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1、(10)申请公布号 CN 102978140 A (43)申请公布日 2013.03.20 CN 102978140 A *CN102978140A* (21)申请号 201210512344.1 (22)申请日 2012.12.04 CGMCC No. 6771 2012.11.02 C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/38(2006.01) (71)申请人 天津科技大学 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开发 区十三大街 29 号 (72)发明人 杨洪江 于越 (74)专利代理机构 天津盛理。
2、知识产权代理有限 公司 12209 代理人 王来佳 (54) 发明名称 一种正丁醇耐受菌株及其筛选和鉴定方法 (57) 摘要 本发明涉及一种正丁醇耐受菌株， 名称为 YY-23， 分类名称为 Pseudomonas stutzeri， 保藏 编号为 ： CGMCC No.6771， 保藏日期 ： 2012 年 11 月 2 日， 保藏地址为 ： 北京市朝阳区大屯路中国科学 院微生物研究所， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心。本发明分离的正 丁醇耐受菌株， 可以作为宿主菌， 异源表达正丁醇 合成途径的关键酶基因， 可得到正丁醇产量较高 的重组菌株， 为正丁醇重组菌的构建。
3、扩宽了思路。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 2 页 1/2 页 2 1. 一种正丁醇耐受菌株， 其特征在于 ： 名称为 YY-23， 分类名称为 PSeudomonas stutxeri, 保藏编号为 ： CGMCCNo.6771， 保藏日期 ： 2012 年 11 月 2 日， 保藏地址为 ： 北京市 朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中。
4、心。 2. 如权利要求 1 所述的正丁醇耐受菌株在构建正丁醇高产菌株中的应用。 3. 一种如权利要求 1 所述的正丁醇耐受菌株筛选方法， 其特征在于 ： 在筛选过程中采 用将不同环境样品培养在富集培养基中进行分离， 获得分离菌株， 再将分离菌株培养在添 加不同浓度正丁醇的耐受培养基中， 用分光光度计测定菌体密度的方法测定菌体的相对生 长率， 获得正丁醇耐受菌株。 4. 根据权利要求 3 所述的正丁醇耐受菌株筛选方法， 其特征在于 ： 具体步骤如下 ： 正丁醇耐受菌株的富集与分离 ： 取不同环境样品， 分别与生理盐水混合后稀释， 于220rpm震荡30min， 静止15min， 取上 清液， 按。
5、上清液与富集培养基的体积比为 1:15， 将上清液分别加入添加到含有正丁醇的富 集培养基中， 混合液放于 35 C 恒温培养 22-26h ； 取混合液上清按体积比为 1:15 分别添 加到含有不同质量浓度正丁醇的富集培养基中， 混合液放于 35 C 恒温培养 22-26h， 重复 上述富集步骤3次以上， 将富集培养液梯度稀释、 涂布于添加10g/L正丁醇的固体富集培养 基， 35 C 下培养 72h 后， 在固体富集培养基中生长的菌株为分离菌株 ； 耐受分析 将分离菌株接种于种子液体培养基， 于 35 C 活化为一级和二级种子 ； 吸取二级种子 液按 5% 的接种量接种于耐受培养基中， 35。
6、 C220rpm 培养 24h， 在 600nm 波长下， 用分光光 度计测定菌体密度， 计算菌株的相对生长率， 经筛选， 即可获得正丁醇耐受菌株。 5. 根据权利要求 3 或 4 所述的正丁醇耐受菌株的筛选方法， 其特征在于 ： 所述不同环 境样品为杨树林土壤、 松树林土壤、 甜瓜地土壤、 花生地土壤、 污水与污泥、 沼气池残渣、 淀 粉厂排污口土壤、 山东段黄河水、 山东段河床土壤、 天津渤海湾海水或天津渤海湾海沙。 6. 根据权利要求 3 或 4 所述的正丁醇耐受菌株筛选方法， 其特征在于 ： 所述富集培养 基为 ： NaCl10g/L、 蛋白胨10g/L、 酵母粉5g/L、 正丁醇10。
7、g/L或50g/L， 调节酸碱度至pH7.0， 121 C， 灭菌 20min。 7. 根据权利要求 3 或 4 所述的正丁醇耐受菌株的筛选方法， 其特征在于 ： 所述耐受培 养基为 ： KH2PO40.5g/L、 K2HPO40.5g/L、 FeSO47H2O0.01g/L、 MgSO40.2g/L、 NaCl9g/L、 蛋白胨 5g/L 和葡萄糖 30g/L， 分别补充质量分数为 1% 或 2% 或 3% 的正丁醇， 调节酸碱度至 pH7.0， 121 C， 灭菌 20min。 8. 根据权利要求 3 或 4 所述的正丁醇耐受菌株的筛选方法， 其特征在于 ： 还包括对筛 选所得正丁醇耐受菌。
8、株进行菌种鉴定， 步骤如下 ： DNA 提取方法 ： 苯酚 - 氯仿 - 异戊醇法抽提 ； 16S rRNA 引物 ： 正向引物 ： SEQNO.1， 反向引物 ： SEQNO.2 ； PCR 反应体系 ： 10Reaction Buffer5.0L ； dNTP2.5mmol/L4.0L ； 正向引物 10Mol/L1.0L ； 反向引物 10Mol/L1.0L ； 权 利 要 求 书 CN 102978140 A 2 2/2 页 3 Taq 聚合酶 5U/L0.8L ； DMSO1L ； 模版 DNA50ng/L2.0L ； 补加重蒸水至 50L ； PCR 扩 增 程 序 ： 95 C1。
9、0min ； 94 C1min， 53 C45s， 72 C1min， 33 个 循 环 ； 72 C10min ； 数据处理 ： 凝胶纯化PCR并被测序， 使用NCBI Blast分析分离菌株的同源性， 并使用 Ribosomal Database Project 软件 Classifier， 对分离的菌株进行分类。 权 利 要 求 书 CN 102978140 A 3 1/6 页 4 一种正丁醇耐受菌株及其筛选和鉴定方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及正丁醇耐受微生物， 尤其是一种正丁醇耐受菌株 及其筛选和鉴定方法。 背景技术 0002 正丁醇是重要的精细化工原料， 主。
10、要用于邻苯二甲酸二丁酯 DBP 和丙烯酸丁酯 BA 等脂肪族二元酸脂类及磷酸酯类的生产。更重要的是， 由于正丁醇能值高、 可混合性高、 辛 烷值高和挥发性低等优势， 所以正丁醇更是良好的生物燃料。研究表明正丁醇燃烧所释放 的能量是同等体积的乙醇的两倍。随着石油资源的日益匮乏和温室效应的日益恶化， 生物 法生产正丁醇越来越受到人们的关注。 0003 正丁醇可通过微生物发酵法生产， 一般采用丙酮丁醇梭菌 (Clostridium acetobutylicum) 及相关变种， 在厌氧条件下利用淀粉或糖份发酵生成丙酮、 丁醇和少 量酒精等有机溶剂， 故称 ABE 发酵。目前生产菌株主要是专性厌氧的梭状。
11、芽孢杆菌， 包 括 Clostridium acetobutylicum、 C.beijerinckii、 C.saccharoprbutylacetonicum 和 C.saccharobutylicum。 0004 ABE 发酵法生产正丁醇有很长的历史， 但存在溶剂浓度低、 溶剂产量低、 丁醇毒性 大以及产品比例不合理等因素， 导致生物法生产正丁醇难以和化学合成法相竞争的主要因 素。为了提高微生物发酵生产正丁醇的能力， 在选育菌种方面， 人们用了不同的方法， 包括 合成生物学、 基因突变、 基因工程和代谢工程、 细胞固定化以及发酵过程中移除正丁醇等策 略。由于 ABE 发酵时对设备要求较高。
12、且传统菌株生长缓慢， 所以人们把正丁醇的合成路径 克隆到不同的微生物中形成异源表达， 如在大肠埃希氏菌、 恶臭假单胞菌、 枯草芽孢杆菌和 短乳酸菌的表达。 这些微生物对正丁醇有较高耐受能力， 相比梭状芽孢杆菌， 也有较高生长 速率。 0005 目前已有梭菌丁醇合成基因在不同受体菌进行表达的文献报道， Inui 等在大肠杆 菌中表达梭菌丁醇代谢途径相关基因， Stee 等在酵母中表达丁醇代谢关键酶， Berezina 等 在断乳杆菌中构建表达丙酮丁醇代谢相关基因， 可见利用重组菌发酵产丁醇仍是生物丁醇 研究的方向。 0006 通过检索， 并未发现与本专利申请相关的专利公开文献。 发明内容 000。
13、7 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处， 提供了一种正丁醇耐受菌株及其筛 选和鉴定方法， 旨在从不同的环境样品中分离筛选能够耐受正丁醇的微生物， 分离菌株可 以作为宿主菌， 异源表达正丁醇合成途径的关键酶基因， 为正丁醇重组菌的构建扩宽了思 路。 0008 本发明实现目的的技术方案如下 ： 0009 一种正丁醇耐受菌株， 名称为 YY-23， 分类名称为 Pseudomonas stutzeri， 保藏编 说 明 书 CN 102978140 A 4 2/6 页 5 号为 ： CGMCCNo.6771， 保藏日期 ： 2012 年 11 月 2 日， 保藏地址为 ： 北京市朝阳区大屯路中国。
14、 科学院微生物研究所， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 0010 如上所述的正丁醇耐受菌株在构建正丁醇高产菌株中的应用。 0011 如上所述的正丁醇耐受菌株筛选方法， 在筛选过程中采用将不同环境样品培养在 富集培养基中进行分离， 获得分离菌株， 再将分离菌株培养在添加不同浓度正丁醇的耐受 培养基中， 用分光光度计测定菌体密度的方法测定菌体的相对生长率， 获得正丁醇耐受菌 株。 0012 而且， 所述的正丁醇耐受菌株筛选方法， 具体步骤如下 ： 0013 正丁醇耐受菌株的富集与分离 ： 0014 取不同环境样品， 分别与生理盐水混合后稀释， 于220rpm震荡30mi。
15、n， 静止15min， 取上清液， 按上清液与富集培养基的体积比为 1:15， 将上清液分别加入添加到含有正丁醇 的富集培养基中， 混合液放于35C恒温培养22-26h ； 取混合液上清按体积比为1:15分别 添加到含有不同质量浓度正丁醇的富集培养基中， 混合液放于 35 C 恒温培养 22-26h， 重 复上述富集步骤3次以上， 将富集培养液梯度稀释、 涂布于添加10g/L正丁醇的固体富集培 养基， 35 C 下培养 72h 后， 在固体富集培养基中生长的菌株为分离菌株 ； 0015 耐受分析 0016 将分离菌株接种于种子液体培养基， 于 35 C 活化为一级和二级种子 ； 吸取二级 种子。
16、液按 5% 的接种量接种于耐受培养基中， 35 C220rpm 培养 24h， 在 600nm 波长下， 用分 光光度计测定菌体密度， 计算菌株的相对生长率， 经筛选， 即可获得正丁醇耐受菌株。 0017 而且， 所述不同环境样品为杨树林土壤、 松树林土壤、 甜瓜地土壤、 花生地土壤、 污 水与污泥、 沼气池残渣、 淀粉厂排污口土壤、 山东段黄河水、 山东段河床土壤、 天津渤海湾海 水或天津渤海湾海沙。 0018 而且， 所述富集培养基为 ： NaCl10g/L、 蛋白胨10g/L、 酵母粉5g/L、 正丁醇10g/L或 50g/L， 调节酸碱度至 pH7.0， 121 C， 灭菌 20min。
17、。 0019 而 且， 所 述 耐 受 培 养 基 为 ： KH2PO40.5g/L、 K2HPO40.5g/L、 FeSO47H2O0.01g/L、 MgSO40.2g/L、 NaCl9g/L、 蛋白胨 5g/L 和葡萄糖 30g/L， 分别补充质量分数为 1% 或 2% 或 3% 的正丁醇， 调节酸碱度至 pH7.0， 121 C， 灭菌 20min。 0020 而且， 还包括对筛选所得正丁醇耐受菌株进行菌种鉴定， 步骤如下 ： 0021 DNA 提取方法 ： 苯酚 - 氯仿 - 异戊醇法抽提 ； 0022 16S rRNA 引物 ： 正向引物 ： SEQNO.1， 反向引物 ： SEQN。
18、O.2 ； 0023 PCR 反应体系 ： 10Reaction Buffer5.0L ； 0024 dNTP2.5mmol/L4.0L ； 0025 正向引物 10Mol/L1.0L ； 0026 反向引物 10Mol/L1.0L ； 0027 Taq 聚合酶 5U/L0.8L ； 0028 DMSO1L ； 0029 模版 DNA50ng/L2.0L ； 0030 补加重蒸水至 50L ； 0031 PCR 扩增程序 ： 95 C10min ； 94 C1min， 53 C45s， 72 C1min， 33 个循环 ； 说 明 书 CN 102978140 A 5 3/6 页 6 72 C。
19、10min ； 0032 数据处理 ： 凝胶纯化PCR并被测序， 使用NCBI Blast分析分离菌株的同源性， 并 使用 Ribosomal Database Project 软件 Classifier， 对分离的菌株进行分类。 0033 本发明的优点和积极效果为 ： 0034 1、 本发明正丁醇耐受菌株， 可以作为宿主菌， 异源表达正丁醇合成途径的关键酶 基因， 可得到正丁醇产量较高的重组菌株， 为正丁醇重组菌的构建扩宽了思路。 0035 2、 本发明正丁醇耐受菌株的筛选方法工艺简单、 操作方便， 从不同的环境样品中 分离筛选能够耐受正丁醇的微生物， 针对分离菌株进行了正丁醇耐受能力的测定。
20、， 利用相 对生长率计算分离菌株的耐受能力， 获得了耐受能力强的菌株。 附图说明 0036 图 1 为本发明筛选方法筛选得到的分离菌株的相对生长率图 ； 其中， A ： 在 1% 正丁 醇浓度下分离菌株的相对生长率 ； B ： 在 2% 正丁醇浓度下分离菌株的相对生长率 ； C ： 在 3% 正丁醇浓度下分离菌株的相对生长率 ； 0037 图 2 为本发明筛选方法得到菌株的基因组电泳图 ； 0038 图 3 为本发明 PCR 方法扩增分离菌株 16S rRNA 基因片段电泳图。 具体实施方式 0039 下面通过具体实施例对本发明作进一步详述， 以下实施例只是描述性的， 不是限 定性的， 不能以。
21、此限定本发明的保护范围。 0040 需要说明的是 ： 0041 从各种环境中 （杨树林土壤、 松树林土壤、 甜瓜地土壤、 花生地土壤、 污水与污泥、 沼 气池残渣、 淀粉厂排污口土壤、 山东段黄河水和河床土壤以及天津渤海湾海水和海沙 等） 采取样品分离得到的微生物， 其耐受正丁醇能力不同， 因此采用相对生长率来分析菌株 的分离菌株的耐受情况， 从而筛选出耐受能力较强的微生物。 0042 分离菌株的来源为不同地域的不同生态环境， 包括杨树林土壤、 松树林土壤、 甜瓜 地土壤、 花生地土壤、 污水与污泥、 沼气池残渣、 淀粉厂排污口土壤、 山东段黄河水和河床土 壤以及天津渤海湾海水和海沙等。 00。
22、43 本发明旨在从不同的环境样品中 （杨树林土壤、 松树林土壤、 甜瓜地土壤、 花生地 土壤、 污水与污泥、 沼气池残渣、 淀粉厂排污口土壤、 山东段黄河水和河床土壤以及天津渤 海湾海水和海沙等） 分离筛选能够耐受正丁醇的微生物， 做了定量的相关耐受程度的测定 及其耐受机制的研究， 为构建重组微生物用于正丁醇生产打下基础。 0044 一种正丁醇耐受菌株， 名称为 YY-23， 分类名称为 Pseudomonas stutzeri， 保藏编 号为 ： CGMCC No.6771， 保藏日期 ： 2012年11月2日， 保藏地址为 ： 北京市朝阳区大屯路中国 科学院微生物研究所， 保藏单位 ： 中。
23、国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 0045 一种正丁醇耐受菌株的筛选方法， 步骤如下 ： 0046 从不同环境中采集样品 ； 0047 正丁醇耐受菌株的富集与分离 ： 将不同的环境样品培养在以正丁醇作为富集条 件的培养基中， 从而筛选出耐受一定浓度正丁醇的微生物分离菌株。 说 明 书 CN 102978140 A 6 4/6 页 7 0048 耐受分析 ： 将微生物分离菌株按相应编号培养在添加不同浓度正丁醇的耐受培 养基中， 用分光光度计测定菌体密度的方法 （OD600值） 测定菌体的相对生长率， 用相对生长 率来衡量菌株的耐受情况 ； 0049 (4) 菌种鉴定 ： 对有一定特性的。
24、分离菌株， 采用苯酚 - 氯仿 - 异戊醇抽提法提取 了菌体 DNA， 并以此做模板进行 16S rRNA 的 PCR， 使用 NCBI Blast 和 Ribosomal Database Project 软件 Classifier 对分离菌株进行进一步分析与鉴定。 0050 采用上述方法筛选保藏编号为 ： CGMCC No.6771 的正丁醇耐受菌株 YY-23 及设计 了构建重组菌， 步骤如下 ： 0051 一、 正丁醇耐受菌株的富集与分离 0052 所用试剂均为市售分析纯或生化试剂 ； 0053 所使用的仪器主要包括 ： 恒温摇床， 恒温培养箱 ； 0054 所用的培养基为 LB 培养。
25、基 ： NaCl10g/L， 蛋白胨 10g/L, 酵母粉 5g/L， 调 pH7.0 后， 121 C， 灭菌 20min ； 。 0055 分别取不同环境 （杨树林土壤、 松树林土壤、 甜瓜地土壤、 花生地土壤、 污水与污 泥、 沼气池残渣、 淀粉厂排污口土壤、 山东段黄河水和河床土壤以及天津渤海湾海水和海沙 等） 样品 20g 稀释于 150mL 生理盐水中， 摇床 220rpm 震荡 30min， 静止 15min， 取上清 10mL 于 250mL 带胶塞的三角瓶中， 三角瓶中装有 150mL 添加有 10g/L， 50g/L 的正丁醇的 LB 培养 基作为富集条件的富集培养基， 混。
26、合液放于 35 C 恒温培养 24h。取混合液上清 10mL 于 250mL带胶塞的三角瓶中， 三角瓶中装有150mL添加有10g/L， 50g/L的正丁醇作为富集条件 的富集培养基， 混合液放于 35 C 恒温培养 24h。重复上述富集步骤 3 次以上， 用以筛选耐 受菌株。将最后一次富集培养液进行梯度稀释， 取 150ul 均匀涂布于添加 10g/L 正丁醇的 固体富集培养基， 35C下培养72h后进行观察， 在固体富集培养基中生长的菌株为分离菌 株。 0056 结果 ： 0057 从不同的环境样品中共筛选出30株不同菌落形态的菌株， 其中在10g/L的正丁醇 为选择压力下共筛选出 25 。
27、株分离菌株， 在 50g/L 的正丁醇为选择压力下共筛选出 5 株分离 菌株。 0058 二、 耐受分析 0059 所用试剂均为市售分析纯或生化试剂 ； 0060 所使用的仪器主要包括 ： 恒温振荡器， 分光光度计 ； 0061 所用的培养基为 ： 0062 （1）种子培养基 (LB) ： NaCl10g/L， 蛋白胨 10g/L, 酵母粉 5g/L， 调 pH7.0 后， 121 C， 灭菌 20min。 0063 （2） 耐受培养基 ： KH2PO40.5g/L， K2HPO40.5g/L， FeSO47H2O0.01g/L， MgSO40.2g/L， NaCl9g/L， 蛋白胨 5g/L。
28、， 葡萄糖 30g/L， 调 pH7.0 后， 121 C， 灭菌 20min， 添加质量浓度分别 为 1% 或 2% 或 3% 正丁醇作为筛选富集条件。 0064 将分离菌株按相应编号连续接种于 5mL 种子液体培养基， 于 35 C 活化为一级， 二级种子。吸取二级种子液按 5% 的接种量接种于耐受培养基中， 35 C220rpm 培养 24h， 其中添加 1% 或 2% 或 3% 正丁醇于耐受培养基。在 600nm 波长， 用分光光度计测定菌体密度 说 明 书 CN 102978140 A 7 5/6 页 8 （OD600值） 。 0065 耐受分析结果 ： 0066 从图1A可以看出，。
29、 大部分分离菌株在添加有1%的正丁醇的培养基中生长良好， 表 明大部分分离菌株耐受正丁醇超过1%。 从图1B可以看出， 在2%正丁醇浓度下， 相对生长率 超过 40% 有 10 株菌， 其中 YY-23 相对生长率最高， 达 67.8%， 甚至 YY-23 在 3% 正丁醇浓度 下， 其相对生长率还能达到 30%（图 1C） 。菌株 YY-23 的耐受性与报道过的最高耐受性菌 株耐受能力相似， 这为进一步构建工程菌株提供了可能。 可见， 正丁醇耐受菌株可应用于构 建正丁醇高产菌株中。 0067 三、 菌种鉴定 0068 所用试剂均为市售分析纯或生化试剂 ； 0069 所使用的仪器主要包括 ： 。
30、恒温振荡器， PCR 仪 ； 0070 所用的培养基为 ： 种子培养基 (LB) ： NaCl10g/L， 蛋白胨 10g/L, 酵母粉 5g/L， 调 pH7.0 后， 121 C， 灭菌 20min。 0071 将分离出来的具有一定特性的菌株接种在 LB 培养基中， 过夜培养， 待用。按如下 操作进行 : 0072 （1） 按照苯酚 - 氯仿 - 异戊醇抽提法提取菌体 DNA， 并做电泳验证， 电泳图如图 2 所示。 0073 苯酚 - 氯仿 - 异戊醇抽提法步骤如下 ： 0074 a、 取 1.5mL 过夜培养的菌液， 离心 8000rpm5min 后， 弃上清 ； 0075 b、 沉淀。
31、中加入 0.5mL TE 缓冲液， 10L 溶菌酶， 室温放置 10min ； 0076 c、 加入 10L20% 的 SDS 和 50L 蛋白酶 K， 震荡混匀， 于 60 C 水浴 2h ； 0077 d、 加入 0.6mL 抽提液 （苯酚 ： 氯仿 ： 异戊醇 =25:24:1）充分混匀， 10000rpm 离心 10min ； 0078 e、 吸取上清， 重复抽提至无蛋白膜， 加等体积氯仿混匀， 离心 10000rpm10min ； 0079 f、 吸取上清于新 EP 管加 10% 上清体积的 3M NaAc 和 2 倍上清体积的 95% 冷乙醇， 震荡混匀， 10000rpm 离心 。
32、10min。沉淀中加 600L70% 乙醇， 10000rpm 离心 5min 弃上清后 室温干燥， 加 100LddH2O， 冰箱保存。 0080 （2） 16S rRNA 引 物 ： 正 向 引 物 SEQ NO.1 ： 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 (E.colibases8to27)， 反向引物 SEQNO.2 ： 5 -TACCTTGTTACGACTT-3 （E.colibases1507to1492） 。 0081 （3） PCR 反应体系 ： 10Reaction Buffer5.0L， dNTP（2.5mmol/L） 4.0L， 正 向引物 （10Mol/。
33、L） 1.0L， 反向引物 （10Mol/L） 1.0L， Taq 聚合酶 （5U/L） 0.8L， DMSO1L， 模版 DNA（50ng/L） 2.0L， 补加重蒸水至 50L。 0082 （4） PCR 扩增程序 ： 95 C10min ； 94 C1min， 53 C45s， 72 C1min， 33 个循环 ； 72 C10min， PCR 结果如图 3 所示。 0083 （5） 数据处理 ： 凝胶纯化 PCR 并被测序 （由北京六合华大基因科技股份有限公司完 成） ， 使用 NCBI Blast 分析分离菌株的同源性， 并使用 Ribosomal Database Project 。
34、软 件 Classifier， 对分离的菌株进行分类。 0084 结果 ： 说 明 书 CN 102978140 A 8 6/6 页 9 0085 按照上述步骤进行操作并用计算机对测序结果进行了处理分析。 这两种分析都给 出相似的结果见表 1 ： 菌株 YY-23 与枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 同源性最近， 同源 程度是99%。 已有相关文献报道过已分离大肠杆菌， 运动发酵单胞菌， 酿酒酵母， 乳酸菌能耐 受 1-3% 的正丁醇。 0086 表 1 分离菌株的同源性分析和分类结果 0087 0088 aRDP 的分类结果。 说 明 书 CN 102978140 A 9 1/1 页 10 0001 序 列 表 CN 102978140 A 10 1/2 页 11 图 1 说 明 书 附 图 CN 102978140 A 11 2/2 页 12 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102978140 A 12 。