叠氮胸苷治疗白血病的新用途.pdf

本发明公开叠氮胸苷治疗白血病的新用途，通过药效学实验表明叠氮胸苷具有抑制人白血病细胞Jukat及鼠白血病细胞L615生长的作用，而且可以抑制小鼠外周血、骨髓及肝脾组织的侵润，显著延长白血病小鼠的生存期，有效减低Friend鼠脾脏白血病病毒载量，对治疗Friend鼠白血病病毒诱发的急性红白血病有显著作用。

1、  叠氮胸苷在制备治疗白血病药物中的应用。

2、  如权利要求1所述的应用，其特征在于其中所述的治疗白血病是指抑制白血病细胞的生长。

3、  如权利要求2所述的应用，其特征在于其中所述的白血病细胞是指人白血病细胞Jukat及鼠白血病细胞L615。

4、  如权利要求1所述的应用，其特征在于其中所述治疗白血病是指抗白血病病毒。

叠氮胸苷治疗白血病的新用途
发明领域
本发明涉及一种叠氮胸苷的新用途，本发明特点涉及一种叠氮胸苷治疗白血病的新用途。
背景技术
白血病是造血组织的恶性疾病，又称“血癌”。其特点是骨髓及其他造血组织中有大量白血病细胞无限制地增生，并进入外周血液，而正常血细胞的制造被明显抑制。白血病是造血系统的恶性肿瘤，是我国最常见的恶性肿瘤之一。根据回顾调查，各地区白血病的发病率在各种肿瘤中占第六位，该病居年轻人恶性疾病中的首位。
叠氮胸苷(AZT)是一种核苷类逆转录酶抑制剂，在世界范围内已被广泛使用治疗艾滋病，它能有效清除艾滋病患者体内的病毒。但叠氮胸苷(AZT)用于治疗白血病的报道还不曾见到。
发明内容
本发明的目的在于公开叠氮胸苷用于治疗白血病的新用途。
药效实验表明，叠氮胸苷具有抑制人白血病细胞Jukat及鼠白血病细胞L615生长的作用；可以抑制小鼠L615白血病模型外周血、骨髓及肝脾组织的侵润，显著延长白血病小鼠的生存期；有效减低小鼠Friend病毒感染后脾脏中病毒载量，对治疗Friend鼠白血病病毒诱发的急性红白血病有显著作用。
附图说明：
图1：AZT对白血病细胞增值的影响；
图2：模型组的外周血涂片，瑞氏染色×1000；
图3：AZT组的外周血涂片，瑞氏染色×1000
图4：模型组的骨髓涂片，瑞氏染色×1000
图5：AZT组的骨髓涂片，瑞氏染色×1000
图6：模型组的肝组织切片，HE染色×1000
图7：AZT组的肝组织切片，HE染色×1000
图8：模型组的脾组织切片，HE染色×1000
图9：AZT组的脾组织切片，HE染色×1000
图10：MuLV感染28天后脾脏病毒mRNA表达凝胶电泳图；
本发明目的是通过如下实验例实现的：
实验例1叠氮胸苷抑制白血病细胞增值实验
1、实验材料
(1)药品与试剂
叠氮胸苷(AZT)；RPMI1640购于GIBICO；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司产品；二甲基亚砜(DMSO)：北京化学试剂公司；MTT购于SIGMA.。
(2)肿瘤细胞株
鼠白血病细胞L615及人白血病细胞Jukat。
(3)主要仪器
倒置显微镜：日本OLYMPAS公司产品。酶标仪：美国BIO-RAD公司550型。
2、MTT比色法检测细胞增殖抑制率
将处于对数生长期细胞配制成浓度为1～2×104个/ml的细胞悬液，按1000～2000个细胞/孔接种于96孔板，每孔加100μl。次日加含不同浓度化合物及相应溶剂对照的新鲜培养基，每孔加100μl(DMSO终浓度＜0.1％)，受试化合物设5～10个剂量组，以10mg/ml为最大终浓度依次向下5倍稀释(阳性药以5mg/ml为最大终浓度依次向下2倍稀释)，每组设5个平行孔，于37℃继续培养48h后，每孔加无血清培养基新鲜配制的0.5mg/ml MTT100μl，继续培养4h，然后，每孔加200μl DMSO溶解甲臜颗粒，用微型振荡器振荡混匀后，于酶标仪上测定光密度值(OD)(参考波长655nm，检测波长570nm)，以溶剂对照处理肿瘤细胞为对照组，数据处理以T/C表示，T/C％＝100×OD值处理组/OD值对照组，通过回归计算，可求出T/C＝50％的药物浓度，即IC50值，并按下述公式计算化合物对肿瘤细胞的抑制率：

3、统计分析
使用EXCEL统计学软件进行分析，进行多组t检验，P＜0.05时，具有统计学意义。
4、结果
结果如附图1所示，不同浓度AZT对人白血病细胞Jukat及鼠白血病细胞L615的生长抑制作用呈剂量依赖性，实验组与对照组进行比较，差异具有显著性(P＜0.01)。通过直线回归计算，IC50值为2.924mg/ml、0.028mg/ml。由此说明AZT可以明显抑制白血病细胞的生长。
实验例2叠氮胸苷对小鼠L615白血病细胞生长的抑制实验
1、实验材料
(1)药品及试剂：克度(AZT，齐多夫定片)，东北制药总厂产品，购自中国医药保健品进出口总公司；环磷酰胺(CTX，上海华联制药有限公司生产；RPMI1640培养基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青)，瑞氏染液。
(2)实验仪器及器械：CO₂培养箱，倒置显微镜，光学显微镜，celltacMEK-6318K血细胞分析仪。
(3)细胞株：L615白血病细胞株由中国医学科学院天津血液病研究所病理细胞库提供。
(4)动物：615近交系小鼠36只，SPF级，8~10周龄，体重25～28g，雄性，由中国医学科学院血液研究所提供。
2、实验方法
(1)细胞培养：L615白血病细胞株在含10％胎牛血清的RPMI-1640中，于37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞进行造模。
(2)小鼠模型的建立及给药：将小鼠随机分为3组，每组12只，即模型对照组、AZT组和CTX组。取对数生长期L615细胞，调整细胞终浓度为1.0×10⁶/ml，给小鼠腹腔接种L615细胞0.2ml/只，造成L615白血病模型^[2]。接种细胞后第3d开始给药，每日1次，连续5天，模型组以生理盐水灌胃，0.4ml/d；AZT组以AZT 90mg/kg^-1·d^-1灌胃；CTX组腹腔注射环磷酰胺200mg/kg^-1·d^-1。以上各组动物每组取6只于接种后第7d(给药第5d)处死，余下动物进行生存期观察。
(3)观测指标：①一般情况：观察小鼠精神、食欲、毛色及体重变化；②生存期观察：生命延长率用公式(治疗组平均生存天数/模型组平均生存天数-1)×100％得出；③外周血血常规分析及细胞涂片；④骨髓涂片及骨髓白细胞分类；⑤肝脾脏器指数计算及病理学检查：肝(脾)指数＝肝(脾)质量/体质量×100％
(4)统计学处理：实验结果以χ±s表示。用单因素方差分析进行统计处理，分析组与组之间的差异。以P＜0.05作为差异显著性标准，以P＜0.01作为差异极显著性标准。
3、实验结果
(1)一般情况：接种L615细胞的小鼠发病后均出现精神状态差、食欲下降，活动减少以及毛皮光泽度降低，体重不增或下降。
(2)生存时间：AZT组和CTX组与模型组相比，生存时间显著延长(P＜0.01)，其延长时间及生命延长率见表1。
表1各组小鼠生存时间比较(χ±s)

与模型组比较**P＜0.01
(3)外周血血常规分析及细胞涂片：接种细胞的小鼠都于3~4d后发病，血涂片找到L615细胞即证实小鼠发病。各组小鼠在病程早、中期血小板数量逐渐升高，进入白血病晚期随之下降，模型组下降更为显著；与模型组相比，AZT能明显降低患病小鼠的WBC及RBC数，差异具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)；与CTX组相比，AZT对正常血细胞的破坏性较小(见表2)。镜下可观察到AZT和CTX组的白血病细胞出现核固缩、碎裂、溶解等细胞坏死的征象(附图2，附图3)，CTX组细胞坏死的尤为明显，甚至部分正常血细胞也发生坏死。
表2小鼠外周血WBC、PLT计数(×109/L)及RBC计数(×1012/L)比较(χ±s)

与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；同组间与给药前比较，θP＜0.05，θθP＜0.01
(4)骨髓涂片：镜下可见L615细胞侵润骨髓，低倍镜下明显可见AZT和CTX组小鼠骨髓内L615细胞要少于模型组，高倍镜下可观察到同外周血较为一致的L615细胞破坏的迹象，细胞核表现为固缩，碎裂，部分细胞核出现溶解的现象(图4，图5)。
(5)肝脾指数计算及病理学检查：小鼠发病后肝脾明显肿大，AZT和CTX组小鼠肝脾肿大不如模型组，指数也明显低于模型组，与模型组相比具有统计学差异(P＜0.01)(表3)。肝脾病理切片可看出AZT和CTX组中L615细胞的浸润程度明显轻于模型组小鼠，AZT和CTX组中能见到肝脏中有未被破坏的肝脏动静脉、门静脉、肝管以及脾脏中的小梁，较为清晰明显的脾脏白髓质分界，肝脏血管周围的白血病细胞较少。而模型组小鼠的肝脾正常结构被破坏，整个肝脏脾脏中绝大部分可见白血病细胞浸润，肝脏血管周围完全被白血病细胞包围(图6-9)。
表3各组小鼠肝脾指数比较(χ±s)(n＝12)

与模型组比较**P＜0.01
实验例3叠氮胸苷对Friend鼠白血病病毒的影响实验
1、实验材料
(1)病毒株
Friend鼠白血病病毒(Fr.MuLV)购自ATCC，在BALB/c小鼠体内传代，-70℃保存。
(2)动物
BALB/c小鼠，SPF级，雌雄各半，体重(18±1)g。
(3)药物
叠氮胸苷(AZT)，东北制药总厂产品，购自中国医药保健品进出口总公司。
2、实验方法
(1)小鼠模型的建立及给药
将感染Fr.MuLV的发病小鼠的脾脏无菌取出，研磨，用DMEM制成质量体积比为1∶10的悬液，4℃2.0×103r·min^-1离心10min，取其上清腹腔感染小鼠。感染后2h，AZT以90mg·kg^-1·d^-1的剂量灌胃给药，正常对照组、模型对照组以生理盐水灌胃，每日1次，连续28d。
(2)脾脏病毒载量的测定
用TRIzol试剂提取脾细胞中病毒RNA，参照试剂盒说明进行逆转录反应，制备cDNA，反应总体积为20μl，反应在42℃孵育60min，95℃5min终止反应。参照试剂盒说明进行PCR反应，反应体系总体积为25μl，PCR反应循环参数设置为：变性温度94℃，30s；退火温度55℃，30s；延伸温度72℃，1min。共30个循环，72℃保温5min。PCR产物的定量采用琼脂糖凝胶电泳，Alpha Innotech Corporation凝胶成像仪记录图像并分析。
(3)外周血血常规分析
白细胞(WBC)、血红蛋白(Hbg)、血小板(PLT)计数。
(4)白血病类型的诊断
外周血及骨髓涂片，瑞氏-姬姆萨染色，镜检计数有核细胞并观察细胞形态。
3、实验结果计算与统计分析
以各样本Fr.MuLV/β-actin的值作为Fr.MuLV相对病毒载量进行统计。实验结果以χ±s表示。用单因素方差分析，继以Dunnet双侧检验进行统计处理，分析组与组之间的差异。以P＜0.05作为差异显著性标准，以P＜0.01作为差异极显著性标准。
4、实验结果
(1)外周血涂片及骨髓涂片支持Fr.MuLV诱发急性红白血病的诊断
小鼠外周血涂片有核红细胞约占0.60(0.56～0.67)，其中以早幼和中幼红细胞为主，少数为原始细胞和晚幼红细胞，并可见病理性核分裂。骨髓检查：骨髓增生明显活跃，粒系、红系均增生；NEC≥0.30(0.33～0.75)，原始粒细胞多为圆形，形态较规则，染色质细致，核仁明显，胞质量较少，着色深浅不一，无颗粒；早幼粒细胞多不规则，核畸形、褶叠，浆呈蓝色或紫红色，可见嗜天青颗粒，粒系核浆发育不平衡，可见核分叶过多现象，以中、晚幼红细胞为主；有核红细胞≥0.50(0.54～0.82)，红系可见双核、多核及芽状核细胞，以中、晚幼红细胞为主。符合急性红白血病的诊断标准。
(2)AZT降低脾脏病毒载量
结果显示，模型组脾脏病毒载量较高，条带较亮；AZT组病毒载量明显减弱；而正常对照组未检出病毒RNA(附图10：1：marker；2：正常对照组；3：模型对照组；4：AZT治疗组)。定量分析结果见表4。
表4Fr.MuLV感染28天后脾脏病毒载量的比较

与模型对照组比较^**P＜0.01
(3)AZT降低外周血白细胞和血红蛋白
表5显示，模型组外周血WBC及Hbg明显升高，与正常对照组相比差异有显著性(P＜0.01)，PLT略有升高(无统计学意义)；与模型组相比，AZT能明显降低患病小鼠的WBC及Hbg(P＜0.01)，基本恢复至正常水平。
表5 Fr.MuLV感染后各组WBC、Hbg和PLT计量

与正常对照组比较^##P＜0.01，与模型对照组比较^**P＜0.01
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
具体实施方式
实施例1：片剂
取叠氮胸苷，加入常规辅料，按照常规工艺制备成片剂，用于治疗白血病。
实施例2：胶囊剂
取叠氮胸苷，加入常规辅料，按照常规工艺制备成胶囊剂，用于抑制白血病细胞的生长。
实施例3：注射剂
取叠氮胸苷，加入常规辅料，按照常规工艺制备成注射剂，用于抑制人白血病细胞Jukat及鼠白血病细胞L615的生长。
实施例4：滴丸
取叠氮胸苷，加入常规辅料，按照常规工艺制备成滴丸，用于抗白血病病毒。
实施例5：缓释剂
取叠氮胸苷，加入常规辅料，按照常规工艺制备成缓释剂，用于治疗白血病。