兽用狂犬病灭活疫苗及其制备方法.pdf

本发明涉及一种兽用狂犬病灭活疫苗及其制备方法，该灭活疫苗是以脂质体为佐剂的灭活的狂犬病病毒，其制备方法主要包括以下步骤：制备狂犬病病毒液；病毒液的浓缩、纯化；病病毒的灭活；疫苗的配制；疫苗的分装，包装。本发明的疫苗具有性能稳定、安全性好、动物免疫后产生免疫作用快、免疫力强、保护率高等特点。本疫苗为兽用疫苗，从根源上阻断了狂犬病病毒的传播，能更有效预防和控制狂犬病病毒的感染。

1.  一种兽用狂犬病灭活疫苗，其特征在于：所述的疫苗包含灭活的狂犬病病毒液及佐剂。

2.  根据权利要求1所述的一种兽用狂犬病灭活疫苗，其特征在于：所述疫苗中病毒液的浓度为1.0683×10⁶TCID₅₀/0.03ml，佐剂为脂质体溶液，其中磷脂的浓度为33mmol，胆固醇的浓度为33mmol。

3.  根据权利要求1所述的一种兽用狂犬病灭活疫苗，其特征在于：所述的灭活是指使用灭活剂β-丙内酯(即BPL)灭活病毒的过程，具体的灭活方法为用2％的HEPES 1mol/L pH7.5和0.14 g/l NaHCO₃在4℃下调纯化的病毒原液pH至7.4～7.6，逐滴加入10％W/V BPL，使其最终浓度为0.025％，灭活24h后，将灭活的病毒液再经37℃水浴2小时即可。

4.  一种如权利要求1所述的兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤
(1)制备狂犬病病毒液；(2)病毒液的浓缩、纯化；(3)病毒液的灭活；(4)疫苗的配制；(5)疫苗的分装，包装。

5.  根据权利要求4所述的一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(2)中的浓缩是指用醋酸锌沉淀法浓缩病毒液，纯化是指用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化病毒液。

6.  根据权利要求4所述的一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述的灭活是指使用灭活剂β-丙内酯(即BPL)灭活病毒的过程，具体的灭活方法为用2％的HEPES 1mol/L pH7.5和0.14 g/l NaHCO₃在4℃下调纯化的病毒原液pH至7.4～7.6，逐滴加入10％W/V BPL，使其最终浓度为0.025％。灭活24h后，将灭活的病毒液再经37℃水浴2小时即可。

7.  根据权利要求4所述的一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(4)中疫苗的配制方法为取1ml的匀化的脂质体溶液与1ml灭活的狂犬病病毒液混合，并加入0.02％的柳硫汞，其中1mL的脂质体溶液中含有33mmol的磷脂和33mmol的胆固醇，病毒液的浓度为1.0683×10⁶TCID₅₀/0.03ml。

兽用狂犬病灭活疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种兽用狂犬病灭活疫苗，同时还涉及该兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法，属于兽用疫苗技术领域。
背景技术
自2001～2006年，我国狂犬病年度死亡数分别为854、1159、1980、2651、2545、2649例。从以上的数据可以看出，患狂犬病及死亡人数每年都在上升。这些数据表明狂犬病重新成为中国社会不容忽视的公共卫生问题。在人的狂犬病发生和流行中，野生动物为本病的主要储存宿主，外貌健康而携带病毒的动物亦是传染源，但犬在携带和传播狂犬病中起重要作用，是人畜感染的最主要的来源，人患狂犬病93％以上是由犬传播给人类的。随着家庭犬、猫等宠物饲养量的增加，宠物将越来越成为人感染狂犬病的重要来源。
目前对于人感染狂犬病主要采取的是人感染后对人的免疫，然而要从根本上预防狂犬病的发生，控制和消灭狂犬病，必须对犬和野生动物及宠物实行全面的综合预防措施，加强监测管理力度，提高它们的免疫覆盖率，定期检测其抗体效价是否能达到免疫保护水平，加强免疫。因此研制安全有效的兽用狂犬病疫苗，是预防狂犬病的关键，已成为当务之急。
发明内容
本发明的目的在于提供一种兽用狂犬病灭活疫苗，以从根源上阻断狂犬病病毒的传播。
本发明的目的还在于提供一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案在于采用了一种兽用狂犬病灭活疫苗，该疫苗由灭活的狂犬病病毒液并辅以佐剂制备成，所述疫苗中病毒液的浓度为1.0683×10⁶TCID₅₀/0.03ml，佐剂为脂质体溶液，其中磷脂的浓度为33mmol，胆固醇的浓度为33mmol。
其中所使用的狂犬病病毒是SAD株经原代地鼠肾细胞在32℃条件下培养传代40-107代后即为Vnukovo-32病毒株，来源于中国农业科学院兰州兽医研究所。Vnukovo-32的灭活方法为用2％的HEPES1mol/LpH7.5和0.14g/l NaHCO₃在4℃下调纯化的病毒原液pH至7.4～7.6，逐滴加入10％W/V BPL，使其最终浓度为0.025％。灭活24h后，将灭活的病毒液再经37℃水浴2小时即可。
本发明的技术方案还在于采用了一种兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
(1)制备狂犬病病毒液：接种狂犬病病毒来源于SAD的Vnukovo-32病毒株于BHK21细胞使之感染细胞；接种病毒的细胞首先在37℃培养24h后，换为33℃培养72h，然后将细胞培养物反复冻融3次收取病毒液。
(2)狂犬病病毒液的浓缩、纯化：用醋酸锌沉淀法浓缩病毒液，用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化病毒液。
(3)狂犬病病毒的灭活：使用的灭活剂为β-丙内酯，具体的灭活方法为用2％的HEPES1mol/LpH7.5和0.14g/lNaHCO₃在4℃下调纯化的病毒原液pH至7.4～7.6，逐滴加入10％W/VBPL，使其最终浓度为0.025％。灭活24h后，将灭活的病毒液再经37℃水浴2小时即可。
(4)疫苗的配制
佐剂的配制方法为：按摩尔之比为10∶2∶1，分别取氢化大豆磷脂、胆固醇和十八胺，将称取好后的三种物质溶于20ml氯仿中，旋转蒸发除去有机溶剂，待脂质在瓶壁形成薄膜，再加入60ml氯仿乙醚(1∶1，v/v)混合有机溶剂溶解，进行水浴，超声同时加入磷酸盐缓冲液(20mmol/LpH7.7)20ml，混匀，旋转蒸发除去有机溶剂，当乳液逐渐形成胶状物时，抽真空除去残余的有机溶剂，即成脂质体溶液。其中1mL的脂质体溶液中含有33mmol的磷脂和33mmol的胆固醇。
疫苗的配制：取1mL匀化的脂质体溶液与1mL灭活的狂犬病病毒液混合，并加入0.02％的柳硫汞，其中病毒液的浓度为1.0683×10⁶TCID₅₀/0.03ml。
(5)分装：每头注射1ml，可按1头份/瓶或10头份/瓶进行分装，包装。
本发明所使用的病毒株还可以是来源美国的Flury LEP株，所使用的接毒细胞还可以是来源非洲绿猴肾细胞即vero细胞
本发明所使用的病毒株和接毒细胞也可以上述毒株和接毒细胞中的任意一种，如满足要求，也可以是其他的病毒株或接毒细胞，以上给出的毒株和接毒细胞仅仅是为了示例说明本发明。
本发明的有益效果：本发明采用的是兽用狂犬病灭活疫苗，从根源上阻断了狂犬病病毒的传播。并且本发明使用脂质体作为佐剂，由于脂质体(liposome)是人工合成的脂质双层微囊，具有可与细胞膜融合，可被吞噬细胞吞噬及能被充分生物降解的特点，可以加快疫苗产生免疫作用，提高其免疫力，对被免疫动物的保护率高。因此本疫苗能有效预防和控制狂犬病毒的感染，可产生显著的经济和社会效益。
具体实施例
实施例1
脂质体的制备方法
按摩尔之比为10∶2∶1，分别取氢化大豆磷脂、胆固醇和十八胺，将称取好后的三种物质溶于20ml氯仿中，旋转蒸发除去有机溶剂，待脂质在瓶壁形成薄膜，再加入60ml氯仿乙醚(1∶1，v/v)混合有机溶剂溶解，进行水浴，超声同时加入磷酸盐缓冲液(20mmol/L pH 7.7)20ml，混匀，旋转蒸发除去有机溶剂，当乳液逐渐形成胶状物时，抽真空除去残余的有机溶剂后制备成脂质体溶液。
实施例2
兽用狂犬病灭活疫苗的制备方法
制备狂犬病病毒液：将Vnukovo-32株按1％体积同步接种BHK-21细胞2000mL方瓶，37℃培养24h后，换为33℃培养72h后将细胞培养物反复冻融3次收获病毒液。
病毒的浓缩：病毒液4℃离心30min，3000r/min，去细胞杂片及杂质，收集上清；上清液按1∶50的比例加入1mol/L的醋酸锌(pH 5.0)混合，调整pH至6.8，4℃放置30-60min，3000r/min，4℃离心40min，收集沉淀；以适量饱和的EDTA重新充分悬浮，3000r/min，4℃离心20min，吸取上清液，为浓缩的病毒液。
病毒液的纯化：浓缩后的病毒液，进行Sepharose 4FF层析纯化。介质主窗体级100×1.3²×3.14³，上样后用pH7.2浓度为0.04mol/L的PBS洗脱，洗脱速度为3mL，紫外检测器检测分步收集第一峰。
狂犬病病毒的灭活：使用的灭活剂为β-丙内酯，具体的灭活方法为用2％的HEPES1mol/LpH7.5和0.14g/lNaHCO₃在4℃下调纯化的病毒原液pH至7.6，逐滴加入10％W/V BPL，使其最终浓度为0.025％。灭活24h后，将灭活的病毒液再经37℃水浴2小时即可。
疫苗的配制：脂质体按实施例1的方法配制，取1mL的匀化的脂质体溶液与灭活的狂犬病病毒液混合，并加入0.02％的柳硫汞，其中病毒液的浓度为1.0683×10⁶TCID₅₀/0.03ml，磷脂的浓度为33mmol，胆固醇的浓度为33mmol。
每头注射1ml，可按1头份/瓶或10头份/瓶进行分装，包装。3月龄以上犬、猫，皮下或肌肉注射，每只1ml。
实施例3
狂犬病病毒的感染性检验
将灭活纯化和没有灭活的狂犬病病毒分别接种小白鼠，观察14天，结果前者病毒接种的小白鼠都存活，但是对于没有灭火的病毒液接种的小鼠出现神经症状在第6天，第8天开始出现死亡。可见用β-丙内酯灭活病毒具有很好的灭活效果。
实施例4
灭活病毒效力检验
将所制的疫苗在4℃普通冰箱分别保存4、6和12个月，按保存时间选择9只犬进行免疫注射，每只1mL，并于免疫前和免疫后30天左右采血测定其血清中的抗体。不同时间段灭活病毒的效力见表1。
表1不同时间段灭活病毒的效力

实施例5
标准毒株毒力的测定
将标准毒株CVS-11用PBS作10倍系列的稀释，取10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-85个稀释度分别脑内接种10-12g的小鼠，每个稀释度接种10只，每只0.03mL，观察14天，3日内死亡的小鼠不计，计算LD₅₀，测定结果统计如表2所示。
表2狂犬病病毒CVS-11半数致死量的测定

用Reed-Muench法计算标准毒株的滴度：
距离比＝(高于50％的百分数-50)/(高于50％的百分数-低于50％的百分数)
＝(100-50)/(100-30)
＝0.715
IgLD₅₀＝Ig(高于50％死亡率的稀释度)+(距离比×稀释倍数的对数)
＝-6+(0.715×-1)
＝-6.715
即所测CVS-11对小白鼠的半数致死量为10^-6.715/mL。
实施例6
免疫效力攻毒试验
将灭活纯化的疫苗和参考疫苗用0.04mol/L pH7.6的PBS分别作5倍系列稀释，取4个稀释度(1∶5；1∶25；125，1∶625)腹腔接种11-12g的小鼠，每个稀释度接种10只，0.5mL/只，同时做阴性对照。疫苗接种后2周，全部的试验小鼠以100LD₅₀脑内攻击标准毒株CVS-11狂犬病悬液0.03mL/只，再观察2周，记录攻毒后的5-14天的小鼠呈现狂犬病症状的小鼠(攻毒后4天内每个稀释度最多可允许死亡2只)，对照组的小鼠应全部死亡。用对数法计算待检疫苗和参考疫苗半数保护量(PD₅₀)，其计算公式按照常规的计算方法进行计算。
β-丙内酯灭活的脂质体佐剂疫苗经过NIH效力测定实验结果显示，该疫苗效价达到了7.00IU，有较高的免疫效力，完全能达到抵抗狂犬病毒保护小鼠的效果。