微环DNA基因载体组合物及其制备方法和应用.pdf

本发明公开了一种微环DNA基因载体组合物，包括将病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的DNA成分、转基因克隆到载体中，得到的第一微环DNA基因载体，以及将病毒基因组中负责表达病毒组装蛋白质基因克隆到载体中，得到的第二微环DNA基因载体。将这种微环DNA基因载体组合物送入靶细胞内，第一微环DNA基因载体可以表达前基因组RNA，第二微环DNA基因载体可以表达组装蛋白，将前基因组RNA组装形成可以表达所述治疗性转基因产物并具有侵染性的重组病毒。重组病毒可以穿过体内的大部分微血管床屏障，例如肝窦状隙内皮细胞孔，从而可以顺利的感染新的易感细胞，具有较高的投递效率。本发明还提供上述微环DNA基因载体组合物的应用。

权利要求书一种微环DNA基因载体组合物，其特征在于，包括：第一微环DNA基因载体和第二微环DNA基因载体；
所述第一微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述第一微环DNA基因载体包括：第一启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子；
所述第二微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述第二微环DNA基因载体包括：第二启动子和所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因；
所述第一微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的基因成分和所述治疗性转基因产物至少两个星期，所述第二微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的组装蛋白至少两个星期，所述病毒的基因成分和所述病毒的组装蛋白可以在哺乳动物细胞内组装形成可以表达所述治疗性转基因产物并具有侵染性的重组病毒。
如权利要求1所述的微环DNA基因载体组合物，其特征在于，所述病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分为乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分；
所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因为乙肝病毒基因组中负责表达多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的基因。
如权利要求2所述的微环DNA基因载体组合物，其特征在于，所述乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括：5’包装信号、3’包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域；
所述启动子、所述5’包装信号、所述转基因或转基因表达盒子、所述第一增强子、所述病毒复制调节区域以及所述3’包装信号依次连接。
如权利要求2所述的微环DNA基因载体组合物，其特征在于，所述乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括：包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域；
所述包装信号、所述转基因或转基因表达盒子、所述第一增强子以及所述病毒复制调节区域依次连接，所述病毒复制调节区域和包装信号连接到一起，形成核心蛋白基因的启动子。
如权利要求2所述的微环DNA基因载体组合物，其特征在于，所述乙肝病毒基因组中负责表达多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的基因采用变性码序列替代。
如权利要求2所述的微环DNA基因载体组合物，其特征在于，所述第二微环DNA基因载体还包括表达敲下DGCR8基因的RNAi的成分。
如权利要求1所述的微环DNA基因载体组合物，其特征在于，所述第一启动子为核心蛋白基因的启动子、第二型多聚酶基因启动子或第三型多聚酶基因启动子；
所述第二启动子为第二型多聚酶基因启动子。
如权利要求1所述的微环DNA基因载体组合物，其特征在于，所述第一微环DNA基因载体为双链DNA结构，第二微环DNA基因载体为双链DNA结构。
一种权利要求1～8中任一项所述的微环DNA基因载体组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、提供具有重组酶ΦC31的细菌DNA附着点和重组酶ΦC31的噬菌体DNA附着点的标准质粒；
步骤二、制备第一微环DNA基因载体；将第一启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分、用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子三种DNA成分按照先后顺序依次插入到所述标准质粒的多克隆位点中，得到含有转基因或转基因表达盒子的载体；使用重组酶ΦC31处理所述含有转基因或转基因表达盒子的载体，重组后得到所述第一微环DNA基因载体；
步骤三、制备第二微环DNA基因载体；将第二启动子和所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因按照先后顺序依次插入到所述标准质粒的多克隆位点中，得到含有所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因的载体；使用重组酶ΦC31处理含有所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因的载体，重组后得到所述第二微环DNA基因载体；
步骤四、将所述第一微环DNA基因载体和所述第二微环DNA基因载体混合，得到所述微环DNA基因载体组合物。
一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～8中任一项所述的微环DNA基因载体组合物以及用于将所述微环DNA基因载体组合物送入靶细胞的工具。

说明书微环DNA基因载体组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
本发明涉及基因治疗领域，尤其涉及一种微环DNA基因载体组合物及其制备方法和应用。
【背景技术】
基因治疗是治疗很多遗传性、获得性疾病最理想方法，目前已经有很多临床前实验成功的报道。然而，临床上成功的例子却鲜有报道。基因治疗的核心是将治疗载体送入靶细胞，但载体的构建和投送方面，还有若干技术问题有待解决。基因治疗载体可分为两类，即病毒载体和非病毒载体。病毒载体感染细胞的效率很高，但由于其免疫原性和插入性突变，容易引起严重的反应，包括致癌、致命，因而难以被临床接受；此外，制造成本高也是其应用的一大障碍。非病毒载体较安全、经济、转基因的大小无限制，相对于病毒载体具有一定的优势，但目前还缺乏送入体内细胞的有效手段。
全球有超过三亿五千万人，中国有超过一亿人，是乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)携带者。HBV可诱发肝衰竭、肝硬化及肝癌，导致感染者过早死亡。现有的治疗药物，包括核苷酸类药物、干扰素等，疗效不能持久，需经常或每天给药，价格昂贵且副作用大，应用范围有很大限制。疫苗注射可有效预防乙肝病毒感染扩散产生新带毒者，但对己有带毒者无效。此外，疫苗注射覆盖不全，且有部份受注者不产生保护性免疫反应，故每年仍有大量新病例产生。市场需要一种高效、安全、价廉、方便的新治疗技术与产品。
下面通过基因载体表达干扰RNA(interference RNA，RNAi)，治疗HBV感染的研究现状，来说明基因治疗的巨大潜力和现有问题。
RNAi是最近发现的、生物细胞内的一种保守的分子机制，可将含有特定结构的双链RNA(dsRNA)，包括小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)加工成20～30碱基的RNA，形成RNA诱导的静默复合物(RNA‑induced silencing complex，RISC)，通过与靶mRNA淬火链合(annealing)，将其裂解或抑制其翻译，达到阻止蛋白质合成的目的。这是生物调节细胞反应过程、抵抗入侵病毒的普遍机制。科学家们正在做出巨大的努力，试图把这个机制转变成治疗技术，治疗各种疾病。已有很多成功的临床前实验的报道，包括抗癌、抗病毒感染等。目前已经有采用RNAi的方式，在体内、体外抑制HBV病毒复制，并且具有较好的效果的报道(McCaffrey，2003)。但该技术还存在一些问题，因而难以应用于临床，主要包括：合成的siRNA在肝细胞内的存留时间短，需反复给药，成本高；用质粒表达RNAi，在体外短期效果很好，但体内投递，效率不高，仅能到达少部分肝细胞，而HBV可存在于几乎所有的肝细胞，因而疗效不彰；标准质粒(plasmid)的骨架DNA成份(DNA复制起源，包括抗菌素抵抗基因等)，可抑制转基因表达，使质粒很快失去表达功能；病毒载体如AAV，肝细胞感染率很高，对HBV的抑制很完全(Li，2009)，但AAV载体可被宿主体内抗体中和失效，或诱发可致命的宿主免疫反应，同时病毒基因组插入性突变，潜藏着致癌的危险。因此，发展安全、高效的载体技术，是实现用RNAi治疗HBV感染的关键。
除了RNAi，反义RNA(antisense RNA)、诱饵RNA(decoy RNA)和核酶(ribozyme)也有强效的抗HBV复制的效果。但它们与RNAi一样面临着载体的构筑和有效投送到靶细胞等问题。
Chen等发明的微环DNA(MC)技术(Chen，Z.Y.，et al.，Minicircle DNA vectors devoid of bacteial DNA result in persistent and high level transgene expression in vivo.Mol.Ther.，2003.)，有助于解决上述问题。MC是一个环状表达盒子，不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA，可在体内长期表达高水平的转基因产物。在肝细胞内，HBV病毒基因组也能形成环状的DNA结构，称为共价键密闭环状DNA(cccDNA)。导致HBV感染治疗困难的关键，是cccDNA可在肝内存在多年，且对几乎所有药物不敏感。MC在结构、转基因表达的持久性、细胞内的稳定性上，与HBV cccDNA相同，使MC成为安全、高效的理想载体。
然而，MC也存在着投递到体内靶细胞效率不高的问题。仍以治疗HBV感染为例，在正常的血循环途径中，MC需要穿过肝窦内皮细胞孔才能进入到人肝主质细胞中，而传统的基因载体无法或很难穿过肝窦内皮细胞孔。
【发明内容】
基于此，有必要提供一种具有较高的投递效率的微环DNA基因载体组合物。
此外，还有必要提供一种上述微环DNA基因载体组合物的制备方法和应用。
一种微环DNA基因载体组合物，包括：第一微环DNA基因载体和第二微环DNA基因载体；
所述第一微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述第一微环DNA基因载体包括：第一启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子；
所述第二微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，所述第二微环DNA基因载体包括：第二启动子和所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因；
所述第一微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的基因成分和所述治疗性转基因产物至少两个星期，所述第二微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的组装蛋白至少两个星期，所述病毒的基因成分和所述病毒的组装蛋白可以在哺乳动物细胞内组装形成可以表达所述治疗性转基因产物并具有侵染性的重组病毒。
优选的，所述病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分为乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分；
所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因为乙肝病毒基因组中负责表达多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分。
优选的，所述乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括：5’包装信号、3’包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域；
所述启动子、所述5’包装信号、所述转基因或转基因表达盒子、所述第一增强子、所述病毒复制调节区域以及所述3’包装信号依次连接。
优选的，所述乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括：包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域；
所述包装信号、所述转基因或转基因表达盒子、所述第一增强子以及所述病毒复制调节区域依次连接，所述病毒复制调节区域和包装信号连接到一起，形成核心蛋白基因的启动子。
优选的，所述乙肝病毒基因组中负责表达多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的基因采用变性码序列替代。
优选的，所述第二微环DNA基因载体还包括表达敲下DGCR8基因的RNAi的成分。
优选的，所述第一启动子为核心蛋白基因的启动子、第二型多聚酶基因启动子或第三型多聚酶基因启动子；
所述第二启动子为第二型多聚酶基因启动子。
优选的，所述第一微环DNA基因载体为双链DNA结构，第二微环DNA基因载体为双链DNA结构。
一种上述的微环DNA基因载体组合物的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、提供具有重组酶ΦC31的细菌DNA附着点和重组酶ΦC31的噬菌体DNA附着点的标准质粒；
步骤二、制备第一微环DNA基因载体；将第一启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分、用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子三种DNA成分按照先后顺序依次插入到所述标准质粒的多克隆位点中，得到含有转基因或转基因表达盒子的载体；使用重组酶ΦC31处理所述含有转基因或转基因表达盒子的载体，重组后得到所述第一微环DNA基因载体；
步骤三、制备第二微环DNA基因载体；将第二启动子和所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的成分按照先后顺序依次插入到所述标准质粒的多克隆位点中，得到含有所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因的载体；使用重组酶ΦC31处理含有所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因的载体，重组后得到所述第二微环DNA基因载体；
步骤四、将所述第一微环DNA基因载体和所述第二微环DNA基因载体混合，得到所述微环DNA基因载体组合物。
一种试剂盒，包括如上述的微环DNA基因载体组合物以及用于将所述微环DNA基因载体组合物送入靶细胞的工具。
这种微环DNA基因载体组合物包括将病毒基因组中的负责基因表达和病毒复制的成分克隆到载体中，得到的重组的嵌合的第一微环DNA基因载体，以及将病毒基因组中负责表达病毒蛋白的DNA成分克隆到载体中，得到的重组的第二微环DNA基因载体。将这种微环DNA基因载体组合物送入靶细胞内，第一微环DNA基因载体可以表达病毒的基因成分，第二微环DNA基因载体可以表达病毒的组装蛋白，病毒的基因成分和病毒的组装蛋白在靶细胞内组装形成可以表达所述治疗性转基因产物并具有侵染性的重组病毒。重组病毒可以穿过体内的大部分微血管床屏障，例如肝窦内皮细胞孔，从而可以顺利的感染到新的易感的靶细胞，具有较高的投递效率。
【附图说明】
图1为一实施方式的第一微环DNA基因载体MC.CMV.Ther.RC的结构示意图。
图2为制备微环DNA基因载体的标准质粒p2φC31的结构示意图。
图3为不带有Ther.的空白载体pMC.CMV.GeneLess.RC的结构示意图。
图4为一实施方式的第二微环DNA基因载体MC.UB.HBVprotein的结构示意图。
图5为微环DNA基因载体组合物送入到靶细胞内进行表达和复制的机理生产重组乙肝病毒rHBV示意图。
图6为MC.Ther.RC的结构示意图。
图7A为将转基因AntiHBV、转基因表达盒子UB.AntiHBV和转基因表达盒子H1.AntiHBV分别插入到空白载体pMC.CMV.GeneLess.RC的示意图。
图7B为一实施方式的AntiHBV表达的抗乙肝病毒的miRNA的推测的细胞内结构。
图7C为另一实施方式的AntiHBV表达的抗乙肝病毒的shRNA的推测的细胞内结构。
图8A为将AntiHBV插入到pMC.CMV.GeneLess.RC后得到的MC.CMV.AntiHBV.RC的结构示意图。
图8B为RC.Cp.AntiHBV的结构示意图。
图9A为将UB.AntiHBV插入到pMC.CMV.GeneLess.RC后得到的MC.CMV.UB.AntiHBV.RC的结构示意图。
图9B为RC.Cp.UB.AntiHBV的结构示意图。
图10A为将H1.AntiHBV插入到pMC.CMV.GeneLess.RC后得到的MC.CMV.H1.AntiHBV.RC的结构示意图。
图10B为RC.Cp.H1.AntiHBV的结构示意图。
图11A为MC.CMV.EGFP.RC的结构示意图。
图11B为RC.Cp.EGFP的结构示意图。
图12A为MC.CMV.UB.EGFP.RC的结构示意图。
图12B为RC.Cp.UB.EGFP的结构示意图。
图13A为MC.CMV.hAAT.RC的结构示意图。
图13B为RC.Cp.hAAT的结构示意图。
图14A为多聚酶基因中的第一siRNA模范靶序列与相应的变性码序列编码示意图。
图14B为野生的多聚酶基因表达产生的mRNA与第一siRNA序列互补淬合示意图。
图14C为多聚酶基因中的第二siRNA模范靶序列与相应的变性码序列编码示意图。
图14D为表面蛋白基因中的第三siRNA模范靶序列与相应的变性码序列编码示意图。
图15为结合变性编码子技术制备得到的一实施方式的第二微环DNA基因载体MC.degHBVprotein的结构示意图。
图16为结合抗DGCR8技术制备得到的一实施方式的第二微环DNA基因载体MC.AntiDGCR8.HBVprotein的结构示意图。
图17为结合抗DGCR8技术制备得到的另一实施方式的第二微环DNA基因载体MC.AntiDGCR8.degHBVprotein的结构示意图。
【具体实施方式】
下面结合附图及实施例对微环DNA基因载体组合物及其制备方法和应用做进一步的解释说明。
一实施方式的微环DNA基因载体组合物，包括：第一微环DNA基因载体和第二微环DNA基因载体。
第一微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，包括：第一启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子。第一微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的基因成分和所述治疗性转基因产物至少两个星期。
第二微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，包括：第二启动子和所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因。第二微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的组装蛋白至少两个星期。
当这种微环DNA基因载体组合物被送入到靶细胞内后，第一微环DNA基因载体可以所述病毒的基因成分，第二微环DNA基因载体可以表达所述病毒的组装蛋白，所述病毒的基因成分和所述病毒的组装蛋白可以在靶细胞内组装形成可以表达所述治疗性转基因产物并具有侵染性的重组病毒。重组病毒可以穿过体内的大部分屏障，例如肝窦内皮细胞孔，从而可以顺利的感染到新的细胞，具有较高的投递效率。
靶细胞包括哺乳动物体内的肝主质细胞(hepatocyte)，非肝主质细胞(nonparenchymal hepatocyte)如肝的内皮细胞、Kuffer细胞或其它器官的细胞。
生产出来的重组病毒可以像野生的病毒一样，穿过体内的大部分微血管屏障，例如肝窦内皮细胞孔，从而可以顺利的感染到新的易感靶细胞，生产新的感染性的重组病毒，并且本身可以表达治疗性转基因产物，从而长期、有效的发挥作用，成为一种安全、高效、方便、经济的基因治疗技术。
治疗性转基因产物为蛋白质或非编码RNA(noncoding RNA)。
可以选择仅为表达治疗性转基因产物基因的转基因，也可以选择带有自身启动子的转基因表达盒子。
非编码RNA可以为小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)、微小RNA(micorRNA，miRNA)、反义RNA(antissense RNA)、诱饵RNA(decoy RNA)和核酶(ribozyme)中的至少一种。
生产出来的重组病毒表达的蛋白质可以为补充体内功能有缺陷的蛋白，例如与病毒蛋白特异性结合的蛋白；表达的非编码RNA可以与病毒的靶mRNA淬火链合(annealing)，将其裂解或抑制其翻译，达到阻止蛋白质的合成和病毒复制的目的。
这种微环DNA基因载体组合物所包含的第一微环DNA基因载体和第二微环DNA基因载体均为双链的DNA，可以通过如下方法制备：
步骤一、提供具有重组酶ΦC31的细菌DNA附着点(attB)和重组酶ΦC31的噬菌体DNA附着点(attP)的标准质粒。
步骤二、制备第一微环DNA基因载体。
将第一启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分、用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子三种DNA成分按照先后顺序依次插入到标准质粒的多克隆位点中，得到包含有转基因或转基因表达盒子的载体。使用重组酶ΦC31处理所述含有转基因或转基因表达盒子的载体，重组得到所述微环DNA基因载体。
步骤三、制备第二微环DNA基因载体。
将第二启动子和所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因按照先后顺序依次插入到所述标准质粒的多克隆位点中，得到含有所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的DNA成分的载体；使用重组酶ΦC31处理所述含有所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的基因的载体，重组后得到第二微环DNA基因载体。
步骤四、将第一微环DNA基因载体和第二微环DNA基因载体混合，得到微环DNA基因载体组合物。
通过Chen等的微环DNA技术(Chen，Z.Y.，et al.，Minicircle DNA vectors devoid of bacteial DNA result in persistent and high level transgene expression in vivo.Mol.Ther.，2003.)，制备得到第一微环DNA基因载体和第二微环DNA基因载体。第一微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，包括：第一启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子。第一微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的基因成分和治疗性转基因产物至少两个星期。第二微环DNA基因载体不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分，包括：第二启动子和所述病毒基因组中负责表达所述病毒的组装蛋白的成分。第二微环DNA基因载体可以在哺乳动物细胞内稳定的、高通量的表达所述病毒的组装蛋白至少两个星期。
针对乙肝病毒(HBV)，介绍一实施方式的利用HBV基因的微环DNA基因载体组合物。
本实施方式中所用的HBV的基因组为Galibert所报道的ayw菌株(Galibert，F.，et al.，Nucleotide sequence of the hepatitis B virus genome(suntype ayw)cloned in E.coli.Nature 1979.281：p.646‑650；GenBank号V01640)作为模范序列，简称ayw.Galibert，来自含有1.2单位的HBV基因组的质粒pTHBV2(McCaffrey，A.P.，et al.，Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference.Nature Biotechnology，2003.21(6)：639))。根据Nassal(NASSAL，M.and A.RIEGER，A Bulged Region of the Hepatitis B Virusrus RNA Encapsidation Signal Contains the Replication Origin for Discontinuous First‑Strand DNA Synthesis. JOURNAL OFVIROLOGY，1996.70(5)：p.2764‑2773)的建议，DNA序列以核心蛋白基因启始密码ATG为5’端，前基因组RNA第一个碱基为第3100。
本实施方式的微环DNA基因载体组合物中的第一微环DNA基因载体如图1所示，包括：巨细胞病毒早期启动子(cytomegalovirus immediate early promoter，CMV)、HBV基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及转基因或转基因表达盒子。
HBV基因组中负责基因表达和病毒复制的成分包括：5’包装信号(Encapsulation signal，Enc)、3’包装信号(3’Enc)、第一增强子(Enhancer 1，Enh1)以及病毒复制调节区域(Replication regulatory region，RCR)，上述基因主要负责HBV的包装、复制和表达。
转基因或转基因表达盒子用于表达治疗型转基因产物，可以记为Ther.(Therapeutic transgene)。
第一微环DNA基因载体包含的各种成分为依次连接的CMV、5’Enc、Ther.、Enh1、RCR和3’Enc，连接CMV和Enc的序列中存在固有的重组产物attR。本实施方式中第一启动子为CMV。在其他的实施方式中，第一启动子可以选择启动子为核心蛋白基因的启动子(Cp)、第二型多聚酶基因启动子或第三型多聚酶基因启动子。第二型多聚酶基因启动子可以为CMV或UB(泛素基因的启动子)，第三型多聚酶基因启动子可以为H1。H1启动子可得自“pSilencer 3.1‑H1neo”质粒(Applied Biosystem，Carlsbad，California，USA)。
这种第一微环DNA基因载体可以记为MC.CMV.Ther.RC，统称MC1。
结合图2和图3，以CMV启动子为例，对MC.CMV.Ther.RC的制备方法进行说明：
参照Chen等的微环DNA技术，提供如图2所示的标准质粒p2φC31。标准质粒p2φC31具有：可诱导的重组酶ΦC31位点、可诱导的归巢内切酶(homingendonuclease)I‑SceI位点、重组酶ΦC31的细菌DNA附着点(attB)、重组酶ΦC31的噬菌体DNA附着点(attP)以及多克隆位点MCS。
将CMV、HBV基因组中负责基因表达和病毒复制的成分共三个DNA片段用标准DNA克隆技术，依次插入到p2φC31的多克隆位点中，三个DNA片段为：(1)、CMV.Enc，CMV和5’Enc，相当于MC.2013的16～712共697bp(Li SB等，High expression of hepatitis B virus based vector with reporter gene in hepatitis B virus infection system.World J Gastroenterol 13(17)：2490，2007)；(2)、Enh 1，相当于ayw.Galibert的2264～2601共338bp；(3)、RCR.Enc，病毒复制调控区和3’Enc，相当于ayw.Galibert的2913～3182/1～20共290bp。RCR.Enc中包含第一、第二重复序列(DR1和DR2，图中未显示)，与DNA合成有关的序列Φ(图中未显示)，第二增强子(Enh 2，图中未显示)，核心蛋白基因增强子以及前基因组RNA的3’包装信号(3’Enc)。
上述操作完成后，得到如图3所示的空白载体pMC.CMV.GeneLess.RC，接着将Ther.插入到5’Enc下游，得到pMC.CMV.Ther.RC。
上述三个乙肝病毒DNA片段均可从pTHBV2(McCaffrey，A.P.，et al.，Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference.Nature Biotechnology，2003.21(6)：639))中得到。
得到pMC.CMV.Ther.RC后，可利用Chen等的微环DNA技术，attB和attP序列重组形成attR，最终得到MC.CMV.Ther.RC。
本实施方式的微环DNA基因载体组合物中的第二微环DNA基因载体如图4所示，包括：泛素基因的启动子(UB)以及HBV基因组中负责表达多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分。HBV基因组中负责表达多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分为ayw.Galibert的1～2905共2905bp的序列。
第二微环DNA基因载体包含的各种成分为依次连接的UB和ayw.Galibert1～2905，连接UB和ayw.Galibert 1～2905的序列中存在固有的重组产物attR，ayw.Galibert 1～2905的末端连接有bpA。本实施方式中第二启动子为UB。在其他的实施方式中，启动子可以选择为其他种类的第二型多聚酶基因启动子，例如CMV。
这种第二微环DNA基因载体可以记为MC.UB.HBVprotein，统称MC2。
MC.UB.HBVprotein的制备方法与MC.CMV.Ther.RC类似，下面简单进行说明：
参照Chen等的微环DNA技术，提供如图2所示的标准质粒p2φC31。标准质粒p2φC31具有：可诱导的重组酶ΦC31位点、可诱导的归巢内切酶(homing endonuclease)I‑SceI位点、重组酶ΦC31的细菌DNA附着点(attB)、重组酶ΦC31的噬菌体DNA附着点(attP)以及多克隆位点。
将UB和HBV基因组中负责表达多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分采用标准DNA克隆技术，末端连接上猪生长因子基因的poly A信号(记为bpA)后，插入到p2φC31的多克隆位点中。
HBV基因组中负责表达多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分为ayw.Galibert的1～2905共2905bp的序列。
最后利用Chen等的微环DNA技术，attB和attP序列重组形成attR，最终得到MC.UB.HBVprotein。
将MC.CMV.Ther.RC和MC.UB.HBVprotein混合后，得到微环DNA基因载体组合物。下面结合图5，对将微环DNA基因载体组合物送入到靶细胞内进行表达和复制的机理进行简单说明。
本实施方式中，以肝窦内皮细胞为靶细胞，rHBV穿过肝窦内皮细胞孔后，进入感染了HBV的肝主质细胞内。
将微环DNA基因载体组合物送入肝窦内皮细胞内，MC.CMV.Ther.RC和MC.UB.HBVprotein共同表达，组装形成rHBV。具体过程为：MC.CMV.Ther.RC先转录形成前基因组RNA(pgRNA)，MC.UB.HBVprotein表达核心蛋白、多聚酶(polymerase，pol)、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白。前基因组RNA与pol一起，被核心蛋白包装得到不成熟的病毒粒子(nucleocapsid)。接着，不成熟的病毒粒子中的前基因组RNA逆转录形成两条DNA双链，其中一条较长负链已经形成完整的开放式环状，另一条长度较短的正链，呈半环状。最后不成熟的病毒颗粒被内质网包裹，大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白被加入到病毒粒子中，形成治疗性的、感染性的rHBV。rHBV的基因组是由两条螺旋的DNA链围成的环状结构，其中一条较长负链已经形成完整的开放式环状，另一条长度较短的正链，呈半环状。rHBV可以穿过肝窦内皮细胞孔，从而进入到感染了HBV病毒的肝主质细胞中，感染肝主质细胞之后，rHBV的DNA链要以负链为模板，在DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状。这时重组乙肝病毒基因组就形成了一个完全开放式的环状的双链DNA，经过DNA重组成为重组共价键密闭环状DNA(recombined covalent closed circular，rcccDNA)，具有野生乙肝病毒重组共价键密闭环状DNA(covalent closed circular，cccDNA)一样的表达和复制功能。rcccDNA没有CMV，可以记为MC.Ther.RC。MC.Ther.RC中RCR和新形成的的Enc相连形成核心蛋白基因的启动子(Cp)，加上上游Enh1，能够长期地、高水平地表达治疗性转基因产物。
MC.Ther.RC的结构如图6所示，包含的各种成分为依次连接的Enc、Ther.、Enh1和RCR，RCR和Enc连接到一起，形成核心蛋白基因的启动子Cp，加上促进子Enh1，从而能够长期表达高水平的、治疗性转基因产物。包装信号、第一增强子以及病毒复制调节区域为乙肝病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分。MC.Ther.RC中包括启动子、病毒基因组中负责基因表达和病毒复制的成分以及用于表达治疗性转基因产物的转基因或转基因表达盒子，并且不含标准质粒中能关闭转基因表达的骨架DNA成分。
因此，MC.Ther.RC为另一实施方式的MC1。
MC.Ther.RC可以通过将MC.CMV.Ther.RC和MC.UB.HBVprotein送入到哺乳动物肝细胞内后提取得到；也可以通过将MC.CMV.Ther.RC送入感染了HBV的肝主质细胞中后提取得到；还可以采用类似于MC.CMV.Ther.RC的制备方法，采用基因重组的手段，将相关序列插入到p2φC31的多克隆位点中后采用Chen等的微环DNA技术，大量制备含有attR的MC.Ther.RC。
MC.Ther.RC与MC.UB.HBVprotein混合后，也可以得到具有治疗功能的微环DNA基因载体组合物，将这种微环DNA基因载体组合物送入到肝内皮细胞后，MC.Ther.RC在启动子Cp驱动表达前基因组RNA。MC.UB.HBVprotein中启动子UB驱动表达病毒蛋白，并将重组的HBV前基因组RNA包装成治疗性的、感染性的重组HBV(rHBV)。具体重组过程及rHBV中的基因组结构与前述基本相同，在此不重复叙述。rHBV可以穿过肝窦内皮细胞孔，从而进入到感染了HBV病毒的肝主质细胞中，感染肝主质细胞之后，rHBV的DNA链要以负链为模板，在DNA聚合酶的作用下延长，最终形成完整的环状结构(rcccDNA)，该结构为MC.Ther.RC。
MC.CMV.Ther.RC在表达前基因组RNA时，会导致CMV启动子和attR序列的丢失，从而其结构中的5’Enc和3’Enc相连，形成新的Enc，而RCR和新形成的的Enc相连形成启动子Cp，再经过后续的逆转录等过程，形成的rcccDNA为MC.Ther.RC。
MC.Ther.RC在表达前基因组RNA时，并不会有序列的丢失，最后得到的rcccDNA为其本身。
本实施方式中，Ther.为不带有自身启动子的转基因AntiHBV，用于抑制HBV的复制，从而治疗乙肝病毒感染。根据Ther.是否带有自身启动子，以及启动子的种类，分别应用到MC.CMV.Ther.RC和MC.Ther.RC中，可以得到不同实施方式的具体的MC1。
AntiHBV表达非编码RNA，可以为shRNA、miRNA、antissense RNA、decoyRNA和ribozyme中的至少一种。
本实施方式中，AntiHBV表达miRNA，具体的信息见图7B。下述各种载体中，如无特别说明，AntiHBV均表达如图7B所示的miRNA。
如图7A所示，将转基因AntiHBV、转基因表达盒子UB.AntiHBV和转基因表达盒子H1.AntiHBV分别插入到空白载体pMC.CMV.GeneLess.RC的5’Enc下游，再通过微环DNA技术，得到不同的MC1。
如图7B所示的本实施方式的AntiHBV表达的抗乙肝病毒的miRNA的推测的细胞内结构。这种结构为RNAi两种基本形式之一，加黑斜体部分为抗HBVsiRNA，引自Ely等(Ely，A.，T.Naidoo，and P.Arbuthnot，Efficient silencing of gene expression with modular trimeric Pol II expression cassettes comprising microRNA shuttles.Nucleic Acids Research，2009.37(13)：p.e91)。
如图7C所示的另一实施方式的AntiHBV抗乙肝病毒的shRNA的推测的细胞内结构。这种结构为RNAi的另外一种基本形式。加黑斜体部分为抗HBVsiRNA，引自McCaffrey AP et al.(McCaffrey，A.P.，et al.，Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference.Nature Biotechnology，2003.21(6)：639))。
如图8A所示的MC.CMV.AntiHBV.RC，表达后得到的RC.Cp.AntiHBV如图8B所示，RCR和Enc连接到一起，形成启动子Cp。这里对表达后得到的rcccDNA的命名进行了些修改，以显示出启动子，当然这并不影响方案的实施。即前述的MC.Ther.RC在Ther.为具体的基因时，命名改变为RC.Cp.Ther.，后面也沿用这样的命名。
如图9A所示的MC.CMV.UB.AntiHBV.RC，表达后得到的RC.UB.AntiHBV如图9B所示。
如图10A所示的MC.CMV.H1.AntiHBV.RC，表达后得到的RC.H1.AntiHBV如图10B所示。
在其他的实施方式中，根据Ther.的不同，可以获得具有不同功能的微环DNA基因载体组合物。第二微环DNA基因载体仍以MC.UB.HBVprotein为例。下面通过第一微环DNA基因载体中Ther.的不同，来介绍不同功能的基因载体组合物。
一实施方式的用于表达报告基因的第一微环DNA基因载体，本实施方式中，报告基因为增强型鱼绿色荧光蛋白(EGFP)基因。根据EGFP基因自身是否带有启动子，可以得到两种类型的第一微环DNA基因载体。如图11A所示的第一微环DNA基因载体，EGFP基因自身不带启动子，记为MC.CMV.EGFP.RC，由其衍生的rcccDNA如图11B所示，RCR和Enc连接到一起，形成启动子Cp。如图12A所示的第一微环DNA基因载体，EGFP基因自身带有启动子UB，记为MC.CMV.UB.EGFP.RC，表达后得到的RC.Cp.UB.EGFP如图12B所示。本实施方式的第一微环DNA基因载体与MC.UB.HBVprotein混合后得到的微环DNA基因载体组合物能够在哺乳动物细胞内重组形成具有表达EGFP基因功能的rHBV，且该rHBV可以穿过体内包括肝窦内皮细胞孔在内的屏障。
如图13A所示的一实施方式的用于表达抗胰蛋白酶(human alpha‑1antitrypsin，hAAT)的第一微环DNA基因载体，记为MC.CMV.hAAT.RC。由其衍生的rcccDNARC.Cp.hAAT如图13B所示，RCR和Enc连接到一起，形成启动子Cp。本实施方式的第一微环DNA基因载体与MC.UB.HBVprotein混合后得到的微环DNA基因载体组合物能够在哺乳动物细胞内重组形成具有表达抗胰蛋白酶功能的rHBV，且该rHBV可以穿过体内包括肝窦内皮细胞孔在内的屏障。
微环DNA基因载体组合物在投递到哺乳动物细胞内后，还面临着一个问题。当治疗性转基因产物为针对HBV病毒的非编码RNA(noncoding RNA)时，具体到上述实施例中第一微环DNA基因载体的Ther.表达抗乙肝病毒的miRNA，该非编码RNA产生的RNAi会破坏前基因组RNA和编码病毒蛋白的mRNA，影响第二微环DNA基因载体的正常表达，最终导致rHBV无法正常形成。
需要注意的是，当治疗型转基因产物为针对其他种类病毒的非编码RNA时，由于RNAi的特异性，并不会影响到第二微环DNA基因载体的正常表达。
另一个问题是，当前基因组RNA含有shRNA或miRNA的结构时，细胞内的Drosha‑Pasha/DGCR8复合物，会将它们从前基因组RNA分离，破坏前基因组RNA的完整性，不能被包装成rHBV。基于上述理由，我们开发了变性编码子和敲下DGCR8两种技术用于解决上述问题，以使得第二微环DNA基因载体可以正常表达。
下面对变性编码子和抗DGCR8两种技术分别进行介绍。
变性编码子技术通过采用编码相同氨基酸序列的变性码序列替换野生序列，而这种变性码序列转录后得到的前基因组RNA和mRNA不会被RNAi特异性的识别，不会被第一微环DNA基因载体所表达非编码RNA破坏，从而可以正常的表达HBV蛋白，最终完成rHBV的包装。
提供三个变性编码子序列，分别如图14A、图14C和图14D所示。
如图14A所示，多聚酶基因中的第一siRNA模范靶序列(McCaffrey，A.P.，etal.，Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference.Nature Biotechnology，2003.21(6)：639))与变性码序列编码相同的氨基酸序列，但是RNA序列却不相同。
如图14B所示，野生的多聚酶基因表达产生的mRNA与第一siRNA序列互补淬合，最终被裂解，从而无法表达多聚酶，导致rHBV病毒颗粒无法正常形成。而采用变性码序列的mRNA无法与第一siRNA序列互补淬合，从而可以顺利的表达多聚酶，rHBV病毒颗粒可以顺利的形成。
如图14C所示，多聚酶基因中的第二siRNA模范靶序列(Ely，A.，T.Naidoo，and P. Arbuthnot，Effiicient silencing of gene expression with modular trimeric Pol II expression cassettes comprising microRNA shuttles.Nucleic Acids Research，2009.37(13)：p.e91.)与变性码序列编码相同的氨基酸序列，但是RNA序列却不相同。
如图14D所示，表面蛋白基因中的第三siRNA模范靶序列(McCaffrey，A.P.，et al.，Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference.Nature Biotechnology，2003.21(6)：639))与变性码序列编码相同的氨基酸序列，但是RNA序列却不相同。
采用上述变性码序列替代相应的野生序列，可以得到结合变性编码子技术制备的第二微环DNA基因载体。
下面提供一实施方式的结合变性编码子技术的第二微环DNA基因载体。
首先，将多聚酶基因中的第一siRNA模范靶序列和第二siRNA模范靶序列用相应的变性码序列替换，记为degPol。将大表面蛋白基因的中第三siRNA模范靶序列用相应的变性码序列替换，记为deg.LHBsAg。将小表面蛋白基因中第三siRNA模范靶序列用相应的变性码序列替换，记为deg.sHBsAg。随后，用来自parcoviruses的自我裂解的多酞2A连接核心蛋白的基因(Core gene，C)以及上述三个基因片段，成为融合基因。然后，将启动子UB、融合基因、猪生长因子基因的poly A信号依次插p2ΦC31的多克隆位点。最后利用Chen等的微环DNA技术，制得如图15所示的结合变性编码子技术的第二微环DNA基因载体，记为MC.degHBVprotein。
其中，核心蛋白的基因(C)为ayw.Galibert的第1～552个碱基对，多聚酶的基因为ayw.Galibert的第407～2897个碱基对，2A来自parcoviruses的自我裂解多酞，大表面蛋白的基因为ayw.Galibert的第948～2118个碱基对，小表面蛋白基因为ayw.Galibert的第1437～2118个碱基对。
接下来对敲下DGCR8技术进行介绍。本实施方式中，采用将表达敲下DGCR8基因的RNAi的成分连接到第二微环DNA基因载体中，实现对DGCR8基因的敲除。
参与将pri‑miRNA加工成siRNA的细胞成分包括蛋白质Drosha、Pasha(又名DGCR8)和Dicer等。Drosha‑Pasha复合体负责将miRNA从pri‑miRNA上切下，再由Dicer等加工成RNAi。含有miRNA的前基因组RNA相当于pri‑miRNA。用siRNA技术敲下DGCR8，使细胞内不含或仅含极低水平的DGCR8，带有miRNA的大部分前基因组RNA，便可保持完整，被包装成rHBV。
如图16所示的一实施方式的第二微环DNA基因载体，与MC.UB.HBVprotein的区别仅在于bpA后面所连接的H1启动子以及siRNA.DGCR8序列，记为MC.AntiDGCR8.HBVprotein。siRNA.DGCR8序列为抗DGCR8的siRNA表达盒子，以DGCR8mRNA(GeneBank NM_022720)526～548作为模范靶子，构建pMC.Anti.DGCR8protein，其靶序列为“ccc tgc tgagga ccc ctt caa c”。表达抗DGCR8的shRNA包括终止子的合成DNA序列为“gttg aag ggg tcc tca gca ggg CTTCGAA ccc tgc tga gga ccc ctt caa c TTTTT”，加底线的序列TTTTT为启动子H1的终止信号。MC.AntiDGCR8.HBVprotein表达合成的抗DGCR8d1siRNA序列为“g uug aag ggg ucc tca gca ggg”。
MC.AntiDGCR8.HBVprotein的制备方法与MC.UB.HBVprotein基本相同，具体为：参照Chen等的微环DNA技术，提供如图2所示的标准质粒p2φC31。标准质粒p2φC31具有：可诱导的重组酶ΦC31位点、可诱导的归巢内切酶(homing endonuclease)I‑SceI位点、重组酶ΦC31的细菌DNA附着点(attB)、重组酶ΦC31的噬菌体DNA附着点(attP)以及多克隆位点。将UB和HBV基因组中负责表达多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分采用标准DNA克隆技术，末端连接上猪生长因子基因的polyA信号(记为bpA)后，插入到p2φC31的多克隆位点中。再将H1启动子和siRNA.DGCR8序列融合后插入到polyA信号下游的PspOM1酶切点。最后利用Chen等的微环DNA技术，attB和attP序列重组形成attR，最终得到MC.AntiDGCR8.HBVprotein。
如图17所示的一实施方式的第二微环DNA基因载体，与MC.degHBVprotein的区别仅在于bpA后面所连接的H1启动子以及siRNA.DGCR8序列，记为MC.AntiDGCR8.degHBVprotein。
MC.AntiDGCR8.degHBVprotein的制备方法参照前述可以轻易得出，在此不再重复叙述。
本发明还提供一种试剂盒，包括如上所述的微环DNA基因载体组合物以及用于将该微环DNA基因载体组合物送入靶细胞的工具。
在一般的实施例中，可以选择用脂质体(Lipofectamine)与微环DNA基因载体组合物混合，将微环DNA基因载体组合物送入靶细胞。
下面通过具体的实验，来验证上述制备的微环DNA基因载体组合物的功能。
1、测定第一、第二微环DNA基因载体表达蛋白质的功能。
实验分成五组：
(1)、MC.UB.HBVprotein(图4)
(2)、MC.degHBVprotein(图15)
(3)、MC.AntiDGCR8.degHBVprotein(图13A)
(4)、MC.CMV.hAAT.RC (图16)
(5)、无处理组。
选择微环DNA基因载体，每种5μg，与Lipofectamine形成复合物，感染人肝癌细胞株huh7；无处理组未进行任何处理。48小时后，用ELISA检测，发现第1～3组细胞，表达相当水平的HBV表面抗原(HBsAG)，而第4、5组阴性；相反，只有第4组细胞hAAT阳性，而其它组都阴性。Northern blot检测，以pTHBV2中的ayw.Galibert序列为探针，发现第1组细胞，表达各种乙肝病毒mRNA，包括核心蛋白/pol、大表面抗原、小表面抗原mRNA；第2、3组，没有2.9kb的核心蛋白/pol mRNA，而见0.5kb和2.5kb的mRNA，相当于核心蛋白和多聚酶mRNA；第4、5组阴性。结果表明，这些第一、第二微环DNA基因载体能按设计，表达相关的蛋白或mRNA。
Lipofectamine 2000是美国Invitrogen的产品(Carlsbad，California，USA)。
2、测定第一、第二微环DNA基因载体表达EGFP的功能。
实验分成五组：
(1)MC.CMV.EGFP.RC  (图11A)
(2)MC.CMV.UB.EGFP.RC  (图12A)
(3)RC.Cp.UB.EGFP  (图12B)
(4)MC.CMV.hAAT.RC  (图13A)
(5)Lipofactamin对照组
选择微环DNA基因载体，每种5μg，加上Lipofactamin后，转染huh7细胞；Lipofactamin对照组仅用Lipofectamine处理。48小时后，用荧光显微镜和流式细胞仪检测发现，第1、2、3组，10％以上的细胞，表达相当高水平的鱼绿色荧光蛋白，而第4、5组阴性。结果表明，第一、第二微环DNA基因载体能按照设计，表达鱼绿色荧光基因。
3、测定各种微环DNA基因载体组合物的复制功能。
实验分成五组：
(1)、MC.CMV.EGFP.RC(图11A)加MC.UB.HBVprotein  (图4)
(2)、MC.CMV.UB.EGFP.RC(图12A)加MC.UB.HBVprotein(图4)
(3、MC.CMV.hAAT.RC 图13A)加MC.UB.HBVprotein(图4)
(4)、仅有MC.UB.HBVprotein(图4)。
这里用体内加体外双重实验方法来测定。首先，第1～3组，每组两种微环DNA基因载体，每种4μg，一起与2mL的生理盐水混合，按照标准程序，通过尾静脉高压注入小鼠肝脏(Zhang，G.，V. Budker，and J.A.Wolff，High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmidDNA.Hum Gene Ther，1999.10(10)：p.1735‑7.)；第4组仅注MC.UB.HBVprotein。每组三只雌性小鼠，品种为B和T淋巴细胞缺乏的NOD/SICD，10周大。48小时后，收集小鼠血清，加入6井的人肝细胞原代培养，每井100微升。24小时后，用显微镜和流式细胞仪检测发现，第1、2组，10％以上的细胞表达显著的鱼绿色荧光，而第3、4组阴性。将这些细胞收集，制备总DNA，用PCR和Southern blot的方法，检测载体DNA EGF P，发现第1、2组阳性，并有rcccDNA形成，而第3、4组阴性。这些结果表明，MC.CMV.EGFP.RC和MC.CMV.UB.EGFP.RC中的HBV病毒DNA成分，赋予这两个MC.Report.RC表达、复制的功能，使它们能在小鼠肝内表达病毒前基因组RNA，被MC.UB.HBVprotein所表达的病毒蛋白包装病毒颗粒，被排入血循环，并能感染原代培养的人肝细胞，表达报告基因，形成重组共价键密闭环状DNA(rcccDNA)。
4、测定各种微环DNA基因载体组合物抗乙肝病毒的功能。
实验分成6组：
(1)、MC.CMV.AntiHBV.RC(图8A)、MC.UB.HBVprotein(图4)加MC.CMV.hAAT.RC(图13A)
(2)、MC.CMV.AntiHBV.RC(图8A)、MC.degHBVprotein(图15)加MC.CMV.hAAT.RC(图13A)
(3)、MC.CMV.AntiHBV.RC(图8A)、MC.AntiDGCR8.degHBVprotein(图17)加MC.CMV.hAAT.RC(图13A)
(4)、RC.Cp.UB.EGFP(图12B)、MC.UB.HBVprotein(图4)加MC.CMV.hAAT.RC(图13A)
(5)、RC.Cp.UB.EGFP(图12B)、MC.degHBVprotein(图15)加MC.CMV.hAAT.RC(图13A)
(6)、RC.Cp.UB.EGFP(图12B)、MC.AntiDGCR8.degHBVprotein(图17)加MC.CMV.hAAT.RC  (图13A)。
第1、2和3组的AntiHBV序列，能表达抗乙肝病毒的治疗性miRNA(如图7B所示)；第4、5、6组中，用表达EGFP的载体代替抗乙肝的MC.RC，作为对照组。为了测定它们抗HBV功能，将每组三种DNA，每种5微克，与2毫升生理盐水混合后，用标准尾静脉注高压射法，注入小鼠肝内。每组3只雌性小鼠，品种为B和T淋巴细胞缺乏的NOD/SICD，10周大。48小时后，用ELISA测定血中的hAAT、HBsAg的水平，用qPCR测定血中HBV DNA的含量。所有6个组，都表达相似水平的hAAT，证明尾静脉注高压射DNA的均匀性。第1～3组，血中的HBsAg水平显著低于第4～6组，而第4～6组之间，没有显著差别；血中HBV DNA，第1组最低，第2组稍高，第3组最高，第4～6组阴性。这些结果证明了这个AntiHBV序列的抗HBV的治疗作用，以及变性编码子与敲下DGCR8对表达病毒包装蛋白功能的保护作用。第1组的病毒包装蛋白mRNA，被siRNA与DGCR8(Pasha)两重性破坏，故血中只有微量的HBsAg与rHBV DNA，变性编码子使病毒mRNA不被siRNA破坏，而敲下DGCR8进一步保护病毒mRNA，不被Drosha/Pasha复合体破坏，有叠加保护作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。