提高活性氧清除酶活性的方法 【发明领域】
本发明涉及一种提高活性氧(Rreactive Oxygen Species：ROS)清除酶活性的方法，其是以赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇，木糖醇通过诱导显现或增强的机制，提高因吸烟等生活习惯，老化，疾病或心理压力等所降低的ROS清除酶的活性。此外，本发明还涉及一种通过前述机制补充预防及/或治疗起因于ROS疾病的方法。
【发明背景】
生物体进行有氧呼吸是为了分解摄取有机物获取生命能量。通过有氧呼吸可获取生命能量同时无时无刻处于氧应激状态。这种氧应激是由氧分子中分子内带有不成对电子且具有高反应性的ROS造成的。
进行有氧呼吸的生物体在生物体内拥有ROS清除酶用来作为能清除ROS的机制。通常，靠这些ROS清除酶才能够使ROS浓度维持在极低浓度。但是，由于吸烟等生活习惯，老化，疾病或心理压力等原因，当生物体内ROS的生成量超出相对的ROS清除酶的清除能力时，将使两者之间失去平衡。过量生成的ROS会给细胞带来损伤，加速老化，或直接成为病因引发诸如癌症和生活习惯病的各种疾病。
作为ROS清除酶可举例如超氧化物岐化酶(SOD)〔酶编号：EC 1.15.1.1〕，过氧化氢酶〔EC 1.11.1.6〕，过氧化物酶〔EC 1.11.1.7〕，谷胱甘肽过氧化物酶〔EC 1.11.1.9〕等，随生物种类其详细也各有不同。以超氧化物岐化酶为例如众所知，大鼠和人类具有Cu/Zn型，Mn型和EC型的3种类型3种的SOD同功酶，拟南芥则具有Cu/Zn型，Mn型和Fe型的3种类型8种的SOD同功酶。
近几年，SOD活性与疾病发病的关连性特别受到关注。举例而言，据报告，沃纳综合征(Werner syndrome)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症的发病是起因于SOD活性低落，且还报告，美拉德反应(Maillard reaction)会显著降低SOD活性，糖尿病患者SOD活性低落是起因于美拉德反应(非专利文献1)。此外，SOD的活性低落将降低对氧应激的防御能力结果导致引发各种疾病的并发症。
作为ROS引发疾病的改善方法，捕集生物体内过量ROS进而消除ROS细胞损伤能力的方法，或者提高ROS清除酶系统活性使其能同于正常情况清除ROS的方法是有效的。
作为捕集生物体内过量ROS进而消除ROS细胞损伤能力的方法，摄取胆红素，尿酸，维生素E，类胡萝卜素，异黄酮类，酚类，抗坏血酸等代表抗氧化物质的方法是众所周知的(非专利文献2)。比起对细胞的氧化损伤，这些抗氧化物质是一种能更快速更容易被氧化的物质，也以说是作为细胞的替身先与ROS反应进而消除ROS的细胞损伤能力，也被称为自由基清除剂。含有这些抗氧化物质的食品，也就是所谓的SOD类食品，拥有多数消费者的支持并被广泛销售。抗氧化物质因其反应性极高所以不安定，且SOD类食品中所含油脂等在储存过程中会发生如氧化或分解等之类的化学变化，所以持续保持清除自由基的有效量到投入生物体内为止是很难的。再者，就算抗氧化物质被摄取到生物体内因其会受如前述各种反应的影响所以选择并确实的消除ROS细胞损伤能力不是很容易的。此外，这些抗氧化物质当其捕集ROS后，在反应机理上其本身将成为一种新的自由基，所以也未必能完全消除ROS细胞损伤能力。
另一方面，有人建议把化学性质稳定的糖醇中的一种即木蜜醇，山梨醇，木糖醇作为羟基自由基(HO·)捕集剂来使用(专利文献1)。同样也发现赤藓糖醇对羟基自由基，超氧阴离子(O2-)，过羟基自由基(HOO·)等的ROS，脂过氧自由基和脂烷氧自由基具有自由基清除剂的功能，并建议将其用于食品，食品添加物，化妆品，疾病预防及/或治疗的用药(专利文献2)。然而，这些糖醇作为自由基清除剂的有效性几乎都是以活体外方式(in vitro)证实的，对在实际生物体内捕集ROS消除细胞损伤能力并没有取得直接的证据，且对这些糖醇的作用机制尚未明了。
作为提高ROS清除酶系统活性使其能同于正常情况清除ROS的方法，对ROS清除酶系统其中特别又以SOD，过氧化物酶来说，摄取具有活性促进効果的各种药材提取物(专利文献3)，灵芝属蘑菇提取物(专利文献4)，生育酚磷酸酯的方法已被公开。各种药材提取物和灵芝属蘑菇提取物中的ROS清除酶活性的促进物质，与前述以抗氧化物质直接消除生物体内过量ROS细胞损伤能力的方法有所不同，其被当作促进SOD活性和过氧化物酶活性的诱导物质起作用，且拥有只需少量即可间接清除ROS的优点。这些各种药材提取物和灵芝属蘑菇提取物可取得于食用或服用天然产物的提取法，因此基于食用经验在安全上不会有问题可广泛用于食品，但是，促进ROS清除酶系统活性的有效成份含量尚未确认且其作用机制也尚未明了。除此以外，因有效成份含量会受到收获产地，收获时期的影响不是一个定值，所以均质性的制剂是很难的。此外，生育酚磷酸酯与各种药材提取物或灵芝属蘑菇提取物有所不同，其有效成份已被确认，且其分子结构也已被解明，因此可以推测其对ROS清除酶系统活性的促进机制。但是，生育酚磷酸酯不管是从其采用合成法制造的观点来看或从食用经验地观点来看都无法保证其安全性，所以如专利文献5所述实施例事实上其只能限定用于膏霜等之类的化妆品。
与前述通过抗氧化物质清除ROS方法相比，提高促进ROS清除酶系统活性进而清除ROS方法因其可使ROS分解成水和氧使其无毒化，所以其作用机制极优。但是，有关具有促进活性效果物质的报告例并不多，到今为止，作用机制已被解明且能确保高安全性能广泛用于饮食品的物质可以说几乎不存在。
【非专利文献1】N.Taniguch，Clinical significances of superoxidedismutases：changes in aging，diabetes，ischemia，andcancer.Adv.Clin.Chem.Vol.29，p.1-59(1992).
【非专利文献2】长野哲雄，增野匡彦 自由基：用于活性氧研究的清除剂及其特性。FARUMASHIA Vol.27，p.231-233(1991).
【专利文献1】日本特表昭61-502821号公报
【专利文献2】日本特开2001-026536号公报
【专利文献3】日本特开2002-29992号公报
【专利文献4】日本特开2002-173441号公报
【专利文献5】日本特开2006-232767号公报
发明的揭示
本发明是为解决上述问题而施行的，其目的是提供一种具有以科学根据为基础的作用机制和高安全性且廉价能广泛利用的提高活性氧清除酶类活性的方法。
为解决上述课题，搜寻能诱导ROS清除酶类的酶量增加或酶活性增高的物质，通过DNA芯片的转录组学分析和代谢物分析的筛查方法进行物质搜寻与评价。
所谓DNA芯片是一种将DNA的部分阵列以高密度配置印记到被划分成数万到数十万格的玻片片基。利用DNA芯片可检验出所显现的遗传基因。把拟南芥和大鼠作为模式生物体，以任一被试物质培育或饲养模式生物体，再用反转录酶把从培育或饲养后的细胞中提取的mRNA转换成cDNA(靶；target)，经杂交即可全面查出模式生物细胞内所显现的遗传基因信息，也就是进行所谓的转录组学分析。接着，分离精制模式生物体内的ROS清除酶蛋白质，测定酶活性并直接验证从转录组学分析所取得的结果。
于含2％蔗糖的MS培养基成份中添加最终浓度为0～2％的一系列被试物质，用这些培养基培育拟南芥后，从拟南芥根部提取RNA并制成前述DNA芯片。此外，以玉米淀粉为主成份的对照饲料中添加最终浓度为0～10％作为一系列被试物质的糖醇，用这些饲料喂养SD大鼠后，从大鼠的肝细胞提取RNA并同样制成前述DNA芯片。用快速纯化工艺开拓系统AKT Aexplorer(FPLC)分离精制模式生物细胞内的ROS清除酶蛋白质。通过SOD检测试剂盒(SOD Assay Kit-WST)按照标准程序进行SOD活性测定。
DNA芯片的结果表明，从投予赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇，木糖醇之类糖醇的试样中，能得到显示诱导ROS清除酶的结果。特别又以投予赤藓糖醇的试样，能得到SOD被极显著诱导的结果。也就是说，这些赤藓糖醇等糖醇的ROS清除机制，不同于作为自由基清除剂让ROS无毒化为众所知的抗氧化物质，其是促进ROS清除酶活性。这些赤藓糖醇等糖醇，从促进ROS清除酶活性的作用效果来看，同于各种药材提取物，灵芝属蘑菇提取物和生育酚磷酸酯，但是，从诱导ROS清除酶本身并促进其活性的作用机制来看其等有所不同。所以可以说这些赤藓糖醇等糖醇发现了一个既往皆无新型的ROS清除机制。此外，通过代谢物分析，当使用这些赤藓糖醇等糖醇时，比对照组可检测到更高水平的ROS清除酶类，且实际上呈高值的ROS清除活性测定结果将对前述ROS清除酶的诱导做证实。在此，在专利文献1和专利文献2中记载了赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇，木糖醇本身捕集ROS消除ROS细胞损伤能力的意旨，但是对赤藓糖醇诱导ROS清除酶类，特别是SOD的数量增加或活性并无任何记载或启示。
本发明者门，依据这些结果表明赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇，木糖醇能诱导ROS清除酶类的酶量增加和酶活性增高，进而完成本发明。
也就是说，本发明提供一种诱导ROS清除酶类的酶量增加和酶活性增高的方法，其是将赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇，木糖醇中至少任何一种糖醇投于到拥有ROS清除酶的生物，例如人，非人动物，植物，诱导ROS清除酶类的酶量增加和酶活性增高。且，通过诱导ROS清除酶类的酶量增加和酶活性增高提供一种能补充预防及/或治疗起因于ROS的疾病的方法。且，通过诱导ROS清除酶类的酶量增加和酶活性增高提供一种具有抗氧化能力的动物或植物之类的生物体。这些物质作为ROS清除酶类的酶量增加促进剂，ROS清除酶类的酶活性促进剂之类的药剂成份是有效的。且这些物质可用于食品，饲料，肥料添加物，医药品的有效成份，医药品的补助成份，化妆品成份。
依据本发明，能高效率高效果诱导被认为与各种疾病有关ROS的一系列清除酶类的活性，所以可减低包括人类在内的生物疾病风险，作为简单且安全的预防法，治疗法或其等的补充法是有用的。且，依据本发明亦可提高如家畜，家禽的动物，稻麦等谷物，蔬菜和果树等草木植物之类的农林渔畜产物的抗氧化能力，进而提供SOD类食品或食品原材料。此外，本发明所使用的赤藓糖醇等糖醇作为药品剂和添加物是有效的。
实施发明的最佳方式
以下，详细加以说明适用于本发明的实施例，但是本发明的范围不限于这些实施例。
于本发明，把赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇，木糖醇之类的糖醇投予到生物体，摄取这些糖醇的生物体内将会造成ROS清除酶类特别是ROS清除酶的酶量增加或酶活性增高。在本发明的目的比方说，以诱导ROS清除酶类到能预防及/或治疗起因于ROS疾病的有效水平为特征的补充疾病的预防及/或治疗时，只要把赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇，木糖醇之类的糖醇添加到注射液，点滴液，涂抹药剂，贴药剂，还有日常用食品，食品原材料或饮料中即可。同样的当饲育家畜，家禽时，把这些糖醇添加到注射液，平常投喂饲料或喂水中即可，此外，当培育植物时，把这些糖醇添加到叶面涂抹剂，农药及日常浇水中即可。此时，添加到食品，食品原材料，饮料，饲料，喂水，浇洒水中的赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇，木糖醇的浓度最好是重量百分比0.01％以上，若重量百分比为0.05～10％时则更佳。当添加量的重量百分比未满0.01％时，则无法充分期待ROS清除酶的酶量增加或酶活性的增高效果。至于投予频率并没有特别的限制，与一般摄食，饮水，浇洒水的频度相同即可。
对把上述具有ROS清除酶的酶量增加或酶活性的增高效果的赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇，木糖醇添加到注射液，点滴液，涂抹药剂，胶囊药剂，颗粒药剂，丸剂，悬浮剂，乳剂，粉剂，片剂，糖浆，含片剂，贴药剂，叶面涂抹剂，农药，食品，食品原材料，饮料，饲料，喂水，浇洒水的调制方法并没有特别的限制，可举例如，直接单独溶解这些糖醇类，或溶解这些糖醇类与其他糖类或糖醇类所制填充剂，把固态物浸泡于该糖醇或糖醇剂水溶液中的方法，和赋形剂一起混练的方法。制成这些剂型，可用于经口服用，注射，涂抹，敷贴，亦可用于喷雾和浇洒水。
本发明把赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇，木糖醇用于食品或食品原材料，能诱导ROS清除酶的酶量增加或酶活性增高。因使用安全性已被保障的材料，所以从生物体，特别是人体安全性或环境保全性的观点来看非常优化。此外，预防治疗或补充起因于ROS疾病的本发明的方法是既往皆无独特且其生效的作用机制已被科学理论证实，还有只需微量即可显示效果是一个极优化的方法。依据本发明，能廉价广泛用来保持对ROS的抗性，且有益于增进人体健康，促进动植物的健全成长。并且可获得生育状态良好的动植物之类的各种生物。
实施例
接着，用实际施行的实施例对本发明做更进一步的具体说明。
(实施例1)
于含2％蔗糖的MS培养基成份中添加最终浓度为0～2％的一系列糖醇，用此培养基培育拟南芥，从拟南芥根部提取全RNA(Total RNA)，通过GeneFrontier公司的拟南芥RNA芯片(搭载基因数：30，480基因，每个基因有6个探针，探针长度是60mer)进行转录组学分析。结果表明，在赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇和木糖醇的添加组，作为ROS清除酶的SOD，其中特别又以赤藓糖醇组的Cu/Zn型SOD和SOD铜伴侣基因等有很多起上调(Up-regulate)。
(实施例2)
用由玉米淀粉552.5重量份，酪蛋白250重量份，矿质混合物35重量份，维生素混合物10重量份，重酒石酸胆碱2.5重量份，玉米油50重量份，粉状纤维素100重量份所组成的对照饲料，或以最终浓度为0～10％的一系列糖醇取代粉状纤维素的饲料来喂养SD大鼠30天之后，取出死后SD大鼠的肝脏，从肝细胞提取全RNA(Total RNA)，通过GeneFrontier公司的大鼠RNA芯片(搭载基因数：21，205基因，每个基因有9个探针，探针长度是60mer)进行转录组学分析。结果表明，在赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇和木糖醇的添加组，作为ROS清除酶的SOD，其中特别又以赤藓糖醇组的Cu/Zn型SOD和SOD铜伴侣基因等有很多起上调(Up-regulate)。
(实施例3)
捣碎以实施例1培育的拟南芥根部，冻结干燥水提取成份后，把提取物溶于1M磷酸钙缓冲液作为试料，通过日本同仁化学研究所的SOD检测试剂盒(SOD AssayKit-WST)按照标准程序进行SOD活性测定。结果表明，与对照组相比赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇和木糖醇的添加组观察到SOD活性增高。其中特别又以赤藓糖醇组的SOD增高到2至5倍。
(实施例4)
捣碎以实施例2喂养的大鼠肝脏，冻结干燥生理食盐水提取成份后，按照实施例3的方法进行SOD活性测定。结果表明，与对照组相比赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇和木糖醇的添加组观察到SOD活性增高。其中特别又以赤藓糖醇组的SOD增高到2倍左右。
产业上利用的可能性
于本发明是把赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇，木糖醇之类的糖醇投予到拥有ROS清除酶的生物，能诱导ROS清除酶的酶量增加或酶活性增高。通过ROS清除酶的酶量增加或酶活性增高，可以减低起因于ROS的疾病风险。赤藓糖醇，木蜜醇，山梨醇，木糖醇是可作为食品或食品原材料使用的安全物质，所以本发明拥有极高的安全性。此外，补充预防及/或治疗起因于ROS的疾病的本发明的方法不仅保障安全性，且是既往皆无独特且其生效的作用机制已被科学理论证实，还有只需微量即可显示效果是一个极优化的方法，能廉价广泛用来增进动物，植物，人体的健康或保持状态。因此，本发明可广泛用于食品，食品添加物，医药品，医药品添加物，化妆品，农药，农药添加物，饲料添加物，肥料的添加物。