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1、(10)申请公布号 CN 103102397 A (43)申请公布日 2013.05.15 CN 103102397 A *CN103102397A* (21)申请号 201110351825.4 (22)申请日 2011.11.09 C07K 14/00(2006.01) A61K 38/16(2006.01) A61P 31/20(2006.01) (71)申请人 韩健宝 地址 210014 江苏省南京市江宁区 21 世纪 假日花园 27 栋 203 室 (72)发明人 韩健宝 (54) 发明名称 预防和治疗 PCV-2 病毒的肽核酸及其制剂 (57) 摘要 本发明公开了一种预防和治疗 P。
2、CV-2 病毒的 肽核酸， 由序列 1 和序列 3 或序列 1、 序列 2、 序列 5和序列6所示的肽核酸组成 ； 或由序列5和序列 6 所示的肽核酸组成。本发明还公开了含有所述 肽核酸的肽核酸制剂。本发明针对 PCV-2 的 Rep 和 Cap 两种主要蛋白基因的保守区域设计的病毒 特异性的反义寡核苷酸序列， 合成肽核酸以及用 壳聚糖进行修饰， 使其具备高水平的生物利用度、 稳定理化性能及高效安全的疗效。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 10 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书10页 序列表2页 (10)。
3、申请公布号 CN 103102397 A CN 103102397 A *CN103102397A* 1/1 页 2 1. 一种预防和治疗 PCV-2 病毒的肽核酸， 由序列 1 和序列 3 或序列 1、 序列 2、 序列 5 和 序列 6 所示的肽核酸组成 ； 序列 1 ： 5 -AGATCTAGGAGCTCCACATTCGATC-3 ； 序列 2 ： 5 -TAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTG-3 ； 序列 3 ： 5 -TACATTGGTCTTCCAATCACGCTTC-3 ； 序列 4 ： 5 -TTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGG-3 ； 序列 5 ： 5。
4、 -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3 ； 序列 6 ： 5 -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3 。 2. 根据权利要求 1 所述的肽核酸， 其特征在于 ： 所述肽核酸经过咪唑丙烯酸壳聚糖化 学修饰。 3. 一种预防和治疗 PCV-2 病毒的肽核酸， 由序列 5 和序列 6 所示的肽核酸组成 ； 序列 5 ： 5 -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3 ； 序列 6 ： 5 -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3 。 4. 根据权利要求 3 所述的肽核酸， 其特征在于 ： 所述肽核酸经过咪唑丙烯酸壳聚糖化 学修饰。 。
5、5. 一种预防和治疗 PCV-2 病毒的肽核酸制剂， 其活性成分为权利要求 1-4 任一所述的 肽核酸。 6. 根据权利要求 5 所述的肽核酸制剂， 其特征在于 ： 还包含可药用载体或赋形剂。 权 利 要 求 书 CN 103102397 A 2 1/10 页 3 预防和治疗 PCV-2 病毒的肽核酸及其制剂 技术领域 0001 本发明涉及一种预防和治疗 PCV-2 病毒的肽核酸及其制剂。 背景技术 0002 猪圆环病毒 (Porcine circovirus， PCV) 是由德国学者 Tischer I 等 1974 年首 次由多株连续传代的猪肾细胞系 (PK-15) 中分离得到， 实验结果。
6、显示， 该病毒可以持续感 染 PK-15 细胞， 但不引起细胞病变， 该病毒于 1982 年获得命名。根据圆环病毒的致病性和 核酸序列的不同， 将 PCV 划分为两个型 ： PCV-1 和 PCV-2。目前认为 PCV-1 不会引起疾病。 猪圆环病毒 2 型 (PCV-2) 感染是近 20 年来发现的猪的一种新疾病， 该病已经在世界范围 内广泛流行， 对养猪业的危害日益被人们重视。PCV-2 可造成猪断奶后多系统衰竭综合症 (Post-weaning multisystemic wasting syndrome， PMWS)、 皮炎和肾病综合症 (Porcine dermatitisand n。
7、ephropathy syndrome， PDNS)、繁 殖 障 碍 (Reproductive failure)、 A2 型先天性震颤 (Congenital tremors)、 猪呼吸道病复合征 (Porcine respiratory disease complex， PRDC) 以及猪增生性坏死性间质性肺炎 (Porcine proliferative and necrotizing pneumonias) 等疾病。1991 年 Clark E G 首次报道在加拿大猪场发生断奶仔 猪多系统衰竭征 (Post-weaning multisystemic wating syndrome， 。
8、PMWS)， 此后该病在世 界范围内广泛流行， 给养猪业带来极大危害， 尤其是引起发病猪群免疫抑制而倍受人们关 注。我国由郎洪武等于 2001 年首次报道， 从北京、 河北的疑似 PMWS 的发病猪群中分离到 PCV-2， 王忠田等在对北京、 天津、 广东、 深圳、 山东、 山西等地 12 个规模化养猪场进行圆环 病毒流行病学调查时发现， 11 个猪场有 PMWS 的发生， 表明 PCV-2 的感染已在我国规模化养 殖场普遍存在。 PCV-2感染能造成猪的生长缓慢， 饲料报酬降低， 同时侵害猪的免疫系统， 导 致机体的免疫力下降， 引起其他疾病的大爆发， 给世界各国养猪业的发展造成了严重威胁 。
9、和巨大的经济损失。经过各国研究人员几十年的共同努力， 基本清楚了 PCV-2 的生物学特 性、 流行病学、 感染的危害， 但对其致病机制尚不清楚， 同时如何防治PCV-2和研制PCV-2疫 苗的成为当前兽医科研人员的研究热点。 0003 PCV 的分布极为广泛， 一般认为， PCV 的唯一宿主是猪。病猪和带毒 ( 隐性感染 ) 猪是主要传染源。病毒存在于感染猪的呼吸道、 肺、 脾和淋巴结中， 主要从鼻液和粪便等废 物中排出病毒， 感染公猪的精液被认为是一种潜在的 PCV-2 病毒来源。PCV-2 一年四季均 可发生， 既可接触感染、 空气传播， 也可经胎盘垂直感染和通过口腔、 呼吸道、 鼻液、。
10、 粪便等 途径水平传播而感染不同年龄的猪群。育肥猪多表现为阴性感染， 不表现临床症状。少数 怀孕母猪感染 PCV 后， 可经胎盘垂直感染给仔猪， 造成仔猪先天性震颤或断奶仔猪多系统 衰竭综合征。PCV 常与 PPV 或猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒 (PRRSV) 混合感染， 造成许多 附加症状， 使疾病的诊断更趋于复杂化和多样化。年龄在 5 12 周的仔猪感染后多表现为 PMWS， 一般于断 奶后 2 3 天或 1 周开始发病， 发病率 20 60， 病死率 5 35。 0004 到目前为止， PCV-2 引起各类疾病的发病机理尚不完全清楚， 但许多研究证据表 明， 猪感染 PCV-2 可导致机。
11、体的免疫抑制， 影响猪的免疫功能。PCV-2 感染总是与淋巴器官 说 明 书 CN 103102397 A 3 2/10 页 4 的粒细胞炎性浸润有关。PCV-2 感染猪体后在猪体内增殖， 导致感染猪发生一系列临床和 组织病理学变化， 主要存在于淋巴组织、 肺、 肝和肾等组织器官中， 使淋巴组织 ( 淋巴结、 胸 腺、 扁桃体和脾)、 肺、 肝和肾出现以细胞浸润为主要特征的炎性病理变化和淋巴细胞萎缩。 0005 McNeilly等(1996)通过研究PCV感染猪肺泡巨噬细胞体外免疫功能的影响， 发现 对 FC 和补体受体或者吞噬作用没有影响。在感染 4d 后对 MHC-1 类抗原有上调作用， 。
12、8d 后 降低了细胞对MHC-2类抗原的表达。 Darwich等将猪血液样品用抗凝剂作用后， 再用植物血 凝素 (PHA) 和超抗原葡萄球菌肠毒素 B(SEB) 作用， PCV-2 感染猪形成炎症反应能力受损和 细胞因子合成下降， 即 PCV-2 感染猪淋巴细胞和巨噬细胞激活途径存在缺陷。 0006 圆环病毒可以诱导淋巴系统中的 B 细胞凋亡， 使患猪处于免疫抑制状态， 这是导 致混合感染和继发感染的主导因素。Joagnin 等认为 PCV-2 的感染对免疫系统的效应来讲 似乎是一把双刃剑 ： 一方面， PCV-2 与其他病毒 ( 如 PRRSV 和 PPV) 同时实验感染时， 这些病 毒可以。
13、刺激和活化免疫系统， 增加了混合感染猪体内的 PCV-2 的增殖 ； 另一方面， 严重的淋 巴组织病损， 包括淋巴细胞缺失和这些组织中免疫细胞亚群的其他变化， 是严重发病猪的 规律性特征， 因此， PCV-2 感染猪对其它免疫原不能产生有效的免疫应答成为本病致病机制 的重要原因。Krakowka 等对 1 日龄患病猪进行了试验， 发现所有 PCV-2 和 PPV 混合感染猪 都出现了 PMWS 症状， 在巨噬细胞中可检测到 PCV-2 抗原， 而 PCV-2 单独感染猪不能复制出 PMWS 症状。 0007 PCV作为圆环病毒属的代表种， 无囊膜， 单股环状DNA， 病毒粒子直径为1720nm。
14、， 呈二十面体对称。病毒粒子由衣壳蛋白和核酸组成， 是迄今为止发现的一种最小的动物病 毒。在分类地位上属圆环病毒科 (Circoviridae)、 圆环病毒属 (Circovirus)。PCV-1 与 PCV-2在核苷酸序列上约有76的同源性。 PCV-1基因组为1759bp， PCV-2基因组为1768bp 或 1767bp。PCV-1 有 7 个 ORFs， 均编码大于 5ku 的蛋白质。PCV-2 通常含有 11 个 ORFs， 预 计分别编码 1.8ku 35.8Ku 的蛋白质， 各阅读框大小相差悬殊， 且大部分 ORF 都有部分重 叠， 其中 ORF1、 ORF5、 ORF7 和 O。
15、RF10 在正义链， ORF2、 ORF3、 ORF4、 ORF6、 ORF8、 ORF9 和 ORF11 位于负义链， 这些基因表现为重叠基因， 充分利用了病毒有限的遗传物质。研究发现， 病毒 基因组由 2 个相对排列的 ORF 和其间的基因间隔组成， 其中较大的 ORF1 经病毒正向 DNA 转 录， 为 Rep 基因， 有 945 个碱基， 编码 314 个氨基酸， 大小为 35.6ku， 编码病毒复制酶相关蛋 白 (Rep) ； 较小的 ORF2 经病毒 DNA 互补链转录， 为 Cap 基因， 含有 705 个碱基， 编码 234 个 氨基酸， 编码大小约 27.9ku 的主要结构蛋。
16、白或衣壳蛋白。该结构蛋白构成病毒的核衣壳， 其抗原性具有型特异性。PCV 相同基因型不同毒株之间序列同源性大于 90， 不同基因型 毒株之间同源性为 68 79。 0008 Rep 蛋白由病毒的正向链转录而成的， 是 PCV 基因中最大的阅读框 (ORF1) 编码而 成， 它编码的复制酶蛋白在所有的圆环病毒中高度保守。Rep 基因分别编码 Rep(312 个氨 基酸， 35.6ku) 和 Rep (168 个氨基酸， 19.2ku)。Rep 蛋白和 Rep 蛋白是 PCV 病毒复制所 必需的， Rep 蛋白单独不能启动病毒复制， 必须与 Rep 蛋白共同作用才能启动 PCV 的复制。 系统发生。
17、结果表明， 圆环病毒 Rep 蛋白可能是通过在微粒病毒的 Rep 蛋白和小 RNA 病毒样 编码的 RNA 结合蛋白或原核生物的螺旋酶重组作用而产生。PCV-2 的 Rep 基因位于第 51 995位核苷酸， 含有945个碱基， 编码315个氨基酸， 编码病毒的复制相关蛋白Rep。 Rep 185 位 211 位氨基酸区域内存在 PCV-1 和 PCV-2 共有表位。PCV-1 与 PCV-2 相比较， Rep 蛋白 说 明 书 CN 103102397 A 4 3/10 页 5 相对比较保守， 氨基酸序列同源性达 86， 这也是两种血清型 PCV 病毒产生抗原交叉性的 主要原因所在。PCV-。
18、1Rep 蛋白仅有一个糖基化位点， 位于 20 22aa(NpS) ； PCV2Rep 蛋白 则含有 3 个糖基化位点， 23 25aa(NPS)， 256 258aa(NQT) 及 286 288aa(NAT)。Rep 蛋 白具有与典型滚环复制 (RCR) 相关的 3 个保守基序以及结合 dNTps 的 p 环 (P-loop) 结构 (序列为G-GKs)， 这些结构对于维持Rep蛋白的功能至关重要， 突变或缺失均会影响病毒的 复制， 这也进一步证明 PCV 病毒 DNA 进行滚环式复制。 0009 Cap 蛋白即 ORF2， 分子量为 27.8ku， 位于 DNA 互补链上， 编码病毒衣壳。
19、蛋白， 位 于细胞核中， 其 N 端富含精氨酸和碱性氨基酸， 编码 234 个氨基酸。该基因可能是在病毒 感染细胞后由宿主所编码的各种蛋白酶的参与下催化合成的中间产物， 所编码的蛋白是 PCV-2 囊膜的主要成分， 目前对 ORF2 的研究已经成为 PCV-2 研究的热点。PCV-2 与 PCV-1 的 ORF2 相似， 其起始密码子位于第 1033 位核苷酸或第 1034 位核苷酸， PCV-1 和 PCV-2 的 Cap 基因都只有一个糖基化位点， 分别位于 PCV-2Cap 蛋白的 143-145aa(NYS) 及 PCV-1 的 102-104aa(NYS)。Cap 基因转录起点位于第。
20、 1238 个核苷酸， 转录产物可连接 ORF1 的外显 子， 第 737 位核苷酸为接翻译的起始位点。Rep 基因的启动子精确定位于第 1353 1168 位核苷酸， 没有发现 PCV 编码蛋白对 Cap 基因转录具有调控作用。ORF2 有 702 个碱基， 分 析 PCV-1 和 PCV-2 高免血清与病毒 Cap 蛋白的结合部位， 结果表明 PCV-1 和 PCV-2Cap 蛋 白 169 183 位氨基酸片段， 能与 PCV-1 和 PCV-2 高免血清发生特异性结合 ； PCV-2Cap 蛋 白 65 87 位， 113 139 位和 193 207 位氨基酸片段， 仅与 PCV-2。
21、 高免血清发生特异性 结合， 而与 PCV-1 高免血清不发生反应， 两种血清型的 Cap 蛋白虽然有共同的抗原决定簇， 但没有抗原交叉性。Cap 蛋白 169 183 位氨基酸区域内， 存在 PCV-1 和 PCV-2 共有表位 ； PCV2Cap 蛋白 65 87 位， 113 139 位和 193 207 位氨基酸区域内， 存在 3 个或 3 个以上 PCV-2 型特异性表位。Cap 基因可能是造成病毒遗传特性发生根本性改变的惟一基因， 因而 推测其与病毒致病性密切相关， 通过改变病毒的宿主嗜性及病毒蛋白与细胞蛋白因子的相 互作用机制， 而使病毒获得不同的致 病性。由于 Cap 蛋白具有。
22、以上特性， 使其成为在分子 水平上诊断 PCV-2 的最佳抗原， 同时它在 PCV-2 血清学研究中发挥巨大的作用， 成为 PCV-2 研究的热点。 0010 反义核酸 (antisense nucleic acid) 是一段与靶基因 (mRNA 或 DNA) 的某段序列 互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列， 反义核酸通过碱基配对方式特异性的与病毒靶 基因结合形成杂交分子， 从而在复制、 转录和翻译水平调节靶基因的表达， 或诱导 RNase H 识别并切割 mRNA， 进而使其功能丧失。 0011 反义核酸包括反义 RNA(antisense RNA) 和反义 DNA(antisense D。
23、NA)， 具有合成 方便、 序列设计简单、 容易修饰、 选择性高、 亲和力强等特点。反义核酸作为一种新的抗病 毒、 抗肿瘤药物， 掀起了一场药理学领域的革命， 即新的药物受体 mRNA 通过新受体结合方 式 (Watson-Crick 杂交 )、 引发新的药物受体结合后反应 ： (1)RNase H 介导的靶 RNA 的降 解 ； (2) 抑制 DNA 的复制和转录及转录后的加工和翻译等。可以说反义寡核苷酸 (ODNs) 疗 法比传统的药物治疗手段有更高的特异性。从二十世纪 70 年代末到现在， 在这三十年的 时间中， 反义核酸药物已走出实验室， 进入了实际临床应用。特别是第一个反义核酸药物 。
24、Fomivirsen 通过 FDA 批准上市后， 人们对反义疗法尤为关注。 0012 反义核酸作用原理基于碱基配对原则， 可通过与靶 RNA 进行碱基配对结合的方式 说 明 书 CN 103102397 A 5 4/10 页 6 参与对相关基因表达的调控。其作用方式可能有 ： 反义 RNA 与病毒 mRNA 结合形成互补 双链阻断核糖体与病毒 mRNA 的结合， 从而抑制了病毒 mRNA 翻译成蛋白质的过程。反义 DNA能与靶基因形成一种三链核酸(triple helix nucleic acid)， 它通过作用于控制基因 转录的转录子、 增强子和启动子区， 对基因的转录进行调控。反义核酸与病。
25、毒 mRNA 的结 合可阻挡 mRNA 向细胞质的运输。反义核酸与病毒 mRNA 结合后使得 mRNA 更加易被核酸 酶识别降解， 从而大大缩短 mRNA 的半衰期。上述四种作用途径都可表现为对病毒基因表达 的抑制或调控， 且这种调控是高度特异性的。 0013 反义核酸是通过碱基互补配对的原理来识别所打靶的基因， 从理论来分析， 研究 人员以动物细胞为例， 其染色体大约有几十亿对碱基， 如果 4 个碱基 (A、 G、 C 和 T) 的数目大 致相同， 并在整个基因中随机分布， 那么按照统计学原理， 大于 17 个碱基的反义核酸与非 靶基因杂交的可能性不大， 所以长度超过 17 个碱基的反义核酸。
26、分子与靶基因的结合可以 说是唯一的， 从而使反义核酸具有高度的特异性。 0014 研究表明， 在细胞内部一个拷贝的基因会产生 200-300 条 mRNA， 翻译出 10 万个具 有生物活性的蛋白质分子。 传统药物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某结构域上的几 个作用位点， 事实上蛋白的结构是非常复杂的， 且在生物体内， 活性蛋白的空间结构又是千 变万化的， 以传统药物有限的几种作用位点来控制靶分子的动态的和整体的功能很难达到 理想的 效果， 因而不难看出传统药物的局限性。由 mRNA 可翻译出几十到几百个蛋白， 反义 核酸在 mRNA 水平对靶基因直接进行调控， 这个步骤相当于将传统药物作用。
27、放大了数十到 数百倍， 可见反义核酸的调控是极其经济合理的。 0015 毒理学研究表明， 反义核酸在体内具有很低的毒性， 尽管其在生物体内的存留时 间有长有短， 但最终都将被降解消除， 这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色 体上的危险性。与传统药物相比， 反义核酸药物具有特异性强， 效率高和毒副作用低等优 点， 在抑制肿瘤生长和抗病毒复制等方面显现出了良好的应用价值。目前已有多个药物进 入美国和欧洲市场， 另还有 30 多种反义核酸药物正在进行临床前期的研究或开发后进入 了 I、 II 和 III 期实验。 0016 由于动物体内存在大量的核酸外切酶， 反义核酸若不经过化学修饰， 很快。
28、就被降 解， 失去活性。目前对反义核酸的化学修饰有很多方法， 常见的有硫代修饰反义核酸及 2 -甲氧基修饰反义核酸等。 且目前硫代修饰药物的研究最为全面， 它可有效抵抗核酸酶的 降解， 同时可促进核酸酶 Rase H 的活性， 目前这种修饰方法已成功用于临床的反义核酸药 物。 但这些还只是第一代反义核酸的修饰方法， 随着技术的发展与进步， 新的修饰途径与方 法被开发出来， 使得反义核酸的研究进入了第二、 三代， 其中肽核酸的修饰最为引人关注。 0017 肽核酸(peptidenucleic acids， PNAs)， 是一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA 类似物， 可序列特异的靶向作用于 D。
29、NA 的大沟槽， 其骨架的结构单元为 N(2- 氨基乙基 )- 甘 氨酸， 碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架的氨基 N 上。为反义核酸的第二代产品。 0018 PCV-2 是目前严重危害世界养猪业的重要病原之一。PCV2 不仅可造成猪断奶后多 系统衰竭综合症、 皮炎和肾病综合症、 繁殖障碍等诸多类型的疾病， 该病毒还能导致免疫抑 制， 引起继发感染， 严重影响养猪业的发展。 到目前为止， 对该病还没有理想的防控措施， 开 发预防和治疗PCV2感染的新手段显得尤为迫切， 但PCV2在细胞中增殖不引起细胞病变， 感 染后会引起免疫抑制， 疫苗研究至今没有根本性突破。 说 明 书 CN 10310。
30、2397 A 6 5/10 页 7 发明内容 0019 本发明的目的是提供一种具备高水平的生物利用度、 稳定理化性能及高效安全的 疗效的用于预防和治疗 PCV-2 病毒的肽核酸及其制剂。 0020 本发明所提供的肽核酸， 由序列 1 和序列 3 或序列 1、 序列 2、 序列 5 和序列 6 所示 的肽核酸组成 ； 0021 序列 1 ： 5 -AGATCTAGGAGCTCCACATTCGATC-3 ； 0022 序列 2 ： 5 -TAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTG-3 ； 0023 序列 3 ： 5 -TACATTGGTCTTCCAATCACGCTTC-3 ； 0024 序。
31、列 4 ： 5 -TTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGG-3 ； 0025 序列 5 ： 5 -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3 ； 0026 序列 6 ： 5 -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3 。 0027 其中， 所述肽核酸经过咪唑丙烯酸壳聚糖化学修饰。 0028 本发明所提供的另一种肽核酸， 由序列 5 和序列 6 所示的肽核酸组成 ； 0029 序列 5 ： 5 -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3 ； 0030 序列 6 ： 5 -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3 。 0031 其中，。
32、 所述肽核酸经过咪唑丙烯酸壳聚糖化学修饰。 0032 本发明的肽核酸可以制成肽核酸制剂 ： 0033 1、 采用控释制药工艺将经修饰过的肽核酸制备成结肠溶控释微丸制剂 ； 0034 2、 采用冷冻干燥制药工艺将经修饰过的肽核酸制备成注射用冻干制剂 ； 0035 3、 采用冻干后再制粒工艺将经修饰过的肽核酸制备成口服用水溶性颗粒剂。 0036 肽核酸制剂稳定性分析 0037 高温 ： 流通蒸汽高温 105， 20 分钟灭菌不影响其生物活性。 0038 极端温度 ： 50存放 6 个月不影响其生物活性。 0039 室温 ： 存放 24 个月不影响其生物活性。 0040 低温 ： -20存放 48 。
33、个月不影响其生物活性。 0041 本发明针对 PCV-2 的 Rep 和 Cap 两种主要蛋白基因的保守区域设计的病毒特异性 的反义寡核苷酸序列， 合成肽核酸以及用壳聚糖进行修饰， 使其具备高水平的生物利用度、 稳定理化性能及高效安全的疗效。 具体实施方式 0042 主要材料与试剂 0043 病毒毒株 0044 PCV-2 毒株 ： WS01 株， 毒价为 105.20TCID50， 由楠森兽医诊断技术研究中心实验室 提供。 0045 细胞株 0046 Dulac 细胞， 楠森兽医诊断技术研究中心实验室提供。 0047 实施例 1 针对 PCV-2 的肽核酸体外抗病毒效果分析 0048 从Ge。
34、nBank数据库检索出PCV-2的基因组， 用生物学软件进行序列分析， 综合考虑 说 明 书 CN 103102397 A 7 6/10 页 8 序列的保守性， G+C含量， 碱基分布特点， 然后从中挑选出合适的区域设计反义核酸， 然后 根据反义核苷酸合成肽核酸。采用肽核酸的合成工艺进行肽核酸的人工合成。 0049 Rep-1 ： 5 -AGATCTAGGAGCTCCACATTCGATC-3 0050 Rep-2 ： 5 -TAGACAGGTCACTCCGTTGTCCTTG-3 0051 Rep-3 ： 5 -TACATTGGTCTTCCAATCACGCTTC-3 0052 Cap-1 ： 5。
35、 -TTGATAGTATATCCGAAGGTGCGGG-3 0053 Cap-2 ： 5 -AATAGTGGAATCTAGGACAGGTTTG-3 0054 Cap-3 ： 5 -TGTAGTCTCAGCCAGAGCTGATTTC-3 0055 1.1 以不同浓度分析它们抗病毒效果 0056 取生长状态良好的 Dulac 细胞， 用胰酶消化后， 铺板于 24 孔细胞板中， 0.5mL/ 孔 (2.0105 个细胞 )， 5 CO2 37条件下培养 24h 后吸去培养液， 加入 0.1mL 的 105TCID50 PCV-2 WS01株感染上述细胞， 感染后24h， 每孔加入300l待筛选药物，。
36、 以完全培养基作稀 释液， 肽浓度 (0.05M， 0.1M， 0.2M， 0.4M， 0.8M， 1.6M)， 每个药物梯度设 4 个平 行孔。加药处理 24h 后收集上清和细胞， 运用 TaqMan 探针 Real-time PCR 法定量检测各处 理组中 PCV2 病毒拷贝数。同时设病毒感染阳性对照组， 空白对照组， 细胞阴性对照组。 0057 本发明参考 Chung 等提供的引物， 采用 real-time PCR 定量检测 PCV2。 0058 引物 PCV2-1 ： 5 -TAGGTTAGGGCTGT-GGCCTTA-3 0059 引物 PCV2-2 ： 5 -TTCTCCCGCA。
37、CTTTCGGATAT-3 0060 探针 PCV2probe ： 5 -ATCTCATCATGTCCACCGCCCAGGA-3 -fluorescin 0061 以下述公式来计算不同的肽核酸对 PCV-2 病毒复制产生的抑制率。 0062 0063 肽核酸体外抗病毒结果 0064 表 1. 肽核酸对体外 Dulac 细胞抗 PCV2 效果 0065 0066 说 明 书 CN 103102397 A 8 7/10 页 9 0067 表1结果显示， 各肽核酸对PCV-2病毒复制产生的抑制率， 通过统计学分析确定出 各反义肽核酸的半数有效量浓度。 0068 1.2 以不同时间点分析它们抗病毒效果。
38、 0069 病毒感染和药物处理方法同上， 参考前一步所筛选出的 Rep-1， Rep-2， Rep-3， Cap-1， Cap-2 和 Cap-3 半数有效量浓度， 分别分析各自在不同时间点抗病毒效果。Dulac 细胞感染 PCV-2WS01 株后 24、 36、 48、 60、 72h， 每孔加入 300l 待筛选药物 ( 以完全培养基 作稀释液 )， 每个药物 4 个平行孔。加药处理 24h 后收集上清和细胞， 运用用 TaqMan 探针 Real-time PCR 法定量检测各处理组中 PCV2 病毒拷贝数， 统计分析各用药组之间病毒抑制 率， 结果见表 2。 0070 表 2. 肽核酸。
39、对体外 Dulac 细胞抗 PCV2 效果 0071 0072 1.3 药物组合处理 0073 在前面的这些实验基础上， 对筛选出的有效抗病毒作用的药物进行组合使用， 比 较各组合组的抗病毒效果之间的差异。Dulac 细胞感染 PCV-2WS01 株后， 分别加入 Rep 或 Cap 药物组合， 同时设病毒对照组和阴性对照组， 用 Real-time PCR 方法进行检测， 统计分 析各用药组之间病毒抑制率， 确定药物的组合优选方案， 如表 3。 0074 表 3. 不同组合的肽核酸对体外 Dulac 细胞抗 PCV2 效果 0075 说 明 书 CN 103102397 A 9 8/10 页。
40、 10 0076 0077 1.4 细胞毒性实验 0078 1) 以 Dulac 细胞作检测对象， 96 孔板， 每孔加 100 微升 5000 个细胞。药物浓度 (0.02， 0.1， 0.5， 1， 5， 10m)， 每个梯度设置 3 个重复孔， 另设未处理细胞对照、 无细胞培养 基对照。 0079 2)处理结束后， 每孔每100l培养基加入10l MTT Stock， 37-培养箱内继续 孵育 4 小时。也可更换 100l 新鲜无血清培养基后再加 MTT Stock。 0080 3) 吸去培养基， 每孔加入 100l MTT 溶解剂， 保持各孔内液体体积一致。 0081 4) 在 570。
41、nm 测定 OD 吸光度并进行比较计算。注意 ： 为准确考虑可在 699nm 处测 定未还原的 MTT 本身的吸光度 OD 值， 然后用 OD570 减去 OD699。 0082 5)结果判断 ： 细胞增殖或毒性100x(OD实验-OD本底)/(OD对照-OD本底)。 0083 OD 实验是接受处理细胞的 OD 值， OD 对照是未处理细胞对照管 OD 值， OD 本底是无 细胞培养基对照 OD 值。处理后细胞增殖或毒性变化表示为未处理对照的百分数。 0084 检测结果表明， 均无毒性 .。 0085 实施例 2 肽核酸对抗猪 PCV2 人工感染的保护效率 0086 材料和方法 0087 材料。
42、 0088 40 日龄非免健康仔猪共 50 头， 由楠森兽医诊断技术研究中心实验猪场提供， 经 RT-PCR/PCR 检测 PRRSV、 PCV2、 猪细小病毒 (PPV)、 猪伪狂犬病病毒 (PRV)、 猪流感病毒 (SIV)、 猪瘟病毒 (CSFV) 及猪肺炎支原体均为阴性 ； 用间接 ELISA 检测 PRRSV、 PCV2 特异性 抗体均为阴性。 0089 抗 PCV-2 肽 核 酸 (UAC-PNA) ： 用 咪 唑 丙 烯 酸 壳 聚 糖 化 学 修 饰 肽 核 酸 PNA(Rep-1+Rep-2+Cap-2+Cap-3)。将 (PNA) 与咪唑丙烯酸壳聚糖 (UAC) 进行偶联制。
43、备出 UAC-PNA 纳米分子微囊， 该纳米分子微囊可解决 PNA 口服给药生物利用率低及胃内低 pH 的 破坏。在胃肠道的稳定性， 保护药物不被胃内环境所破坏， 能降低跨内皮细胞电阻， 促进基 因药物透过上皮组织， 提升跨膜转运效率。 0090 方法 0091 分组和处理 ： 感染给药组、 给药对照组、 感染不给药组和空白对照组， 10 头 / 组。 PCV2 感染组经肌注接种 1ml PCV2(10-5.20TCID50) 组织毒。各试验组按常规隔离饲养。给 说 明 书 CN 103102397 A 10 9/10 页 11 药 组药物浓度 100ppm/ 吨， 将药物添加于饲料中。 00。
44、92 试验期间， 每天直肠检测体温并观察临床症状。分别于用药后 1、 3、 5、 7、 9 天经前 腔静脉采集血液并分离血清， 5ml/ 头， 用 PCR 法检测血清中所含的 PCV2。另于接毒后 14d 剖杀试验猪并检查病理变化， 采集淋巴结、 肺脏、 脾脏， 肝脏。 0093 PCV2 的 PCR 检测系统 0094 引物序列如下 ： 0095 上游引物 ： 5 -AAGGGCTGGGTTATGGTATG-3 ； 0096 下游引物 ： 5 -CGCTGGAGAAGGAAAAATGG-3。 0097 反应体系 (25L) ： 0098 10PCR 缓冲液 2.5L， 0099 dN TP 。
45、混合物 3L， 10pmol/L， 0100 病毒特异性上、 下游引物各 1L， 0101 DNA 模板 2L， 0102 Taq DNA 聚合酶 0.3L， 0103 用去离子水补足至 25L 0104 反应程序 ： 0105 0106 取 5l 扩增产物以 1.5琼脂糖电泳鉴定， 出现 353bp 条带的样品， 可判定为 PCV2 阳性。 0107 结果 ： 0108 临床症状和病理剖检结果 ： 接种后， 感染不给药组在感染后 4 天 10 头猪均出现 PCV2 感染的明显临床症状 ( 进行性消瘦， 生长迟缓、 呼吸困难、 咳嗽、 腹泻、 皮肤苍白、 贫血， 耳后出现丘疹继而蔓延至全身和典型病理变化 ( 血液稀薄、 肺脏肿胀肉变、 间质性肺炎、 全 身淋巴结显著肿大、 苍白、 切面为灰黄色、 脾轻度肿胀， 肝肿大 ； 给药对照组、 空白对照组全 部试验猪均未见异常。 0109 表 4. 试验各组 PCV2 存在于血清中的阳性情况 0110 0111 说 明 书 CN 103102397 A 11 10/10 页 12 说 明 书 CN 103102397 A 12 1/2 页 13 0001 0002 序 列 表 CN 103102397 A 13 2/2 页 14 序 列 表 CN 103102397 A 14 。