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1、(10)申请公布号 CN 103172730 A (43)申请公布日 2013.06.26 CN 103172730 A *CN103172730A* (21)申请号 201310085704.9 (22)申请日 2013.03.18 C07K 14/81(2006.01) C12N 15/15(2006.01) (71)申请人 昆明理工大学 地址 650093 云南省昆明市五华区学府路 253 号 (72)发明人 宋玉竹 刘娃 张阿梅 韩芹芹 纪森林 (54) 发明名称 黑眶蟾蜍胱抑素及其基因和应用 (57) 摘要 本发明公开了一种黑眶蟾蜍胱抑素及其基 因， 该黑眶蟾蜍胱抑素的氨基酸序列如 。
2、SEQ ID NO ： 2 所示， 编码黑眶蟾蜍胱抑素的基因核苷酸序 列如 SEQ ID NO ： 1 所示， 通过原核表达手段获得 的黑眶蟾蜍胱抑素具有很强的组织蛋白酶 B 抑制 活性， 并且还具有体外生产方便、 抑制组织蛋白酶 B活性强大的特点， 可做为组织蛋白酶B抑制剂进 行应用。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 序列表3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103172730 A CN 103172730 A *CN103172730A* 。
3、1/1 页 2 1. 一种黑眶蟾蜍胱抑素， 其特征在于 ： 所述黑眶蟾蜍胱抑素的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 2. 一种编码权利要求 1 所述黑眶蟾蜍胱抑素的基因， 其特征在于 ： 核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 3. 权利要求 1 所述的黑眶蟾蜍胱抑素在制备组织蛋白酶 B 抑制剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103172730 A 2 1/6 页 3 黑眶蟾蜍胱抑素及其基因和应用 技术领域 0001 本发明提供一种黑眶蟾蜍胱抑素基因及其应用， 属于生物医学技术领域。 背景技术 0002 黑眶蟾蜍， 无尾目， 蟾蜍科， 蟾蜍属， 是传统中药材 “干。
4、蟾” 的主要来源之一， 一般于 夏、 秋二季捕捉 ； 味辛、 凉， 有毒， 归肝、 脾、 肺经， 具有消肿解毒、 止痛、 利尿的功效， 常用于慢 性气管炎、 痈疖疔疮、 咽喉肿痛、 水肿和小便不利等症治疗 ； 民间也有用于癌症 （尤其是乳腺 癌） 等的验方， 但目前关于其功效的分子机制研究较少。 0003 在肿瘤发生发展的过程中， 组织蛋白酶B起着重要的作用， 组织蛋白酶B能够直接 降解或激活纤溶酶原激活剂及基质金属蛋白酶等而间接降解许多细胞外基质成分， 从而参 与肿瘤的侵袭转移过程。 此外它还可以促进肿瘤血管的增生， 增强肿瘤细胞的运动能力， 而 且组织蛋白酶 B 转录、 表达水平的高低与肿。
5、瘤的预后呈正相关。目前认为对组织蛋白酶 B 等半胱氨酸蛋白酶的抑制与抗肿瘤作用有关。 0004 将本发明的黑眶蟾蜍胱抑素氨基酸全序列及其编码基因分别对蛋白质数据库和 基因数据库进行了比对搜索， 均未发现有任何相同序列信息。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种黑眶蟾蜍胱抑素， 该黑眶蟾蜍胱抑素的氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示， 其是一种单链多肽， 分子量 10882.84 道尔顿， 等电点 7.57。 0006 本发明另一目的是提供一种编码所述黑眶蟾蜍胱抑素的基因， 其核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 黑眶蟾蜍胱抑素基因的克隆方法如下 : 黑眶蟾蜍皮肤总。
6、 RNA 提取、 反转录及设计引物并利用 PCR 方法筛选黑眶蟾蜍胱抑素基 因， 其中正向扩增引物长度为 23 个核苷酸， 其序列为 5 ATGGATCAAAAAGGAAATGTTCC-3 ， 反向扩增引物序列为 5 -CTAAAAATAACAGATGGGGTCTTC-3 ； 所获阳性单克隆进行基因核苷酸 序列测定， 基因测序结果表明编码黑眶蟾蜍胱抑素的基因由 309 个核苷酸组成， 自 5 端至 3 端序列为 ： atggatcaaa aaggaaatgt tcctggcgga ctgggtgcag aaaagcctgc taccccagaa 60 atacaggcgc tgtgtgacat。
7、 ggtaaaatgc gcttttgagc aaaaatccgg gactaatgca 120 gcagagttta aggccatctg ttacgcaagt caagttgttg ctggaacaat gtactatgtg 180 aaggtggata ttggaggagg tcagtgctgt catctgaaaa tacttcaacc tctgcctact 240 ggagggaaag tgagtctgag cgactaccag tgcgggaaga agaaggaaga ccccatctgt 300 tatttttag 309 编码黑眶蟾蜍成熟胱抑素为第 1306 位核苷酸， 其氨。
8、基酸序列为如 SEQ ID NO ： 2 所 示。 0007 黑眶蟾蜍胱抑素的原核表达、 纯化方法如下 ： 说 明 书 CN 103172730 A 3 2/6 页 4 构建原核表达载体， 转化入 BL21 感受态细胞， 培养于含氨苄青霉素的 LB 培养基中， 经 IPTG 诱导表达后， 离心收集菌体， 超声破碎离心取上清， 进行亲和层析获得融合黑眶蟾蜍胱 抑素 ； 经超滤后用肠激酶进行消化后， 纯化即得重组黑眶蟾蜍胱抑素， 该胱抑素具有强烈的 抑制组织蛋白酶 B 活性。 0008 本发明另一目的是将黑眶蟾蜍胱抑素应用在制备组织蛋白酶 B 抑制剂中。 0009 本发明中所用黑眶蟾蜍来源于云南省。
9、西双版纳州， 从农贸市场购得。 0010 本发明的有益效果在于 : 由黑眶蟾蜍胱抑素编码基因推导其氨基酸结构， 并进行原核表达， 纯化后的黑眶蟾蜍 胱抑素具有强烈的抑制组织蛋白酶 B 的活性， 该黑眶蟾蜍胱抑素具有体外生产方便、 抑制 组织蛋白酶 B 活性强大的特点。 0011 本发明提供的黑眶蟾蜍胱抑素在2uM浓度可抑制75%的组织蛋白酶B活性， 8uM浓 度黑眶蟾蜍胱抑素可抑制 90% 的组织蛋白酶 B 活性。 附图说明 0012 图 1 是本发明黑眶蟾蜍胱抑素对组织蛋白酶 B 抑制活性结果示意图。 具体实施方式 0013 下面通过实施例对本发明作进一步详细说明， 但本发明的内容并不局限于。
10、此， 本 实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作， 所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂 或按常规方法配置的试剂。 0014 实施例 1 ： 黑眶蟾蜍胱抑素基因的克隆 一、 黑眶蟾蜍皮肤总 RNA 提取 A、 将活体黑眶蟾蜍用水清洗干净， 放入液氮中速冻 4 小时， 取皮肤组织， 称重， 取 300mg 皮肤组织， 加入10ml总RNA提取缓冲液 (Trizol溶液， 美国Invitrogen公司产品)， 于20ml 玻璃匀浆器中匀浆 10 分钟 ； B、 加入等体积酚/氯仿溶液， 振荡混匀， 室温放置10分钟， 4， 12000rpm离心10分钟， 吸取上层水相液体 ； C、 在上清液中加。
11、入上清液 1/2 体积的异丙醇， 室温放置 10 分钟， 4下 7500g 离心 10 分钟， 沉淀用 75% 乙醇洗一次， 晾干， 管底沉淀物即为黑眶蟾蜍皮肤总 RNA。 0015 二、 黑眶蟾蜍皮肤 cDNA 文库合成 采用 CLONTECH 公司 CreatorTM SMART TM cDNA Library Construction Kit 质粒 cDNA 文库构建试剂盒， 参照试剂盒说明书方法操作如下 ： A、 cDNA 第一链合成 ( mRNA 反转录 )， 具体步骤如下 ： 1、 在 0.5ml 无菌的离心管加入 1l 黑眶蟾蜍皮肤总 RNA、 1l SMART IV 寡聚核苷酸。
12、、 1l CDS III/3 PCR 引物， 加 2l 去离子水使总体积达到 5l ； 2、 混匀离心管中的试剂并短暂离心， 72 保温 2 分钟 ； 3、 将离心管在冰上孵育 2 分钟 ； 4、 在离心管中加入以下试剂 2.0l 5 第一链缓冲、 1.0l 20mM 二硫苏糖醇、 1.0l 10mM dNTP 混合物、 1.0l PowerScript 反转录酶 ； 说 明 书 CN 103172730 A 4 3/6 页 5 5、 混合离心管中试剂并短暂离心， 在 42保温 1 小时 ； 6、 将离心管置于冰上中止第一链的合成 ； 7、 从离心管取 2l 所合成的 cDNA 第一链备用。 。
13、0016 B、 采用长末端聚合酶链式反应 (LD- PCR ) 方法扩增第二链， 具体内容如下 ： 1、 95预热 PCR 仪 ； 2、 将2l cDNA第一链 （mRNA 反转录） 、 80l 去离子水、 10l 10Advantage 2 PCR 缓冲、 2l 50dNTP 混合物、 2l 5 PCR 引物、 2l CDS III/3 PCR 引物以及 2l 大 肠杆菌聚合酶离心管进行反应 ； 3、 在 PCR 仪中按以下程序扩增 ： 95 20 秒钟 22 个循环 ： 95 5 秒钟 68 6 分钟 ； 4 ； 循环结束后， 将离心管中合成的 cDNA 双链进行后续过程。 0017 三、。
14、 黑眶蟾蜍胱抑素编码基因的扩增 1、 95预热 PCR 仪 ； 2、 将2l cDNA双链 （上述产物） 、 75.5l 去离子水、 10l PCR 缓冲液、 8l dNTP混 合物 （各 2.5uM） 、 2l 正向扩增引物、 2l 反向扩增引物以及 0.5l 大肠杆菌 DNA 聚合酶 放入离心管中进行反应 ； 正向扩增引物长度为 23 个核苷酸， 其序列为 5 ATGGATCAAAAAG GAAATGTTCC-3 (SEQ ID NO ： 3)， 反向扩增引物序列为 5 -CTAAAAATAACAGATGGGGTCTTC-3 (SEQ ID NO ： 4) ； 3、 在 PCR 仪中按以下。
15、程序扩增 ： (1) 预变性 95 5 分秒钟 (2) 25 个循环 ： 95 30 秒钟 56 40 秒钟 72 30 秒钟 (3) 后扩增 72 5 分钟 4、 循环结束后， 将 PCR 产物用 TIANGEN 公司的 DNA 产物纯化试剂盒进行抽提回收， 步 骤如下 ： (1) 将 PCR 产物与等体积的膜结合液颠倒混匀， 然后将混和液转入离心纯化柱， 室温 静置 5 分钟， 使 DNA 充分与硅胶膜结合， 12000rpm 离心分 1 钟， 倒掉收集管中的废液 ； (2) 加入 700 l 的漂洗液 （含乙醇） 于离心纯化柱中， 12000 rpm 离心 1 分钟， 倒掉收 集管中的废。
16、液 ； (3) 重复步骤 2 ； (4) 12000 rpm 离心 3 分钟 ； (5) 将离心纯化柱置于新的离心管中 ； 说 明 书 CN 103172730 A 5 4/6 页 6 (6) 加入 30l 超纯水， 在室温下静置 5 分钟 ； (7) 12000 rpm 离心 1 分钟， 管底溶液即为纯化过的黑眶蟾蜍胱抑素编码基因 PCR 产 物。 0018 四、 大肠杆菌 DH5 感受态细胞的制备 1、 挑取单个 DH5 菌落， 接种于 3m1 不含氨苄青霉素的 LB 培养基中， 37培养过夜， 次 日取上述菌液按比例 1:100 再接种于 50m1 LB 培养基中， 37振荡 2 小时。。
17、当 OD600 值达 到 0.35 时， 收获细菌培养物 ； 2、 将细菌转移到一个 50m1 预冷的无菌聚丙烯管中， 冰上放置 10min， 使培养物冷却 ； 3、 于 4下 4100 rpm 离心 10min， 吸出培养液， 并将管倒置 l min 以使残留的培养基流 尽 ； 4、 每 50ml 初始培养液用 30ml 预冷的 0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液 (80mmol/L MgCl2， 20mmol/L CaCl2) 重悬细胞沉淀 ； 5、 于 4下 4100 rpm 离心 10min， 吸出上清液， 并将管倒置 l min 以使残留的液体流 尽 ； 6、 每 50ml。
18、 初始培养物用 2ml 预冷的 0.1mol/L CaCl2溶液重悬细胞沉淀， 分装后备用。 0019 五、 连接及连接产物的转化 1、 在微量离心管中加入1l Takara pMD19-T simple载体、 4l黑眶蟾蜍胱抑素编码 基因 PCR 产物及 5 l 的连接酶缓冲混合物 ； 2、 16反应 3 小时 ； 3、 全量 （10l） 加入至 100l DH5 感受态细胞中， 冰中放置 30 分钟 ； 4、 42加热 90 秒钟后， 再在冰中放置 1 分钟 ； 5、 加入 37温浴过的 LB 培养基 890l， 37缓慢振荡培养 60 分钟 ； 6、 取 200l 涂布于含有 X-Gal。
19、、 IPTG、 氨苄青霉素的 LB 培养基上， 37培养 16 小时以 形成单菌落。 0020 六、 黑眶蟾蜍胱抑素基因克隆筛选及鉴定 挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的 LB 培养基中， 37缓慢振荡培养 4 小时， 进行 PCR 扩增， 扩增引物及扩增条件同前述黑眶蟾蜍胱抑素编码基因的扩增条件 ； 将经 PCR 确 证的阳性克隆进行质粒提取后， 以美国 Applied Biosystems3730A 全自动核苷酸序列测 定仪进行核苷酸序列的测定 ； 测序引物为 BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47（5 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3 ） ，。
20、 基因测序结果自 5 端至 3 端序列为 : atggatcaaa aaggaaatgt tcctggcgga ctgggtgcag aaaagcctgc taccccagaa 60 atacaggcgc tgtgtgacat ggtaaaatgc gcttttgagc aaaaatccgg gactaatgca 120 gcagagttta aggccatctg ttacgcaagt caagttgttg ctggaacaat gtactatgtg 180 aaggtggata ttggaggagg tcagtgctgt catctgaaaa tacttcaacc tctgcctact 24。
21、0 ggagggaaag tgagtctgag cgactaccag tgcgggaaga agaaggaaga ccccatctgt 300 tatttttag 309 黑眶蟾蜍胱抑素基因核苷酸序列长度为 309 个碱基， 序列类型 ： 核酸， 链数 ： 单链， 拓扑 学 ： 直链状， 序列种类 ： cDNA， 来源 ： 黑眶蟾蜍皮肤。 0021 编码黑眶蟾蜍胱抑素为第 1306 位核苷酸， 其氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 2 所示。 说 明 书 CN 103172730 A 6 5/6 页 7 0022 实施例 2 ： 黑眶蟾蜍胱抑素的原核表达、 纯化 一、 黑眶蟾蜍胱抑素原核表达。
22、载体的构建 根据编码黑眶蟾蜍胱抑素的基因设计引物， 正向嵌套引物序列两条， 加入Kpn I限制性 内切酶切位点和肠激酶酶切位点， F1 序列为 5 -GGTACCGACGACGACGACAAGATGGA-3 (SEQ ID NO ： 5) ； F2 序列为 5 -CGACAAGATGGATCAAAAAGG-3 (SEQ ID NO ： 6) ； 反向引物 R 序列为 5 -A AGCTTCTAAAAATAACAGATGGG-3 (SEQ ID NO ： 7)， 加入 Hind III 酶切位点， 经 PCR、 胶回收后， 进行双酶切 ； PCR、 胶回收操作步骤同前实施例 1 中的步骤三。 0。
23、023 在 PCR 管中配制下列酶切体系 ： PCR 产物 / 环状载体 50 ul ddH2O 30ul 10M Buffer 10ul Kpn I 5ul(15 U ) Hind III 5ul(15 U ) 总体积 100ul 37酶切10小时， 在反应管中加入6溴酚兰载样缓冲液20l， 混匀后于1.0%琼脂糖 凝胶中电泳， 根据条带大小回收目的片段， 操作步骤同前实施例 1 中的步骤三。 0024 在 PCR 管中配制下列连接体系 ： 载体 DNA 200ng 插入片段 DNA 30ng 连接酶 10X 缓冲液 2 ul T4 DNA 连接酶 2U 加无核酸酶水至 20ul 15连接 。
24、18 小时， 连接产物转入大肠杆菌 BL21 感受态细胞并筛选阳性克隆， 操作步 骤同前实施例 1 中的步骤三。 0025 二、 黑眶蟾蜍胱抑素的诱导表达 1、 37摇床培养至 OD600 到 0.4-1( 建议 OD600 为 0.6) ； 2、 加入 100mM IPTG 储液至终浓度 0.4mM， 继续培养 2-3 小时 ； 3、 将摇瓶置于冰上 5 分钟， 5000g 4 离心 5 分钟收集菌体 ； 4、 重悬细胞于 0.25 倍体积预冷的 20mM 磷酸钠， 20mM 咪唑 （pH7.4） 中， 离心 ； 5、 除去上清， 菌体保存于 -70冰箱或继续纯化。 0026 三、 黑眶蟾蜍。
25、胱抑素的纯化 1、 超声破碎提取蛋白 以 20mM 磷酸钠， 20mM 咪唑 （pH7.4）重悬细胞后， 于冰浴中进行超声波破碎， 功率 100-200W， 每次超声 3s， 间歇 7s， 总时间 15min， 离心取上清即可用于亲和层析 ； 2、 亲和层析柱的准备 组装层析柱后， 用蒸馏水冲洗以去除末端的气泡， 关闭层析柱流出口， 保持层析柱下端 有部分水存在， 重悬Ni Sepharose 6 Fast Flow填料后， 连续单次将其装入层析柱， 打开层 析柱出口， 将恒流泵设置为所需流速后， 完成至少 3 个柱体积的洗脱、 备用 ； 3、 亲和层析 说 明 书 CN 103172730 。
26、A 7 6/6 页 8 以 150cm/h 的线性流速用 5 到 10 个柱体积的结合缓冲液 （20mM 磷酸钠， 20mM 咪唑， pH7.4） 平衡层析柱， 加入前述样品， 用结合缓冲液洗柱子， 直至 280nm 处吸收回复至基线 处， 用洗脱缓冲液 （20mM 磷酸钠， 0.5M NaCl， 0.5M 咪唑， pH7.4） 进行线性梯度洗脱， 收集 60%-100% 洗脱组分， 即为黑眶蟾蜍胱抑素融合蛋白 ； 4、 超滤 使用截留分子量3kD的超滤离心管进行超滤， 于常温下4000转离心30min， 加入等体积 ddH2O 后重复离心步骤两次， 收集离心管上方的液体进行后续操作 ； 5、。
27、 肠激酶切割及纯化 取上述蛋白 5mg， 加入重组肠激酶 20U， 10 反应缓冲液 100ul， 总体积 1ml ； 25反应 12 小时后， 进行亲和层析， 收集层析柱不能结合的组分， 再次进行超滤， 即得纯度超过 99% 的黑眶蟾蜍胱抑素。 0027 实施例 3 ： 黑眶蟾蜍胱抑素的应用 检测黑眶蟾蜍胱抑素的组织蛋白酶 B 抑制活性。 0028 以生色底物 Z-Arg-Arg-pNA(Benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-arginine-p-nit roani- lide) 为反应底物， 将牛组织蛋白酶 B（0.2ng/ 反应） 与反应缓冲液 （0.1 M 乙酸 。
28、钠， pH 5.5， 含 1mM DTT， 2mM EDTA 和 4mM 半胱氨酸） 、 不同浓度的黑眶蟾蜍胱抑素 （终浓度 28M） ， 混合后置于室温 5min， 加入 Z-Arg-Arg-pNA 至终浓度为 400uM， 37孵育 30min 后检测 410nm 处吸光度 （记为 Abo I） ， 设置加入重组黑眶蟾蜍胱抑素的作为对照 （记为 Abo C） ， 计算抑制率， 计算方法为 （Abo C-Abo I） /Abo C 100%。 0029 结果如图 1 显示， 黑眶蟾蜍胱抑素具有强大的组织蛋白酶 B 抑制活性， 在 2uM 浓度 时可抑制75%的组织蛋白酶B活性， 8uM浓度黑。
29、眶蟾蜍胱抑素可抑制90%的组织蛋白酶B活 性， 而且这种抑制作用十分迅速， 在 15 秒内 2uM 黑眶蟾蜍胱抑素即可抑制 60% 的组织蛋白 酶 B 活性， 实验证明其可以作为组织蛋白酶抑制剂使用。 说 明 书 CN 103172730 A 8 1/3 页 9 SEQUENCE LISTING 昆明理工大学 黑眶蟾蜍胱抑素及其基因和应用 7 PatentIn version 3.3 1 309 DNA Bufo melanostictus 1 atggatcaaa aaggaaatgt tcctggcgga ctgggtgcag aaaagcctgc taccccagaa 60 atacag。
30、gcgc tgtgtgacat ggtaaaatgc gcttttgagc aaaaatccgg gactaatgca 120 gcagagttta aggccatctg ttacgcaagt caagttgttg ctggaacaat gtactatgtg 180 aaggtggata ttggaggagg tcagtgctgt catctgaaaa tacttcaacc tctgcctact 240 ggagggaaag tgagtctgag cgactaccag tgcgggaaga agaaggaaga ccccatctgt 300 tatttttag 309 2 102 PRT Bu。
31、fo melanostictus 2 Met Asp Gln Lys Gly Asn Val Pro Gly Gly Leu Gly Ala Glu Lys Pro 1 5 10 15 Ala Thr Pro Glu Ile Gln Ala Leu Cys Asp Met Val Lys Cys Ala Phe 20 25 30 Glu Gln Lys Ser Gly Thr Asn Ala Ala Glu Phe Lys Ala Ile Cys Tyr 35 40 45 Ala Ser Gln Val Val Ala Gly Thr Met Tyr Tyr Val Lys Val Asp I。
32、le 50 55 60 Gly Gly Gly Gln Cys Cys His Leu Lys Ile Leu Gln Pro Leu Pro Thr 65 70 75 80 Gly Gly Lys Val Ser Leu Ser Asp Tyr Gln Cys Gly Lys Lys Lys Glu 85 90 95 Asp Pro Ile Cys Tyr Phe 序 列 表 CN 103172730 A 9 2/3 页 10 100 3 23 DNA 人工序列 3 atggatcaaa aaggaaatgt tcc 23 4 24 DNA 人工序列 4 ctaaaaataa cagatggggt cttc 24 5 26 DNA 人工序列 5 ggtaccgacg acgacgacaa gatgga 26 6 21 DNA 人工序列 6 cgacaagatg gatcaaaaag g 21 7 24 DNA 人工序列 7 序 列 表 CN 103172730 A 10 3/3 页 11 aagcttctaa aaataacaga tggg 24 序 列 表 CN 103172730 A 11 1/1 页 12 图 1 说 明 书 附 图 CN 103172730 A 12 。