一种聚乙二醇单甲醚聚磷酸酯两嵌段共聚物及其阿霉素键合药.pdf

本发明公开了一种基于阿霉素的大分子键合药，它的活性成分是聚磷酸酯聚合物键合阿霉素形成的纳米颗粒，该聚磷酸酯聚合物具体可为侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚-聚磷酸酯两嵌段共聚物。本发明还提供了一种侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚-聚磷酸酯共聚物以及合成该共聚物的方法。本发明提供的聚磷酸酯阿霉素大分子键合药，在水溶液中可以自组装形成粒径30nm左右的纳米颗粒。通过纳米颗粒本身的尺度效应并结合电荷反转技术，纳米颗粒可以更好的在肿瘤组织及细胞内富集，提高了阿霉素对肿瘤部位的靶向性。而聚磷酸酯聚合物链上键合的阿霉素可以对肿瘤组织微环境存在响应性，能够迅速的肿瘤组织内弱酸性条件下释放，对肿瘤细胞有较好的杀伤效果。

权利要求书一种聚磷酸酯阿霉素大分子键合药，其活性成分是聚磷酸酯聚合物键合阿霉素形成的纳米颗粒，其中所述聚磷酸酯聚合物为聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物，所述聚磷酸酯键合阿霉素的通式为：mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA，
其中a＝45‑113，b＝25‑150，a和b分别是所述范围内的任意数值；
其中mPEG是聚乙二醇单甲醚的缩写，下标a为该聚合物聚合度；PAOOP是聚(2‑烯丙氧基‑2‑氧‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷)的缩写，下标b为该聚合物聚合度；Cya是巯基乙胺盐酸盐的缩写，ADR是阿霉素的缩写，DMMA是2，3‑二甲基马来酸酐的缩写。
根据权利要求1的聚磷酸酯阿霉素大分子键合药，其活性成分为mPEG45‑PAOOP25‑Cya‑ADR‑DMMA，mPEG45‑PAOOP75‑Cya‑ADR‑DMMA或mPEG113‑POOP150‑Cya‑ADR‑DMMA。
根据权利要求1的聚磷酸酯阿霉素大分子键合药，其中所述聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物中起始嵌段是聚乙二醇单甲醚，另一个嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇单甲醚嵌段的聚合度为45‑113，对应的数均分子量为2,000‑5,000g/mol；所述聚磷酸酯嵌段的聚合度为25‑150，对应的数均分子量为6,925‑27,700g/mol。
根据权利要求1的聚磷酸酯阿霉素大分子键合药，其中所述聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物中的聚磷酸酯由结构式如式(I)的五元环状磷酸酯单体聚合后进一步官能化而成：

根据权利要求1的聚磷酸酯阿霉素大分子键合药，其由所述聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物侧基键合阿霉素和2，3‑二甲基马来酸酐形成。
根据权利要求1的聚磷酸酯阿霉素大分子键合药，其进一步进行化学修饰或配体修饰。
制备权利要求1的聚磷酸酯阿霉素大分子键合药的方法，其以侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物在适当pH值条件下依次与适当比例的2‑亚氨基硫烷盐酸盐、Mal‑ADR、2，3‑二甲基马来酸酐反应，从而最终得到聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物中聚磷酸酯嵌段侧基键合阿霉素和2，3‑二甲基马来酸酐的阿霉素大分子键合药，其中，所述Mal‑ADR可通过马来酸酐和6‑氨基己酸以及肼基甲酸叔丁酯和阿霉素反应得到，Mal为马来酰亚胺基团的缩写。
根据权利要求7的方法，其中所述pH值在6.5‑8.5范围内，2‑亚氨基硫烷盐酸盐、Mal‑ADR、2，3‑二甲基马来酸酐与所用的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物侧基氨基的摩尔比例分别至少为1/10、1/20和3/1。
侧基为双键的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸两嵌段共聚物，其中起始嵌段是聚乙二醇单甲醚，另一个嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇单甲醚嵌段的聚合度为45‑113，对应的数均分子量为2,000‑5,000g/mol；所述聚磷酸酯嵌段的聚合度为25‑150，对应的数均分子量为4,100‑24,600g/mol，所述共聚物通过下述合成：以端羟基聚乙二醇单甲醚为大分子引发剂，以1，5，7‑三叠氮双环(4.4.0)癸‑5‑烯为催化剂，通过结构式如式(I)的环状磷酸酯单体的开环聚合反应得到侧基为双键的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸两嵌段共聚物。
侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸两嵌段共聚物，其中起始嵌段是聚乙二醇单甲醚，另一个嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇单甲醚嵌段的聚合度为45‑113，对应的数均分子量为2,000‑5,000g/mol；所述聚磷酸酯嵌段的聚合度为25‑150，对应的数均分子量为6,925‑27,700g/mol，所述共聚物通过下述合成：将权利要求9的侧基为双键的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸两嵌段共聚物使用安息香双甲醚催化，在365nm紫外光照射下，利用巯基乙胺盐酸盐的巯基与双键进行巯基的点击化学反应，从而最终合成侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物。

说明书一种聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物及其阿霉素键合药
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物及由其制备的聚磷酸酯阿霉素大分子键合药。具体地，所述聚磷酸酯阿霉素大分子键合药的通式为mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA，其中a＝45‑113，b＝25‑150。更具体地，本发明合成制备了mPEG45‑PAOOP25‑Cya‑ADR‑DMMA或mPEG45‑PAOOP75‑Cya‑ADR‑DMMA或mPEG113‑PAOOP150‑Cya‑ADR‑DMMA三种阿霉素大分子键合药。本发明提供的聚磷酸酯阿霉素大分子键合药，在水溶液中可以自组装形成粒径30nm左右的纳米颗粒。
背景技术
阿霉素属于蒽环霉素类抗生素，是在上个世纪60年代初由意大利的科学家首先从一种链霉菌中提取发现的。从发现至今，阿霉素一直是一种在肿瘤治疗中十分常见的药物，其属于广谱性肿瘤抗生素，为周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀伤作用。阿霉素对机体可产生广泛的生物化学效应，因此被大范围的用于各种癌症的治疗，尤其是针对乳腺癌，在临床上阿霉素是治疗乳腺癌的首选药物之一。阿霉素的基本作用原理首先是嵌入细胞核中的DNA的大沟区，形成DNA‑药物的强烈相互作用，由此干扰且抑制DNA的合成，复制以及转录；其次，阿霉素可以通过结合方式来抑制DNA合成中起关键作用的拓扑异构酶；并且，阿霉素在细胞及体内的代谢可产生氧自由基，而氧自由基可以破坏DNA，阻止DNA合成；通过几种方式的共同作用，阿霉素可以导致细胞复制等生理活动的异常，从而达到杀死细胞的目的。
尽管阿霉素的使用如此之广，也确实表现出了针对肿瘤的较好的治疗效果，但其作为抗肿瘤药物仍面临诸多问题。由于阿霉素本身非选择性的对体内正常细胞和肿瘤细胞均起作用，因此，在杀死肿瘤细胞的同时，也会导致人体正常细胞的不正常死亡，从而产生用药期间严重的副作用。其主要的毒性反应有，约60％～80％的病人可发生白细胞和血小板减少；100％的病人有不同程度的毛发脱落，停药后可以恢复生长；阿霉素体现出非常强烈的心脏毒性，表现为心律失常，在停药后的1～6个月会出现ST‑T改变，及早应用维生素B6和辅酶Q10可减低其对心脏的毒性；恶心、食欲减退；药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。因此，研究阿霉素的给药载体和输送体系是提高阿霉素药物疗效的关键。如何能够将阿霉素选择性的输送到肿瘤组织和肿瘤细胞内以减小阿霉素的毒副作用是阿霉素给药体系的重点发展方向。
近年来，基于高分子纳米颗粒的载药体系成为了小分子药物和基因药物进行体内输送和药物研发的重要突破口。高分子纳米颗粒的传递体系在实际应用中具有较多的优势，如生物相容性好，具有靶向传递的潜能，具有更好的稳定性，能有效保护生物活性分子对生理环境的耐受性，并增强细胞对被传递分子的吸收。特别值得指出的是高分子自组装的纳米粒具有增强的渗透和滞留效应(Enhanced permeability and retention effect，EPR效应)，可促进药物在肿瘤组织的富集，并能有效地被肿瘤部位细胞吸收，进入细胞质和各种细胞器，因此高分子纳米颗粒是极具潜能的抗肿瘤药物传递系统的候选者。其中，已经有相关的载药体系取得了一些进展，如美国强生公司生产的DOXIL，其使用脂质体和聚乙烯甘醇的衍生物的复合物，以此来包载盐酸阿霉素，免受单核巨噬系统的吞噬，导致阿霉素在体内的血液循环时间明显增加，降低阿霉素心脏毒性、增加肿瘤靶组织吸收的作用。DOXIL目前已经被美国食品与药物管理局(FDA)批准用于临床使用，主要针对于难治性卵巢癌的治疗。再如美国FDA目前已经批准韩国Samyang公司研发的新剂型Genexol‑PM进入I期临床研究阶段，Genexol‑PM使用生物可降解材料聚乙二醇‑聚乳酸纳米颗粒包载疏水性抗肿瘤药物紫杉醇，以增强紫杉醇在肿瘤细胞中的富集，并具有向肿瘤部位给予输送更大剂量药物的潜力。
在研究发现聚乙二醇及聚乳酸等高分子载药体系的基础上，近年来研究人员也发现了新的具有生物相容性和生物可降解性的聚合物‑聚磷酸酯。相对于传统的碳链高分子，聚磷酸酯的一个显著特点即聚合物主链上存在一个五价的磷原子，从而使得聚合物的侧基能够通过不同的单体的聚合以及特定的修饰来官能化以实现具体独特的功能。如杜金志等利用侧基为氨基的磷酸酯单体，成功的合成了一种两亲性阳离子胶束，由于氨基带有正电荷通过静电作用结合siRNA，使得该两嵌段聚合物成为了一种新型高效的siRNA载药体系。
但磷酸酯的聚合反应也面临一些局限，如果直接使用侧基官能化的磷酸酯单体通过聚合来合成聚磷酸酯，其侧基的选择有限，官能化基团极易干扰聚合反应从而导致发生副反应，因此需要对单体中相关基团进行保护，造成了单体合成困难，增加了合成路线的复杂程度。为了克服这一问题，我们设计合成侧基为双键的聚磷酸酯，其单体2‑烯丙氧基‑2‑氧‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷合成纯化相对容易，在聚合反应后，通过聚合物侧基的双键与巯基分子发生“点击化学”反应从而对聚合物侧基进行官能化修饰，克服了之前功能化聚磷酸酯合成的瓶颈。“点击化学”反应条件温和，反应的速度快，反应物转化率高，在此基础上，本发明人完成了本发明。
利用化学反应在高分子聚合物链末端或侧基键合抗肿瘤药物形成的大分子键合药是除了使用高分子纳米颗粒包载药物以外的一种同样有效的药物输送体系。与使用颗粒包载药物相比，大分子键合药具有其独特的优势，可以通过化学键合将药物引入聚合物链，与高分子链形成十分牢固的结合，从而使得药物更加稳定，免受人体内生理环境中酶和免疫系统的攻击，达到缓释和长效的目的；并且通常可以控制键合药物与聚合物的比例，克服了包载药物方法容易在体内扩散药物以及无法准确控制载药量的缺点；而键合使用的化学键通常具有敏感性，使药物能够在相关组织和细胞内选择性的释放，结合EPR效应，在增强药物生物利用度的同时还可以减少药物的毒副作用。
为了提高高分子纳米颗粒载药体系的治疗效果，除了已知的EPR效应等被动靶向性，研究人员还一直在研究如何进一步增强其在肿瘤细胞内的富集能力。在这一方面，在纳米颗粒表面修饰一些靶向基团以定位肿瘤细胞表面特异性的蛋白或受体是一种比较常用的方法。研究表明，纳米颗粒的表面电位会影响细胞的摄取，负电性的颗粒进入细胞的能力较弱，而正电性的颗粒则易于被细胞摄取，因此，利用电荷反转技术有潜力成为改善肿瘤细胞对颗粒摄取的一种策略，该方法主要是通过pH敏感基团对颗粒表面的电势进行控制，当材料处于pH中性的血液中循环时，其表面电势偏负，体现出体内的隐形效应，避免了材料在体内的清除；而当材料进入肿瘤组织后，由于肿瘤组织内偏酸性的环境(pH≈6.8)而使得颗粒表面电势转为正值，可以更好的与细胞表面呈负电的蛋白结合，从而进入细胞；该方法通过减少清除和增强与细胞的相互作用而综合提高纳米颗粒进入细胞的能力。
发明内容
本发明公开了一种基于阿霉素的大分子键合药，它的活性成分是聚磷酸酯聚合物键合阿霉素形成的纳米颗粒，该聚磷酸酯聚合物具体可为侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物。本发明还提供了一种侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯共聚物以及合成该共聚物的方法。本发明提供的聚磷酸酯阿霉素大分子键合药，在水溶液中可以自组装形成粒径30nm左右的纳米颗粒。通过纳米颗粒本身的尺度效应并结合电荷反转技术，纳米颗粒可以更好的在肿瘤组织及细胞内富集，提高了阿霉素对肿瘤部位的靶向性。而聚磷酸酯聚合物链上键合的阿霉素可以对肿瘤组织微环境存在响应性，能够迅速的肿瘤组织内弱酸性条件下释放，对肿瘤细胞有较好的杀伤效果。因此，这类生物可降解的大分子键合药在阿霉素输送及癌症治疗中具有良好的应用前景。
本发明的一个目的是提供一种聚磷酸酯阿霉素大分子键合药，它的活性成分是聚磷酸酯聚合物键合阿霉素形成的纳米颗粒，其中所述聚磷酸酯聚合物可为聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物。
所述阿霉素聚磷酸酯键合药可为上述聚合物侧基键合阿霉素和2，3‑二甲基马来酸酐。
所述纳米颗粒还可进行化学修饰或配体修饰。
上述聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物中，所述聚磷酸酯由结构式如式(I)的五元环状磷酸酯单体聚合后进一步官能化而成：

上述聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物中，起始嵌段是聚乙二醇单甲醚，另一个嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇单甲醚嵌段的聚合度为45‑113，对应的数均分子量为2,000‑5,000g/mol；所述聚磷酸酯嵌段的聚合度为25‑150，对应的数均分子量为6,925‑27,700g/mol。
上述聚磷酸酯阿霉素大分子键合药的通式可为mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA，其中a＝45‑113，b＝25‑150(a和b的取值分别应当是所述范围内的任意数值)，其中mPEG是聚乙二醇单甲醚的缩写，下标a为该聚合物聚合度；PAOOP是聚(2‑烯丙氧基‑2‑氧‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷)的缩写，下标b为该聚合物聚合度；Cya是巯基乙胺盐酸盐的缩写，ADR是阿霉素的缩写，DMMA是2，3‑二甲基马来酸酐的缩写。
在本发明具体的实施方案中，本发明人合成了mPEG45‑PAOOP25‑Cya‑ADR‑DMMA或mPEG45‑PAOOP75‑Cya‑ADR‑DMMA或mPEG113‑PAOOP150‑Cya‑ADR‑DMMA，并提供了相关的检测数据。
本发明还提供了一种合成聚磷酸酯阿霉素大分子键合药的方法。
所述合成聚磷酸酯阿霉素大分子键合药的方法是以侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物在不同的pH值条件下(例如，pH值在6.5‑8.5范围内，优选pH＝6.5、6.7以及8.0，见下述实施例)依次与不同比例的2‑亚氨基硫烷盐酸盐、Mal‑ADR、2，3‑二甲基马来酸酐(例如，三者与所用的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物侧基氨基的摩尔比可以分别至少为1/10、1/20和3/1(见下述实施例)反应，从而最终得到聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物中聚磷酸酯嵌段侧基键合阿霉素和2，3‑二甲基马来酸酐的阿霉素大分子键合药，选取上述投料比范围即为保证侧基为氨基的聚乙二醇‑聚磷酸酯嵌段聚合物的结构中，侧基的氨基完全被2‑亚氨基硫烷盐酸盐以及Mal‑ADR取代，并且2‑亚氨基硫烷盐酸盐键合于聚合物侧基之后可以与2，3‑二甲基马来酸酐完全反应，最终得到侧基为Mal‑ADR和2，3‑二甲基马来酸酐的聚磷酸酯阿霉素大分子键合药。其中，所述Mal‑ADR可通过马来酸酐和6‑氨基己酸以及肼基甲酸叔丁酯和阿霉素反应得到。Mal为马来酰亚胺基团的缩写。
本发明还提供了一种侧基为双键的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物。
上述聚磷酸酯由结构式如式(I)的五元环状磷酸酯单体聚合而成。
上述侧基为双键的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物中，起始嵌段是聚乙二醇单甲醚，另一个嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇单甲醚嵌段的聚合度为45‑113，对应的数均分子量为2,000‑5,000g/mol；所述聚磷酸酯嵌段的聚合度为25‑150，对应的数均分子量为4,100‑24,600g/mol。
上述侧基为双键的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物为mPEG45‑PAOOP25或mPEG45‑PAOOP75或mPEG113‑PAOOP150。
本发明还提供了一种合成侧基为双键的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物的方法。
所述合成侧基为双键的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸两嵌段共聚物的方法是以端羟基聚乙二醇单甲醚为大分子引发剂，以1，5，7‑三叠氮双环(4.4.0)癸‑5‑烯为催化剂，通过结构式如式(I)的环状磷酸酯单体的开环聚合反应得到两嵌段共聚物。
上述环状磷酸酯单体可通过2‑氯‑2‑氧‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷和丙烯醇反应得到。反应条件为，在无水四氢呋喃中，以三乙胺为缚酸剂，使2‑氯‑2‑氧‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷与等摩尔量的丙烯醇反应后，通过蒸馏纯化得到上述磷酸酯单体。
上述2‑氯‑2‑氧‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷可通过乙二醇和三氯化磷反应得到。反应条件为，25℃下，在无水二氯甲烷中，三氯化磷与等倍摩尔量的乙二醇反应后，通过蒸馏纯化2‑氯‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷，再在无水苯中通入氧气氧化，蒸馏纯化后得到上述2‑氯‑2‑氧‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷。
本发明还提供了一种侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物。其中所述聚磷酸酯由结构式如式(I)的五元环状磷酸酯单体聚合后进一步官能化而成。
上述侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物中，起始嵌段是聚乙二醇单甲醚，另一个嵌段是所述聚磷酸酯；所述聚乙二醇单甲醚嵌段的聚合度为45‑113，对应的数均分子量为2,000‑5,000g/mol；所述聚磷酸酯嵌段的聚合度为25‑150，对应的数均分子量为6,925‑27,700g/mol。
上述侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物可为mPEG45‑PAOOP25‑Cya或mPEG45‑PAOOP75‑Cya或mPEG113‑PAOOP150‑Cya。
本发明还提供了一种合成侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物的方法。
所述合成侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸两嵌段共聚物的方法是以侧基为双键的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸两嵌段共聚物使用安息香双甲醚催化，在365nm紫外光照射下，利用巯基乙胺盐酸盐的巯基与双键进行巯基的点击化学反应，从而最终合成侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物。
本发明优点和积极效果
本发明得到了具有良好生物相容性和生物可降解性的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物，其物理、化学性能可通过调节聚合物的组成而调节。本发明提供生物相容性的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段大分子阿霉素键合药，在水溶液中可以自组装形成纳米颗粒，并且具有良好的稳定性，制备方法简单，可重复性高，作为载体能够保护阿霉素不游离于血液造成阿霉素的毒副作用，又能结合纳米颗粒本身的尺度效应及性质使得阿霉素更好的富集于肿瘤组织和肿瘤细胞内。
本发明提供的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段大分子键合药可以形成带有负电荷的纳米颗粒，这种纳米颗粒的粒径在30nm左右，表面电荷在‑20mV左右，避免了纳米颗粒在体内被迅速清除而失去作用。在偏酸性环境下，由于聚合物侧链的酰胺键被降解而裸露出氨基，表面电荷会逐渐从负值转变为正值，在2h后可以转变为10mV左右，通过流式细胞仪检测可以发现由于表面电荷转变为正值，进入细胞的颗粒数量明显增多。
本发明利用聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段聚合物键合阿霉素组装形成纳米颗粒后可以作为大分子键合药。通过EPR效应以及电荷反转作用，可以提高纳米颗粒在肿瘤部位和细胞中的富集，而通过腙键键合的阿霉素可以在偏酸性pH值下迅速释放，证明了纳米颗粒可以有效地在肿瘤组织内释放阿霉素并发挥杀伤细胞的作用。本发明使用细胞毒性实验验证了纳米颗粒杀伤细胞的能力，在低pH值下颗粒的杀伤能力都要强于pH＝7.4时颗粒的杀伤能力，而随着阿霉素浓度的增加，细胞的存活率逐渐降低。
本发明通过细胞毒性实验证明这种大分子键合药具有良好的生物相容性，同时高分子材料具备在较低pH条件下电荷反转且迅速释放阿霉素的特点，使得这种生物可降解的大分子键合药在癌症治疗中具有良好的应用前景。
附图说明
当结合附图时通过阅读下列详细说明能够更容易地理解本发明的上述方面和许多伴随的优点，其中：
图1为mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA的合成路线图。
图2为AOOP(2‑烯丙氧基‑2‑氧‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷)的1H NMR谱。
图3为mPEGa‑PAOOPb的GPC谱。其中图3(A)对应mPEG45‑PAOOP25，图3(B)对应mPEG45‑PAOOP75，图3(C)对应mPEG113‑PAOOP150。
图4为mPEGa‑PAOOPb的1H NMR谱。其中图4(A)对应mPEG45‑PAOOP25，图4(B)对应mPEG45‑PAOOP75，图4(C)对应mPEG113‑PAOOP150。
图5为mPEGa‑PAOOPb‑Cya的1H NMR谱。其中图5(A)对应mPEG45‑PAOOP25‑Cya，图5(B)对应mPEG45‑PAOOP75‑Cya，图5(C)对应mPEG113‑PAOOP150‑Cya。
图6为Mal‑ADR的ESI‑MS谱。
图7为mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA的1H NMR谱。其中图7(A)对应mPEG45‑PAOOP25‑Cya‑ADR‑DMMA，图7(B)对应mPEG45‑PAOOP75‑Cya‑ADR‑DMMA，图7(C)对应mPEG113‑PAOOP150‑Cya‑ADR‑DMMA。
图8为mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑DMMA的细胞毒性。其中图8(A)对应mPEG45‑PAOOP25‑Cya‑DMMA，图8(B)对应mPEG45‑PAEOOP75‑Cya‑DMMA，图8(C)对应mPEG113‑PAOOP150‑Cya‑DMMA。
图9为mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA纳米颗粒的细胞毒性。其中图9(A)对应mPEG45‑PAOOP25‑Cya‑ADR‑DMMA，图9(B)对应mPEG45‑PAOOP75‑Cya‑ADR‑DMMA，图9(C)对应mPEG113‑PAOOP150‑Cya‑ADR‑DMMA。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
本发明的提供了一种聚磷酸酯阿霉素大分子键合药，它的活性成分是聚磷酸酯聚合物键合阿霉素形成的纳米颗粒。
其中所述聚磷酸酯聚合物为聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物，所述聚磷酸酯键合阿霉素的通式为：mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA，
其中a＝45‑113，b＝25‑150，a和b分别是所述范围内的任意数值；
其中mPEG是聚乙二醇单甲醚的缩写，下标a为该聚合物聚合度；PAOOP是聚(2‑烯丙氧基‑2‑氧‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷)的缩写，下标b为该聚合物聚合度；Cya是巯基乙胺盐酸盐的缩写，ADR是阿霉素的缩写，DMMA是2，3‑二甲基马来酸酐的缩写。
其中所述聚磷酸酯聚合物为AB型聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物，包括聚乙二醇单甲醚(A嵌段)和聚磷酸酯(B嵌段)，所述B嵌段由结构式如式(I)的单体聚合而成，该聚乙二醇单甲醚‑聚己内酯‑聚磷酸酯共聚物表示为mPEG‑PAOOP。
使用聚乙二醇单甲醚作为本发明的两嵌段共聚物的起始嵌段结构，具有如下优点和作用：①良好的亲水性，可以保护纳米颗粒避免与血液中蛋白结合从而延长纳米颗粒在血液中的循环时间；②可生物降解；③生物相容；④利用其末端羟基进行开环聚合较为方便；⑤原料较为廉价，节约成本。
使用亲水性聚磷酸酯作为本发明两嵌段共聚物的另一嵌段，主要利用聚磷酸酯易官能化的优点得到侧基带有氨基官能团的共聚物，为键合阿霉素奠定基础。
下述实施例提供了由1，5，7‑三叠氮双环(4.4.0)癸‑5‑烯催化，大分子聚乙二醇引发的合成两嵌段共聚物并键合阿霉素的合成方法。该方法是：以端羟基聚乙二醇单甲醚为大分子引发剂，1，5，7‑三叠氮双环(4.4.0)癸‑5‑烯为催化剂，通过环状磷酸酯单体的开环聚合反应得到两嵌段共聚物。利用聚磷酸酯侧基的双键进行巯基的点击化学反应，得到侧链为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯嵌段共聚物；再通过氨基分别与阿霉素和2，3‑二甲基马来酸酐反应，得到基于阿霉素的大分子键合药。
下述实施例中所用原料来源及处理方法如下：
聚乙二醇单甲醚(Mn＝2000g/mol，mPEG45；Mn＝5000g/mol，mPEG113)，购于Aldrich公司，纯度≥99.5％，使用前用甲苯共沸蒸馏除水。
1，5，7‑三叠氮双环(4.4.0)癸‑5‑烯(TBD)，购自Sigma‑Aldrich公司。
三氯化磷、乙二醇，使用前重蒸。
二氯甲烷，用五氧化二磷回流24h，使用前蒸出。
三乙胺，先后用邻苯二甲酸酐，NaOH和CaH2分别回流24h，使用前蒸出。
苯，用五氧化二磷于90℃下回流24h，使用前蒸出。
四氢呋喃(THF)，用钠钾合金回流，使用前蒸出。
乙醚、甲苯用钠砂回流干燥，均在使用前蒸出。
未经特别说明的其它试剂直接使用。本领域的技术人员应该理解，除非另外指明，本发明所用的试剂均为可从常规化学试剂公司商购获得的分析纯级别的试剂。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、mPEGa‑PAOOPb的合成和表征
一、2‑烯丙氧基‑2‑氧‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷(AOOP)环状磷酸酯单体的合成与表征
(一)2‑氯‑2‑氧‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷(COP)的合成
COP合成路线如图1(A)所示。合成COP的具体步骤为：在25℃下，将301mL 3.25mol/L乙二醇的二氯甲烷溶液缓慢加入300mL 3.26mol/L三氯化磷的二氯甲烷溶液中。待滴加完毕后，继续反应0.5小时，45℃常压蒸馏除去溶剂。再连续两次减压蒸馏(20Pa)得到产物后，将产物溶解在500mL苯中，通3天O2直到反应完全，再次减压蒸馏(20Pa)，收集70℃馏分得到COP。
(二)2‑烯丙氧基‑2‑氧‑1，3，2‑二氧磷杂环戊烷(AOOP)的合成和表征
合成路线如图1(B)所示。合成AOOP的具体步骤为：在‑5℃的低温反应浴下，将制得的COP(14.25g，0.1mol)的四氢呋喃(30mL)溶液滴加到丙烯醇(5.80g，0.1mol)和三乙胺(10.12g，0.1mol)的四氢呋喃(120mL)溶液中，反应过夜。然后在N2保护下，过滤以上溶液，将四氢呋喃减压(20Pa)于40℃除去，剩余液体减压蒸馏(20Pa)，收集72℃的馏分，得到AOOP。
对AOOP进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，图2为AOOP的1HNMR谱图，分析如下：1H NMR(CDCl3，ppm)：4.45(m，‑POCH2CH2‑)，4.68(m，‑OCH2CHCH2)，5.28(dd，‑OCH2CHCH2‑)，5.95(m，‑OCH2CHCH2‑)。
二、聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物(mPEGa‑PAOOPb)的合成和表征
各种分子量聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯嵌段聚合物是以聚乙二醇单甲醚为引发剂，在溶液条件下引发聚磷酸酯单体聚合而成。通过调节聚乙二醇单甲醚的分子量以及聚磷酸酯与聚乙二醇单甲醚的投料比，可以得到不同分子量的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯嵌段聚合物。1，5，7‑三叠氮双环(4.4.0)癸‑5‑烯(TBD)属于有机杂环非金属催化剂，其催化效率较高，已经被证明较适用于内酯及交酯环状单体的开环聚合。
合成路线如图1(C)所示，以mPEG45和mPEG113为引发剂，1，5，7‑三叠氮双环(4.4.0)癸‑5‑烯(TBD)为催化剂制备聚合物，聚合反应在手套箱(购自：布劳恩惰性气体系统(上海)有限公司)中进行(O2与H2O的浓度均小于0.1ppm)，以mPEG45作为引发剂为例，mPEGa‑PAOOPb合成的具体实验步骤如下：
1)将进行反应的圆底烧瓶经多次的抽真空火焰干燥和充氮气的处理后，放入手套箱(购自：布劳恩惰性气体系统(上海)有限公司)。
2)按表1的配比进行投料：向烧瓶中加入mPEG45或mPEG113、AOOP单体、THF和TBD，在25℃搅拌下反应。
3)反应0.5小时后，将产物移出手套箱，使用旋转蒸发仪将体系浓缩，用0℃的乙醚甲醇混合溶剂(乙醚∶甲醇＝9∶1，v/v，100mL)沉淀两次，收集沉淀物，用油泵抽干至恒重为止，即得产物。
不同投料比可得到不同的产物，如此得到了一系列mPEGa‑PAOOPb共聚物，见表1。
表1不同投料比(摩尔比)合成mPEGa‑PAOOPb

1*聚合物右下角的数字代表聚合物根据1H NMR得到的聚合度
对上述mPEG‑PAOOP共聚物进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，测定其聚合度和数均分子量。用凝胶渗透色谱(GPC)法以聚苯乙烯为标准分析mPEG‑PAOOP共聚物的数均分子量和分子量分布PDI(分子量分布宽度指数)。聚合度、数均分子量和分子量分布PDI见表2。GPC谱见图2。1H NMR谱见图3。
表2mPEGa‑PAOOPb聚合物的表征

2aGPC测定；2b1H NMR测定。
图3为聚合物的GPC谱图，图3(A)对应mPEG45‑PAOOP25；图3(B)对应mPEG45‑PAOOP75；图3(C)对应mPEG113‑PAOOP150。从图中可以看到三种聚合物呈现的都是规整的单峰，且随着聚合物分子量的增大其流出时间相应缩短，并具有相对较窄的分子量分布。
图4为mPEG‑PAOOP的1H NMR谱图，所合成的三种不同分子量的mPEG‑PAOOP具有相似的谱，分析如下：1H NMR(CDCl3，ppm)：3.63(s，‑CH2CH2O‑)，4.25(t，‑POCH2CH2‑)，4.57(t，‑POCH2CH＝CH2)，5.30(dd，‑POCH2CH＝CH2)，5.93(m，‑POCH2CH＝CH2)。聚磷酸酯的聚合度通过4.25ppm的三重峰与3.63ppm的单峰的积分面积比计算得到，相关数据统计于表2。
由表2可见，根据1H NMR计算结果，mPEG45‑PAOOP25的数均分子量为6100g/mol，对应的嵌段PAOOP25的数均分子量为4100g/mol；mPEG45‑PAOOP75的数均分子量为14300g/mol，对应的嵌段PAOOP75的数均分子量为12300g/mol；mPEG113‑PAOOP150的数均分子量为29600g/mol，对应的嵌段PAOOP150的数均分子量为24600g/mol。
实施例2、聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物酸敏感键合阿霉素的合成和表征(mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA)
一、侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物(mPEGa‑PAOOPb‑Cya)的合成及表征
合成路线如图1(D)所示，以mPEG45‑b‑PAOOP75为例，在25℃下，取mPEG45‑b‑PAOOP75(200mg，0.014mmol)，巯基乙胺盐酸盐(0.375g，3.15mmol，双键摩尔量的300％)以及安息香双甲醚(DMPA，13.4mg，0.05mmol，双键摩尔量的5％)溶解于1.5mL无水DMF中。鼓入氮气20min后，在365nm紫外光下照射30min，产物在4℃下使用蒸馏水透析48h(截留分子量为2000)，冻干后即得到侧基为氨基的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯聚合物(mPEG45‑PAOOP75‑Cya，PPC)。对PPC进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，图5为mPEGa‑PAOOPb‑Cya的1H NMR谱图，三种不同分子量的聚合物均有类似的谱由图5可见，根据1H NMR分析，1HNMR(D2O，ppm)：1.92(m，‑POCH2CH2CH2‑)，2.60(t，‑CH2CH2CHS‑)，2.75(t，‑SCH2CH2NH3+Cl‑)，3.11(t，‑SCH2CH2NH3+Cl‑)，3.57(s，‑CH2CH2O‑)，4.16(m，‑POCH2CH2CH2‑)，4.26(t，‑POCH2CH2‑)。通过2.75ppm处的三重峰以及4.26ppm处的三重峰，可计算确定所有聚磷酸酯结构单元的侧基都已经被氨基化修饰。
二、马来酰亚胺官能化的阿霉素衍生物(Mal‑ADR)的合成及表征
合成路线如图1(E)所示，马来酸酐(29.4g，0.3mol)与6‑氨基己酸(39.35g，0.3mol)在冰醋酸(900mL)中搅拌16h，70℃下减压(20Pa)除去乙酸，得到黄色糖浆状固体，将其通过硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇/乙酸，100∶5∶1，v/v)纯化。取纯化后的固体6‑马来氨基己酸(2.11g，10mmol)与N‑甲基吗啉(1.01g，10mmol)溶解于无水THF(200mL)中，在4℃向其中逐滴滴加入氯甲酸异丁酯(1.36g，10mmol)的THF(10mL)溶液，搅拌5min后，再向其中逐滴滴加肼基甲酸叔丁酯(1.32g，10mmol)的THF(10mL)溶液，4℃下反应30min，再在25℃下反应1h。减压蒸馏(20Pa)除去溶剂后，用乙酸乙酯和水分相，有机相用0.1N稀盐酸溶液、水、5wt％碳酸氢钠水溶液洗涤，再用无水硫酸钠干燥。除去溶剂后，固体用硅胶柱层析(洗脱剂为二氯甲烷/甲醇，100∶1‑2，V/V)纯化。将层析产物(545mg，2.4mmol)用三氟乙酸(10mL)溶解，在0℃中搅拌8min，25℃下减压(20Pa)除去过量的三氟乙酸，剩余粗产物用乙醚研磨，即得到6‑马来酰亚胺己酸酰肼三氟乙酸盐。取6‑马来酰亚胺基己酸酰肼三氟乙酸盐(92mg，27.1mmol)与阿霉素盐酸盐(52mg，89.6mmol)溶解于甲醇中(17.5mL)，加入50μL的三氟乙酸，室温下避光搅拌反应24h。将体系浓缩至2.5mL，加入12.5mL乙腈，4℃静置48h得到结晶产物，离心后用甲醇‑乙腈混合溶液洗涤(10∶1，v/v)，真空干燥即得产物，产率70％。对Mal‑ADR进行ESI质谱分析，如图5所示，该物质理论分子量为750.3，而检测到的m/z＝751.04即为[M+H]+的信号峰，且产物无其它杂质，证明产物结构与预期吻合，且纯度很高。
三、聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物酸敏感键合阿霉素的合成和表征(mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA)
mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA  如图1(G)所示，以mPEG45‑PAOOP75‑Cya为例，将mPEG45‑PAOOP75‑Cya(PPC，62.4mg，0.003mmol)溶解于去离子水(pH＝6.5，5mL)，25℃下加入2‑亚氨基硫烷盐酸盐(2.88mg，0.021mmol)，室温下搅拌反应2h，超滤以除去未反应的2‑亚氨基硫烷盐酸盐。再向混合溶液中加入Mal‑ADR(9.60mg，0.012mmol)，用NaOH溶液(0.1N)调节pH至6.7，搅拌3h，超滤除去未反应的Mal‑ADR。加入2，3‑二甲基马来酸酐(DMMA，77.6mg，0.62mmol)，用NaOH溶液(0.2N)调节pH至8.0‑8.5，再次超滤除去未反应的DMMA，冻干后即得产物。mPEG45‑PAOOP25‑Cya以及mPEG113‑PAOOP150‑Cya键合2，3‑二甲基马来酸酐和酸敏感键合阿霉素的合成过程与mPEG45‑PAOOP75‑Cya相似，只需改变投料摩尔比即可，例如，具体投料摩尔比如下：针对mPEG45‑PAOOP25‑Cya，其与2‑亚氨基硫烷盐酸盐、Mal‑ADR、2，3‑二甲基马来酸酐的摩尔比分别为1∶2、1∶1和1∶75；针对mPEG45‑PAOOP150‑Cya，其与2‑亚氨基硫烷盐酸盐、Mal‑ADR、2，3‑二甲基马来酸酐的摩尔比分别为1∶15、1∶7.5和1∶450。
对mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA进行核磁共振氢谱(1H NMR)分析，由图7可见，根据1H NMR分析，对于mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA，字母a‑l以及p，q和s标记了全部mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA的质子信号。
这里需要说明的是，对于不同聚合度(即，不同的a和b取值)的mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA的合成，反应条件和过程除了投料摩尔比以外没有任何变化。例如，反应的pH值在6.5‑8.5范围内，优选pH＝6.5、6.7以及8.0，并且2‑亚氨基硫烷盐酸盐、Mal‑ADR、2，3‑二甲基马来酸酐与所用的聚乙二醇单甲醚‑聚磷酸酯两嵌段共聚物侧基氨基的摩尔比例分别至少为1/10、1/20和3/1。
实施例3、mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑DMMA以及mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA共聚物纳米颗粒的生物相容性
1、mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑DMMA纳米颗粒的生物相容性
在此实验中，由于ADR本身即存在对细胞的杀伤能力，所以为了排除ADR对材料生物相容性的干扰，所选取的为未在侧基键合阿霉素的mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑DMMA。将上述材料配制为1mg/mL的纳米颗粒溶液再稀释为10.6‑340μg/mL。通过MTT方法测定不同浓度mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑DMMA共聚物纳米颗粒的细胞毒性。具体试验为：将不同浓度的mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑DMMA纳米颗粒溶液在pH＝7.4和pH＝6.8条件下分别与MDA‑MB‑231细胞共培养48小时后，分别测细胞存活率。不同处理下细胞的存活率见图8(A)。
由图9可见，当聚合物浓度从10.6μg/mL增大到340μg/mL，三种不同分子量的聚合物形成的纳米颗粒在两种pH条件下对细胞活力都没有明显的影响，细胞活力一直维持在100％左右，表明上述纳米颗粒具有良好的生物相容性。
2、mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA纳米颗粒对细胞的杀伤能力的表征
将mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA配制为1mg/mL的纳米颗粒溶液并加以稀释以调整阿霉素的浓度为0.28‑35μg/mL。通过MTT方法测定不同浓度mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA共聚物纳米颗粒的细胞毒性。具体试验为：将不同浓度的mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA纳米颗粒溶液在pH＝7.4和pH＝6.8条件下分别与MDA‑MB‑231细胞共培养48小时后，分别测细胞存活率。不同处理下细胞的存活率见图9。
由于mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA本身为大分子键合药，并且在释放实验中已经证明该材料可以在pH偏酸性的环境下更好的释放阿霉素，具有细胞内内含体环境的响应性，因此将该材料作用于MDA‑MB‑231细胞。由图可见，不论在何种pH环境以及何种分子量的聚合物纳米颗粒条件下，随着mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA其浓度的增加，细胞的存活率呈现较为显著地下降的趋势，相比于未键合阿霉素的材料的良好的生物相容性，可以判断材料的细胞毒性是键合引入的阿霉素释放造成的，当mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA的浓度为17.5μg/mL时，三种分子量的纳米颗粒均可以导致MDA‑MB‑231细胞存活率在两种pH条件下低于75％，说明了mPEGa‑PAOOPb‑Cya‑ADR‑DMMA具有较好的细胞杀伤能力。同时，在两种pH条件下，可以清楚地发现，不论材料的浓度，较低pH值环境下的细胞存活率都相对较低，以图9(A)中纳米颗粒浓度为17.5μg/mL为例，pH＝7.4的细胞存活率为75％左右，而模拟肿瘤内较低pH环境下的细胞存活率则不足60％，有着较为明显的区别。根据之前材料zeta电位的变化规律可知，材料的表面电荷在该pH下会逐渐从负值转为正值，在2h后其zeta电位会保持在+7.5mV，且由于细胞表面会存在较多携带负电的蛋白质，所以表面电荷偏正的材料会更好的进入细胞，因此，在不同pH值下的细胞杀伤能力的不同应该归结于在不同pH条件下材料进入细胞能力的不同。当pH为6.8时，材料表面会逐渐携载正电荷，从而更多的在细胞内富集，与pH＝7.4时相比，材料在细胞内的浓度以及在细胞内释放的阿霉素的量都会相对较高，从而更好的杀伤细胞，而三种聚合物纳米颗粒对细胞的杀伤能力基本一致。该实验证明了在肿瘤组织偏酸环境下材料可以杀伤肿瘤细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。