013845 A 6 5/5 页 7 0067 实施例 5 0068 如实施例 3 所述的应用， 不同之处在于按 2.5% 的接种量 （v/v) 向 50L 糖度为 12.50.3 P 的麦芽汁中添加上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var. kluyveri) 菌株 SS1-5 的生产用种子液， 所得低醇饮料的相关指标如下 ： 0069 表 2 发酵产品中基本生化指标分析结果 0070 0071 实施例 6 0072 如。
29、实施例 3 所述的应用， 不同之处在于按 2.5% 的接种量 （v/v) 向 300L 糖度为 120.3 P 的麦芽汁中添加上述克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var. kluyveri) 菌株 SS1-5 的生产用种子液， 所得低醇饮料的相关指标如下 ： 0073 表 3 发酵产品中基本生化指标分析结果 0074 0075 由此可见， 通过利用特定的克鲁维毕赤酵母克鲁维变种 (Pichia kluyveri var. kluyveri) 菌株 SS1-5 生产麦芽汁低醇饮料， 采用全新生产工艺， 所得饮料具有低糖， 香味 丰富， 基本不含乙醇， 具有普通啤酒的色香味等感官特征， 可作为饮料饮用， 同时含有大量 的氨基酸、 维生素， 有利于人体健康。 0076 当理解的是， 对本领域普通技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换， 而 所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 说 明 书 CN 103013845 A 7 1/1 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103013845 A 8 。