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免疫抑制性多肽与核酸.pdf

上传人：111****112 文档编号：522963 上传时间：2018-02-20 格式：PDF 页数：413 大小：4.08MB
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摘要
申请专利号：

CN200880114532.0

 申请日：

2008.10.15
公开号：

CN101998965A

 公开日：

2011.03.30
当前法律状态：

授权

 有效性：

有权
法律详情：

授权|||专利申请权的转移IPC(主分类):C07K 14/725变更事项:申请人变更前权利人:珀西德治疗有限责任公司变更后权利人:安斯泰来制药有限公司变更事项:地址变更前权利人:美国加利福尼亚州变更后权利人:日本东京都登记生效日:20130916|||实质审查的生效IPC(主分类):C07K 14/725申请日:20081015|||公开
IPC分类号：

C07K14/725; C07K19/00; C12N15/12; C12N15/63; A61K38/17; A61P37/00; C12N15/62; C12N15/79; C12N15/85; C12N5/10; A61K35/12; C12P21/02

 主分类号：

C07K14/725
申请人：

珀西德治疗有限责任公司
发明人：

埃里克·E·卡勒; 马登·M·佩邓加特; 史蒂文·H·巴斯; 玛格丽特·奈格伯斯; 约哈·庞诺南; 史蒂文·J·查平; 斯里达·维斯瓦纳撒恩; 布伦特·R·拉森
地址：

美国加利福尼亚州
优先权：

2007.11.01 US 60/984,631; 2008.05.07 US 61/051,215
专利代理机构：

北京市柳沈律师事务所 11105

 代理人：

岑晓东
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内容摘要

本发明提供了免疫抑制性多肽以及对此类多肽进行编码的核酸。在一个方面，本发明提供了突变CTLA-4多肽以及对突变CTLA-4多肽进行编码的核酸。还提供了组合物以及使用此类多肽连同核酸的方法。

权利要求书

1： 一种分离或重组的 CTLA-4 多肽， 该多肽包括与在 SEQ ID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 细胞外结构域的多肽序列具有达到 15 个氨基酸残基差异的一个多肽序列， 其中该 分离或重组的 CTLA-4 多肽具有结合 CD80 或 CD86 或二者之一的一个细胞外结构域的能力， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。
2： 根据权利要求 1 所述的一种分离或重组的多肽， 该多肽具有与 SEQID NO ： 36 的多肽 序列至少 90％的序列一致性。
3： 根据权利要求 2 所述的一种分离或重组的多肽， 该多肽具有与 SEQID NO ： 36 的多肽 序列至少 95％的序列一致性。
4： 根据权利要求 3 所述的一种分离或重组的多肽， 该多肽包括 SEQID NO ： 36 的多肽序 列。
5： 根据权利要求 1 所述的一种分离或重组的多肽， 该多肽具有与 SEQID NO ： 50 的多肽 序列至少 90％的序列一致性。
6： 根据权利要求 5 所述的一种分离或重组的多肽， 该多肽具有与 SEQID NO ： 50 的多肽 序列至少 95％的序列一致性。
7： 根据权利要求 6 所述的一种分离或重组的多肽， 该多肽包括 SEQID NO ： 50 的多肽序 列。
8： 如以上权利要求中任一项所述的多肽， 其中 CD80 是人类 CD80 并且 CD86 是人类 CD86。
9： 如以上权利要求中任一项所述的多肽， 其中该多肽包括长度为 124 个氨基酸残基的 一个多肽序列。
10： 如以上权利要求中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个氨基酸取代， 该取代在选自 下组的一个氨基酸位置上， 该组的构成为 ： 对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的多个氨基酸位置。
11： 如以上权利要求中任一项所述的多肽， 该多肽包括两个氨基酸取代， 这些取代在选 自下组的多个氨基酸位置上， 该组的构成为 ： 对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的多个氨基酸位置。
12： 如以上权利要求中任一项所述的多肽， 该多肽包括三个氨基酸取代， 这些取代在选 自下组的多个氨基酸位置上， 该组的构成为 ： 对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的多个氨基酸位置。
13： 如以上权利要求中任一项所述的多肽， 该多肽包括四个氨基酸取代， 这些取代在选 自下组的多个氨基酸位置上， 该组的构成为 ： 对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的多个氨基酸位置。
14： 如权利要求 10 至 13 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 70 上的氨基酸取代。
15： 根据如权利要求 14 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 70 上的氨 基酸取代是 S70F。
16： 如权利要求 10 至 15 中任一项所述的多肽， 该多肽进一步包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 104 上的氨基酸取代。
17： 如权利要求 16 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 104 上的氨基酸 2 取代是 L104E。
18： 如权利要求 10 至 17 中任一项所述的多肽， 该多肽进一步包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 30 上的氨基酸取代。
19： 如权利要求 18 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 30 上的取代是 T30N/D/A。
20： 如权利要求 19 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 30 上的取代是 T30N。
21： 如权利要求 10 至 20 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 64 上的氨基酸取代。
22： 如权利要求 21 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 64 上的氨基酸 取代是 S64P。
23： 如权利要求 10 至 22 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 50 上的氨基酸取代。
24： 如权利要求 23 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 50 上的氨基酸 取代是 A50M。
25： 如权利要求 10 至 24 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 54 上的氨基酸取代。
26： 根据如权利要求 25 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 54 上的氨 基酸取代是 M54K/V。
27： 如权利要求 26 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 54 上的氨基酸 取代是 M54K。
28： 如权利要求 10 至 17 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 65 上的氨基酸取代。
29： 如权利要求 28 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 65 上的氨基酸 取代是 I65S。
30： 如权利要求 10 至 17 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 56 上的氨基酸取代。
31： 如权利要求 30 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 56 上的氨基酸 取代是 N56D。
32： 如权利要求 10 至 17 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 55 上的氨基酸取代。
33： 如权利要求 32 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 55 上的氨基酸 取代是 G55E。
34： 如权利要求 10 至 17 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 85 上的氨基酸取代。
35： 如权利要求 34 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 55 上的氨基酸 取代是 M85A。
36： 如权利要求 10 至 17 中任一项所述的多肽， 该多肽进一步包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 24 上的氨基酸取代。 3
37： 如权利要求 36 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 24 上的氨基酸 取代是 A24E/S。
38： 如权利要求 37 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 24 上的氨基酸 取代是 A24E。
39： 如以上权利要求中任一项所述的多肽， 其中该多肽具有对于 CD86 或它的一个细胞 外结构域的一种结合亲和力， 该结合亲和力是大约等于或大于一种单体人类 CTLA-4 细胞 外结构域对于 CD86 或 CD86 细胞外结构域的结合亲和力。
40： 如以上权利要求中任一项所述的多肽， 其中该多肽具有对于 CD80 或它的一个细胞 外结构域的一种结合亲和力， 该结合亲和力大于一种单体人类 CTLA-4 细胞外结构域对于 CD80 或 CD80 细胞外结构域的结合亲和力。
41： 如以上权利要求中任一项所述的多肽， 其中该多肽具有阻抑一种免疫应答的能力。
42： 如以上权利要求中任一项所述的多肽， 其中该多肽具有抑制 T 细胞活化或 T 细胞增 殖的能力。
43： 一种分离或重组的多肽多聚体， 该多肽多聚体包括至少两个如以上权利要求中任 一项所述的多肽。
44： 一种分离或重组的融合蛋白， 该融合蛋白包括 (a) 如权利要求 1 至 42 中任一项所 述的一种多肽， 以及 (b) 一种第二多肽， 其中该第二多肽是一种 Ig Fc 多肽， 并且其中该融 合蛋白具有结合 CD80 和 / 或 CD86、 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域的能力， 和/ 或调整或调节一种免疫应答的能力。
45： 一种分离或重组的二聚体融合蛋白， 该二聚体融合蛋白包括两个根据权利要求 44 所述的单体融合蛋白。
46： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个核苷酸序列， 该核苷酸序列编码了如权利 要求 1 至 42 中任一项所述的一种多肽、 权利要求 43 所述的一种多聚体、 权利要求 44 所述 的一种融合蛋白、 或权利要求 45 所述的一种二聚体融合蛋白。
47： 一种载体， 该载体包括如权利要求 46 所述的一种核酸。
48： 一种分离或重组的宿主细胞， 该宿主细胞包括 ： (a) 如权利要求 1 至 42 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 43 所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 44 所述的一种融合蛋白 ； (d) 如权利要求 45 所述的一种二聚体融合蛋白 ； (e) 如权利要求 46 所述的一种核酸 ； 和 / 或。 (f) 如权利要求 47 所述的一种载体。
49： 一种药物组合物， 该药物组合物包括一种药学上可接受的赋形剂或药学上可接受 的载体、 以及以下的一项或多项 ： (a) 如权利要求 1 至 42 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 43 所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 44 所述的一种融合蛋白 ； (d) 如权利要求 45 所述的一种二聚体融合蛋白 ； (e) 如权利要求 46 所述的一种核酸 ； 4 (f) 如权利要求 47 所述的一种载体 ； 和 / 或。 (g) 如权利要求 48 所述的一种宿主细胞。
50： 用于阻抑一种免疫应答的一种方法， 所述方法包括将一种 B7- 阳性细胞与一个有 效量的以下的至少一项进行接触 ： (a) 如权利要求 1 至 42 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 43 所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 44 所述的一种融合蛋白 ； (d) 如权利要求 45 所述的一种二聚体融合蛋白 ； (e) 如权利要求 46 所述的一种核酸 ； (f) 如权利要求 47 所述的一种载体 ； 和 / 或。 (g) 如权利要求 48 所述的一种宿主细胞 以阻抑一种免疫应答， 其中一种免疫应答由此受到阻抑。
51： 如权利要求 1 至 42 中任一项所述的一种多肽、 权利要求 43 所述的一种多聚体、 权 利要求 44 所述的一种融合蛋白、 权利要求 45 所述的一种二聚体融合蛋白、 权利要求 46 所 述的一种核酸、 权利要求 47 所述的一种载体、 和 / 或权利要求 48 所述的一种宿主细胞， 用 于阻抑一种免疫应答。
52： 如权利要求 1 至 42 中任一项所述的一种多肽、 权利要求 43 所述的一种多聚体、 权 利要求 44 所述的一种融合蛋白、 权利要求 45 所述的一种二聚体融合蛋白、 权利要求 46 所 述的一种核酸、 权利要求 47 所述的一种载体、 和 / 或权利要求 48 所述的一种宿主细胞， 在 制造用于阻抑一种免疫应答的药物中的用途。
53： 一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的 至少一种多肽序列至少 95％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该多 肽结合 CD80 或 CD86 或二者之一的一个细胞外结构域， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应 答的能力。
54： 如权利要求 53 所述的多肽， 其中 CD80 是人类 CD80 并且 CD86 是人类 CD86。
55： 如权利要求 53 至 54 中任一项所述的多肽， 其中该多肽具有阻抑或抑制一种免疫应 答的能力。
56： 如权利要求 53 至 55 中任一项所述的多肽， 其中该多肽具有抑制 T 细胞活化的能 力。
57： 如权利要求 53 至 55 中任一项所述的多肽， 其中该多肽具有抑制 T 细胞增殖的能 力。
58： 如权利要求 53 至 57 中任一项所述的多肽， 其中该多肽与 CTLA-4 相比具有阻抑或 抑制一种免疫应答的更大的能力。
59： 如权利要求 53 所述的多肽， 其中该多肽具有抑制 T 细胞活化或 T 细胞增殖的一种 能力， 该能力大于人类 CTLA-4 抑制 T 细胞活化或 T 细胞增殖的能力。
60： 如权利要求 53 所述的多肽， 其中该多肽具有抑制 T 细胞活化或 T 细胞增殖的能力， 该能力大于人类 CTLA-4 的一种细胞外结构域对 T 细胞活化或 T 细胞增殖进行抑制的能力。
61： 如权利要求 53 至 57 中任一项所述的多肽， 其中该多肽具有抑制一种免疫应答的一 种能力， 该能力大于包括了在 SEQ ID NO ： 168 中所示的多肽序列的一种 LEA29Y 多肽抑制一 5 种免疫应答的能力。
62： 如权利要求 53 至 61 中任一项所述的多肽， 其中该多肽包括一个多肽序列， 该多肽 序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少 96％、 97％、 98％、 或 99％的序列一致性， 该 组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73。
63： 如权利要求 53 至 62 中任一项所述的多肽， 其中该多肽包括选自下组的一个多肽序 列， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73。
64： 一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的 至少一种多肽序列至少 95％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该多 肽结合一个单体人类 CD80 或单体人类 CD86 或二者之一的一个细胞外结构域。
65： 如权利要求 64 所述的多肽， 其中该多肽具有对于单体人类 CD86 的一种结合亲和 力， 该结合亲和力是大约等于或大于单体人类 CTLA-4 对于单体人类 CD86 的结合亲和力。
66： 如权利要求 64 所述的多肽， 其中该多肽具有对于单体人类 CD86 的一种结合亲和 力， 该结合亲和力是大约等于或大于单体人类 CTLA-4 对于单体人类 CD86 的结合亲和力。
67： 如权利要求 65 所述的多肽， 其中该多肽具有对于单体人类 CD86 的一种结合亲和 力， 该结合亲和力是大约等于或大于单体人类 CTLA-4 对于单体人类 CD86 的结合亲和力。
68： 如权利要求 64 至 67 中任一项所述的多肽， 其中该多肽与单体人类 CTLA-4 相比具 有阻抑一种免疫应答的更大的能力、 抑制 T 细胞活化的更大的能力、 和 / 或抑制 T 细胞增殖 的更大的能力。
69： 一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的 至少一种多肽序列至少 95％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该多 肽具有对于一个人类 CD86 细胞外结构域或人类 CD80 细胞外结构域的一种结合亲和力， 该 结合亲和力对应地是大约等于或大于一种人类 CTLA-4 细胞外结构域对于该人类 CD86 细胞 外结构域或人类 CD80 细胞外结构域的结合亲和力， 并且其中该多肽可任选地具有阻抑一 种免疫应答的能力。
70： 如权利要求 69 所述的多肽， 其中该多肽具有对于该人类 CD86 细胞外结构域的一种 结合亲和力， 该结合亲和力大于该人类 CTLA-4 细胞外结构域对于该人类 CD86 细胞外结构 域的结合亲和力。
71： 如权利要求 70 所述的多肽， 其中该多肽具有对于该人类 CD80 细胞外结构域的一种 结合亲和力， 该结合亲和力大于该人类 CTLA-4 细胞外结构域对于该人类 CD80 细胞外结构 域的结合亲和力。
72： 如权利要求 69 至 71 中任一项所述的多肽， 其中该多肽与该人类 CTLA-4 细胞外结 构域相比具有阻抑一种免疫应答的更大的能力、 抑制 T 细胞活化的更大的能力、 和 / 或抑制 T 细胞增殖的更大的能力。
73： 如权利要求 53 所述的多肽， 其中该突变多肽包括长度为 124 个氨基酸残基的一个 多肽序列。
74： 一种分离或重组的突变 CTLA-4 多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 细胞外结构域的多肽序列具有不超过 11 个、 不超过 10 个、 不超过 9 个、 不超过 8 个、 不超过 7 个、 或不超过 6 个氨基酸残基的差 异， 并且 6 (b) 包括至少一个氨基酸取代， 该取代是在对应于相对 SEQ IDNO ： 159 的位置 24、 30、 32、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的一个氨基酸残基位置上， 其中该突变 CTLA-4 多肽具有结合 CD80 或 CD86 或二者之一的一个细胞外结构域的能 力， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。
75： 如权利要求 74 所述的多肽， 其中 CD80 是人类 CD80 并且 CD86 是人类 CD86。
76： 如权利要求 74 所述的多肽， 其中该突变多肽包括长度为 124 个氨基酸残基的一个 多肽序列。
77： 如权利要求 74 所述的多肽， 该多肽包括两个氨基酸取代， 这些取代是在选自下组 的多个氨基酸位置上， 该组的构成为 ： 对应于相对 SEQ IDNO ： 159 的位置 24、 30、 32、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 85、 或 104 的多个氨基酸位置。
78： 如权利要求 74 所述的多肽， 该多肽包括三个氨基酸取代， 这些取代是在选自下组 的多个氨基酸位置上， 该组的构成为 ： 对应于相对 SEQ IDNO ： 159 的位置 24、 30、 32、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 85、 或 104 的多个氨基酸位置。
79： 如权利要求 74 所述的多肽， 该多肽包括四个氨基酸取代， 这些取代是在选自下组 的多个氨基酸位置上， 该组的构成为 ： 对应于相对 SEQ IDNO ： 159 的位置 24、 30、 32、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 85、 或 104 的多个氨基酸位置。
80： 如权利要求 74 所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ IDNO ： 159 的位置 70 上的 氨基酸取代。
81： 如权利要求 80 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 70 上的氨基酸 取代是 S70F。
82： 如权利要求 74 至 81 中任一项所述的多肽， 该多肽进一步包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 104 上的氨基酸取代。
83： 如权利要求 82 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 104 上的氨基酸 取代是 L104E。
84： 如权利要求 74 至 83 中任一项所述的多肽， 该多肽进一步包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 30 上的氨基酸取代。
85： 如权利要求 84 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 30 上的取代是 T30N/D/A。
86： 如权利要求 85 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 30 上的取代是 T30N。
87： 如权利要求 74 至 86 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 64 上的氨基酸取代。
88： 如权利要求 87 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 64 上的氨基酸 取代是 S64P。
89： 如权利要求 74 至 88 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 50 上的氨基酸取代。
90： 如权利要求 89 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 50 上的氨基酸 取代是 A50M。
91： 如权利要求 74 至 83 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 7 的位置 54 上的氨基酸取代。
92： 如权利要求 91 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 54 上的氨基酸 取代是 M54K/V。
93： 如权利要求 92 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 54 上的氨基酸 取代是 M54K。
94： 如权利要求 74 至 83 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 65 上的氨基酸取代。
95： 如权利要求 94 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 65 上的氨基酸 取代是 I65S。
96： 如权利要求 74 至 83 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 56 上的氨基酸取代。
97： 如权利要求 96 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 56 上的氨基酸 取代是 N56D。
98： 如权利要求 74 至 83 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 55 上的氨基酸取代。
99： 如权利要求 98 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 55 上的氨基酸 取代是 G55E。
100： 如权利要求 74 至 83 中任一项所述的多肽， 该多肽包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 85 上的氨基酸取代。
101： 如权利要求 100 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 55 上的氨基 酸取代是 M85A。
102： 如权利要求 74 至 83 中任一项所述的多肽， 该多肽进一步包括一个在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 24 上的氨基酸取代。
103： 如权利要求 102 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 24 上的氨基 酸取代是 A24E/S。
104： 如权利要求 103 所述的多肽， 其中该在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 24 上的氨基 酸取代是 A24E。
105： 如权利要求 74 至 104 中任一项所述的多肽， 其中该多肽具有对于 CD86 或它的一 个细胞外结构域的一种结合亲和力， 该结合亲和力是大约等于或大于一种单体人类 CTLA-4 细胞外结构域对于 CD86 或 CD86 细胞外结构域的结合亲和力。
106： 如权利要求 74 至 105 中任一项所述的多肽， 其中该多肽具有对于 CD80 或它的一 个细胞外结构域的一种结合亲和力， 该结合亲和力大于一种单体人类 CTLA-4 细胞外结构 域对于 CD80 或 CD80 细胞外结构域的结合亲和力。
107： 如权利要求 74 至 106 中任一项所述的多肽， 其中该多肽具有阻抑一种免疫应答的 能力。
108： 如权利要求 74 至 107 中任一项所述的多肽， 其中该多肽具有抑制 T 细胞活化或 T 细胞增殖的能力。
109： 一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列包括 ： (i) 与由 SEQ ID NOS ： 1 至 73 所构成的组中选出的一个多肽序列至少 95％的序列一致性， 以及 (ii) 8 一个苯丙胺酸残基， 该苯丙胺酸残基在对应于由 SEQ ID NOS ： 1 至 73 所构成的组中选出的 所述多肽序列的位置 70 的氨基酸位置上， 其中该多肽具有结合 CD80 和 / 或 CD86、 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域的能 力， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。
110： 如权利要求 109 所述的多肽， 其中该多肽包括以下的一项或多项 ： 在对应于位置 24 的一个氨基酸位置上的一个谷氨酸残基 ； 在对应于对应位置 30 的一个氨基酸位置上的一个天冬酰胺残基 ； 在对应于位置 32 的一个氨基酸位置上的一个异亮氨酸残基 ； 在对应于位置 50 的一个氨基酸位置上的一个甲硫氨酸残基 ； 在对应于位置 54 的一个氨基酸位置上的一个赖氨酸残基 ； 在对应于位置 55 的一个氨基酸位置上的一个谷氨酸残基 ； 在对应于位置 56 的一个氨基酸位置上的一个天冬氨酸残基 ； 在对应于位置 64 的一个氨基酸位置上的一个脯氨酸残基 ； 在对应于位置 65 的一个氨基酸位置上的一个丝氨酸残基 ； 以及 在对应于位置 104 的一个氨基酸位置上的一个谷氨酸残基 ；
111： 一种分离或重组的突变 CTLA-4 多肽， 该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者 之一的或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或可阻抑一种免疫应答， 所述多肽包括一个多肽 序列， 该多肽序列 ： (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 细胞外结构域多肽的多肽序列具有不 超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且 (b) 包括至少一个氨基酸取代， 其中所述至少一个氨基酸取代包括 S70F， 其中根据 SEQ ID NO ： 159 对多个氨基酸残基位置进行编号。
112： 如权利要求 111 所述的多肽， 该多肽进一步包括至少一个氨基酸取代， 该氨基酸 取代选自下组， 其构成为 ： A24E、 T30N、 V32I、 D41G、 A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 M85A、 L104E、 以及 I106F。
113： 一种分离或重组的多肽， 该多肽包括选自下组的一个多肽序列， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 79， 或任何所述多肽序列的一个片段， 其中所述片段结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答 的能力。
114： 如权利要求 113 所述的多肽， 其中该片段结合人类 CD80 以及人类 CD86 和 / 或它 们对应的细胞外结构域。
115： 如权利要求 53 至 114 中任一项所述的多肽， 其中该多肽是一种可溶性多肽。
116： 一种分离或重组的蛋白， 该蛋白包括 ： (a) 如权利要求 53 至 115 中任一项所述的一种多肽， 以及 (b) 协助该多肽的分泌的一种肽。
117： 如权利要求 116 所述的蛋白， 其中该肽是一种信号肽。
118： 如权利要求 117 所述的蛋白， 其中该信号肽包括一种氨基酸序列， 该氨基酸序列 具有与 SEQ ID NO ： 182 或 SEQ ID NO ： 216 的氨基酸序列至少 95％的序列一致性。
119： 如权利要求 118 所述的蛋白， 其中该信号肽包括 SEQ ID NO ： 182 或 SEQ ID NO ： 9 216 的氨基酸序列。
120： 一种分离或重组的蛋白， 该蛋白包括如权利要求 53 至 115 中任一项所述的一种多 肽， 以及一个跨膜结构域。
121： 如权利要求 120 所述的蛋白， 其中该跨膜结构域包括一个氨基酸序列， 该氨基酸 序列与包括 SEQ ID NO ： 160 的氨基酸残基 162 至 182 的一个氨基酸序列具有至少 95％的 一致性。
122： 如权利要求 121 所述的蛋白， 其中该跨膜结构域包括 SEQ IDNO ： 160 的氨基酸残 基 162 至 182。
123： 如权利要求 120 所述的蛋白， 该蛋白进一步包括一个胞质域。
124： 如权利要求 122 所述的蛋白， 其中该胞质域包括一个氨基酸序列， 该氨基酸序列 与包括 SEQ ID NO ： 160 的氨基酸残基 183 至 223 的一个氨基酸序列具有至少 95％的一致 性。
125： 如权利要求 124 所述的蛋白， 其中该胞质域包括一个氨基酸序列， 该氨基酸序列 包括 SEQ ID NO ： 160 的氨基酸残基 183 至 223。
126： 如权利要求 120 至 125 中任一项所述的蛋白， 该蛋白进一步包括一种信号肽。
127： 如权利要求 53 至 115 中任一项所述的多肽或如权利要求 116 至 126 中任一项所 述的蛋白， 其中该多肽的氨基酸残基中的一个或多个被糖基化。
128： 如权利要求 53 至 115 或 127 中任一项所述的多肽或如权利要求 116 至 127 中任 一项所述的蛋白， 其中该多肽的氨基酸残基中的一个或多个被聚乙二醇化。
129： 一种分离或重组的多肽多聚体， 该多肽多聚体包括至少两个如权利要求 53 至 115 中任一项所述的多肽或至少两个权利要求 116 至 128 中任一项所述的蛋白。
130： 如权利要求 129 所述的多聚体， 其中该至少两个多肽中的所有都是相同的。
131： 如权利要求 129 所述的多聚体， 其中该多聚体是可阻抑或抑制一种免疫应答的。
132： 如权利要求 129 所述的多聚体， 其中该多聚体是可抑制 T 细胞活化或 T 细胞增殖 的。
133： 如权利要求 129 所述的多聚体， 其中该多聚体包括四个多肽。
134： 一种分离或重组的多肽二聚体， 该二聚体包括两个如权利要求 53 至 115 中任一项 所述的多肽。
135： 如权利要求 134 所述的二聚体， 其中该二聚体是一种同型二聚体。
136： 如权利要求 134 所述的二聚体， 其中该二聚体是一种异型二聚体。
137： 如权利要求 134 所述的二聚体， 其中该二聚体是可阻抑或抑制一种免疫应答的。
138： 如权利要求 134 所述的二聚体， 其中该二聚体是可抑制 T 细胞活化或 T 细胞增殖 的。
139： 一种分离或重组的多肽二聚体， 该多肽二聚体包括两个如权利要求 53 至 115 中任 一项所述的多肽， 其中该二聚体具有对于人类 CD86 或它的一个细胞外结构域的一种结合 亲合力， 该结合亲合力对应地是大约等于或大于包括两个人类 CTLA-4 细胞外结构域的一 个二聚体对于人类 CD86 或它的一个细胞外结构域的结合亲合力。
140： 一种分离或重组的多肽二聚体， 该多肽二聚体包括两个如权利要求 53 至 115 中任 一项所述的多肽， 其中该二聚体具有对于人类 CD80 或它的一个细胞外结构域的一种结合 10 亲合力， 该结合亲合力对应地是大约等于或大于包括两个人类 CTLA-4 细胞外结构域的一 个二聚体对于人类 CD80 或它的一个细胞外结构域的结合亲合力。
141： 如权利要求 139 所述的二聚体， 其中该二聚体具有对于人类 CD80 或它的一个细胞 外结构域的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是大约等于或大于包括两个人类 CTLA-4 细胞外结构域的一个二聚体对于人类 CD80 或它的一个细胞外结构域的结合亲合力。
142： 如权利要求 140 所述的二聚体， 其中该二聚体具有对于人类 CD86 或它的一个细胞 外结构域的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是大于包括两个 LEA29Y 多肽的一个二 聚体对于人类 CD86 或它的一个细胞外结构域的结合亲合力， 其中每个 LEA29Y 多肽包括在 SEQ ID NO ： 168 中所示的多肽序列。
143： 如权利要求 140 所述的二聚体， 其中该二聚体以一个速率从结合的人类 CD86 或它 的一个细胞外结构域中解离， 该速率对应地是小于包括两个人类 CTLA-4 细胞外结构域的 一个二聚体从结合的人类 CD86 或它的一个细胞外结构域中解离的速率。
144： 如权利要求 140 所述的二聚体， 其中该二聚体以一个速率从结合的人类 CD86 或 它的一个细胞外结构域中解离， 该速率对应地是小于包括两个 LEA29Y 多肽的一个二聚体 从结合的人类 CD86 或它的一个细胞外结构域中解离的速率， 其中每个 LEA29Y 多肽包括在 SEQ ID NO ： 168 中所示的多肽序列。
145： 如权利要求 140 所述的二聚体， 其中该二聚体以一个速率与人类 CD86 或它的一个 细胞外结构域相结合， 该速率对应地是大于包括两个人类 CTLA-4 细胞外结构域的一个二 聚体与人类 CD86 或它的一个细胞外结构域相结合的速率。
146： 如权利要求 140 所述的二聚体， 其中该二聚体以一个速率与人类 CD86 或它的一 个细胞外结构域相结合， 该速率对应地是大于包括两个 LEA29Y 多肽的一个二聚体与人类 CD86 或它的一个细胞外结构域相结合的速率， 其中每个 LEA29Y 多肽包括在 SEQ ID NO ： 168 中所示的多肽序列。
147： 一种分离或重组的多肽二聚体， 该多肽二聚体包括两个如权利要求 53 至 115 中任 一项所述的多肽， 其中包括两个人类 CTLA-4 细胞外结构域或两个 LEA29Y 多肽的一个二聚 体相比该二聚体具有阻抑一种免疫应答的更大的能力。
148： 如权利要求 147 所述的二聚体， 其中该二聚体与包括两个人类 CTLA-4 细胞外结构 域的一个二聚体相比具有抑制 T 细胞活化或 T 细胞增殖的更大的能力。
149： 一种分离或重组的多肽二聚体， 该二聚体包括两个如权利要求 53 至 115 中任一项 所述的多肽， 其中该二聚体具有一个 CD86 平衡解离常数 (KD)， 该 CD86 平衡解离常数小于包 括了两个人类 CTLA-4 细胞外结构域或两个 LEA29Y 多肽的一种二聚体的 CD86 平衡解离常 数 (KD)。
150： 一种分离或合成的偶联物， 该偶联物包括 ： (a) 如权利要求 1 至 115 中任一项所述的一种多肽， 以及 (b) 共价地附连至该多肽上的一个非多肽部分。
151： 如权利要求 150 所述的偶联物， 其中该偶联物结合了 CD80 或 CD86 或二者之一的 一个细胞外结构域。
152： 如权利要求 151 所述的偶联物， 其中 CD80 是人类 CD80 并且 CD86 是人类 CD86。
153： 如权利要求 150 所述的偶联物， 该偶联物包括至少两个非多肽部分。 11
154： 如权利要求 153 所述的偶联物， 其中该非多肽部分是一个糖分子。
155： 如权利要求 154 所述的偶联物， 其中该糖分子是附连于一个 N- 糖基化位点上的。
156： 如权利要求 150 所述的偶联物， 其中该非多肽部分是一种聚合物。
157： 如权利要求 156 所述的偶联物， 其中该聚合物是一个聚乙二醇部分。
158： 如权利要求 157 所述的偶联物， 其中该聚乙二醇部分是共价地附连于该多肽的一 个半胱氨酸残基上的。
159： 如权利要求 157 所述的偶联物， 该偶联物包括共价地附连于该多肽的一个赖氨酸 残基上的一个聚乙二醇部分。
160： 如权利要求 159 所述的偶联物， 该偶联物包括共价地附连于该多肽的 N- 端氨基基 团上的一个聚乙二醇部分。
161： 一种分离或重组的融合蛋白， 该融合蛋白包括 (a) 一个第一多肽， 该多肽包括一 个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少 95％的一致性， 该组的 构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 以及 (b) 一个第二多肽， 其中该第二多肽是一个 Ig Fc 多肽， 其中该融合蛋白具有结合 CD80 和 / 或 CD86、 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域的一 种能力， 和 / 或调整或调节一种免疫应答的能力。
162： 如权利要求 161 所述的融合蛋白， 其中该融合蛋白调整或调节了 T 细胞的活化或 增殖或细胞因子的产生。
163： 如权利要求 161 或 162 所述的融合蛋白， 其中该第二多肽是直接地与该第一多肽 进行融合的。
164： 如权利要求 161 或 162 所述的融合蛋白， 其中该第二多肽是与一个连接物氨基酸 序列进行融合的， 该氨基酸序列是与该第一多肽进行融合的。
165： 如权利要求 161 所述的融合蛋白， 其中该第二多肽是与该第一多肽的 C- 端进行融 合的。
166： 如权利要求 161 所述的融合蛋白， 其中该第二多肽包括一个 Ig 重链恒定区的一个 或多个结构域。
167： 如权利要求 161 所述的融合蛋白， 其中该第二多肽包括一种 Ig 多肽的一个铰链 区、 CH2 结构域、 以及 CH3 结构域。
168： 如权利要求 161 所述的融合蛋白， 其中该 Ig Fc 多肽是一种野生型人类 Ig Fc 多 肽或一种突变 Ig Fc 多肽。
169： 如权利要求 161 所述的融合蛋白， 其中该第二多肽包括一种人类 Ig 多肽的一个铰 链区、 CH2 结构域、 以及 CH3 结构域。
170： 如权利要求 169 所述的融合蛋白， 其中该人类 Ig 多肽是一种人类 IgG 多肽， 该人 类 IgG2 多肽可任选地是人类 IgG2Fc 多肽。
171： 一种分离或重组的融合蛋白二聚体， 该融合蛋白二聚体包括经由至少一个二硫键 连接的两个单体融合蛋白， 该二硫键在每个单体突变融合蛋白中存在的两个半胱氨酸残基 之间形成， 其中每个单体融合蛋白包括 (a) 一个多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序 列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 95％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 以及 (b) 一个 Ig Fc 多肽， 其中该融合蛋白二聚体具有结合 CD80 和 / 或 CD86、 和/ 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig 的能力， 和 / 或具有抑制或阻抑一种免疫应答的能力。 12
172： 一种分离或重组的融合蛋白二聚体， 该融合蛋白二聚体包括两个单体融合蛋白， 其中每个这种单体融合蛋白包括 ： (1) 一个多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列与 选自下组的一种多肽序列具有不超过 10、 9、 8、 7 或 6 个氨基酸残基的差异， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 并且其中在该多肽序列中在位置 24、 30、 32、 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 上的氨基酸残基是与在所述所选择的多肽序列的对应位置上的氨基酸残基相同 的， 以及 (2) 一个 Ig Fc 多肽， 其中该融合蛋白二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86， 和 / 或抑制一 种免疫应答。
173： 一种分离或重组的融合蛋白二聚体， 该融合蛋白二聚体包括两个单体融合蛋白， 其中每个单体融合蛋白包括 ： (1) 一个突变 CTLA-4 细胞外结构域多肽， 该多肽包括一个多 肽序列， 该多肽序列 (i) 与在 SEQ IDNO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 细胞外结构域的多肽序 列具有不超过 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基酸残基的差异， 并且 (ii) 包括至少一个氨基酸取代， 该 取代是在对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 24、 30、 32、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的一 个氨基酸位置上 ； 以及 (2) 一个 Ig Fc 多肽， 其中该融合蛋白二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或阻抑或抑制一种免疫应答。
174： 一种分离或重组的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体， 该融合蛋白二聚体包括两 个突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白单体， 其中每个突变 CTLA-4-Ig 融合单体包括 ： (1) 一个突变 CTLA-4-ECD 多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 中所示 的人类 CTLA-4 细胞外结构域的多肽序列具有不超过 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基酸残基的差异， 并且 (b) 包括在相对于 SEQ ID NO ： 159 的多个氨基酸位置上的一个或多个取代， 这种或这 些取代选自下组， 其构成为 ： A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 以及 S70F ； 以及 (2) 一个 Ig Fc 多肽， 该 Ig Fc 多肽可任选地是 IgG2Fc 多肽， 其中该突变 CTLA-4-Ig 二聚体结合了 hCD80 或 hCD86， 和 / 或阻抑或抑制一种免疫应答。
175： 一种分离或重组的融合蛋白二聚体， 该融合蛋白二聚体包括两个如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的单体融合蛋白， 其中这两个单体融合蛋白是经由以 下各项连接的 ： (i) 在两个半胱氨酸残基之间形成的至少一个二硫键， 其中每个半胱氨酸 残基是存在于这两个第一多肽之一中的， 和 / 或 (ii) 在两个半胱氨酸残基之间形成的至少 一个二硫键， 其中每个半胱氨酸残基是存在于这两个第二多肽之一中的。
176： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 具有对于人类 CD86 或它的一个细胞外结构域或 hCD86-Ig 的一种结合亲合力， 该结合亲合 力对应地是大于一种融合蛋白二聚体对于人类 CD86 或它的一种细胞外结构域或 hCD86-Ig 的结合亲合力， 该融合蛋白二聚体包括两个单体融合蛋白， 各自包括与一种 Ig 多肽进行融 合的一种野生型人类 CTLA-4 细胞外结构域。
177： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚 体具有对于人类 CD86 或它的一个细胞外结构域或 hCD86-Ig 的一种结合亲合力， 该结合 亲合力对应地是大于一种 CTLA-4-IgG2 融合蛋白二聚体对于人类 CD86 或它的一种细胞 外结构域或 hCD86-Ig 的结合亲合力， 其中该 CTLA-4-IgG2 融合蛋白二聚体包括两个单体 CTLA-4-IgG2 融合蛋白， 每个 CTLA-4-IgG2 融合蛋白包括 SEQ ID NO ： 162 的多肽序列。
178： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 具有对于人类 CD86 或它的一个细胞外结构域或 hCD86-Ig 的一种结合亲合力， 该结合亲合 13 力对应地是至少等于或大于一种人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体对于人类 CD86 或它的一 个细胞外结构域或 hCD86-Ig 的结合亲合力， 其中该人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体包括两 个融合蛋白单体， 每个这种单体包括 SEQ ID NO ： 164 的多肽序列。
179： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚 体具有对于人类 CD86 或它的一个细胞外结构域或 hCD86-Ig 的一种结合亲合力， 该结合亲 合力对应地是至少等于或大于一种 LEA29Y-Ig 融合蛋白二聚体对于人类 CD86 或它的一个 细胞外结构域或 hCD86-Ig 的结合亲合力， 其中该 LEA29Y-Ig 融合蛋白二聚体包括两个单体 LEA29Y-Ig 融合蛋白， 各自包括 SEQ ID NO ： 166 的多肽序列。
180： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 具有一种能力来阻抑一种免疫应答、 抑制 T 细胞活化、 或抑制 T 细胞增殖， 该能力是至少等 于或大于一种融合蛋白的能力， 该融合蛋白包括两个单体融合蛋白， 这两个单体融合蛋白 各自包括与一种 Ig 多肽进行融合的一个野生型人类 CTLA-4 细胞外结构域。
181： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚 体具有一种能力来阻抑一种免疫应答、 抑制 T 细胞活化、 或抑制 T 细胞增殖， 该能力是至少 等于或大于一种 CTLA-4-IgG2 融合蛋白二聚体阻抑一种免疫应答、 抑制 T 细胞活化、 或抑制 T 细胞增殖的能力， 该 CTLA-4-IgG2 融合蛋白二聚体包括两个单体融合蛋白， 这两个单体融 合蛋白各自具有 SEQ ID NO ： 162 的多肽序列。
182： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 具有一种能力来阻抑一种免疫应答、 抑制 T 细胞活化、 或抑制 T 细胞增殖， 该能力是至少等 于或大于一种人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体阻抑一种免疫应答、 抑制 T 细胞活化、 或抑制 T 细胞增殖的能力， 其中该人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体包括两个融合蛋白单体， 每个这 种单体包括 SEQ ID NO ： 164 的多肽序列。
183： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 以一个速率从结合的人类 CD86 或它的一个细胞外结构域或 hCD86-Ig 中解离， 该速率是对 应地小于包括两个人类 CTLA-4 细胞外结构域的一种融合蛋白二聚体从结合的人类 CD86 或 它的一个细胞外结构域或 hCD86-Ig 中解离的速率。
184： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 以一个速率从结合的人类 CD86 或它的一个细胞外结构域或 hCD86-Ig 中解离， 该速率是对 应地小于一种 CTLA-4-IgG2 融合蛋白二聚体从结合的人类 CD86 或它的一个细胞外结构域 或 hCD86-Ig 中解离的速率。
185： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 是以一个速率从结合的人类 CD86 或它的一个细胞外结构域或 hCD86-Ig 中解离， 该速率是 对应地小于一种人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体从结合的人类 CD86 或它的一个细胞外结 构域或 hCD86-Ig 中解离的速率， 其中该人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体包括两个融合蛋白 单体， 每个这种单体包括 SEQ ID NO ： 164 的多肽序列。
186： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 以一个速率从结合的人类 CD86 或它的一个细胞外结构域或 hCD86-Ig 中解离， 该速率是对 应地小于一种 LEA29Y-Ig 融合蛋白二聚体从结合的人类 CD86 或它的一个细胞外结构域或 hCD86-Ig 中解离的速率， 其中该 LEA29Y-Ig 融合蛋白二聚体包括两个融合蛋白， 这两个融 14 合蛋白各自具有 SEQ ID NO ： 166 的序列。
187： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 以一个速率与人类 CD86 或它的一个细胞外结构域或 hCD86-Ig 相结合， 该速率是对应地至 少等于或大于包括两个人类 CTLA-4 细胞外结构域的一个融合蛋白二聚体与人类 CD86 或它 的一个细胞外结构域或 hCD86-Ig 相结合的速率。
188： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚 体以一个速率与人类 CD86 或它的一种细胞外结构域或 hCD86-Ig 相结合， 该速率是对应地 至少等于或大于一种 CTLA-4-IgG2 融合蛋白二聚体与人类 CD86 或它的一个细胞外结构域 ( 或 hCD86-Ig) 相结合的速率。
189： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚 体以一个速率与人类 CD86 或它的一种细胞外结构域或 hCD86-Ig 相结合， 该速率是对应地 至少等于或大于一种人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体与人类 CD86 或它的一种细胞外结构 域或 hCD86-Ig 相结合的速率， 其中该人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体包括两个融合蛋白单 体， 每个这种单体包括 SEQ ID NO ： 164 的多肽序列。
190： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚 体以一个速率与人类 CD86 或它的一种细胞外结构域或 hCD86-Ig 相结合， 该速率是对应地 至少等于或大于一种 LEA29Y-Ig 融合蛋白二聚体与人类 CD86 或它的一种细胞外结构域或 hCD86-Ig 相结合的速率。
191： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 具有一个 CD86 平衡解离常数 (KD)， 该 CD86 平衡解离常数小于包括了两个人类 CTLA-4 细胞 外结构域的一种融合蛋白二聚体的 CD86 平衡解离常数 (KD)。
192： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 具有一个 CD86 平衡解离常数 (KD)， 该 CD86 平衡解离常数小于一种 CTLA-4-IgG2 融合蛋白 二聚体的 CD86 平衡解离常数 (KD)。
193： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 具有一个 CD86 平衡解离常数 (KD)， 该 CD86 平衡解离常数小于一种人类 CTLA-4-Ig 融合蛋 白二聚体的 CD86 平衡解离常数 (KD)， 其中该人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体包括两个融合 蛋白单体， 每个这种单体包括 SEQ ID NO ： 164 的多肽序列。
194： 如权利要求 171、 172、 173、 或 174 所述的融合蛋白二聚体， 其中该融合蛋白二聚体 具有一个 CD86 平衡解离常数 (KD)， 该 CD86 平衡解离常数小于一种 LEA29Y-Ig 融合蛋白二 聚体的 CD86 平衡解离常数 (KD)。
195： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码了 如权利要求 53 至 115 中任一项所述的一种多肽、 权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任 一项所述的一种融合蛋白、 或权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白 二聚体、 或它的一个互补的多核苷酸序列。
196： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码 了包括一个多肽序列的一种多肽， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222， 其中该多肽具有结合 CD80 和 / 或 CD86、 15 和 / 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域的能力， 和 / 或具有阻抑一种免疫应答的能 力， 或它的一个互补的多核苷酸序列。
197： 如权利要求 196 所述的核酸， 其中该核酸编码了一种多肽， 与一种人类 CTLA-4 单 体或它的一个细胞外结构域相比， 该多肽具有对应地对于人类 CD86 或它的一个细胞外结 构域的更大的结合亲和力。
198： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码了 包括一个多肽序列的一种融合蛋白， 该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222， 其中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或它的一个细胞外结构域， 和 / 或阻抑一种免疫应答， 或它的一个互补的多核苷酸序列。
199： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括 ： (a) 一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列 具有与选自下组的至少一个多核苷酸序列至少 95％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 80 至 158、 201 至 204、 223、 以及 224 ； (b)(a) 的一个互补的多核苷酸序列 ； 或 (c)(a) 或 (b) 的任何多核苷酸序列的一个片段， 其中该核酸编码了一种多肽， 该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫 应答的能力。
200： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码了 一种多肽， 该多肽包括一个多肽序列， (a) 该多肽序列与选自下组的一个多肽序列具有不超 过 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基酸残基的差异， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 并且 (b) 其 中在该多肽序列中在位置 24、 30、 32、 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 上的氨基酸残基是 与在所述选自下组的多肽序列的对应位置上的氨基酸残基相同的， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个细胞外结 构域， 和 / 或抑制一种免疫应答， 或它的一个互补的多核苷酸序列。
201： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码了 包括一个多肽序列的一种多肽， 该多肽序列 (a) 与在 SEQID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 细胞外结构域的多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且 (b) 包括至少一个氨基 酸取代， 该氨基酸取代是在对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 30、 32、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70 或 85 上的一个氨基酸位置， 其中所述多肽具有结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一 的一个细胞外结构域的能力， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力， 或它的一个互 补的多核苷酸序列。
202： 如权利要求 201 所述的核酸， 其中所述核酸包括至少一个相对 SEQID NO ： 159 的 氨基酸取代， 该氨基酸取代选自下组， 其构成为 ： A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 以及 S70F， 并且可任选地进一步包括至少一个相对 SEQ ID NO ： 159 的氨基酸取代， 该氨基酸取代 选自下组， 其构成为 ： L104E/D、 T30N/D/A、 以及 V32I。
203： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码了 包括一个多肽序列的一种多肽， 该多肽序列具有 (i) 至少 95％一致性的一个多肽序列， 该 多肽序列选自下组， 其构成为 ： SEQ IDNOS ： 1 至 73， 以及 (ii) 一个苯丙氨酸残基， 该苯丙氨 酸残基在对应于所述选自下组的多肽序列的位置 70 的一个氨基酸位置上， 该组的构成为 ： 16 SEQ IDNOS ： 1 至 73， 其中该多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86 或它的一个 ECD， 和 / 或抑制一种 免疫应答， 其中所述氨基酸取代可任选地包括 S70F， 或它的一个互补的多核苷酸序列。
204： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码了 一种重组多肽二聚体， 该重组多肽二聚体包括两个多肽， 其中每个这种多肽包括一个多肽 序列， 该多肽序列具有与选自下组的一个序列至少 95％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该二聚体结合 hCD80 和 / 或 hCD86、 和 / 或抑制一种免疫应答， 或它的一 种互补的多核苷酸序列。
205： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该核苷酸序列编码了一 种融合蛋白， 该融合蛋白包括 (a) 一种多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与 选自下组的至少一个多肽序列至少 95％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 以 及 (b) 一种 Ig 多肽， 其中该融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或具有阻抑一种免疫应答 的能力， 或它的一个互补的多核苷酸序列。
206： 如权利要求 205 所述的核酸， 其中所述核酸编码了一种融合蛋白二聚体。
207： 如权利要求 196 所述的核酸， 其中该核酸编码了一种多肽， 该多肽与一种人类 CTLA-4 单体或它的一个细胞外结构域相比具有阻抑一种免疫应答的更大的能力。
208： 如权利要求 207 所述的核酸， 其中该核酸编码了一种多肽， 该多肽与一种人类 CTLA-4 单体或它的一个细胞外结构域相比具有抑制 T 细胞活化或 T 细胞增殖的更大的能 力。
209： 如权利要求 196 所述的核酸， 其中该核酸编码了一种多肽， 该多肽以一个速率从 结合的人类 CD86 或它的一个细胞外结构域中解离， 该速率是小于一种人类 CTLA-4 单体或 它的一种细胞外结构域从结合的人类 CD86 或它的一种细胞外结构域中解离的速率。
210： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括 ： (a) 一种多核苷酸序列， 该多核苷酸序列具有与一种 RNA 多核苷酸序列至少 95％的序 列一致性， 其中该 RNA 多核苷酸序列包括选自下组的一种 DNA 序列， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 80 至 158、 201 至 204、 223、 以及 224， 其中在该 DNA 序列中所有的胸腺嘧啶核苷酸残基 被尿嘧啶核苷酸残基替换 ； (b)(a) 的一个互补的多核苷酸序列 ； 或 (c)(a) 或 (b) 的任何多核苷酸序列的一个片段， 其中该核酸编码了一种多肽， 该多肽 (i) 结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或 两者的一个细胞外结构域， 和 / 或 (ii) 具有阻抑一种免疫应答的能力， 该免疫应答可任选 地包括 T 细胞活化和 / 或 T 细胞增殖。
211： 如权利要求 195 至 210 中任一项所述的核酸， 该核酸进一步包括编码了一种信号 肽的一个核苷酸序列。
212： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码了 包括一个多肽序列的一种多肽， 该多肽序列 (a) 与在 SEQID NO ： 31 中所示的多肽序列具有 不超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且 (b) 包括以下的至少一项 ： 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的 位置 50 的一个位置上的一个甲硫氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 54 的一个位置 上的一个赖氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 55 的一个位置上的一个谷氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 64 的一个位置上的一个脯氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 17 31 的位置 65 的一个位置上的一个丝氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 70 的一个 位置上的一个苯丙氨酸残基， 其中根据 SEQ ID NO ： 31 对多个氨基酸残基位置进行编号， 并 且其中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个 ECD、 和 / 或抑制一 种免疫应答， 或它的一个互补的多核苷酸序列。
213： 一种载体， 该载体包括如权利要求 143 至 160 中任一项所述的一种核酸、 编码了 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽的一种核酸、 编码了如权利 要求 129 至 133 中任一项所述的一种多肽多聚体的一种核酸、 编码了如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种多肽二聚体的一种核酸、 编码了如权利要求 150 至 160 中任一项所述 的一种偶联物的一种核酸、 编码了如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的 一种融合蛋白的一种核酸、 或编码了如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种 融合蛋白二聚体的一种核酸。
214： 如权利要求 213 所述的载体， 其中该载体是一种 DNA 载体。
215： 如权利要求 213 所述的载体， 其中该载体是一种 RNA 载体。
216： 如权利要求 213 所述的载体， 其中该核酸是可操作地连接至一个启动子上的。
217： 如权利要求 213 所述的载体， 其中该载体是一种表达载体。
218： 如权利要求 217 所述的载体， 其中该表达载体包括在图 1C 中所示的质粒表达载 体。
219： 如权利要求 213 所述的载体， 其中该载体是一种病毒载体、 酵母载体、 植物载体、 细菌载体、 或昆虫载体。
220： 如权利要求所述 219 的载体， 其中该病毒载体是一种腺病毒载体。
221： 如权利要求 213 所述的载体， 其中该载体是一种质粒载体。
222： 如权利要求 213 至 221 中任一项所述的载体， 其中该载体进一步包括一种选择性 标记。
223： 一种表达载体， 该载体包括 ： (i) 一个第一多核苷酸序列， 该第一多核苷酸序列编 码了一种第一多肽， 该第一多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一 个多肽序列至少 95％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中所述第一多肽结 合人类 CD86 和 / 或人类 CD80、 和 / 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或阻抑 一种免疫应答， 以及 (ii) 一个第二多核苷酸序列， 该第二多核苷酸序列编码了一种第二多 肽， 该第二多肽包括一种免疫球蛋白 (Ig) 多肽的一个铰链区、 一个 CH2 结构域、 以及一个 CH3 结构域， 该 Ig 多肽可任选地是人类 IgG2Fc 多肽。
224： 一种分离或重组的宿主细胞， 该宿主细胞包括 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； 和/或 (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体。 18
225： 一种分离或重组的宿主细胞， 该宿主细胞用如权利要求 143 至 160 中任一项所述 的一种核酸进行转染或转化。
226： 一种分离或重组的宿主细胞， 该宿主细胞用编码了一种融合蛋白的一种核酸进行 转染， 该核酸包括 ： (i) 一个第一核苷酸序列， 该第一核苷酸序列编码了包括一种多肽序列的一种第一多 肽， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 95％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中所述第一多肽具有结合人类 CD86 和 / 或人类 CD80、 和 / 或二者 之一的或两者的一个细胞外结构域的能力， 和 / 或具有阻抑一种免疫应答的能力 ； 以及 (ii) 一个第二核苷酸序列， 该第二核苷酸序列编码了一种第二多肽， 该第二多肽包括 一种免疫球蛋白 (Ig) 多肽的一个铰链区、 一个 CH2 结构域、 以及一个 CH3 结构域， 该 Ig 多 肽可任选地是人类 IgG2Fc 多肽， 其中该宿主细胞是可表达该融合蛋白的。
227： 一种分离或重组分离的宿主细胞， 该宿主细胞包括如权利要求 213 至 223 中任一 项所述的一种载体。
228： 一种分离的宿主细胞， 该宿主细胞用根据权利要求 213 至 223 中任一项所述的一 种载体进行转染或转化。
229： 如权利要求 224 至 228 中任一项所述的宿主细胞， 其中该宿主细胞是一种真核细 胞。
230： 如权利要求 229 所述的宿主细胞， 其中该宿主细胞是一种中国仓鼠卵巢 (CHO) 细 胞或 COS 细胞。
231： 一种无限增殖化的细胞系， 该细胞系包括 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体 ； 和/或 (i) 如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞。
232： 一种组合物， 该组合物包括一种赋形剂或载体、 以及以下的一项或多项 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体。 19 (i) 如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞 ； 和/或 (j) 如权利要求 231 所述的一种细胞系。
233： 一种药物组合物， 该药物组合物包括一种药学上可接受的赋形剂或药学上可接受 的载体、 以及以下的一项或多项 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体。 (i) 如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞 ； 和/或 (j) 如权利要求 231 所述的一种细胞系。
234： 阻抑一种免疫应答的一种方法， 所述方法包括将一种 B7- 阳性细胞与一个有效量 的以下的至少一项进行接触 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体 ； 和/或 (i) 如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞 ； 以阻抑一种免疫应答， 其中一种免疫应答由此受到阻抑。
235： 如权利要求 234 所述的方法， 其中该受到阻抑的免疫应答是一种 T 细胞应答。
236： 如权利要求 234 所述的方法， 其中该方法包括将一种 B7- 阳性细胞与所述多肽进 行接触， 其中所述多肽结合在多个 B7- 阳性细胞上表达的 B7-1、 和 / 或结合了在多个 B7- 阳 性细胞上表达的 B7-2。
237： 调整了表达 CD28 和 / 或 CTLA-4 的 T 细胞与 B7- 阳性细胞的相互作用的一种方 法， 该方法包括将 B7- 阳性细胞与一个有效量的以下的至少一项进行接触 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； 20 (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体 ； 和/或 (i) 如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞 ； 以调整 B7- 阳性细胞与 CD28- 阳性 T 细胞和 / 或 CTLA-4- 阳性 T 细胞的相互作用， 其中 该 B7- 阳性细胞与 CD28- 阳性 T 细胞和 / 或 CTLA-4- 阳性 T 细胞的相互作用受到了调节。
238： 抑制该 CD28- 阳性 T 细胞和 / 或 CTLA-4- 阳性 T 细胞与 B7- 阳性细胞的相互作用 的一种方法， 该方法包括将 B7- 阳性细胞与一个有效量的以下的至少一项进行接触 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体 ； 和/或 (i) 如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞 ； 其中该 CD28- 阳性 T 细胞和 / 或 CTLA-4- 阳性 T 细胞与 B7- 阳性细胞的相互作用受到 抑制。
239： 如权利要求 238 所述的方法， 其中 T 细胞的活化或增殖受到抑制。
240： 如权利要求 238 所述的方法， 其中这些 B7- 阳性细胞是抗原呈递细胞。
241： 在一位受试者体内抑制该 CD28- 阳性 T 细胞与 B7- 阳性细胞的相互作用的一种方 法， 所述方法包括对一个受试者给予一个有效量的以下的至少一项 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体 ； 和/或 (i) 如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞 ； 其中在该受试者体内的该内源性 CD28- 阳性 T 细胞与内源性 B7- 阳性细胞的相互作用 受到抑制。
242： 如权利要求 241 所述的方法， 其中内源性 CD28- 阳性 T 细胞与表达 B7-2(CD86) 或 B7-1(CD80) 的内源性 B7- 阳性细胞的相互作用受到抑制。
243： 如权利要求 241 所述的方法， 其中这些表达 B7-2(CD86) 和 / 或 B7-1(CD80) 的 B7- 阳性细胞以及 B7-2(CD86) 和 / 或 B7-1(CD80) 与 CD28- 阳性 T 细胞的相互作用受到抑 制。
244： 如权利要求 243 所述的方法， 其中 B7-2(CD86) 以及 B7-1(CD80) 与 CD28- 阳性 T 细胞的相互作用受到抑制。 21
245： 在一位受试者体内阻抑一种免疫应答的一种方法， 该方法包括对需要该方法的一 位受试者给予一个治疗有效量的以下的一项或多项 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体 ； 和/或 (i) 如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞 ； 由此在该受试者体内阻抑一种免疫应答。
246： 如权利要求 245 所述的方法， 其中一种可溶性融合蛋白二聚体是以一个治疗有效 量给予该受试者的， 该治疗有效量包括从大约 0.001 毫克每千克 (mg/kg) 该受试者体重至 大约 100 毫克每千克 (mg/kg) 该受试者体重。
247： 如权利要求 246 所述的方法， 其中该可溶性融合蛋白二聚体的治疗有效量包括从 大约 0.001mg/kg 该受试者体重到至少约 0.005、 0.01、 0.025、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1、 1.5、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 25、 或 50mg/kg 该受试者体重。
248： 如权利要求 245 所述的方法， 其中该多肽、 融合蛋白、 二聚体、 多聚体、 融合蛋白二 聚体、 核酸、 载体、 和 / 或细胞是在一种药学上可接受的赋形剂或载体中给予该受试者的。
249： 如权利要求 245 所述的方法， 其中经胃肠外、 皮下、 或静脉内给予该多肽、 融合蛋 白、 二聚体、 多聚体、 融合蛋白二聚体、 核酸、 载体、 和 / 或细胞。
250： 如权利要求 245 所述的方法， 其中该多肽、 融合蛋白、 二聚体、 多聚体、 融合蛋白二 聚体、 核酸、 载体、 和 / 或细胞是每个月一、 二、 三或四次经皮下给予的。
251： 如权利要求 245 至 250 中任一项所述的方法， 其中一种可溶性融合蛋白二聚体 是在一种药学上可接受的赋形剂或载体中以一种浓度给予该受试者的， 该浓度是从大约 0.01mg/ml 至大约 200mg/ml、 大约 0.1mg/ml 至大约 200mg/ml、 大约 1 至大约 200mg/ml、 大约 1 至大约 100mg/ml、 大约 5 至大约 75mg/ml、 大约 10 至大约 50mg/ml、 大约 25 至大约 50mg/ ml、 或大约 50mg/ml 至大约 100mg/ml。
252： 如权利要求 245 所述的方法， 其中该多肽是一种可溶性多肽， 该融合蛋白是一种 可溶性融合蛋白， 该二聚体是一种可溶性二聚体， 该多聚体是一种可溶性多聚体， 并且该融 合蛋白二聚体是一种可溶性融合蛋白二聚体。 该方法包括对一位需要该方
253： 在一位受试者体内阻抑一种免疫应答的一种方法， 法的受试者给予一个治疗有效量的一个第一免疫抑制剂或化合物， 所述第一免疫抑制剂包 括： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； 22 (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体 ； 和/或 (i) 如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞 ； 由此在该受试者体内阻抑一种免疫应答。
254： 如权利要求 253 所述的方法， 该方法进一步包括给予一个有效量的至少一种额加 的免疫抑制剂或治疗剂。
255： 如权利要求 254 所述的方法， 其中该至少一种额加的免疫抑制剂或治疗剂是选自 下组， 其构成为 ： 一种缓解疾病的抗风湿药 (DMARD)、 甾体化合物、 非甾体化合物、 水杨酸钠 或镁、 布洛芬、 乙酰水杨酸、 扑热息痛、 抗体、 阻断一种抗炎细胞因子产生的生物剂、 依法珠 单抗、 抗炎剂或化合物、 以及非甾体抗炎药物 (NSAID)。
256： 如权利要求 254 或 255 所述的方法， 其中该至少一种额加的免疫抑制剂或治疗剂 是在一种药学上可接受的赋形剂或载体中给予该受试者的。
257： 如权利要求 253 至 256 中任一项所述的方法， 其中该多肽、 融合蛋白、 二聚体、 多聚 体、 融合蛋白二聚体、 核酸、 载体、 和 / 或细胞是每天至少一次、 每周至少一次、 每双周至少 一次、 或每月至少一次进行给予的。
258： 如权利要求 253 至 257 中任一项所述的方法， 其中该至少一种额加的免疫抑制剂 或药剂是 (i) 与给予该第一免疫抑制剂或化合物的同时 ； (ii) 在给予该第一免疫抑制剂或 化合物之后 ； 或 (iii) 在给予该第一免疫抑制剂或化合物之前给予的。
259： 治疗患有一种免疫系统疾病或紊乱的一位受试者的一种方法， 该疾病或紊乱是通 过内源性 T 细胞与表达 CD80 和 / 或 CD86 的内源性细胞的相互作用调整的， 所述方法包括 对需要这种治疗的一位受试者给予一个治疗有效量的以下各项 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体 ； 和/或 (i) 如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞 ； 其中在内源性 T 细胞与表达所述 CD80 和 / 或所述 CD86 的内源性细胞之间的一种或多 种相互作用受到抑制， 由此治疗该受试者体内的免疫系统疾病或紊乱。
260： 如权利要求 259 所述的方法， 其中 CD80 是人类 CD80 并且 CD86 是人类 CD86。
261： 如权利要求 259 所述的方法， 其中是表达 CD28 的内源性 T 细胞与表达 CD86 的内 源性细胞和 / 或表达 CD80 的内源性细胞之间的相互作用受到抑制。
262： 如权利要求所述 261 的方法， 其中 CD80 是人类 CD80， CD86 是人类 CD86， 并且 CD28 是人类 CD28。 23
263： 如权利要求 259 至 262 中任一项所述的方法， 其中该免疫系统疾病或紊乱是一种 自身免疫疾病或紊乱。
264： 如权利要求 263 所述的方法， 其中该免疫系统疾病或紊乱是选自下组， 其构成为 ： 关节炎、 类风湿性关节炎、 幼年型特发性关节炎 (JIA)、 系统性红斑狼疮 (SLE)、 银屑病、 银 屑病性关节炎、 糖尿病、 幼年型糖尿病、 I 型糖尿病、 多发性硬化症、 克罗恩病、 系统性硬皮 病、 溃疡性结肠炎、 炎症性肠病 (IBD)、 韦格纳氏肉芽肿病病、 阿狄森氏病、 格雷夫斯氏病、 肌 风湿病、 风湿性疾病、 强直性脊柱炎、 重症肌无力、 以及 ANCA- 相关性脉管炎。
265： 如权利要求 259 至 264 中任一项所述的方法， 其中该多肽、 融合蛋白、 二聚体、 偶联 物、 融合蛋白二聚体、 核酸、 载体、 和 / 或细胞是在一种药学上可接受的赋形剂或载体中给 予该受试者的。
266： 如权利要求 259 中任一项所述的方法， 其中一种可溶性融合蛋白二聚体是以一个 治疗有效量给予的， 该治疗有效量包括从大约 0.001mg/kg 该受试者体重至约大 100mg/kg 该患者体重。
267： 如权利要求 266 所述的方法， 其中该可溶性融合蛋白二聚体的治疗有效量包括至 少 约 0.001、 0.005、 0.01、 0.025、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 25、 50、 75、 或 100mg/kg 该受试者体重。
268： 如权利要求 266 所述的方法， 其中该可溶性融合蛋白二聚体的治疗有效量包括从 大约 0.001mg/kg 该受试者体重到至少约 0.005、 0.01、 0.025、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 25、 50、 75、 或 100mg/kg 该受试者体重。
269： 如权利要求 259 至 268 中任一项所述的方法， 其中该多肽、 融合蛋白、 二聚体、 偶联 物、 融合蛋白二聚体、 核酸、 载体、 和 / 或细胞是每天至少一次、 每周至少一次、 每双周至少 一次、 或每月至少一次进行给予。
270： 制备一种多肽的一种方法， 该方法包括在一种培养基中培养如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种宿主细胞， 并且回收由该细胞所表达的多肽。
271： 制备一种多肽的一种方法， 该方法包括 ： (a) 将如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸引入到多个细胞的一个群体之 中， 其中该核酸被可操作地连接到有效生产由该核酸所编码的多肽的一个调节序列上 ； (b) 在一种培养基中培养这些细胞以生产该多肽 ； 并且 (c) 将该多肽从这些细胞或培养基中分离。
272： 一种经培养的细胞， 其中已引入如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体。
273： 一种经培养的细胞， 其中已引入如权利要求 161 至 171 中任一项所述的一种表达 载体。
274： 制备一种融合蛋白的一种方法， 该方法包括 ： (1) 在一种培养基中培养用一种核酸转化的一种宿主细胞， 其中该核酸包括 ： (i) 一种 第一核苷酸序列， 该第一核苷酸序列编码了一种多肽， 该多肽具有与选自下组的一个多肽 序列至少 95％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 该多肽结合 CD86 和 / 或 CD80、 和 / 或 CD86 或 CD80 之一的一个细胞外结构域， 以及 (ii) 一个第二核苷酸序列， 该第二核 苷酸序列编码了一种 Ig 多肽， 该 Ig 多肽包括一个铰链区、 CH2 结构域、 以及 CH3 结构域， 该 Ig 多肽可任选地是人类 IgG2Fc， 由此表达了该核酸并且产生了一种融合蛋白 ； 并且 24 (2) 回收该融合蛋白。
275： 如权利要求 274 所述的方法， 其中该核酸进一步包括一个第三核苷酸序列， 该第 三核苷酸序列编码了可操作地连接至该融合蛋白上的一种分泌肽或信号肽， 并且该融合蛋 白是作为包括相同的第一以及第二融合蛋白的一种二硫键合的融合蛋白二聚体而从该宿 主细胞中分泌的， 并且该二硫键合的融合蛋白二聚体是从该培养基中回收的。
276： 如权利要求 275 所述的方法， 其中该二硫键合的融合蛋白二聚体是经由在该第一 融合蛋白的一个半胱氨酸残基与该第二融合蛋白的一个半胱氨酸残基之间的一个共价二 硫键而形成的。
277： 如权利要求 274 所述的方法， 其中该融合蛋白是从该培养基、 宿主细胞、 或宿主细 胞周质中回收的。
278： 一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个核苷酸序列， 该核苷酸序列编码了 (i) 一个第一多肽， 该第一多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多 肽序列至少 95％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该第一多肽结合 CD86 和 / 或 CD80、 和 / 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， 以及 (ii) 一个第二多肽， 该第二多肽包括一种 IgG 多肽的一个铰链区、 CH2 结构域、 以及 CH3 结构域。
279： 如权利要求 278 所述的核酸分子， 其中该第二多肽包括 SEQ IDNO ： 184 的多肽序 列。
280： 一种表达载体， 该载体包括如权利要求 278 或 279 所述的核酸。
281： 如权利要求 280 所述的表达载体， 该表达载体进一步包括一个第三核苷酸序列， 该第三核苷酸序列协助该第一多肽以及该第二多肽的表达。
282： 如权利要求 280 所述的表达载体， 该表达载体进一步包括一个第四核苷酸序列， 该第四核苷酸序列协助该第二多肽的表达， 其中该第三以及第四核苷酸序列是相同或不同 的。
283： 一种宿主细胞， 该宿主细胞包括如权利要求 280、 281、 或 282 所述的表达载体。
284： 制备一种融合蛋白二聚体的一种方法， 该方法包括培养如权利要求 283 所述的宿 主细胞。
285： 如权利要求 284 所述的方法， 其中该融合蛋白二聚体是从该宿主细胞培养基中回 收的。
286： 如权利要求 285 所述的方法， 其中该二聚体是从该宿主细胞中回收的。
287： 如权利要求 285 所述的方法， 其中该二聚体是从该宿主细胞周质中回收的。
288： 抑制由一位受方受试者对于来自一个供方的一个组织、 细胞、 移植物、 或器官的移 植体的排斥的一种方法， 该方法包括对其有需要的受方受试者给予一个治疗有效量的以下 各项 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； 25 (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体 ； 和/或 (i) 如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞 ； 由此抑制该受方受试者对于该组织、 细胞、 移植物、 或器官的移植体的排斥。
289： 如权利要求 288 所述的方法， 其中将该多肽、 融合蛋白、 二聚体、 多聚体、 偶联物、 融合蛋白二聚体、 核酸、 载体、 和 / 或细胞是在组织、 细胞、 移植物、 或器官的移植之前、 同 时、 或之后给予该受方受试者的。
290： 如权利要求 288 所述的方法， 其中该供方以及该受方受试者是相同的物种。
291： 如权利要求 288 所述的方法， 其中该供方以及该受方受试者是不同的物种。
292： 如权利要求 290 所述的方法， 其中该供方以及该受方受试者均是人类。
293： 如权利要求 288 所述的方法， 其中该有效量包括从大约 0.001mg/kg 该受试者体重 至大约 200mg/kg 该受试者体重。
294： 如权利要求 293 所述的方法， 其中该有效量包括从大约 0.001 毫克每千克 (mg/ kg) 该受试者体重到至少约 0.005、 0.01、 0.05、 0.1、 0.2、 0.25、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1、 2、 3、 4、 5、 10、 15、 25、 50、 75、 100、 125、 150、 或 175 毫克每千克 (mg/kg) 该受试者体重。
295： 如权利要求 294 所述的方法， 其中该有效量包括从大约 0.001 毫克每千克 (mg/ kg) 该受试者体重到至少约 0.005、 0.01、 0.05、 0.1、 0.2、 0.25、 0.5、 1、 2、 3、 4、 或 5 毫克每千 克 (mg/kg) 该受试者体重。
296： 如权利要求 288 所述的方法， 其中该多肽、 融合蛋白、 二聚体、 偶联物、 融合蛋白 二聚体、 核酸、 载体、 和 / 或细胞是在组织、 细胞、 移植物、 或器官的移植之后的那天并且在 移植之后每周至少一次或每月至少一次， 当需要时， 达到 12、 24、 或 36 或更多个月而进行给 予。
297： 如权利要求 288 所述的方法， 其中该器官移植体是一种肾移植体、 肝移植体、 肺移 植体、 或心脏移植体。
298： 在一位受试者体内治疗组织、 细胞、 移植物、 或器官的移植体的排斥的一种方法， 该方法包括对需要这种治疗的一位受试者给予一个治疗有效量的以下各项 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体 ； (g) 如权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸 ； (h) 如权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种载体 ； 和/或 (i) 如权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞 ； 由此减少或缓解由该受试者对该组织、 细胞、 移植物、 或器官的移植体的排斥。
299： 如权利要求 298 所述的方法， 其中该多肽、 融合蛋白、 二聚体、 多聚体、 偶联物、 融 合蛋白二聚体、 核酸、 载体、 和 / 或细胞是在组织、 细胞、 移植物、 或器官的移植之前、 同时、 或之后给予该受试者的。 26
300： 根据权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽、 权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多肽、 权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体、 权利要 求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物、 权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项 所述的一种融合蛋白、 权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体、 权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸、 权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种 载体、 或权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞， 在制造用于在一个哺乳动物体内抑 制或阻抑一种免疫应答的药物中的用途。
301： 根据权利要求 300 所述的用途， 其中该免疫应答是一种 T 细胞应答。
302： 根据权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽、 权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多肽、 权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体、 权利要 求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物、 权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项 所述的一种融合蛋白、 权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体、 权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸、 权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种 载体、 或权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞， 在制造用于治疗一种免疫系统疾病 或紊乱的药物中的用途。
303： 根据权利要求 302 所述的用途， 其中该免疫系统疾病或紊乱是通过在一个哺乳动 物体内的 T 细胞与 CD80- 阳性细胞和 / 或 CD86- 阳性细胞的相互作用而介导的。
304： 根据权利要求 303 所述的用途， 其中该免疫系统疾病或紊乱是一种自身免疫疾病 或自身免疫紊乱。
305： 根据权利要求 302 所述的用途， 其中该免疫系统疾病或紊乱是选自下组， 其构成 为： 关节炎、 类风湿性关节炎、 幼年型特发性关节炎 (JIA)、 系统性红斑狼疮 (SLE)、 银屑病、 银屑病性关节炎、 糖尿病、 幼年型糖尿病、 I 型糖尿病、 多发性硬化症、 克罗恩病、 系统性硬皮 病、 溃疡性结肠炎、 炎症性肠病 (IBD)、 韦格纳氏肉芽肿病病、 阿狄森氏病、 格雷夫斯氏病、 肌 风湿病、 风湿性疾病、 强直性脊柱炎、 重症肌无力、 以及 ANCA- 相关性脉管炎。
306： 根据权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽、 权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多肽、 权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体、 权利要 求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物、 权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项 所述的一种融合蛋白、 权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体、 权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸、 权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种 载体、 或权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞， 在制造用于在一个哺乳动物体内治 疗一种组织或器官移植排斥的药物的用途。
307： 根据权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽、 权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多肽、 权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体、 权利要 求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物、 权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项 所述的一种融合蛋白、 权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体、 权利要求 195 至 212 中任一项所述的一种核酸、 权利要求 213 至 223 中任一项所述的一种 载体、 或权利要求 224 至 230 中任一项所述的一种细胞， 在制造用于抑制 CD80- 阳性细胞和 / 或 CD86- 阳性细胞与 CD28- 阳性细胞和 / 或 CTLA-4- 阳性 T 细胞的相互作用的药物的用 途。 27
308： 如权利要求 172 所述的多肽， 其中在氨基酸位置 24、 30、 32、 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 85、 104 以及 106 上的这些氨基酸残基是与在所述所选择的多肽序列中的多个对应 位置上的氨基酸残基相同。
309： 一种分离或重组的融合蛋白二聚体， 该融合蛋白二聚体包括两个单体融合蛋白， 每个这种单体融合蛋白包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序 列至少 95％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以 及 219 至 222， 其中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或它的一个细胞外结构域， 和 / 或阻 抑一种免疫应答。
310： 一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 31 中所示的多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且 (b) 包括以下的至少一 项： 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 50 的一个位置上的一个甲硫氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 54 的一个位置上的一个赖氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 55 的一 个位置上的一个谷氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 64 的一个位置上的一个脯氨 酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 65 的一个位置上的一个丝氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 70 的一个位置上的一个苯丙氨酸残基， 其中根据 SEQ ID NO ： 31 对多个氨 基酸残基位置进行编号， 并且该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或两者的一 个 ECD， 和 / 或抑制一种免疫应答。
311： 一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列包括 (i) 与由 SEQ ID NOS ： 36 至 46 以及 55 所构成的组中选出的一个多肽序列至少 95％的序列一致性， 以及 (ii) 一个谷氨酸残基， 该谷氨酸残基在所述选出的多肽序列的位置 70 的氨基酸位置上， 其中该多肽 (i) 结合 CD80 和 / 或 CD86、 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， 和/或 (ii) 阻抑一种免疫应答。
312： 一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组 的一个多肽序列至少 95％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 36、 SEQ ID NO ： 38、 SEQ ID NO ： 50、 以及 SEQID NO ： 56， 其中该多肽 (i) 结合 CD80 和 / 或 CD86、 或二 者之一的或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或 (ii) 阻抑一种免疫应答。
313： 一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组 的一个多肽序列至少 95％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222， 其中该多肽 (i) 结合 CD80 和 / 或 CD86、 或二者之一的或两者 的一个细胞外结构域， (ii) 结合一种 CD80-Ig 融合蛋白和 / 或一种 CD86-Ig 融合蛋白， 和/ 或 (iii) 阻抑一种免疫应答。
314： 如权利要求 161 所述的分离或重组的融合蛋白， 所述融合蛋白包括 (a) 一个第 一多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少 95％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ IDNO ： 26、 SEQ ID NO ： 36、 SEQ ID NO ： 38、 SEQ ID NO ： 50、 以及 SEQ ID NO ： 56， 以及 (b) 一个第二多肽， 其中该第二多肽是一种 Ig Fc 多肽， 其 中该融合蛋白具有结合 CD80 和 / 或 CD86、 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域的能 力， 和 / 或调整或调节一种免疫应答的能力。
315： 如权利要求 314 所述的融合蛋白， 其中该 Ig Fc 多肽是一种野生型人类 Ig Fc 多 肽或一种突变 Ig Fc 多肽。 28
316： 如权利要求 314 所述的融合蛋白， 其中该 Ig Fc 多肽是一种人类 IgGFc 多肽， 该人 类 IgG2Fc 多肽可任选地是人类 IgG2Fc 多肽。
317： 一种分离或重组的融合蛋白二聚体， 该融合蛋白二聚体包括经由至少一个二硫键 连接的两个单体融合蛋白， 该二硫键在每个单体突变融合蛋白中存在的两个半胱氨酸残基 之间形成， 其中每个单体融合蛋白包括 (a) 一种多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序 具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 95％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NO ： 79、 SEQ IDNO ： 197、 SEQ ID NO ： 198、 SEQ ID NO ： 199、 以及 SEQ ID NO ： 200， 以及 (b) 一种 Ig Fc 多肽， 其中该融合蛋白二聚体具有 (i) 结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或 CD80 和 / 或 CD86 的 一个细胞外结构域的能力， (ii) 结合 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig 的能力， 和 / 或 (iii) 具有 抑制或阻抑一种免疫应答的能力。
318： 如权利要求 263 所述的方法， 其中该免疫系统疾病或紊乱是选自下组， 其构成 为： 阿狄森氏病、 过敏、 斑秃、 阿耳兹海默氏病、 抗嗜中性细胞胞质抗体 (ANCA)- 相关性脉管 炎、 强直性脊柱炎、 抗磷脂综合征 ( 休斯综合征 )、 关节炎、 哮喘、 动脉硬化、 动脉硬化斑块、 自身免疫疾病 ( 例如， 狼疮、 RA、 MS、 格雷夫斯氏病、 等等 )、 自身免疫性溶血性贫血、 自身 免疫性肝炎、 自身免疫性内耳病、 自身免疫性淋巴增生综合征、 自身免疫性心肌炎、 自身免 疫性卵巢炎、 自身免疫性睾丸炎、 无精子症、 贝切特氏病、 贝切特氏综合征、 贝格尔氏病、 大 疱性类天疱疮、 心肌症、 心血管疾病、 口炎性腹泻 / 乳糜泻、 慢性疲劳免疫功能障碍综合征 (CFIDS)、 慢性自发性多发神经炎、 慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经疾病 (CIPD)、 慢性复发 性多发性神经病变 ( 格 - 巴二氏综合征 )、 丘 - 施二氏血管炎 (CSS)、 瘢痕性类天疱疮、 冷 凝集素病 (CAD)、 COPD、 CREST 综合征、 克罗恩病、 疱疹样皮炎、 皮肌炎、 糖尿病、 盘状狼疮、 湿 疹、 后天性大疱性表皮松解症、 原发性混合型冷凝球蛋白血症、 伊凡斯氏综合征、 眼球突出 症、 纤维肌痛、 古德帕斯彻氏综合征、 移植物相关性疾病或紊乱、 格雷夫斯氏病、 GVHD、 桥本 甲状腺炎、 特发性肺纤维化、 特发性血小板减少性紫癜 (ITP)、 IgA 肾病、 免疫增生性疾病或 紊乱 ( 例如， 银屑病 )、 炎症性肠病 (IBD)、 胰岛素依赖型糖尿病 (IDDM)、 间质性肺病、 幼年型 糖尿病、 幼年型关节炎、 幼年型特发性关节炎 (JIA)、 川崎氏病、 朗 - 伊二氏肌无力综合征、 扁平苔藓、 狼疮、 狼疮肾炎、 淋巴细胞性垂体炎、 美尼尔氏病、 米勒费雪综合征 / 急性播散性 脑脊髓脊神经根病、 混合性结缔组织病、 多发性硬化症症 (MS)、 肌风湿病、 肌痛性脑脊髓炎 (ME)、 重症肌无力、 眼部炎症、 落叶型天疱疮、 寻常型天疱疮、 恶性贫血、 结节性多动脉炎、 多 软骨炎、 多腺体综合征 ( 怀塔克综合征 )、 风湿性多肌痛、 多发性肌炎、 原发性无丙种球蛋白 血症、 原发性胆汁性肝硬化 / 自身免疫性胆道疾病、 银屑病、 银屑病性关节炎、 雷诺氏现象、 莱特尔氏综合征 / 反应性关节炎、 再狭窄、 风湿热、 风湿性疾病、 类风湿性关节炎、 肉样瘤 病、 施密特氏综合征、 硬皮病、 斯耶格伦氏综合症、 实体器官移植体排斥 ( 肾、 心脏、 肝、 肺、 等等 )、 僵人综合征、 系统性红斑狼疮 (SLE)、 系统性硬皮病、 高安氏动脉炎、 颞动脉炎 / 巨 细胞动脉炎、 甲状腺炎、 I 型糖尿病、 II 型糖尿病、 溃疡性结肠炎、 眼色素层炎、 脉管炎、 白癜 风、 韦格纳氏肉芽肿病， 以及预防或阻抑与由一位受方受试者对于一种供方的组织、 细胞、 移植物、 或器官移植体的排斥相关联的一种免疫应答。
319： 如权利要求 232 或 233 所述的组合物， 该组合物包括一个有效量的以下各项 ： (a) 如权利要求 53 至 128 以及 312 至 313 中任一项所述的一种多肽 ； (b) 如权利要求 129 至 133 中任一项所述的一种多聚体 ； 29 (c) 如权利要求 134 至 149 中任一项所述的一种二聚体 ； (d) 如权利要求 150 至 160 中任一项所述的一种偶联物 ； (e) 如权利要求 161 至 171 以及 314 至 316 中任一项所述的一种融合蛋白 ； 或 (f) 如权利要求 172 至 194 以及 317 中任一项所述的一种融合蛋白二聚体。
320： 如权利要求 232、 233、 或 319 所述的组合物， 该组合物包括可将该组合物的 pH 维 持在大约 pH 3 至大约 pH 10 范围内的一种缓冲剂、 水、 可任选的一种非离子型洗涤剂、 可任 选的一种盐、 以及可任选的一种糖醇、 单糖、 二糖、 或多糖。
321： 如权利要求 319 至 320 中任一项所述的组合物， 其中该组合物是在生理的 pH 下。
322： 如权利要求 319 至 321 中任一项所述的组合物， 其中该组合物具有从大约 4 至大 约 7.5 的 pH。
323： 如权利要求 319 至 322 中任一项所述的组合物， 其中该组合物具有从大约 5.0 至 大约 7.5 的 pH。
324： 如权利要求 319 至 323 中任一项所述的组合物， 其中该组合物具有大约 6.4 的 pH。
325： 如权利要求 319 至 323 中任一项所述的组合物， 其中该组合物具有大约 7.4 或 7.5 的 pH。
326： 如权利要求 319 至 325 中任一项所述的组合物， 其中该缓冲剂是以从大约 1mM 至 大约 100mM 或 1mM 至大约 50mM 的浓度而存在。
327： 如权利要求 319 至 326 中任一项所述的组合物， 其中该缓冲剂是以大约 5mM 至大 约 35mM 的浓度而存在。
328： 如权利要求 319 至 327 中任一项所述的组合物， 其中该缓冲剂是以大约 10mM 至大 约 25mM 的浓度而存在。
329： 如权利要求 319 至 328 中任一项所述的组合物， 其中该缓冲剂是以大约 20mM 的浓 度而存在。
330： 如权利要求 319 至 329 中任一项所述的组合物， 其中该缓冲剂是选自下组， 其构 成为 ： 一种 HEPES 缓冲剂、 柠檬酸盐缓冲剂、 琥珀酸盐缓冲剂、 乙酸盐缓冲剂、 柠檬酸盐缓冲 剂、 马来酸盐缓冲剂、 磷酸缓冲剂、 以及 Tris 缓冲剂。
331： 如权利要求 319 至 330 中任一项所述的组合物， 其中该缓冲剂是选自下组， 其构成 为： 一种 HEPES 缓冲剂、 柠檬酸钠缓冲剂、 以及琥珀酸钠缓冲剂。
332： 如权利要求 319 至 331 中任一项所述的组合物， 其中该 pH 是大约 6.0 至大约 6.7， 并且该缓冲剂是琥珀酸钠或柠檬酸钠。
333： 如权利要求 319 至 332 中任一项所述的组合物， 其中该 pH 是大约 7.0 至大约 7.7， 并且该缓冲剂是 HEPES。
334： 如权利要求 319 至 333 中任一项所述的组合物， 其中该组合物包括一种糖醇或糖 类， 其中该糖类是一种单糖、 二糖、 或多糖。
335： 如权利要求 319 至 334 中任一项所述的组合物， 其中该二糖是蔗糖或海藻糖。
336： 如权利要求 319 至 335 中任一项所述的组合物， 其中该组合物包括以大约 1mM 至 大约 50mM 的浓度而存在的一种盐。
337： 如权利要求 319 至 336 中任一项所述的组合物， 其中该组合物包括以大约 20mM 的 浓度而存在的一种盐。 30
338： 如权利要求 319 至 337 中任一项所述的组合物， 其中该组合物包括一种非离子型 洗涤剂。
339： 如 权 利 要 求 319 至 338 中 任 一 项 所 述 的 组 合 物， 其中该组合物包括一种非 离 子 性 清 洁 剂， 该 非 离 子 型 洗 涤 剂 选 自 下 组， 其构成为 ： 或普流尼克 F-68。
340： 如权利要求 319 至 339 中任一项所述的组合物， 其中该多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联 物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体是以在大约 1mg/ml( 重量 / 体积 ) 至大约 200mg/ml( 重量 / 体积 ) 的范围内的浓度而存在。
341： 如权利要求 319 至 340 中任一项所述的组合物， 其中该多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联 物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体是以在大约 25mg/ml( 重量 / 体积 ) 至大约 100mg/ml( 重 量 / 体积 ) 的范围内的浓度而存在。
342： 如权利要求 319 至 341 中任一项所述的组合物， 其中该多肽、 多聚体、 二聚体、 偶 联物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体是以一个浓度而存在， 该浓度是在大约 50mg/ml( 重量 / 体积 ) 至大约 300mg/ml( 重量 / 体积 ) 的范围内的浓度而存在， 任选地大约在大约 50mg/ ml( 重量 / 体积 ) 至大约 100mg/ml( 重量 / 体积 ) 的范围内。
343： 如权利要求 319 至 342 中任一项所述的组合物， 其中该组合物的多肽、 多聚体、 二 聚体、 偶联物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体的有效量是从大约 0.1mg/kg 至大约 15mg/kg， 并且其中将该组合物给予一个哺乳动物。
344： 如权利要求 319 至 343 中任一项所述的组合物， 其中该多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联 物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体的有效量是从大约 0.5mg/kg 至大约 10mg/kg， 并且该组合 物是经经胃肠外给予的。
345： 如权利要求 319 至 344 中任一项所述的组合物， 其中该多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联 物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体的有效量是从大约 0.5mg/kg 至大约 5mg/kg， 并且可任选 的是大约 0.5mg/kg， 并且该组合物是经皮下给予的。
346： 如权利要求 319 至 345 中任一项所述的组合物， 其中该多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联 物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体的有效量是从大约 10mg/kg 至大约 5mg/kg， 并且任选地的 是大约 0.5mg/kg， 并且该组合物是经静脉内给予的。
347： 如权利要求 319 至 346 中任一项所述的组合物， 其中该多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联 物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体包括一个氨基酸序列， 该氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 36 的氨基酸序列至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性。
348： 如权利要求 319 至 346 中任一项所述的组合物， 其中该多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联 物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体包括一个氨基酸序列， 该氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 50 的氨基酸序列至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性。
349： 如权利要求 319 至 348 中任一项所述的组合物， 其中该组合物是无菌的。
350： 如权利要求 319 至 348 中任一项所述的组合物， 其中该组合物是对血液等渗的。
351： 如权利要求 319 至 350 中任一项所述的组合物， 其中该组合物是一种液体组合物。
352： 如权利要求 319 至 351 中任一项所述的组合物， 其中该组合物是一种液体或一种 经干燥的形式， 其中该经干燥的形式是选自下组， 其构成为 ： 一种冻干形式、 一种风干形式、 以及一种经喷雾干燥的形式。 31
353： 如权利要求 319 至 352 中任一项所述的组合物， 其中该组合物是处于冻干形式。
354： 一种药物组合物， 该组合物包括 ： (a) 一种多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多 肽序列选自下组， 其构成为 ： SEQ ID NOS ： 36 以及 50， 以在大约 1 至大约 200mg/ml( 重量 / 体积 ) 的浓度范围而存在 ； (b) 一种缓冲剂， 该缓冲剂以大约 5mM 至大约 50mM 的浓度具有 在大约 pH 5.0 与大约 pH 8.0 之间的缓冲能力 ； (c) 将该组合物达到一个指定体积的一种 药学上可接受的稀释剂 ； (d) 一种糖， 其浓度为按重量计大约 0.5％至大约 10％ ； (e) 一种 盐， 其浓度为大约 1mM 至大约 200mM ； (f) 该 pH 是在大约 pH 5.0 至大约 pH 8.0 的范围内 ； 以及 (g) 可任选的一种洗涤剂。
355： 如权利要求 354 所述的组合物， 其中 (a) 该多肽包括 SEQ IDNO ： 36 的多肽序列， 该 多肽序列以从大约 50mg/ml 至大约 100mg/ml 的浓度而存在 ； (b) 该缓冲剂是 HEPES 缓冲剂， 以大约 20mM 的浓度存在 ； (c) 该药学上可接受的稀释剂是水 ； (d) 该糖是蔗糖或海藻糖， 其浓度为按重量计 2％ ； (e) 该盐是氯化钠， 其浓度为大约 100mM ： (f) 该 pH 是大约 7.4 ； 并 且 (g) 可任选地， 该洗涤剂是存在的， 其中该洗涤剂是选自下组， 其构成为 ： 或普流尼克 F-68， 浓度为小于或等于约 0.1mg/ml。
356： 如权利要求 354 所述的组合物， 其中 (a) 该多肽包括 SEQ ID NO ： 50 的多肽序列， 以在从大约 50mg/ml 至大约 100mg/ml 的浓度范围而存在 ； (b) 该缓冲剂是柠檬酸钠缓冲 剂， 以大约 20mM 的浓度存在 ； (c) 该药学上可接受的稀释剂是水 ； (d) 该糖是蔗糖或海藻 糖， 其浓度为按重量计 2％； (e) 该盐是氯化钠， 其浓度为大约 100mM ； (f) 该 pH 是大约 6.5 ； 并且 (g) 可任选的一种洗涤剂， 该洗涤剂选自下组， 其构成为 ： 或普流尼克 F-68， 其浓度为小于或等于约 0.1mg/ml。
357： 一种药物组合物， 该组合物包括 ： (a) 一种多肽， 该多肽包括一个氨基酸序列， 该 氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 36 的氨基酸序列至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性 ； 以及 (b)HEPES 缓冲剂。
358： 一种药物组合物， 该组合物包括 ： (a) 一种多肽， 该多肽包括一个氨基酸序列， 该 氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 36 的氨基酸序列至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性 ； 以及 (b) 一种药学上可接受的赋形剂或一种药学上可接受的载体， 其 中该组合物具有从大约 7 至大约 8 的 pH。
359： 根据权利要求 358 所述的一种药物组合物， 其中该组合物具有大约 7.4 的 pH。
360： 根据权利要求 358 或 359 所述的一种药物组合物， 该组合物包括 HEPES 缓冲剂。 该多肽包括一个氨基酸序列， 该
361： 一种药物组合物， 该组合物包括 ： (a) 一种多肽， 氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 50 的氨基酸序列至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列 一致性 ； 以及 (b) 柠檬酸钠缓冲剂。
362： 一种药物组合物， 该组合物包括 ： (a) 一种多肽， 该多肽包括一个氨基酸序列， 该 氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 50 的氨基酸序列至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列 一致性 ； 以及 (b) 一种药学上可接受的赋形剂或一种药学上可接受的载体， 其中该组合物 具有从大约 6 至大约 7 的 pH。
363： 根据权利要求 362 所述的一种药物组合物， 其中该组合物具有大约 6.5 的 pH。
364： 根据权利要求 362 或 363 所述的一种药物组合物， 该组合物包括柠檬酸钠缓冲剂。
365： 根据权利要求所述 302 的用途， 其中该免疫系统疾病或病症是选自下组， 其构成 32 为： 该免疫系统疾病或紊乱是选自下组， 其构成为 ： 阿狄森氏病、 过敏、 斑秃、 阿耳兹海默氏 病、 抗嗜中性细胞胞质抗体 (ANCA)- 相关性脉管炎、 强直性脊柱炎、 抗磷脂综合征 ( 休斯综 合征 )、 关节炎、 哮喘、 动脉硬化、 动脉硬化斑块、 自身免疫疾病 ( 例如， 狼疮、 RA、 MS、 格雷夫 斯氏病、 等等 )、 自身免疫性溶血性贫血、 自身免疫性肝炎、 自身免疫性内耳病、 自身免疫性 淋巴增生综合征、 自身免疫性心肌炎、 自身免疫性卵巢炎、 自身免疫性睾丸炎、 无精子症、 贝切特氏病、 贝切特氏综合征、 贝格尔氏病、 大疱性类天疱疮、 心肌症、 心血管疾病、 口炎性 腹泻 / 乳糜泻、 慢性疲劳免疫功能障碍综合征 (CFIDS)、 慢性自发性多发神经炎、 慢性炎症 性脱髓鞘性多发性神经疾病 (CIPD)、 慢性复发性多发性神经病变 ( 格 - 巴二氏综合征 )、 丘 - 施二氏血管炎 (CSS)、 瘢痕性类天疱疮、 冷凝集素病 (CAD)、 COPD、 CREST 综合征、 克罗 恩病、 疱疹样皮炎、 皮肌炎、 糖尿病、 盘状狼疮、 湿疹、 后天性大疱性表皮松解症、 原发性混合 型冷凝球蛋白血症、 伊凡斯氏综合征、 眼球突出症、 纤维肌痛、 古德帕斯彻氏综合征、 移植物 相关性疾病或紊乱、 格雷夫斯氏病、 GVHD、 桥本甲状腺炎、 特发性肺纤维化、 特发性血小板减 少性紫癜 (ITP)、 IgA 肾病、 免疫增生性疾病或紊乱 ( 例如， 银屑病 )、 炎症性肠病 (IBD)、 胰 岛素依赖型糖尿病 (IDDM)、 间质性肺病、 幼年型糖尿病、 幼年型关节炎、 幼年型特发性关节 炎 (JIA)、 川崎氏病、 朗 - 伊二氏肌无力综合征、 扁平苔藓、 狼疮、 狼疮肾炎、 淋巴细胞性垂 体炎、 美尼尔氏病、 米勒费雪综合征 / 急性播散性脑脊髓脊神经根病、 混合性结缔组织病、 多发性硬化症症 (MS)、 肌风湿病、 肌痛性脑脊髓炎 (ME)、 重症肌无力、 眼部炎症、 落叶型天 疱疮、 寻常型天疱疮、 恶性贫血、 结节性多动脉炎、 多软骨炎、 多腺体综合征 ( 怀塔克综合 征 )、 风湿性多肌痛、 多发性肌炎、 原发性无丙种球蛋白血症、 原发性胆汁性肝硬化 / 自身 免疫性胆道疾病、 银屑病、 银屑病性关节炎、 雷诺氏现象、 莱特尔氏综合征 / 反应性关节炎、 再狭窄、 风湿热、 风湿性疾病、 类风湿性关节炎、 肉样瘤病、 施密特氏综合征、 硬皮病、 斯耶格 伦氏综合症、 实体器官移植体排斥 ( 肾、 心脏、 肝、 肺、 等等 )、 僵人综合征、 系统性红斑狼疮 (SLE)、 系统性硬皮病、 高安氏动脉炎、 颞动脉炎 / 巨细胞动脉炎、 甲状腺炎、 I 型糖尿病、 II 型糖尿病、 溃疡性结肠炎、 眼色素层炎、 脉管炎、 白癜风、 韦格纳氏肉芽肿病， 以及预防或阻 抑与由一位受方受试者对于一种供方的组织、 细胞、 移植物、 或器官移植体的排斥相关联的 一种免疫应答。

说明书


免疫抑制性多肽与核酸

    相关申请的交叉引用
     本申请要求了于 2007 年 11 月 1 日提交的美国临时专利申请序列号 60/984,631 号、 以及于 2008 年 5 月 7 日提交的美国临时专利申请序列号 61/051,215 号的优先权以及 权益， 这些申请各自的披露其全文出于所有目的通过引用结合在此。
     版权注记
     遵照 37C.F.R.1.71(e)， 申请人注意到， 本披露的一部份含有受到版权保护的材 料。版权所有人不反对任何人对专利文件或专利披露内容以其在专利及商标局 (Patent and Trademark Office) 的专利档案或记录中出现的形式传真复制， 但在其他方面则保留 无论何种形式的所有版权。
     发明领域
     本发明总体上涉及结合 CD80 和 / 或 CD86 的新颖多肽类， 编码此类多肽的核酸， 以 及制备并使用此类多肽及核酸的方法。
     本发明的背景
     T 细胞在免疫应答的起始及调控中发挥重要作用。 为了产生 T 细胞的完全活化， 要 求至少两个不同的信号传导事件。一个第一信号是通过表达于 T 细胞表面上的 T 细胞受体 与 (TCR) 与在表达于抗原呈递细胞 (APC) 上的主要组织相容性复合物 (MHC) 分子的环境中 存在的特定抗原 (Ag) 之间的相互作用而产生。一个第二 ( 共刺激 ) 信号是由表达于 APC 上的共刺激性配体与它们的表达于 T 细胞上的对应受之体间的相互作用而产生。一种优势 共刺激通路涉及在表达于 APC 上的 CD80(B7-1 或 B7.1) 以及 CD86(B7-2 或 B7.2) 配体与主 要表达于 T 细胞上的 CD28 以及 CTLA-4( 也称为 CD152) 之间的相互作用。CTLA-4( 细胞毒 性 T 淋巴细胞抗原 4) 以及 CD28 充当这些 CD80 以及 CD86 配体的受体。
     正 向 信 号 传 导 是 通 过 CD28 受 体 介 导 的。 这 种 或 这 些 CD80 和 / 或 CD86 配 体 与 CD28 的结合通过促进免疫突触的形成而降低了 T 细胞活化的阈值 (Viola A.et al.， Science 283 ： 680-682(1999))。此外， CD28 的共刺激活化或增强了对于 T 细胞的增殖 以及存活具有重要性的因子的形成， 如， 白介素 -2(IL-2)、 NF-κB、 以及 Bcl-XL(Norton S.D.et at.， J.Immunol.149 ： 1556-1561(1992) ； Vella A.T.et al.， J.Immunol.158 ： 4714-4720(1997))。在体内， CD28- 缺陷的小鼠是严重免疫妥协的， 并且显示了不良的抗原 特异的 T 细胞应答 (Green， J.M.et al.， Immunity 1 ： 501-508(1994))。当 T 细胞在这种共 刺激性信号的缺失下被活化时， 可造成 T 细胞的无反应性或耐受。
     负向信号传导是通过 CTLA-4 受体介导的。这些 CD80 以及 CD86 配体各自以高 亲和力结合到 CTLA-4 上， 并且衍生自 CD28 信号传导的平衡免疫增生性反应。CTLA-4 信 号传导的潜在机制包括竞争性结合共刺激性分子 CD80/CD86(Masteller， E.M.et al.， J.Immunol.164 ： 5319(2000))、 通过将磷酸酶诱导至免疫突触上而抑制 TCR 信号传导 (Lee K.M.et al.， Science282 ： 2263(1998))、 以及破坏这种免疫突触 (Pentcheva-Hoang T.et al.， Immunity 21 ： 401(2004) ； Chikuma S.et al.， J.Exp.Med 197 ： 129(2003) ； SchneiderH.et al.， Science 313 ： 1972(2006))。在体内， CTLA-4 缺陷的小鼠显示了深度的自身免 疫表型， 其特征为大量的组织浸润以及器官破坏 (Waterhouse P.et al.， Science 270 ： 985(1995))。
     设计成拮抗这种 CD80/CD86 共刺激通路的治疗剂 ( 如， 可溶性人类 CTLA-4-Ig) 具 有用于治疗自身免疫疾病以及紊乱的可能。 本发明提供了具有改进的能力以调整或阻抑经 由这种 CD80/CD86 共刺激通路的信号传导的的有利分子， 以及将此类分子用于所选择且不 同的 T 细胞应答的操纵的方法。此类分子在如以下详细讨论的不同应用中具有有益的用 途。
     本发明的概述
     在第一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的 CTLA-4 多肽， 该多肽包括一个多 肽序列， 该多肽序列与在 SEQ ID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 细胞外结构域的多肽序列具 有达到 15 个氨基酸残基差异， 其中该分离或重组的 CTLA-4 多肽具有结合 CD80 或 CD86 或 二者之一的一个细胞外结构域的能力， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。
     根据本发明第一方面的一种多肽可与 SEQ ID NO ： 36 的多肽序列具有至少 90％的 序列一致性， 或至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性。根 据本发明第一方面的一种多肽可包括 SEQ ID
     NO ： 36 的多肽序列。
     根据本发明第一方面的一种多肽可与 SEQ ID NO ： 50 的多肽序列具有至少 90％的 序列一致性， 或至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性。根 据本发明第一方面的一种多肽可包括 SEQ IDNO ： 50 的多肽序列。
     根据本发明第一方面的一种多肽可具有结合人类 CD80 或人类 CD86 或二者之一的 一个细胞外结构域的能力。
     根据本发明第一方面的一种多肽可包括长度为 124 个氨基酸残基的一个多肽序 列。
     根据本发明第一方面的一种多肽可包括一个氨基酸取代， 该取代在选自下组的一 个氨基酸位置上， 该组的构成为 ： 对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的多个氨基酸位置
     根据本发明第一方面的一种多肽可包括二、 三、 或四个氨基酸取代， 这些取代在选 自下组的多个氨基酸位置上， 该组的构成为 ： 对应于相对 SEQID NO ： 159 的位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的氨基酸位置。
     本发明第一方面的一种多肽可包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 70 上的一个氨 基酸取代， 如取代 S70F。
     本发明第一方面的一种多肽可包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 104 上的一个氨 基酸取代， 如取代 L104E。
     本发明第一方面的一种多肽可包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 30 上的氨基酸 取代， 如取代 T30N/D/A 或取代 T30N。
     本发明第一方面的一种多肽可包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 64 上的一个氨 基酸取代， 如取代 S64P。
     本发明第一方面的一种多肽可包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 50 上的一个氨基酸取代， 如取代 A50M。
     本发明第一方面的一种多肽可包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 54 上的一个氨 基酸取代， 如取代 M54K/V 或取代 M54K。
     本发明第一方面的一种多肽可包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 65 上的一个氨 基酸取代， 如取代 I65S。
     本发明第一方面的一种多肽可包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 56 上的一个氨 基酸取代， 如取代 N56D。
     本发明第一方面的一种多肽可包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 55 上的一个氨 基酸取代， 如取代 G55E。
     本发明第一方面的一种多肽可包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 85 上的一个氨 基酸取代， 如取代 M85A。
     本发明第一方面的一种多肽可包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 24 上的一个氨 基酸取代， 如取代 A24E/S 或取代 A24E。
     本发明第一方面的一种多肽可具有对于 CD86 或它的一根细胞外结构域的一种结 合亲和力， 该结合亲和力是大约等于或大于一种单体人类 CTLA-4 细胞外结构域对于 CD86 或 CD86 细胞外结构域的结合亲和力。
     本发明第一方面的一种多肽可具有对于 CD80 或它的一个细胞外结构域的一种结 合亲和力， 该结合亲和力大于一种单体人类 CTLA-4 细胞外结构域对于 CD80 或 CD80 细胞外 结构域的结合亲和力。
     本发明第一方面的一种多肽可具有阻抑一种免疫应答的能力。
     本发明第一方面的一种多肽可具有抑制 T 细胞活化或 T 细胞增殖的能力。
     在第二方面中， 本发明提供了一种分离或重组的多肽多聚体， 该多肽多聚体包括 本发明第一方面的至少两个多肽。
     在第三方面中， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白， 该融合蛋白包括 (a) 根据本发明第一方面的一种多肽， 以及 (b) 一种第二多肽， 其中该第二多肽是一种 Ig Fc 多 肽， 并且其中该融合蛋白具有结合 CD80 和 / 或 CD86、 或二者之一的或两者的一个细胞外结 构域的能力， 和 / 或调整或调节一种免疫应答的能力。
     在第四方面中， 本发明提供了一种分离或重组的二聚体融合蛋白， 该二聚体融合 蛋白包括根据本发明第三方面的两个单体融合蛋白。
     在第五方面中， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个核苷酸序 列， 该核苷酸序列编码了本发明第一方面的一种多肽、 本发明第二方面的一种多聚体、 本发 明第三方面的一种融合蛋白、 或本发明第四方面的一种二聚体融合蛋白。
     在第六方面中， 本发明提供了一种载体， 该载体包括本发明第五方面的一种核酸。
     在第七方面中， 本发明提供了一种分离或重组的宿主细胞， 该宿主细胞包括本发 明第一方面的一种多肽、 本发明第二方面的一种多聚体、 本发明第三方面的一种融合蛋白、 本发明第四方面的一种二聚体融合蛋白、 本发明第五方面的一种核酸、 和 / 或本发明第六 方面的一种载体。
     在第八方面中， 本发明提供了一种药物组合物， 该药物组合物包括一种药学上可 接受的赋形剂、 药学上可接受的载体、 或药学上可接受的稀释剂， 以及以下的一项或多项 ：本发明第一方面的一种多肽、 本发明第二方面的一种多聚体、 本发明第三方面的一种融合 蛋白、 本发明第四方面的一种二聚体融合蛋白、 本发明第五方面的一种核酸、 本发明第六方 面的一种载体、 和 / 或本发明第七方面的一种宿主细胞。
     在第九方面中， 本发明提供了阻抑一种免疫应答的方法， 所述方法包括将一种 B7- 阳性细胞与一个有效量的以下的至少一项进行接触 ： 本发明第一方面的一种多肽、 本 发明第二方面的一种多聚体、 本发明第三方面的一种融合蛋白、 本发明第四方面的一种二 聚体融合蛋白、 本发明第五方面的一种核酸、 本发明第六方面的一种载体、 和 / 或本发明第 七方面的一种宿主细胞， 以阻抑一种免疫应答， 其中一种免疫应答由此受到阻抑。
     在第十方面中， 本发明提供了本发明第一方面的一种多肽、 本发明第二方面的一 种多聚体、 本发明第三方面的一种融合蛋白、 本发明第四方面的一种二聚体融合蛋白、 本发 明第五方面的一种核酸、 本发明第六方面的一种载体、 和 / 或本发明第七方面的一种宿主 细胞， 用于阻抑一种免疫应答。
     在第十一方面中， 本发明提供了本发明第一方面的一种多肽、 本发明第二方面的 一种多聚体、 本发明第三方面的一种融合蛋白、 本发明第四方面的一种二聚体融合蛋白、 本 发明第五方面的一种核酸、 本发明第六方面的一种载体、 和 / 或本发明第七方面的一种宿 主细胞， 在制造用于阻抑一种免疫应答的一种药物的用途。
     在第十二方面中， 本发明提供了一种偶联物， 该偶联物包括本发明第一方面的一 种多肽、 本发明第二方面的一种多聚体、 本发明第三方面的一种融合蛋白、 或本发明第四方 面的一种二聚体融合蛋白， 以及共价连附于这种多肽、 多聚体、 融合蛋白、 或二聚体融合蛋 白上的一个非多肽部分， 其中所述偶联物具有阻抑一种免疫应答的能力。
     本发明的其他方面如以下说明。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序 列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该多肽结合 CD80 或 CD86 或 二者之一的一个细胞外结构域 (ECD)， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序 列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该多肽具有对于一个人类 CD86 细胞外结构域或人类 CD80 细胞外结构域的一种结合亲和力， 该结合亲和力对应地是 大约等于或大于一个人类 CTLA-4 细胞外结构域对于该人类 CD86 细胞外结构域或人类 CD80 细胞外结构域的结合亲和力， 并且其中该多肽可任选地具有阻抑一种免疫应答的能力。一 些此类多肽具有对于该人类 CD86 细胞外结构域的一种结合亲和力， 该结合亲和力大于该 人类 CTLA-4 细胞外结构域对于该人类 CD86 细胞外结构域的结合亲和力。一些此类多肽具 有对于该人类 CD80 细胞外结构域的一种结合亲和力， 该结合亲和力大于该人类 CTLA-4 细 胞外结构域对于该人类 CD80 细胞外结构域的结合亲和力。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的突变 CTLA-4 多肽， 该多肽包括一 个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 细胞外结构域的 多肽序列具有不超过 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 个氨基酸残基 ) 的差异， 并且 (b) 包括至少一个氨基酸取代， 该取代在对应于相对 SEQIDNO ： 159 的位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的一个氨基酸位置上， 其中该突变 CTLA-4 多 肽具有结合 CD80 或 CD86 或二者之一的一个细胞外结构域的能力， 和 / 或具有阻抑或抑制 一种免疫应答的能力。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽包括 (i) 与 SEQ ID NOS ： 1 至 73 所构成的组中选出的一个多肽序列至少 95％的序列 一致性， 以及 (ii) 一个苯丙胺酸残基， 该苯丙胺酸残基在对应于由 SEQ ID NOS ： 1 至 73 所 构成的组中选出的所述多肽序列的位置 70 的氨基酸位置上， 其中该多肽具有结合 CD80 和 / 或 CD86、 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域的能力， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免 疫应答的能力。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的突变 CTLA-4 多肽， 该突变 CTLA-4 多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或可阻抑 一种免疫应答， 其中所述多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 中所 示的人类 CTLA-4 细胞外结构域多肽的多肽序列具有不超过 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 个氨基酸残基 ) 的差异， 并且 (b) 包括至少一个 氨基酸取代， 其中所述至少一个氨基酸取代包括 S70F， 其中根据 SEQ ID NO ： 159 对多个氨 基酸残基位置进行编号。 在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的突变 CTLA-4 多肽， 该突变 CTLA-4 多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ IDNO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 细胞外 结构域的多肽序列具有不超过 11、 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 或 11 个氨基酸残基 ) 的差异， 并且 (b) 包括至少一个氨基酸取代， 该取代在对 应于相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 24、 30、 32、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的一个氨基酸残 基位置上， 其中该突变 CTLA-4 多肽具有结合 CD80 或 CD86 或二者之一的一个细胞外结构域 的能力， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 31 所示的多肽序列具有不超过 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基酸 残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 个氨基酸残基 ) 的差异， 并且 (b) 包括以下 的至少一项 ： 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 50 的一个位置上的一个甲硫氨酸残基、 在对应 于 SEQ ID NO ： 31 的位置 54 的一个位置上的一个赖氨酸残基、 在对应于 SEQID NO ： 31 的位 置 55 的一个位置上的一个谷氨酸残基、 在对应于 SEQ IDNO ： 31 的位置 64 的一个位置上的 一个脯氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 65 的一个位置上的一个丝氨酸残基、 在对 应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 70 的一个位置上的一个苯丙氨酸残基， 其中根据 SEQ ID NO ： 31 对多个氨基酸残基位置进行编号， 并且该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或 两者的一个 ECD， 和 / 或抑制一种免疫应答。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白二聚体， 该融合蛋白二 聚体包括经由至少一个二硫键连接的两个单体融合蛋白， 该二硫键在每个单体突变融合蛋 白中存在的两个半胱氨酸残基之间形成， 其中每个单体融合蛋白包括 (a) 一种多肽， 该多 肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 或 100 ％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 以及 (b) 一种
     IgFc 多肽， 其中该融合蛋白具有结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig 的能力， 和 / 或具有抑制或阻抑一种免疫应答的能力。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白二聚体， 该融合蛋白二 聚体包括两个单体融合蛋白， 每个这种单体融合蛋白包括一个多肽序列， 该多肽序列具有 与选自下组的至少一个多肽序列至少 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 或 100 ％的序列一致 性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222， 其中该多 肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或它的一个细胞外结构域， 和 / 或阻抑一种免疫应答， 或它们 的一个互补的多核苷酸序列。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白二聚体， 该融合蛋白二 聚体包括两个单体融合蛋白， 其中每个单体融合蛋白包括 ： (1) 一种多肽， 该多肽包括一个 多肽序列， 该多肽序列与选自下组的一个多肽序列具有不超过 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基酸残 基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 个氨基酸残基 ) 的差异， 该组的构成为 ： SEQ IDNOS ： 1 至 73， 并且其中在该多肽序列中在位置 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70 或 85 上的氨基 酸残基是与在所述所选择的多肽序列的对应位置上的氨基酸残基相同的， 以及 (2) 一种 Ig Fc 多肽， 其中该融合蛋白二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86， 和 / 或抑制一种免疫应答。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白二聚体， 该融合蛋白二 聚体包括两个单体融合蛋白， 其中每个单体融合蛋白包括 ： (1) 一种突变 CTLA-4 细胞外结 构域多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (i) 与在 SEQ ID NO ： 159 的人类 CTLA-4 细 胞外结构域的多肽序列具有不超过 10、 9、 8、 7 或 6 个氨基酸残基 ( 如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个氨基酸残基 ) 的差异， 并且 (ii) 包括至少一个氨基酸取代， 该取代是在对应 于相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70 或 85 的氨基酸位置 ； 以及 (2) 一种 Ig Fc 多肽， 其中该融合蛋白二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86， 和 / 或阻抑或抑制一种免疫应 答。 一些此类融合蛋白二聚体在相对 SEQ ID NO ： 159 的多个氨基酸位置上包括一个或多个 取代， 这个或这些取代选自下组， 其构成为 ： A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 以及 S70F ； 以及 (2) 一种 Ig Fc 多肽， 该 Ig Fc 多肽可任选地是 IgG2Fc 多肽， 其中该突变 CTLA-4-Ig 二聚体结合 hCD80 或 hCD86， 和 / 或阻抑或抑制一种免疫应答。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的 序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 36、 SEQ ID NO ： 38、 SEQ ID NO ： 50、 以及 SEQ ID NO ： 56， 其中该多肽 (i) 结合 CD80 和 / 或 CD86、 或二者之一的或两者的一个细 胞外结构域， 和 / 或 (ii) 阻抑一种免疫应答。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的一种多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％的 序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222， 其中该多肽 (i) 结合 CD80 和 / 或 CD86、 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， (ii) 结 合一种 CD80-Ig 融合蛋白和 / 或 CD86-Ig 融合蛋白， 和 / 或 (iii) 阻抑一种免疫应答。
     还提供了一种分离或重组的融合蛋白二聚体， 该二聚体包括经由至少一个二硫键 连接的两个单体融合蛋白， 该二硫键在每个单体突变融合蛋白中存在的两个半胱氨酸残基 之间形成， 其中每个单体融合蛋白包括 (a) 一种多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序 列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 95％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NO ： 79、SEQ IDNO ： 197、 SEQ ID NO ： 198、 SEQ ID NO ： 199、 以及 SEQ ID NO ： 200， 以及 (b) 一种 Ig Fc 多肽， 其中该融合蛋白具有 (i) 结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或 CD80 和 / 或 CD86 的一个细 胞外结构域的能力， (ii) 结合 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig 的能力， 和 / 或 (iii) 具有抑制或 阻抑一种免疫应答的能力。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了包括一种多肽序列的一种多肽， 该多肽序列具有与选自下组 的至少一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该组的构 成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 79、 197 至 200、 205 至 214， 以及 219 至 222， 其中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或具有阻抑一种免疫应答 的能力， 或它的一个互补的多核苷酸序列。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了包括一种多肽序列的一种融合蛋白， 该多肽序列具有与选自 下组的至少一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该组 的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222， 其中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或它的一个细胞外结构域， 和 / 或阻抑一种免疫应答， 或它的一个互 补的多核苷酸序列。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括 ： (a) 一个多 核苷酸序列， 该多核苷酸序列具有与选自下组的至少一个多核苷酸序列至少 95 ％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该组的构成 ： SEQ ID NOS ： 80 至 158、 201 至 204、 223、 以及 224 ； (b)(a) 的一个互补的多核苷酸序列 ； 或 (c)(a) 或 (b) 的任何多核苷酸序列 的一个片段， 其中该核酸编码了一种多肽， 该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的 或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了包括一个多肽序列的一种多肽， (a) 该多肽序列与选自下组的 一个多肽序列具有不超过 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 个氨基酸残基 ) 的差异， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 并且 (b) 其中在该多 肽序列中在位置 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 位置上的氨基酸残基是与在选自下组的 所述多肽序列的对应位置上的氨基酸残基相同的， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其 中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一者的或二者的细胞外结构域， 和 / 或抑制 一种免疫应答， 或它的一个互补的多核苷酸序列。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了包括一个多肽序列的一种多肽， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 细胞外结构域的多肽序列具有不超过 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基 酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 个氨基酸残基 ) 的差异， 并且 (b) 包括至 少一个氨基酸取代， 该取代在对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的一个氨基酸位置上， 其中所述多肽具有结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的一 个细胞外结构域的能力， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力， 或它的一个互补的 多核苷酸序列。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码了包括一个多肽序列的一种多肽， 该多肽序列具有 (i) 与选自 下组的一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该组的构 成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 以及 (ii) 一个苯丙氨酸残基， 该苯丙氨酸残基在对应于所述选 自下组的多肽序列的位置 70 的一个氨基酸位置上， 该组的构成为 ： SEQ ID NO ： 1 至 73， 其中 该多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86、 或它的一个 ECD， 和 / 或抑制一种免疫应答， 其中该氨基酸 取代可任选地包括 S70F， 或它的一个互补的多核苷酸序列。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了包括两个多肽的一种重组多肽二聚体， 其中每个这种多肽 包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的一个序列至少 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98％、 99％、 或 100％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该二聚体结合 hCD80 和 / 或 hCD86， 和 / 或抑制一种免疫应答， 或其它的一根互补的多核苷酸序列。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了一种融合蛋白， 该融合蛋白包括 (a) 一种多肽， 该多肽包括一 个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 以及 (b) 一种 Ig 多肽， 其中该 融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86， 和 / 或具有阻抑一种免疫应答的能力， 或它的一个互补的 多核苷酸序列。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了包括一个多肽序列的一种多肽， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 31 中所示的多肽序列具有不超过 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 个氨基酸残基 ) 的差异， 并且 (b) 包括以下的至少一项 ： 在对应于 SEQID NO ： 31 的位置 50 的一个位置上的一个甲硫氨酸残基、 在对应于 SEQ IDNO ： 31 的位置 54 的一 个位置上的一个赖氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 55 的一个位置上的一个谷氨 酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 64 的一个位置上的一个脯氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 65 的一个位置上的一个丝氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 70 的一个位置上的一个苯丙氨酸残基， 其中 SEQ ID NO ： 31 对多个氨基酸残基位置进行编号， 并且该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86， 和 / 或抑制一种免疫应答， 或它的一个互补的多核苷酸 序列。
     在另一个方面， 本发明提供了一种表达载体， 该表达载体包括 ： (i) 一个第一多核 苷酸序列， 该第一多核苷酸序列编码了一种第一多肽， 该第一多肽包括一个多肽序列， 该多 肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的 一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中所述第一多肽结合人类 CD86 和 / 或人类 CD80、 和 / 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或阻抑一种免疫应答， 以及 (ii) 一个第二多核苷酸序列， 该第二多核苷酸序列编码了一种第二多肽， 该第二多肽包括一种 免疫球蛋白 (Ig) 多肽的一个铰链区、 一个 CH2 结构域、 以及一个 CH3 结构域， 该 Ig 多肽可 任选地是人类 IgG2 Fc 多肽。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的宿主细胞， 该宿主细胞用编码了 一种融合蛋白的一种核酸进行转染， 该核酸包括 ： (i) 一个第一核苷酸序列， 该第一核苷酸 序列编码了包括一种多肽序列的一种第一多肽， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中所述第一多肽具有结合人类 CD86 和 / 或人类 CD80、 和 / 或二者之一的或两者的 一个细胞外结构域的能力， 和 / 或具有阻抑一种免疫应答的能力 ； 以及 (ii) 一个第二核苷 酸序列， 该第二核苷酸序列编码了一种第二多肽， 该第二多肽包括一种免疫球蛋白 (Ig) 多 肽的一个铰链区、 一个 CH2 结构域、 以及一个 CH3 结构域， 该 Ig 多肽可任选地是人类 IgG2 Fc 多肽， 其中该宿主细胞可表达该融合蛋白。
     在另一个方面， 本发明提供了阻抑一种免疫应答的方法， 所述方法包括将一种 B7- 阳性细胞与一个有效量的本发明的至少一种多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 或细胞进行接触 以阻抑一种免疫应答， 其中一种免疫应答由此受到阻抑。
     在另一个方面， 本发明提供了调整表达了 CD28 和 / 或 CTLA-4 的多个 T 细胞与多 个 B7- 阳性细胞的相互作用的方法， 该方法包括将 B7- 阳性细胞与一个有效量的本发明 的至少一种多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 或细胞继续拧接触以调整多个 B7- 阳性细胞与多个 CD28- 阳性 T 细胞和 / 或多个 CTLA-4- 阳性 T 细胞的相互作用， 其中该多个 B7- 阳性细胞与 多个 CD28- 阳性 T 细胞和 / 或多个 CTLA-4- 阳性 T 细胞的相互作用受到调整。
     在另一个方面， 本发明提供了抑制多个 CD28- 阳性 T 细胞和 / 或多个 CTLA-4- 阳性 T 细胞与多个 B7- 阳性细胞的相互作用的方法， 该方法包括将多个 B7- 阳性细胞与一个有效 量的本发明的至少一种多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 或细胞进行接触， 其中该多个 CD28- 阳性 T 细胞和 / 或多个 CTLA-4- 阳性 T 细胞与多个 B7- 阳性细胞的相互作用受到抑制。
     在另一个方面， 本发明提供了在一位受试者体内抑制多个 CD28- 阳性 T 细胞与多 个 B7- 阳性细胞的相互作用的方法， 该方法包括对一位受试者给予一个有效量的本发明的 至少一种多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 或细胞， 其中在该受试者体内的多个内源性 CD28- 阳性 T 细胞与多个内源性 B7- 阳性细胞的相互作用受到阻抑。
     在另一个方面， 本发明提供了治疗患有一种免疫系统疾病或紊乱的一位受试者的 方法， 该疾病或紊乱通过多个内源性 T 细胞与表达 CD80 和 / 或 CD86 的多个内源性细胞的 相互作用调整的， 所述方法包括对需要这种治疗的一位受试者给予一个治疗有效量的本发 明的至少一种多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 或细胞， 其中这种或这些在多个内源性 T 细胞与表 达所述 CD80 和 / 或所述 CD86 的多个内源性细胞之间的相互作用受到抑制， 由此治疗在该 受试者体内的免疫系统疾病或紊乱。
     在另一个方面， 本发明提供了抑制一位受方受试者对于来自一个供方的一个组织 或器官移植体的排斥的方法， 该方法包括对需要该方法的受方受试者给予一个治疗有效量 的本发明的至少一种多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 或细胞， 由此阻抑受方受试者对于该组织或 器官移植体的排斥。
     在另一个方面， 本发明提供了制备一种融合蛋白的方法， 该方法包括 ： (1) 在一种 培养基中培养用一种核酸转化的一种宿主细胞， 其中该核酸包括 ： (i) 一个第一核苷酸序 列， 该第一核苷酸序列编码了一种多肽， 该多肽具有与 SEQ ID NOS ： 1 至 73 中任何一个的 一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％的一致性， 该多肽结合 CD86 和 / 或 CD80、 和 / 或 CD86 或 CD80 之一的一个细胞外结构域， 以及 (ii) 一个第二核苷酸序列， 该第 二核苷酸序列编码了一种 Ig 多肽， 该 Ig 多肽包括一个铰链区、 CH2 结构域、 以及 CH3 结构 域， 由此表达了该核酸并且产生了一种融合蛋白 ； 并且 (2) 回收该融合蛋白。还提供了生产一种多肽的方法， 该方法包括将本发明的一种核酸引入到多个细胞 的一个群体之中， 其中该核酸被可操作地连接到有效生产由该核酸所编码的多肽的一个调 节序列上 ； 在一种培养基中培养这些细胞以生产该多肽 ； 并且将该多肽从这些细胞或培养 基中分离。
     还提供了多种组合物， 这些组合物包括本发明的一种分子 ( 例如， 突变 CTLA-4 分 子 ) 以及一种赋形剂、 载体、 或稀释剂。还包括了多种药物组合物， 这些诶药物组合物包括 本发明的一种分子以及一种药学上可接受的赋形剂、 载体、 或稀释剂。
     以下对本发明的其他方面进行说明。
     图式的简单说明
     图 1 是 质 粒 表 达 载 体 pCDNA 突 变 CTLA-4-Ig 的 示 意 图， 它包括编码了突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的核苷酸序列。 在图 1 中， 每个突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白包括本发明的 一个突变 CTLA-4ECD 多肽， 该多肽在其 C- 端与人类 IgG2(hIgG2)Fc 多肽的 N- 端进行融合。
     图 2A-2D 对应地是示例性 hCD80-Ig、 hCD86-Ig、 LEA29Y-Ig。以及 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白的示意图。示意性地显示了每个融合蛋白的信号肽、 细胞外结构域 (ECD)、 连接物 ( 如有任何存在 )、 以及 Ig Fc 结构域。还显示了存在于该信号肽、 ECD、 连接物 ( 如有任何 存在 )、 与 Ig Fc 之间的多个接合处的氨基酸残基。每个融合蛋白的信号肽典型地在加工 过程中受到切割， 并且因此该分泌 ( 成熟 ) 的融合蛋白典型地并不含有该信号肽序列。图 2D 展示了人类 CTLA-4-IgG2(“hCTLA-4-IgG2” ) 融合蛋白的示意图， 该融合蛋白包括一个 人类 CTLA-4 细胞外结构域 (“hCTLA-4 ECD” )， 该人类 CTLA-4 细胞外结构域在其 C- 端与 人类 IgG2 多肽的 N- 端进行共价融合。这种 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白的预测多肽序列示于 SEQ ID NO ： 161， 并且包括以下片段 ： hCTLA-4 信号肽 ( 氨基酸残基 1-37)、 hCTLA-4ECD 多肽 ( 氨基酸残基 38-161)、 以及人类 IgG2 Fc 多肽 ( 氨基酸残基 162-389)。在该 hCTLA-4 ECD 多肽的 C- 端与该人 IgG2 Fc 的 N- 端之间不包括连接物 ( 例如， 无氨基酸残基 )。该人类 IgG2 Fc 多肽包括人类 IgG2 的铰链区、 CH2 结构域、 以及 CH3 结构域。在图 2D 中， 显示了在 这些不同片段之间的接合处上的氨基酸残基。具体言之， 显示了该信号肽的后四个氨基酸 残基、 该 hCTLA-4ECD 多肽的前五个以及后五个氨基酸残基、 以及该人类 IgG2 Fc 多肽的前 五个以及后五个氨基酸残基。
     该信号肽典型地在加工过程中受到切割， 并且因此该 hCTLA-4-IgG2 的分泌融合 蛋白 ( 成熟融合蛋白 ) 典型地并不含有该信号肽序列。这种 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白的成 熟或分泌形式的多肽序列示于 SEQ IDNO ： 162。hCTLA-4 ECD 多肽的序列包括 SEQ ID NO ： 162 的氨基酸残基 1-124， 并且人类 IgG2 Fc 多肽的序列包括 SEQ ID NO ： 162 的氨基酸残基 125-352。在另一个方面， 这种成熟 hCTLA-4Ig 并不包括 C- 端赖氨酸 (K) 残基， 并且因此包 括 SEQ ID NO ： 162 的氨基酸残基 1-351。
     这种成熟 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白 ( 它具有总共 352 个氨基酸 ) 包括在 SEQ ID NO ： 160 中所示的全长 WT hCTLA-4 蛋白的多肽序列的氨基酸残基 38-389， 并且以下氨基酸 残基序列起始 ： 甲硫氨酸 - 组氨酸 - 缬氨酸 - 丙氨酸。若需要， 该成熟形式的氨基酸能够以 Met-His-Val-Ala 序列的 Met 起始来编号， 将 Met 指定为第一残基 ( 例如， 该 ECD 包括编号 为 1-124 的氨基酸残基 )， 如在 SEQ ID NO ： 162 中。成熟 hCTLA-4IgG2 是典型地在以下所 说明的实例的测定中使用的融合蛋白形式， 除非另有指明。编码了这种 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白 ( 它包括与 hIgG2 Fc 多肽相融合的 hCTLA-4ECD) 的 DNA 序列示于 SEQ ID NO ： 163。
     图 3 表示以下蛋白的 SDS/PAGE 分析 ： 不同质量的分子量标记物 ( 千道尔顿 (kDa)) (第1道)； 基于克隆 D3 的本发明的示例性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 即， D3-IgG2)( 第 2 道)； 基于克隆 D4 的一个示例性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 即， D4-IgG2)( 第 3 道 ) ； 以及 (Abatacept) 融合蛋白 ( 第 4 道 )(Bristol-Myers Squibb Co.， Princeton， NJ)。
     图 4 表示本发明的一种示例性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 即， D3-IgG2) 由 SEC 分 析获得的洗脱图， 证明本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白在从瞬时转染的 COS 细胞中纯化 时在尺寸上是同质的。
     图 5 显示了以下融合蛋白与 hCD86-Ig 的结合的典型 BiacoreTM 分析 ： 融 合蛋白、 LEA29Y-Ig、 以及 D3-IgG2。该分析的解离相以由箭头标记的时间开始。 融合蛋白 ( 它是由融合了突变 IgG1 Fc 结构域多肽的野生型人类 CTLA-4 ECD 多肽构成 ) 有效地充当一种野生型人类 CTLA-4-Ig 对照物。本发明的一种突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 如， D3-IgG2， 它与 融合蛋白相比具有与 CD86-Ig 相结合的更高的亲和力 ) 与 融合蛋白相比具有更慢的从 CD86-Ig 中解离的速率。
     图 6 是涉及本发明的示例性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 (D3-04-IgG2、 D3-11-IgG2、 D3-12-IgG2、 D3-14-IgG2) 的 PBMC 增殖抑制测定 ( 使用抗 -CD3 抗体刺激 ) 结果的图示。这 些测定显示， 与 以及 LEA29Y-Ig 相比， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白在体外 抑制 T 细胞增殖方面是显著地更加有效的。
     图 7 是涉及本发明的多个突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的示例性组的 CD4+T 细胞增 殖抑制测定 ( 使用抗 -CD3 刺激以及 hB7.2- 依赖的共刺激 ) 的图示。将 以及 LEA29Y-Ig 融合蛋白包括为对照物用于进行比较。
     图 8 是涉及本发明的多个突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的示例性组的 PBMC 增殖抑制 分析 ( 使用 PPD 抗原刺激 ) 的图示。将 以及 LEA29Y-Ig 融合蛋白包括为对照物 用于进行比较。
     图 9 是涉及本发明的一个示例性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 D3-IgG2 的单向混合淋 巴细胞反应 (MLR) 增殖抑制测定的图示。将 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白包括为对照 物用于进行比较。
     图 10 是显示本发明的一个示例性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的结构的示意图。 示意 性地显示了两个相同的单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 各自包括一个成熟突变 CTLA-4ECD， 该 ECD 在其 C- 端与人类 IgG2Fc 多肽的 N- 端进行融合。每个人类 IgG2 多肽包括一个 IgG2 铰链区、 CH2 结构域。以及 CH3 结构域。还显示了存在于该 ECD 与 Ig Fc 多肽之间的多个 接合处的示例性氨基酸残基。在这些成分之间的接合处上的氨基酸残基可以不同， 这取决 于该突变 CTLA-4 ECD 多肽序列和 / 或 Ig 多肽序列。这种二聚体融合蛋白是由至少一个二 硫键的形成而产生， 该二硫键在这两个单体中类似位置上的半胱氨酸残基之间形成。潜在 性地涉及在这两个单体之间形成二硫键的半胱氨酸 (C) 残基以星号进行标记。每个单体融 合蛋白的信号肽典型地在加工过程中受到切割， 并且因此该分泌 ( 成熟 ) 融合蛋白典型地 并不包括该信号肽序列。
     图 11 是涉及 hCTLA-4-IgG2、 以及 LEA29Y-Ig 融合蛋白的 CD4+T 细胞增 殖抑分析 ( 使用抗 -CD3 刺激以及 hB7.2- 依赖性共刺激 ) 的图示。图 12A-12F 表示野生型人类 CTLA-4 细胞外结构域的多肽序列 ( 在该图中称为 “hCTLA4ECD” )、 该 LEA29Y 多肽的多肽序列 ( 在该图中称为 “LEA29YECD” )、 与本发明的示例 性突变 CTLA-4 ECD 多肽的多肽序列的比对。本发明的这些突变 CTLA-4 ECD 多肽的克隆名 称示于左侧。与在野生型人类 CTLA-4 ECD 多肽中的氨基酸序列相同的氨基酸残基以句点 (.) 指明。
     图 13 表示一个 BLOSUM62 矩阵。
     图 14A-14D 显示针对两个氨基酸序列的示例性比对以及通过手动计算所确定所 确定的比对得分。
     图 15A-15B 显示在大鼠体内以 1mg/kg 作为一个单一 (A) 静脉 (IV) 团药或 (B) 皮 下 (SC) 注射所给予的 融合蛋白、 人类 CTLA-4-IgG2、 以及本发明的代表性突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白的药物动力学 (PK) 曲线。
     本发明的详细说明
     定义
     还应当理解的是， 本文中所用的术语仅是处于说明聚体的实施方案的目的并且并 不旨在进行限制。除非另外定义， 本文中所用的所有技术及科学术语具有与本发明所涉及 的领域内的普通技术人员所通常理解的意义相同的意义。
     术语 “核酸” 以及 “多核苷酸” 是可互换使用的以便是指处于单或双股形式的多个 核酸残基 ( 例如， 脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸 ) 的聚合物。除非明确限定， 这些术语涵 盖了含有天然核苷酸的已知类似物的核酸， 这些核酸与参比核酸具有类似的结合特性， 并 且可以按照与天然发生的核苷酸相类似的方式进行代谢。除非另有指明， 一种具体的核酸 序列还暗示性地涵盖它的多个保守性修饰的变体 ( 例如， 简并密码子的取代 ) 以及互补的 核苷酸序列， 连同明确指明的序列。确切地， 简并密码子的取代可通过产生多个序列而达 到， 在这些序列中一个或多个所选择 ( 或全部 ) 的密码子的第三位置被混合的碱基和 / 或 脱氧肌苷残基取代 (Batzer et al.， Nucleic AcidRes.19 ： 5081(1991) ； Ohtsuka et al.， J.Biol.Chem.260 ： 26052608(1985) ； 及 Cassol et al.(1992) ； Rossolini et al.， Mol. Cell.Probes 8 ： 9198(1994))。 术语核酸或多核苷酸是与 cDNA 或由一个基因所编码的 mRNA 互换使用的。
     术语 “基因” 广泛地是指与一种生物功能相关联的任何核酸片段 ( 例如， DNA)。一 个基因可包括它们的表达所要求的一个编码序列和 / 或调节序列。一个基因还可包括一个 或多个未经表达的 DNA 核酸片段， 这个或这些片段 ( 例如 ) 形成了其他的一种或多种蛋白 的识别序列 ( 例如， 启动子、 增强子、 或其他调节区域 )。一个基因可获自不同的来源， 包括 从所感兴趣的来源中克隆或从已知的或预测的序列信息而合成， 并且可包括一个或多个经 设计以具有所希望的参数的序列。
     术语 “多肽” 、 “肽” 、 以及 “蛋白” 是互换使用的以便是指多个氨基酸残基的聚合物。 这些术语应用至多个氨基酸聚合物上， 在这些氨基酸聚合物中一个或多个氨基酸残基是一 种对应的自然发生氨基酸的一个人工化学模拟物， 连同自然发生的氨基酸聚合物以及非自 然发生的氨基酸聚合物。 如在本文中所使用的， 这些术语涵盖了任何长度的氨基酸链， 包括 全长蛋白 ( 即， 抗原 )， 其中这些氨基酸残基是由共价肽键连接的。
     一种给定的氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号 “对应于” 或是 “相对” 一种所选择的氨基酸聚合物或核酸聚合物的编号， 当任何给定的聚合物组分 ( 例如， 氨基酸、 核苷酸， 也通称为 “残基” ) 的位置是参比所选择的氨基酸或核酸聚合物的一个相同或等效位置而指 定， 而并非由在该给定聚合物中该组分的实际编号位置而指定。因此， 例如， 一个给定氨基 酸位置在一个给定多肽序列中的编号对应于在用作一个参比序列的一个所选多肽序列中 的相同或等效的氨基酸位置。
     在本文中， 一个 “等效位置” ( 例如， 一个 “等效氨基酸位置” 或 “等效核酸位置” 或 “等效残基位置” ) 被定义为一种试验多肽 ( 或试验多核苷酸 ) 序列的一个位置 ( 如， 一个 氨基酸位置或核酸位置或残基位置 )， 该位置当使用在本文中所说明的比对算法进行比对 ( 优选的是最佳比对 ) 时与参比多肽 ( 或参比多核苷酸 ) 序列的一个对应位置金进行比对。 该试验多肽序列的等效氨基酸位置并不需要具有与该试验多肽的对应位置相同的数字位 置号。同样， 该试验多核苷酸序列的等效核酸位置并不需要具有与该试验多核苷酸的对应 位置相同的数字位置号。
     一种 “突变” 多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列与一种亲本或参比多肽的多肽序 列 ( 例如， 一种野生型 (WT) 多肽序列 ) 具有一个或多个氨基酸残基差异。在一个方面， 一 种突变多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列与一种亲本或参比多肽的多肽序列具有该亲本 或参比多肽序列残基总数的从大约 1％、 2％、 3％、 4％、 5％、 6％、 7％、 8％、 9％、 10％、 11％、 12 ％、 13 ％、 14 ％、 15 ％、 20 ％、 30 ％、 40 ％、 50 ％、 或更多的差异。在另一个方面， 一种突变 多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与一种亲本或参比多肽的多肽序列至少约 50％、 60 ％、 70 ％、 80 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97％、 98％、 或 99％的序列一致性。 在另一个方面， 一种突变多肽包括一个多肽序列， 该多肽 序列与一种亲本或参比多肽的多肽序列具有从 1 至 100 个或更多的氨基酸残基 ( 例如， 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20 个、 或更多的氨基酸残基 ) 差异。 一种突变多肽可包括一个多肽序列， 该多肽序列与一种亲本或参比多肽的多肽序列具有通 过 ( 例如 ) 该亲本或参比多肽的一个或多个氨基酸残基 ( 例如， 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20 个、 或更多的氨基酸残基 ) 的缺失、 添加、 或取代、 或这种 或这些缺失、 插入、 和 / 或取代的任何组合所造成的差异。该参比或亲本多肽其本身可以是 一种突变多肽。
     一种 “突变”核酸包括一个核苷酸序列， 该核苷酸序列与一种亲本或参比核酸 ( 如， 一种 WT 核酸 ) 的核苷酸序列具有一个或多个核酸残基差异。在一个方面， 一种突变 核酸包括一个核苷酸序列， 该核苷酸序列与一种亲本或参比核酸的核苷酸序列具有该亲 本或参比核苷酸序列残基总数的从大约 1 ％、 2 ％、 3 ％、 4 ％、 5 ％、 6 ％、 7 ％、 8 ％、 9 ％、 10 ％、 11％、 12％、 13％、 14％、 15％、 20％、 30％、 40％、 50％、 或更多的差异。 在另一个方面， 一种突 变核酸包括一个核苷酸序列， 该核苷酸序列具有与一种亲本或参比核酸的核苷酸序列至少 约 50％、 60％、 70％、 80％、 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 或 99％的序列一致性。在另一个方面， 一种突变核酸包括一个核苷酸序 列， 该核苷酸序列与一种亲本或参比核酸的核苷酸序列具有从 1 至 100 个或更多的核苷酸 残基 ( 例如， 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20 个、 或更多的核苷 酸残基 ) 差异。一种突变核酸可包括一个多肽序列， 该多肽序列与一种亲本或参比多肽的 多肽序列具有通过 ( 例如 ) 该亲本或参比多肽的一个或多个氨基酸残基 ( 例如， 1、 2、 3、 4、5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20 个、 或更多的氨基酸残基 ) 的缺失、 添加、 或取代、 或这种或这些缺失、 插入、 和 / 或取代的任何组合所造成的差异。在一种核酸中的 一个突变还可以产生于一个可替代的切割或核苷酸的平截或在核苷酸的加工或切割中的 错误。该参比或亲本核酸其本身可以是一种突变核酸。
     “自然发生” 当应用至受试者时意味着该受试者在自然中被发现而不同于由人类 人工生产的。 “非自然发生” 当应用至受试者时意味该受试者不是自然发生的 ( 即， 该受试 者不可能在自然中被发现 )。 例如， 一种非自然发生的多肽是指由人制备的一种多肽， 例如， 通过体外合成或人工制备。
     所感兴趣的一个序列的一个 “亚序列” 或 “片段” 是该完整序列的任何部分， 达到 但不包括所感兴趣的完整序列。
     一种核酸、 蛋白或其他组分当它部分地或彻底地与和它正常结合的多个组分 ( 其 他蛋白、 核酸、 细胞、 合成试剂、 等等 ) 分开时是 “分离的” 。在摩尔基础上， 在一个组合物中 一种分离的种类比其他种类更为大量的。例如， 该分离的种类可包括存在的所有大分子种 类的至少约 50 ％、 70 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99％、 或 100％ ( 在摩尔基础上 )。优选地， 所感兴趣的种类被纯化达到实质的均质性 ( 即， 在该组合物中污染物种类不能通过常规的检测方法检测到 )。纯度和均质性可使用本领域 中所熟知的多种技术确定， 如， 蛋白或核酸样本的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳， 之后跟对 染色、 然后立即显像。若希望， 可使用一种高分辨率的技术， 如高效液相层析 (HPLC) 或一种 类似手段用于材料的纯化。
     术语 “纯化的” 当应用至核酸或多肽上时总体上代表一种核酸或多肽， 该核酸或多 肽基本上不含其他组分， 如通过本领域所熟知的分析技术所确定 ( 例如， 一种纯化的多肽 或多核苷酸在电泳胶、 色谱洗脱液、 和 / 或经受密度梯度离心的媒质中形成一个离散的条 带 )。 例如， 在凝胶电泳中产生基本上一个条带的核酸或多肽是 “纯化的” 。 一种纯化的核酸 或多肽是至少约 50 ％纯度， 通常是至少约 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 99.5 ％、 99.6 ％、 99.7 ％、 99.8 ％、 或更加纯的 ( 例如， 在摩尔 基础上按重量计的百分比 )。
     在一个相关的意义上， 本发明提供了使组合物富含一种或多种本发明的分子的方 法， 如本发明的一种或多种多肽或多核苷酸。当在应用一种纯化或富集技术之后一种分子 的浓度存在着一种实质的增加时， 一种组合物即富含该分子。一种实质上纯的多肽或多核 苷酸将典型地包括按重量计 ( 在摩尔基础上 ) 在一个具体组合物中所有大分子种类的至 少约 55％、 60％、 70％、 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98、 99％、 99.5％或更多。
     一种核酸或多肽当它是人工或工程处理的， 或衍生自一种人工或工程处理的蛋白 或核酸时是 “重组” 的。
     术语 “重组” 当针对一种细胞使用时， 典型地是指该细胞复制了一种异源核酸或表 达了一种由异源核酸编码的多肽。重组细胞可包括不会在天然 ( 非重组 ) 形式的细胞中发 现的基因。 重组细胞还包括以下细胞， 这些细胞包括在天然形式的细胞中发现的基因， 但这 些基因被修饰或通过人工手段重新引入该细胞中。该术语还涵盖了以下细胞， 这些细胞包 括对于该细胞为内源性的一种核酸， 该核酸已经得到修饰， 未将该核酸从该细胞中去除 ； 此类修饰包括通过基因置换、 位点特异性突变、 以及本领域中的普通技术人员已知的相关技 术所获得的那些。 重组 DNA 技术包括用于在体外生产重组 DNA， 并将该重组 DNA 转移至它可 表达或扩增的细胞中、 由此产生一种重组多肽的技术。
     一个 “重组表达盒” 或简称为 “表达基因盒” 是一种重组地或合成地产生的核酸构 建体， 具有可以在与此类序列兼容的宿主中影响一个结构基因表达的多个核酸元件。表达 基因盒包括至少启动子以及可任选地的转录终止信号。典型地， 该重组表达盒包括一种有 待转录的核酸 ( 例如， 编码一种所希望的蛋白的核酸 ) 以及一个启动子。在影响表达方面 所需或有帮助的额外的因子也可如本文所说明进行使用。例如， 一个表达基因盒也可包括 多个核苷酸序列， 这些核苷酸序列编码了指导一种表达的蛋白从宿主细胞中分泌的信号序 列。 转录终止信号、 增强子、 以及影响基因表达的其他核酸序列也可包括于一个表达基因盒 中。
     如在本文中所使用的， 一个 “外源核酸” 、 “外源 DNA 片段” 、 “异源序列” 、 或 “异源核 酸” 是源自于对该具体的宿主细胞而言为外来的来源的， 或者若来自相同的来源， 则是从其 起始形式修饰的。因此， 在一个宿主细胞中的异源基因包括对于该具体的宿主细胞为内源 性的、 但已经过修饰的基因。在本文所说明的应用中一个异源序列的修饰典型地是通过使 用定向分子进化法而发生的。因此， 该术语是指一个 DNA 片段， 该 DNA 片段对于该细胞是外 来的或外源的， 或对于该细胞是同源的， 但在该宿主细胞核酸中的位置是原始无法发现该 元件的。将外源核酸或外源 DNA 表达以产生外源多肽。
     一个 “载体” 可以是能够在宿主细胞中递送或维持一种核酸的任何试剂， 例如但不 限于 ： 质粒 ( 例如， DNA 质粒 )、 裸核酸、 病毒载体、 病毒、 与一种或多种多肽或其他分子络合 的核酸、 连同固定在固相颗粒上的核酸。 载体在以下进行详细说明。 一个载体可用作一种试 剂用于在宿主细胞中递送或维持一个外源基因和 / 或蛋白。一个载体能够转导、 转染、 或转 化一种细胞， 由此造成该细胞复制或表达核酸和 / 或蛋白 ( 处理对于该细胞而言并非天然 的那些 )， 或以该细胞而言非属天然的方式复制或表达核酸和 / 或蛋白。 一个载体可包括协 助一种核酸进入该细胞的材料， 如， 一种病毒颗粒、 脂质体、 蛋白涂层、 或类似物。可使用将 一种核酸递送至该细胞中的任何方法 ； 除非另有指明， 术语载体并不是指将一种核酸递送 至一个细胞中的任何具体方法， 或者并不是指任何具体的细胞类型是转导的受试者。本发 明并不限于用于递送或维持本发明的任何核酸的任何特定载体， 该核酸包括 ( 例如 ) 编码 了本发明的一种突变 CTLA-4 多肽或它的一个片段 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD) 的一种核酸， 该核酸结合 CD80 和 / 或 CD86 或它的一个片段 ( 例如， 一个 CD80 ECD 或 CD86 ECD) 的。
     术语 “表达载体” 典型地是指重组地或合成地产生的一个核酸构建体或序列， 具有 一系列的特定核酸元件， 它允许将一种特定核酸转录至宿主细胞中。该表达载体典型地包 括有待转录的、 可操作地连接到一个启动子上的一种核酸。术语 “表达” 包括涉及生产这种 多肽的任何步骤， 包括但不限于 ： 转录、 转录后修饰、 翻译、 翻译后修饰、 和 / 或分泌。
     一种 “信号肽” 是一个肽 ( 或氨基酸 ) 序列， 该序列典型地是在所感兴趣的一种多 肽之前， 并且与该多肽共同进行翻译， 并且指导或协助该多肽进入分泌系统。 一种信号肽典 型地是与所感兴趣的多肽的氨基端共价地附连或融合的， 并且协助所感兴趣的多肽从宿主 细胞中的分泌。该信号肽典型地在翻译之后从所感兴趣的多肽中切割。
     术语 “编码” 是指一种核苷酸对一个或多个氨基酸进行编码的能力。该术语并不需要一个起始或终止密码子。 一个氨基酸序列可以在一个多核苷酸序列及其互补体所提供 的六个不同读框中的任何一个进行编码。
     术语 “对照序列” 在本文中进行定义以便包括对于表达本发明的一种多肽而言是 必需的或有利的所有组分。 每个对照序列可以是对于编码该多肽的核苷酸序列而言是天然 或外来的。此类对照序列包括但不限于 ： 一个引导子 (leader)、 多腺苷酸序列、 前肽序列、 启动子、 信号肽序列、 以及转录终止子。 在最小限度， 一个对照序列包括一个启动子， 以及转 录的和翻译的终止信号。这些对照序列可以与多个连接物一起提供， 这是出于引入特异的 限制性位点的目的， 这些位点协助了这些对照序列与编码了一种多肽的核苷酸序列的编码 区域的连接作用。
     术语 “编码序列” 是指一种核苷酸序列， 该核苷酸序列直接指定了其蛋白产物的氨 基酸序列。这个编码序列的边界总体上是由一个开放读框 (ORF) 确定的， 它可起始于 ATG 起始密码子。
     一种核酸当它被放置在与另一种核酸序列的功能性关系中时是与另一种核酸序 列 “可操作地连接” 的。 例如， 一个启动子或增强子是可操作地连接到一个编码序列上， 若它 指导了该编码序列的转录。可操作地连接意思是所连接的这些 DNA 序列典型地是邻近的， 并且在必需结合两个蛋白编码区域时是邻近的并且在阅读框中。然而， 因为增强子总体上 在距离该启动子几千个碱基时发挥作用并且内含子序列可具有可变化的长度， 一些多核苷 酸元件可以是可操作地连接的但并非邻近的。
     一种 “宿主细胞” 是任何易于用一种核酸转化的细胞。
     “一个多核苷酸序列的基本上全长” 或 “一个多肽序列的基本上全长” 对应地是 指一个多核苷酸序列或多肽序列长度的至少约 50 ％、 60 ％、 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 99.5 ％或更 多。
     一种 “抗原” 是指一种物质， 它与由特异性免疫原所刺激的免疫应答的这种或这些 产物进行反应。见， 如， JULIUS CRUSE ET AL.， ATLAS OFIMMUNOLOGY 60(1999) ； RICHARD COICO ET AL.， IMMUNOLOGY ： th A SHORTCOURSE 27-30(5 ed.2003)。一种免疫应答可包括一种体液应答和 / 或一种细胞介导 的免疫应答 ( 例如， 细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL))。免疫应答的产物可包括抗体和 / 或 CTL。 抗原典型地是大分子 ( 例如， 多肽、 核酸、 碳水化合物络合物、 磷脂、 多糖类 )， 这些大分子对 于该宿主而言是外来的 ； 被称为抗原决定簇的抗原的部分与该免疫应答的这种或这些产物 进 ( 如一种抗体或在 T 淋巴细胞上的特异性 T 细胞受体 ) 行反应 ( 例如， 与它或它们结合 )。 一种抗原可以 ( 但非必需 ) 诱发一种免疫应答并且与该免疫应答的这种或这些产物进行反 应。 “抗原性” 是指具有抗原性的状态或特性 - 即， 具有一种抗原的特性。一种抗原的特异 性可以显示在一种抗原与它的抗体 ( 反之亦然 ) 的关系中 ； 一种抗原典型地以高度特异的 方式与其对应的抗体进行反应， 并且并不会以相同程度的特异性与由该免疫原所诱发的其 他抗体进行反应。一个 “抗原量” 是一种抗原的量， 该抗原与由一种特异性免疫原所激发的 免疫应答的这种或这些产物进行可检测地反应。
     一种 “免疫原” 是指一种物质， 它可诱发一种免疫应答而非免疫耐受。见， 如， JULIUS CRUSE ET AL.， 以上说明文献于 60-61 ； RICHARD COICO， 以上说明文献于 27-30。 免疫原还与所诱发的 免疫应答的这种或这些产物进行反应 ( 例如， 结合 )， 这种或这些产物已经特异地诱对抗这些抗原。因此， 所有的免疫原都是抗原。 “免疫原性” 是指具有免疫原性的状态或特性 - 即， 具有一种免疫原的特性。一个 “免疫原量” 是有效诱发一种可检测的免疫应答的一种免疫 原的量。一种免疫原可在受试者体内引起一种强免疫应答， 如对于至少一种病原的至少部 分或完整的保护性免疫力。
     一种 “免疫调节剂” 或 “免疫调节性” 分子 ( 如， 一种免疫调节性多肽或核酸 ) 调 整了免疫应答。提及 “调整” 一种免疫应答或对其 “进行调整” 是指该免疫应答被改变。例 如， 在一位受试者体内 “调整” 一种免疫应答或对其 “进行调整” 总体上是指在该受试者体 内激发、 诱发、 抑制、 降低、 阻抑、 增加、 增强、 或以其他方式改变一种免疫应答。一种免疫应 答的这种调整可以通过本领域中的普通技术人员已知的方法进行评估， 包括以下所说明的 那些。一种 “免疫抑制药” 或 “免疫抑制剂” 是一种分子， 如多肽或核酸， 它阻抑一种免疫应 答。
     如在本文中所使用的， 一种 “抗体” ( 缩写为 “Ab” ) 是指一种免疫球蛋白 ( 缩写为 “Ig” )， 不论是天然的或全部或部分地合成产生的。该术语包括它的所有衍生物， 这些衍生 物维持了针对一种抗原的特异性结合能力。该术语还涵盖具有一个结合结构域的任何蛋 白， 该结合结构域与一种免疫球蛋白结合结构域是同源的或大致是同源的。此类蛋白可衍 生于天然来源， 或部分地或全部合成产生。一种抗体可以是单克隆的或多克隆的。一种抗 体可以是任何免疫球蛋白类别的一个成员， 包括以下五个人类类别中的任何一个 ： IgA( 它 包括亚型 IgA1 以及 IgA2)、 IgD、 IgE、 IgG( 它包括亚型 IgG1、 IgG2、 IgG3、 以及 IgG4) 以及 IgM。抗体包括成对的重以及轻多肽链， 并且每个这种链是由单个的免疫球结构域构成的。 每条链包括一个恒定 (C) 区以及一个可变 (V) 区。一种典型的抗体结构单元包括一个四聚 体。每个四聚体是由两组相同的多肽链对构成的， 每个对具有一条 “轻” 链 ( 大约 25kDa) 以 及一条 “重” 链 ( 大约 50-70kDa)。重链以五种主要类型 (γ、 μ、 δ、 α、 以及 ε) 存在， 这 取决于该抗体的类型， 并且含有大约 450 至 600 个氨基酸残基。 轻链具有两种主要类型 (λ 和 κ)， 并且含有大约 230 个氨基酸残基。 作为一种例子， 一种 IgG 抗体是一个四聚蛋白， 该 四聚蛋白包括两条重链以及两条轻链。每条 IgG 重链含有按照以下顺序从 N- 端至 C- 端所 连接的四个免疫球结构域 ： VH-CH1-CH2-CH3( 有时也缩写为 VH-CH1-CH2-CH3)。 这些缩写对应 地是指重链可变结构域、 重链恒定结构域 1、 重链恒定结构域 2、 以及重链恒定结构域 3。一 条重链也可以指抗体类型， 如， Cγ1， 它代表 IgG 抗体的伽玛 (γ) 重链的第一恒定结构域。 每条 IgG 轻链包括按照以下顺序从 N- 端至 C- 端所连接的两个免疫球结构域 ： VH-CL， 其中 VH 和 CL 对应地是指轻链可变结构域以及轻链恒定结构域。
     一种抗体的可变区 ( 它在每条多肽链的 N- 端典型地包括大约 100 至 110 个或更 多的氨基酸 ) 包括抗原结合决定簇， 并且因此主要负责抗原识和及特异性。多个抗体之间 的最大程度的氨基酸序列变异在该可变区中见到。 大部分的序列变异发生在位于该可变区 中的互补决定区 (CDR)。存在着总计六个 CDR， 三个 CDR 在各条重链中， 而三个 CDR 在各条 轻链中， 它们共同形成了抗原结合位点。 重链 CDR 被命名为 VH CDR1、 VH CDR2、 以及 VH CDR3， 而轻链 CDR 被命名为 VL CDR1、 VL CDR2、 以及 VL CDR3。位于 CDR 之外的区域称为框架 (FR) 区。不同抗体的框架区可在氨基酸残基方面发生变化， 但氨基酸变异的程度并未与不同抗 体的可变区之间变异的程度近似一样多。在多个情形下， 这些框架区提供了一个稳定的或 恒定的支架用于由 CDRs 所提出的氨基酸多样性。术语 “抗体片段” 是指小于全长的一种抗体的任何衍生物。抗体片段的实例包括 但不限于 ： 含有 VH-CH1 和 VH-CL 的抗原结合片段 (Fab)、 含有 VH 和 VL 的可变片段 (Fv)、 含 有一起连接在一条链中的 VH 和 VL 的单链可变片段 (scFv)、 连同其他 V 区片段， 如 Fab′、 F(ab)2， F(ab ′ )2、 dsFv 双 抗 体 (diabody)、 Fc、 以 及 Fd 多 肽 片 段。 见 CONCISE ENCYCLOPEDIA ： BIOCHEMISTRYAND MOLECULAR BIOLOGY(de Gruyter， 3d ed.1997)， 以及 Watson， J.D.et al.， RECOMBINANT DNA(2d ed.1992)( 以下称为 “Watson” )。
     一个抗体片段可以通过本领域中已知的任何手段产生。例如， 该抗体片段可通过 将一个完整的抗体断裂而酶促或化学产生， 或它可从一个编码了该部分的抗体序列的基因 中重组地产生。例如， 抗体的片段可通过用一种肽酶进行消化而产生。例如， 胃蛋白酶在铰 链区中在这些二硫键以下消化了一种抗体以产生 F(ab’ )2， 一种 Fab 片段的二聚体， 该 Fab 片段其本身是由一个二硫键结合 VH-CH1 的一条轻链。该 F(ab’ )2 可以在温和的条件下被 还原以破坏铰链区中的二硫化物连接体， 由此将该 (Fab′ )2 二聚体转化成为一个 Fab′单 体。该 Fab′单体实质上是一个具有部分的铰链区的 Fab 片段。对于抗体和抗体片段的更 为详细的说明， 见， FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY， ， W.E.Paul， ed.， Raven Press， N.Y.(1993)。尽管就 一种完整抗体的消化而言定义了不同的抗体片段， 本领域中的普通技术人员应当理解此类 Fab′片段可以从头化学地合成或通过使用重组 DNA 方法学来合成。因此， 该术语还包括通 过整个抗体的修饰而产生的或使用重组 DNA 方法学从头合成的抗体片段。
     可替代地， 该抗体片段可以是整个地或部分地合成产生的。该抗体片段可以可任 选地是一个单链抗体片段。 可替代地， 该片段可包括连接在一起的多个链， 例如通过二硫化 物连接体。该片段也可以可任选地是一种多分子络合物。一种功能性的抗体片段将典型地 包括至少约 50 个氨基酸， 并且将更典型地包括至少约 200 个氨基酸。
     一个免疫球蛋白或抗体分子的 Fc 区域或结构域 ( 也被称为 Ig Fc 多肽或 Fc 多 肽 ) 大致对应于该免疫球蛋白重链的恒定区， 并且负责不同的功能， 包括抗体的一种或多 种效应子功能。例如， IgG 分子的 Ig Fc 区域包括免疫球结构域 CH2 和 CH3 以及导向进入 CH2 的 N- 端铰链区。铰链区是在 Fc 与 CH1 之间的重链的一部分， 含有重链间的二硫键， 并 给予该抗体分子柔性。Fc 区域的恒定结构域与免疫系统的细胞相互作用。Fc 受体是结合 了抗体的 Fc 区域的蛋白。对于这种 IgG 抗体类别的一个重要的 Fc 受体家族包括 Fc 伽玛 受体 (FcγR)。在细胞上抗体对 Fc 受体的结合介导了多中抗体功能。不同的 IgG 亚类对 于 Fc 伽玛受体展示了不同的亲和力。大体上， 与 IgG2 和 IgG4 相比， IgG1 和 IgG3 以更大 的亲和力结合这些受体。Fc 受体表达在不同的细胞上， 包括例如 B 细胞、 单核细胞、 树状细 胞、 嗜中性细胞、 以及某些淋巴细胞。一个 Ig Fc 与它的受体的结合将这些效应子细胞带至 所结合的抗原的位点上， 最后造成信号传导以及免疫应答， 包括 B 细胞活化、 炎症应答、 细 胞毒性应答、 以及吞噬细胞的应答。
     一种 Ig Fc 融合体是一种分子， 该分子包括可操作地连接至一种免疫球蛋白或抗 体的 Fc 区域上的一个或多个多肽 ( 或一个或多个小分子 )。见， 如， Chamow et al.， 1996， Trends Biotechnol.14 ： 52-60。 因此， 一种 Ig Fc 融合蛋白是一种分子， 该分子包括可操作 地连接至一个 Ig Fc 区域上的一种或多种多肽。一种 Ig Fc 融合蛋白可包括例如， 一种抗 体的 Fc 区域 ( 它协助了效应子的功能和药物代谢动力学 )， 以及一种受体蛋白或配体蛋白 或其他蛋白或其片段的结合区域或结合结构域。 该结合区域或结合结构域介导了该靶受体或配体的识别 ( 与一种抗体的抗体可变区对一种抗原的识别是可比的 )。一个 Ig Fc 区域 可间接或直接连接到一个或多个多肽或小分子 ( 融合配偶体 ) 上。可以将本领域中所已知 的并且如以下详细说明的多个连接体用将一个 Ig Fc 连接到一个融合配偶体上以产生一种 Ig Fc 融合体。一种 Ig Fc 融合蛋白典型地包括直接或间接共价连接到至少一个多肽上的 Ig Fc 区域， 该多肽典型地结合一种靶配体或受体。
     单克隆的或多克隆的抗体可以用本领域中已知的任何技术进行制备 ( 见， 如， Kohler&Milstein， Nature 256 ： 495497(1975) ； Kozbor et al.， Immunology Today 4 ： 72(1983) ； Cole et al.， pp.7796 于 MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy(1985))。 可以将产生单链抗体的技术 ( 美国专利号 4,946,778) 进行适应以产生针对本发明多肽的 抗体。此外， 可将转基因小鼠或其他生物体 ( 包括哺乳动物 ) 用来表达人源化的抗体。可 以使用噬菌体展示技术来鉴定特异性地结合到所选择的抗原上的抗体以及杂聚性 Fab 片 段 ( 见， 如， McCafferty et al.， Nature 348 ： 552554(1990) ； Markset al.， Biotechnology 10 ： 779783(1992))。
     术语 “表位” 是指特异性结合到一种抗体的部分上的一个抗原决定簇。表位通常 是由多个分子的化学活性表面群集所构成， 如氨基酸或糖侧链， 并且通常具有特异的三维 结构特征， 连同特异的电荷特征。 对构象和非构象进行区分， 这是因为与前者的结合在变性 溶剂的存在下丧失而后者不会。
     两个分子 ( 例如， 一个配体和一个受体 ) 之间的一种 “特异性结合亲和力” 意思指 一个分子对另一个分子的偏好结合。多个分子的结合被典型地认为是特异的， 若该平衡结 2 -1 13 -1 4 合常数 ( 例如， KA) 是大约 1x10 M 至大约 1x10 M 或更多， 包括大约 10 至 1013M-1、 大约 6 12 -1 8 -1 11 -1 8 10 -1 10 至 10 M 、 大约 10 M 至 10 M 或大约 10 至 10 M 。在一个抗原与一个抗体之间的结 合相互作用的 KA 值典型地在从大约 105M-1 至大约 1012M-1 的范围内， 通常是大约 107M-1 至大 约 1011M-1， 并且经常是大约 108M-1 至大约 1010M-1。KA(M-1) 是通过计算 ka/kd 而确定的， 其中 -1 -1 -1 ka 是结合速率常数而 kd 是解离速率常数。ka 和 kd 的单位对应地是 M s 和 s 。平衡解离 常数 KD 是 KA 的倒数。KD ＝ kd/ka。对于反应 A+B< ＝ >AB( 代表结合到一个所感兴趣的单一 蛋白 ( 例如， 受体 ) 上的一个单一配体 )， KD 等于 ([A][B])/[AB]。用于测量结合亲和力和 / 或分子亲合力的熟知技术的非限制性实例包括例如， BiacoreTM 技术 (GE Healthcare)， 如 在本文其他地方所讨论， 等温滴定微量热法 (isothermal titration microcalorimetry) (MicroCal LLC， Northampton， MAUSA)、 ELISA、 以及荧光激活的细胞分选 (FACS) 法。例如， 可使用 FACS 或其他分选法来选择分子群 ( 例如， 展示细胞表面的配体 )， 这些分子群特异 地结合到相关联的结合对成员 ( 如， 受体， 例如一种可溶性受体 ) 上。配体 - 受体络合物可 ( 例如 ) 通过荧光进行检测并分选 ( 例如， 通过将该络合物与识别该络合物的一种荧光抗 体进行反应 )。将结合一种相关联的结合对成员 ( 例如， 受体 ) 的所感兴趣的分子汇集并 且在较低的受体浓度的存在下再次进行分选。通过在降低的受体浓度 ( 一个示例性浓度范 围， 在 10-6M 降至 10-13M 的数量级上， 即， 由 1 微摩尔浓度 (μM) 降至 1 纳摩尔浓度 (nM)、 或 -11 -12 更小 ( 例如， 10 M 或 10 M) 的存在下进行多轮分选， 根据该配体 - 受体相互作用的本质， 可分离出对于该受体展示出特异的结合亲和力的所感兴趣的分子群。
     当提及一种蛋白时， 短语 “特异地 ( 或选择性地 ) 结合” 一种抗体或 “特异地 ( 或 选择性地 ) 进行免疫应答” 是指一种结合反应， 该结合反应是该蛋白在一个异质性蛋白群体以及其他生物制品学中存在的确定物。因此， 在指定的免疫分析条件下， 所限定的抗体 以背景值的至少两倍结合到一种具体的蛋白上， 并且不会以一个显著的量基本上结合到在 该样本中存在的其他蛋白上。在此类条件下特异性结合到一种抗体上可能要求一种抗体， 该抗体是针对它对一种具体蛋白的特异性选择的。可使用多种免疫分析形式来选择可与 一种具体蛋白进行特异性免疫应答的抗体。例如， 例行使用固相 ELISA 免疫测定来选择与 一种蛋白进行特性地免疫应答的抗体 ( 见， 如， Harlow&Lane， Antibodies， A Laboratory Manual(1988)， 用来确定特异性免疫反应性的免疫分析形式以及条件的说明 )。通常而言， 一种特异性或选择性的反应应当是至少两倍的背景信号或噪声并且更典型地是从 10 至 100 倍中背景值的。
     术语 “细胞因子” 包括例如但不限于 ： 白介素、 干扰素 (IFN)、 趋化因子、 造血生长 因子、 肿瘤坏死因子 (TNF)、 以及转化生长因子。大体上， 此类细胞因子是小分子量的蛋白， 这些蛋白调控了免疫系统细胞的成熟、 活化、 增殖、 以及分化。
     术语 “筛选” 总体上说明了一个过程， 该过程识别了本发明的最佳分子， 例如包括 本发明的多肽， 以及包括其的相关融合蛋白， 以及编码所有此类分子的核酸。 可以在选择和 筛选中使用对应分子的几种特性， 例如， 一种对应分子在试验系统或在体外、 离体、 或体内 的应用中诱发或改变一种所希望的免疫应答的能力。 “选择” 是一种筛选形式， 其中通过一 个选择性标记的表达同时达到了识别和物理分离， 它在一些遗传学情形下在其他细胞死亡 时允许表达该标记的细胞存活 ( 或反之亦然 )。筛选标记包括例如， 荧光素酶、 β- 半乳糖 苷酶、 以及绿色荧光蛋白、 反应底物、 以及类似物。 选择性标记包括药物和毒素耐受基因、 以 及类似物。 另一种选择模式涉及基于一个可检测事件的物理分选， 如， 一个配体与一个受体 的结合、 一种底物与一种酶的反应、 或任何其他能够直接地 ( 例如， 通过使用一种生色的底 物或配体 ) 或间接地 ( 例如， 通过与一种生色的第二抗体进行反应 ) 产生一种可检测信号 的物理过程。 通过物理分选进行的选择可以通过不同的方法完成， 这些方法包括但不限于， 例如， 在全细胞或微滴形式中的 y FACS。
     由于在体外研究初级免疫应答的限制， 体内试验是特别有用的筛选方法。在一些 此类研究中， 首先将本发明的一种多核苷酸或多肽引入试验受试者 ( 例如， 一种哺乳动物， 如， 一种动物 ) 体内， 并且随后研究了一种经诱发的免疫应答， 这是通过分析在经免疫动物 体内的免疫应答类型 ( 例如， 经免疫动物血清中的抗体生产， T 细胞的增殖 )， 或通过研究在 该经免疫动物体内该经诱发免疫应答的质量或强度 ( 例如， 经诱发的抗体效价水平 ) 而进 行的。
     如在本文中所使用的， 术语 “受试者” 包括但不限于 ： 一种生物或动物， 包括哺乳动 物和非哺乳动物。 一种哺乳动物包括例如但不限于 ： 人类、 非人类灵长类 ( 例如， 狒狒、 红毛 猩猩、 猴、 大猩猩 )、 小鼠、 狗、 猪、 牛、 山羊、 猫、 兔、 大鼠、 豚鼠、 仓鼠、 马、 绵羊、 或其他非人类 哺乳动物。一种非哺乳动物包括例如但不限于 ： 一种非哺乳动物无脊椎动物以及非哺乳动 物脊椎动物， 如， 一种鸟 ( 例如， 一种鸡或鸭 ) 或一种鱼。
     术语 “药物组合物” 是指适合于在受试者 ( 包括一种动物或人类 ) 体内的药物用 途的组合物。 一种药物组合物典型地包括一个有效量的一种活性剂以及一种载体、 赋形剂、 或稀释剂。该载体、 赋形剂、 或稀释剂典型地对应地是一种药学上可接受的载体、 赋形剂或 稀释剂。术语 “有效量” 是指一种物质的一个剂量或量， 该剂量或量足以产生一个所希望的 结果。所希望的结果可包括在该剂量或量的受方体内的一个客观或主观改进。例如， 所希 望的结果可包括在一位受试者体内的一种免疫应答的可测量、 可检测或可测试性的诱发、 促进、 增强、 或调整， 对该受试者已经给予了一个剂量或量的一种具体抗原或免疫原 ( 或其 组合物 )。可将足以产生这种结果的一种免疫原的一个剂量或量说明为一个 “免疫原性” 剂 量 ( 药量 ) 或量。
     一种 “预防性治疗” 是给予一位受试者的一种治疗， 该受试者未显示一种疾病、 病 理学、 或紊乱的迹象或症状， 或仅显示了其早期迹象或症状的， 这样使得出于防止或降低了 发展该疾病、 病理学、 或紊乱的风险的目的而给予治疗。一种预防性治疗作为对抗一种疾 病、 病理学、 或紊乱的防止性治疗， 或作为抑制或降低一种疾病、 病理学、 或紊乱进一步发展 或增强的治疗而发挥作用。一种 “预防活性” 是一种试剂的一种活性， 该试剂当给予一位受 试者 ( 该受试者未显示一种病理学、 疾病、 或紊乱的迹象或症状， 或仅显示其早期迹象或症 状 ) 时防止或降低了发展该病理学、 疾病、 或紊乱的风险。一种 “预防上有用” 的试剂 ( 例 如， 核酸或多肽 ) 是指一种试剂， 该试剂在防止一种疾病、 病理学、 或紊乱的发展方面是有 用的， 或在抑制或降低一种疾病、 病理学、 或紊乱进一步发展或增强方面是有用的。
     一种 “治疗性治疗” 是给予一位受试者的一种治疗， 该受试者显示了病理学、 疾病、 或紊乱的症状或迹象， 其中出于减少或消除这些迹象或症状而将治疗给予该受试者。一种 “治疗活性” 是一种试剂的一种活性， 该试剂当给予一位患有病理学、 疾病、 或紊乱的迹象或 症状的受试者时消除或减少了这些迹象或症状。一种 “治疗上有用的” 试剂是指该试剂用 于减少、 治疗、 或消除一种疾病、 病理学、 或紊乱的迹象或症状。
     总体上， 在本文中使用的命名法以及在以下说明的细胞培养、 分子遗传学、 分子生 物学、 核酸化学、 以及蛋白质化学中的实验室操作是本领域中的普通技术人员所熟知的并 且经常使用的。标准技术， 如在 Sambrook et al.， Molecular Cloning □ A Laboratory Manual(2nd Ed.)， Vols.1-3， Cold SpringHarbor Laboratory， Cold Spring Harbor， New York， 1989( 以 下 称 为 “Sambrook” ) 以 及 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY， F.M.Ausubel et al.， eds.， Current Protocols， Greene Publishing Associates， Inc. 与 John Wiley&Sons， Inc. 的合资企业 (1994， 增刊至 1999)( 以下称为 “Ausubel” ) 中所说明， 用于重组核酸方法、 核酸合成、 细胞培养方法、 以及转基因的掺入， 例如， 电穿孔、 注射、 基因 枪、 经由皮肤印记、 以及脂质转染 (lipofection)。 总体上， 寡核苷酸合成以及纯化步骤是根 据说明书而进行的。 这些技术和操作典型地是根据本领域内的常规方法以及子本文件中通 篇提供的不同概述性参考文献而进行的。 其中的操作据信是本领域中的普通技术人员所熟 知的， 并且是为了读者方便而进行提供。
     在本文中对不同的额外术语是进行定义或以其他方式进行表征。
     本发明的分子及方法 _
     本发明提供了用于治疗免疫系统的疾病、 紊乱、 以及病况的分子和方法， 包括例 如， 其中调整免疫系统 ( 例如， T 细胞依赖的免疫应答 ) 是希望的那些。本发明的分子 ( 例 如， 本发明的多肽、 本发明的偶联物、 本发明的可溶性融合蛋白、 编码此类多肽或融合蛋白 的核酸 ) 用于治疗其中希望免疫抑制的免疫系统疾病、 紊乱、 以及病况， 包括例如但不限 于： 自身免疫疾病、 紊乱、 以及病况、 免疫增生性疾病、 移植物相关紊乱的治疗， 以及涉及由从一个供方到一个受方的组织、 细胞、 器官、 或移植物的移植的治疗方法， 其中阻抑该受方 体内对抗该供方的组织、 细胞、 器官、 或移植物的免疫应答是希望的。
     在一个方面， 本发明提供了新颖的突变 CTLA-4 分子， 它们与一个 CTLA-4 分子 ( 例 如， 结合 CD80 和 / 或 CD86 的野生型人类 CTLA-4 多肽 ( “hCTLA-4” ) 或它的一个片段， 如人 类 CTLA-4 的细胞外结构域 ( “hCTLA-4ECD” )) 相比具有改进的特性。如以下更为详细的讨 论， 使用不同的诱变和筛选策略来制得并识别了结合 CD80 和 / 或 CD86 的新颖突变 CTLA-4 分子。 特别地， 使用此类策略来制得并识别对于 CD80(B7-1) 和 / 或 CD86(B7-2) 具有改进的 结合亲合力的 CTLA-4 突变分子 ( 当与人类 CTLA-4(“hCTLA-4” ) 相比 )， 和 / 或对于 CD80 和 / 或 CD86 具有改进的结合亲合力的 CTLA-4 突变分子 ( 当与 hCTLA-4ECD 相比 )。结合表 达于抗原呈递细胞上的内源性 CD80 和 / 或 CD86 配体的本发明的突变 CTLA-4 分子有效地 抑制或阻断这些配体与内源性 CD28 受体 ( 该受体表达于 T 细胞表面上 ) 的相互作用。作 为结果， 由 T 细胞表面受体 CD28 与 B7 分子 ( 即， CD80 和 CD86) 的相互作用所提供的对 T 细 胞活化重要的共刺激信号受到抑制或阻断。此类 T 细胞并未受到最适活化， 并且具有降低 的增殖能力。
     在其中一个 CD80 或 CD86 配体与一个 CD28 受体之间的信号传导受到阻断的情形 下， T 细胞并未受到最适刺激而成为活性的， 并且因此并未受到最适诱发而进行增殖。类似 地， 在其中一个 CD80 或 CD86 配体与一个 CD28 受体之间的信号传导受到阻抑的情形下， T细 胞的活化及增殖受到阻抑。在一个方面， 本发明提供了突变 CTLA-4 分子， 它们作为 CTLA-4 信号传导的拮抗剂而发挥作用。在另一个方面， 本发明提供了突变 CTLA-4 分子， 它们作为 CD28 信号传导的拮抗剂而发挥作用， 由此阻抑或阻断 T 细胞依赖的免疫应答 ； 此类分子作 为免疫抑制剂而发挥作用。在又一个方面， 本发明提供了突变 CTLA-4 分子， 它们结合 CD80 和 CD86， 但它们针对 CD86 具有比针对 CD80 的更高的结合亲合力， 并且因此可抑制 CD86 依 赖的共刺激作用的程度大于 CD80 依赖的共刺激作用。本发明的所有此类突变 CTLA-4 分子 预期用于治疗其中希望免疫抑制或免疫抑制可能具有益处的疾病、 紊乱、 或病况。
     一种人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白以及一种特异的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 两者皆 由 Bristol-Myers Squibb Co.(Princeton， NJ) 研发 ) 已经显示有效治疗某些免疫相关性 疾病或病况。 融合蛋白 ( 也称为阿巴西普 (“ABA” ))(Bristol-Myers Squibb Co.(Princeton， NJ)) 是一种可溶性重组二聚体融合蛋白， 它是由通过一个二硫键共价连接 在一起的两个相同的单体免疫球蛋白 (Ig) 融合蛋白构成， 该二硫键在每个单体融合蛋白 中存在的半胱氨酸残基之间形成。 ORENCIA 是 Bristol-Myers Squibb Company 的注册商标。 二聚体的每个单体 Ig 融合蛋白是由人类 CTLA-4 的细胞外结构域 (SEQ ID NO ： 159) 构成， 该细胞外结构域在其 C- 端与一种特异的突变 IgG1 Fc 多肽 (SEQ ID NO ： 186) 的 N- 端进行融合。 每个这种单体融合蛋白的完整多肽序列示于 SEQ ID NO ： 164。 二 聚体是在一个哺乳动物表达系统中生产的， 并且具有 92kDa 的表观分子量。 据信 二聚体的两个单体 Ig 融合蛋白是通过一个单一的二硫键共价连接在一起的， 该二硫键在 位于每个 hCTLA-4- 突变 IgG1 单体的位置 120 上的半胱氨酸残基之间形成， 并且在这两个 突变 IgG1 Fc 多肽之间没有形成二硫键。
     二聚体是一种选择性共刺激调节剂， 它通过结合 CD80 和 CD86 并且因此 阻断了与 CD28 的相互作用而抑制了 T 细胞活化。 二聚体目前已被批准用于治疗患有中度至严重的类风湿性关节炎 (RA) 的人类成人。 额外的有关 二聚体及其 临床适应症以及有效性的信息以 orencia.com 和 bms.com 提供在万维网上。
     如以上所指出， 二聚体的每个融合蛋白单体含有一个人类 CTLA-4 细胞 外结构域。人类 CTLA-4 是一种膜蛋白， 该膜蛋白瞬时表达于 T 细胞上。WT 全长 hCTLA-4 的 全长蛋白序列示于 SEQ ID NO ： 160， 并且一个编码了 WT 全长 hCTLA-4 的核酸序列示于 SEQ ID NO ： 194。人类 CTLA-4 包括一种信号肽 (SP)、 细胞外结构域 (ECD)、 跨膜结构域 (TD)、 以 及细胞质结构域 (CD)， 以该顺序共价连接在一起 ( 例如， SP 的 C- 端共价连接到 ECD 的 N- 端 上， ECD 的 C- 端共价连接到 TD 的 N- 端上， 而 TD 的 C- 端共价连接到 CD 的 N- 端上 )。WT hCTLA-4 ECD 多肽典型地包括全长 hCTLA-4 蛋白序列 (SEQ ID NO ： 160) 的残基 38-161， 并 且典型地长度为 124 个氨基酸残基。这个 hCTLA-4ECD 多肽序列示于 SEQ ID NO ： 159。该全 长 hCTLA-4 蛋白的信号肽 (SP)( 典型地包括 SEQ ID NO ： 160 的氨基酸残基 1-35 或 1-37) 在加工过程中被切割。见， 如， Harper et al.， J.Immunol.147(3) ： 1037-1044(1991)。包 括 hCTLA-4 蛋白的氨基酸残基 1-35 或 1-37 的人类 CTLA-4 信号肽序列对应地示于 SEQ ID NO ： 182 或 SEQ IDNO ： 216。不论该信号肽序列是示于 SEQ ID NO ： 182 或 SEQ ID NO ： 216 的 那个， 当该信号肽被切割时， 该成熟 hCTLA-4 蛋白典型地以在 SEQ ID NO ： 160 中所示的全长 hCTLA-4 蛋白序列的氨基酸位置 38 上的甲硫氨酸残基起始。因此， 即使该 hCTLA-4 信号肽 序列是 SEQ ID NO ： 182 的那个 ( 它包括 hCTLA-4 蛋白的氨基酸残基 1-35)， 得到的成熟分 泌的 hCTLA-4 蛋白仍以在全长 hCTLA-4 蛋白的位置 38 上的甲硫氨酸起始。对应地在全长 hCTLA-4 蛋白的位置 36 和 37 上的赖氨酸 (K) 和丙氨酸 (A) 并不存在于成熟 hCTLA-4 蛋白 中， 并且据信它们在加工过程中从该成熟 hCTLA-4 蛋白中切割。因此， 成熟 hCTLA-4 蛋白序 列的氨基酸残基典型地以在全长 hCTLA-4 蛋白的位置 38 上存在的甲硫氨酸残基作为第一 氨基酸 ( 即， 占据位置 1) 起始进行编号 ； 因此， 组氨酸残基占据了成熟 hCTLA-4 蛋白中的氨 基酸位置 2， 等等。 二聚体的每个单体包括在 SEQ ID NO ： 159 中所示的 hCTLA-4 ECD 多肽序列。在全长 WT hCTLA-4 蛋白中， 该信号肽包括 SEQ ID NO ： 160 的氨基酸残基 1-37， 该细胞外结构域 (ECD) 包括氨基酸残基 38-161， 该跨膜结构域 (TD) 包括氨基酸残基 162-182， 并且该细胞质结构域 (CD) 包括氨基酸残基 183-223。 该 hCTLA-4 蛋白的成熟结构 域 (MD) 典型地包括 SEQ ID NO ： 160 的氨基酸残基 36-223， 或在一些情形下包括氨基酸残 基 37-223 或 38-223。
     SEQ ID NO ： 194 的核酸包括一个编码了信号肽序列的核酸序列 ( 核苷酸残基 1-111)、 一个编码了 hCTLA-4 ECD 的核酸序列 ( 核苷酸残基 112-483)、 一个编码了 hCTLA-4 跨膜以及细胞质结构域的核酸序列 ( 核苷酸残基 484-669) ； 最后 3 个 C- 端核苷酸是 TGA 终 止密码子。
     贝 拉 西 普 ( 也 被 称 为 “LEA29Y-Ig” 、 “LEA-Ig” 、或 “A29YL104E-Ig” ) (Bristol-Myers Squibb Co.(Princeton， NJ)) 是一种可溶性重组二聚体蛋白， 它是由通过 一个二硫键共价连接在一起的两个相同的 Ig 融合蛋白构成， 该二硫键在每个单体融合蛋 白中的半胱氨酸残基之间形成。每个单体融合蛋白是由一个突变 CTLA-4 细胞外结构域多 肽构成， 该结构域多肽在其 C- 端与一种特异的突变 IgG1 多肽的 N- 端进行融合。该突变 CTLA-4 ECD 的多肽序列与 WT 人类 CTLA-4 ECD 具有两个突变的差异， 确切地是将一个酪氨 酸取代在位置 29 上的丙氨酸 ( 缩写为取代 A29Y) 以及将一个谷氨酰胺取代在位置 104 上的亮氨酸 ( 缩写为取代 L104E)， 其中在该人 CTLA-4ECD 中的氨基酸残基用在 N- 端上的甲 硫氨酸 ( 表示在位置 1 上的氨基酸 ) 进行编号。贝拉西普的每个单体包括在 SEQ ID NO ： 186 中所示的突变 IgG1Fc 多肽序列 ； 这种突变 IgG1 Fc 多肽是与包括于 融合蛋 白中的突变 IgG1 Fc 多肽相同的。 因此， 贝拉西普单体融合蛋白与每个 单体融合 蛋白具有两个氨基酸的差异。贝拉西普中每个单体融合蛋白的多肽序列示于 SEQ ID NO ： 166。因此， 名称 “LEA29Y-Ig” 反映了以下事实 ： 贝拉西普二聚体的每个单体融合蛋白是由 一个突变 CTLA-4ECD 构成的， 它与该人类 CTLA-4ECD 多肽序列具有 L104E 和 A29Y 这两个突 变的差异。与 二聚体相比， 贝拉西普已经显示高出大约 4 倍亲合性地结合 CD86， 并且以高出大约 2 倍亲合性地结合 CD80(Larson et al.， Amer.J.Transplant.5 ： 443-453， 444(2005)。与 二聚体相比， 在体外抑制 T 细胞活化方面贝拉西普已经显示可以 达到高出大约 10 倍的强度， 并且与 蛋白相比具有改进的体内免疫抑制强度， 如 通过其抑制 T 细胞依赖的抗体反应的增加的能力以及在涉及非人类灵长类的临床试验中 它的改进的肾同种移植存活延长所显示。相同文献。额外的有关贝拉西普及其临床适应症 以及有效性的信息以 bms.com 提供在万维网上。
     在一个方面， 本发明提供了突变 CTLA-4 分子， 包括在本文中所说明的新颖可溶性 重组突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 它对 CD86 的结合亲合力大于 二聚体 ( 二聚体 hCTLA-4-Ig) 对 CD86 的结合亲合力。本发明还提供了突变 CTLA-4 分子， 包括新颖的可溶 性重组二聚体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 它对 CD80 具有一种结合亲合力， 该结合亲合力是 大约等于或大于 二聚体对 CD80 的结合亲合力。在又另一个方面， 本发明提供了 突变 CTLA-4 分子， 包括新颖的可溶性重组突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 它比 (阿 巴西普 ) 具有阻抑一种或多种免疫应答 ( 例如， T 细胞依赖的免疫应答 ) 的更大的能力。 与 二聚体相比， 具有一种或多种改进特性的本发明的突变 CTLA-4 分子预期更为 强效， 并且因此在治疗其中希望免疫抑制的疾病、 紊乱、 或病况中比 二聚体更加 有效、 有用、 并且有利， 这些疾病、 紊乱、 或病况包括 二聚体已批准和 / 或已经显 示提供了临床益处的那些疾病、 紊乱、 或病况， 如免疫疾病 ( 包括， 类风湿性关节炎及牛皮 癣 )。
     在又另一个方面， 本发明提供了突变 CTLA-4 分子， 包括在本文中所说明的新颖可 溶性重组突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 它对 CD86 具有一种结合亲合力， 该结合亲合力大于贝 拉西普 (LEA29Y-Ig) 对 CD86 的结合亲合力。 本发明还提供了突变 CTLA-4 分子， 包括在本文 中所说明的新颖可溶性重组突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 它对 CD86 具有一种结合亲合力， 该 结合亲合力大于贝拉西普对 CD86 的结合亲合力。 在另一个方面， 本发明提供了突变 CTLA-4 分子， 包括在本文中所说明的新颖可溶性重组突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 它比贝拉西普具 有阻抑一种或多种免疫应答 ( 例如， T 细胞依赖的免疫应答 ) 的更大的能力。与贝拉西普 相比， 具有一种或多种改进特性的本发明的突变 CTLA-4 分子预期比贝拉西普更加强效， 并 且因此在治疗其中希望免疫抑制的疾病、 紊乱、 或病况中比贝拉西普更加有效、 有用、 并且 有利， 这些疾病、 紊乱、 或病况包括贝拉西普融合蛋白已经显示提供临床益处的那些疾病、 紊乱、 或病况， 如非人类灵长类的肾同种移植存活。
     使用与在涉及类似受试者的 临床试验中所采用的方法学可比的那些 可以确定本发明的一个分子在一位受试者体内的安全性、 耐受性、 药物代谢动力学、 免疫原性、 以及临床功效， 该分子例如本发明的一个突变 CTLA-4 分子 ( 例如， 以下详细说明的突变 CTLA-4ECD 多肽或可溶性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )， 该受试者患有一种免疫疾病或紊乱 ( 例如， 类风湿性关节炎、 多发性硬化症、 牛皮癣、 等等 )， 以一种特定方式 ( 例如， 胃肠外、 静 脉内、 或皮下给药 ) 对该受试者给予一个特定剂量的该分子。 见， 如， 以 bms.com 和 orencia. com 为地址的万维网网站。 例如， 使用与在涉及 RA 患者的 临床试验中所采用的方 法学相类似的那些可以评估本发明的一个突变 CTLA-4 分子 ( 例如， 可溶性突变 CTLA-4-Ig) 在降低患有类风湿性关节炎 (RA) 的受试者体内的关节损伤的进展、 在减轻 RA 的迹象和症 状 ( 包括疼痛减轻 ) 方面的有效程度。
     使用与在涉及类似受试者的贝拉西普临床试验中所采用的方法学可比的那些 可以确定本发明的一个分子 ( 例如， 以下详细说明的突变 CTLA-4ECD 多肽或可溶性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) 在一位受试者体内的安全性、 耐受性、 药物代谢动力学、 免疫原性、 以 及临床功效， 在该受试者体内免疫抑制是希望的 ( 例如， 一位受试者， 他经受了来自一个供 方的组织、 细胞、 器官、 或移植物的移植 ) 并且以一种特定方式 ( 例如， 胃肠外、 静脉内、 或 皮下给药 ) 对该受试者给予一个特定剂量的该分子。见， 如， 以 bms.com 和 orencia.com 为 地址的万维网网站。例如， 使用与在涉及经历肾或肾脏移植的受方患者的贝拉西普临床试 验中所采用的方法学相类似的那些可以评估本发明的一个突变 CTLA-4 分子 ( 例如， 可溶性 突变 CTLA-4-Ig) 在经历肾或肾脏移植的患者体内的肾或肾脏移植体的排斥方面的有效程 度。
     本发明的分子和方法以及本发明的其他方面在以下进行额外的详细讨论。
     本发明的多肽
     本发明提供了新颖的多肽， 集合称为 “本发明的多肽” 。术语 “本发明多肽” 旨在包 括在本文中披露的这些多肽序列的变体和 / 或衍生物。本发明的多肽包括重组非自然发生 或突变 CTLA-4 多肽， 该 CTLA-4 多肽结合 CD80 和 / 或 CD86 和 / 或抑制或阻抑一种免疫应 答。本发明的多肽包括重组融合蛋白， 这些重组融合蛋白包括本发明的一种突变 CTLA-4 多 肽， 并且包括此类融合蛋白的单体和二聚体形式。 本发明的多肽包括多聚体， 这些多聚体包 括本发明的一个或多个突变 CTLA-4 多肽。本发明还包括偶联物， 这些偶联物包括本发明的 一个或多个突变 CTLA-4 多肽。本发明的一些多肽是可溶性多肽。例如， 如以下更为详细说 明的， 本发明包括可溶性的融合蛋白， 这些融合蛋白包括与一种不同的多肽 ( 例如， 一种免 疫球蛋白多肽， 例如， 一种 Ig Fc 多肽 ) 连接的一种突变 CTLA-4 ECD 多肽， 该不同的多肽增 强了该突变 CTLA-4ECD 多肽的溶解度。
     如以下更为详细讨论的， 在本发明的一个方面， 使用不同的诱变和筛选策略来制 得并识别了结合 CD80 和 / 或 CD86 的新颖多肽。特别地， 使用此类策略来制得并识别具有 结合 CD80 和 / 或 CD86 的改进能力的新颖多肽， 包括具有对于 CD80 和 / 或 CD86 的改进的 结合亲和力或亲合力的新颖突变 CTLA-4 多肽。结合了在抗原呈递细胞上表达的 CD80 和 / 或 CD86 配体的本发明的多肽干扰或阻断了这些配体与在 T 细胞表面上表达的 CD28 受体的 相互作用。作为结果， 由 T 细胞表面受体 CD28 与 B7 分子 ( 即， CD80 和 CD86) 的相互作用 所提供的 T 细胞共刺激信号受到抑制或阻断。此类多肽据信用于多种疾病、 紊乱、 以及病况 的预防性以及治疗性治疗， 在这些治疗中免疫系统 ( 例如， T 细胞应答 ) 的调控具有益处。
     突变 CTLA-4 多肽在一个方面， 本发明提供了分离或重组的多肽， 该多肽各自包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少 75％、 80％、 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 90.5％、 91％、 91.5％、 92％、 92.5％、 93％、 93.5％、 94％、 94.5％、 95％、 95.5％、 96％、 96.5％、 97％、 97.5％、 98％、 98.5％、 99％、 99.5％、 或 100％的序列一致性， 该组的构 成为 ： SEQ IDNOS ： 1 至 73( 例如， SEQ ID NO ： 1、 SEQ ID NO ： 2、 SEQ ID NO ： 3、 SEQ ID NO ： 4、 SEQ ID NO ： 5、 SEQ ID NO ： 6、 SEQ ID NO ： 7、 SEQ ID NO ： 8、 SEQ ID NO ： 9、 SEQ ID NO ： 10、 SEQ ID NO ： 11、 SEQ ID NO ： 12、 SEQ ID NO ： 13、 SEQ IDNO ： 14、 SEQ ID NO ： 15、 SEQ ID NO ： 16、 SEQ ID NO ： 17、 SEQ ID NO ： 18、 SEQ ID NO ： 19、 SEQ ID NO ： 20、 SEQ ID NO ： 21、 SEQ ID NO ： 22、 SEQ IDNO ： 23、 SEQ ID NO ： 24、 SEQ ID NO ： 25、 SEQ ID NO ： 26、 SEQ ID NO ： 27、 SEQ ID NO ： 28、 SEQ ID NO ： 29、 SEQ ID NO ： 30、 SEQ ID NO ： 31、 SEQ IDNO ： 32、 SEQ ID NO ： 33、 SEQ ID NO ： 34、 SEQ ID NO ： 35、 SEQ ID NO ： 36、 SEQ ID NO ： 37、 SEQ ID NO ： 38、 SEQ ID NO ： 39、 SEQ ID NO ： 40、 SEQ IDNO ： 41、 SEQ ID NO ： 42、 SEQ ID NO ： 43、 SEQ ID NO ： 44、 SEQ ID NO ： 45、 SEQ ID NO ： 46、 SEQ ID NO ： 47、 SEQ ID NO ： 48、 SEQ ID NO ： 49、 SEQ IDNO ： 50、 SEQ ID NO ： 51、 SEQ ID NO ： 52、 SEQ ID NO ： 53、 SEQ ID NO ： 54、 SEQ ID NO ： 55、 SEQ ID NO ： 56、 SEQ ID NO ： 57、 SEQ ID NO ： 58、 SEQ IDNO ： 59、 SEQ ID NO ： 60、 SEQ ID NO ： 61、 SEQ ID NO ： 62、 SEQ ID NO ： 63、 SEQ ID NO ： 64、 SEQ ID NO ： 65、 SEQ ID NO ： 66、 SEQ ID NO ： 67、 SEQ IDNO ： 68、 SEQ ID NO ： 69、 SEQ ID NO ： 70、 SEQ ID NO ： 71、 SEQ ID NO ： 72、 以及 SEQ ID NO ： 73)， 其中该多肽结 合 CD80 和 / 或 CD86、 或 CD80 和 / 或 CD86 的一个多肽片段 ( 或二者之一的或两者的一个 ECD)， 和 / 或调整或调节一种免疫应答。一些此类多肽 ( 如在 SEQ ID NOS ： 1 至 73 中给出 的那些中的每一个 ) 被说明为分泌或成熟突变 CTLA-4 ECD 多肽。在 SEQ IDNOS ： 1 至 73 中 的每个所给出的突变 CTLA-4 ECD 多肽并不包括一个信号肽 ； 它已经在加工过程中被切割， 由此产生该成熟或分泌多肽。 CD80 的一个多肽片段可包括例如， 一种 CD80 多肽的一个细胞 外结构域多肽， 该 CD80 多肽例如人类 CD80 ECD 多肽 ( “hCD80 ECD” )。CD86 的一个多肽片 段可包括例如， 一种 CD86 多肽的一个细胞外结构域多肽， 该 CD86 多肽人类 CD86 ECD 多肽 (“hCD86 ECD” )。一些此类多肽结合一种哺乳动物 CD80 和 / 或 CD86 或它的一个多肽片 段， 例如一个哺乳动物 CD80 或 CD86 ECD。一些此类多肽结合 WT 人类 CD80(“hCD80” )和 / 或 WT 人类 CD86(“hCD86” ) 或它的一个多肽片段， 例如， hCD80 ECD 或 hCD86 ECD。在一 些此类方法中， 至少一种免疫应答受到阻抑或抑制。
     一些此类多肽具有对于 hCD80 或它的一个片段 ( 例如， hCD80 ECD) 的一种结合 亲和力或亲合力， 该结合亲和力或亲合力对应地是至少大约等于或大于该 hCTLA-4 ECD 多 肽对于 hCD80 或它的一个片段的结合亲和力或亲合力。预测的全长 hCD80 多肽序列在 SEQ ID NO ： 195 中给出， 它包括一个信号肽、 ECD、 跨膜结构域、 以及细胞质结构域， 以该顺序共 价连接在一起。该信号肽包括 SEQ ID NO ： 195 的氨基酸残基 1-34， 该 ECD 包括氨基酸残 基 35-242， 该跨膜结构域包括氨基酸残基 243-263， 并且该细胞质结构域包括氨基酸残基 264-288。该 hCD80 ECD 的多肽序列示于 SEQ IDNO ： 174。在 SEQ ID NO ： 173 中所示的核酸 序列编码了该 WT 人类 CD80 信号肽 ( 在 N- 端 ) 以及人类 CD80 ECD。
     一些此类多肽具有对于 hCD86 或它的一个片段 ( 例如， hCD86 ECD) 的一种结合 亲和力或亲合力， 该结合亲和力或亲合力对应地是大约等于或大于 hCTLA-4 ECD 多肽对于 hCD86 或它的一个片段 ( 例如如， ECD) 的结合亲和力或亲和力。预测的全长 hCD86 多肽序列在 SEQ ID NO ： 175 中给出， 它包括一个信号肽、 ECD、 跨膜结构域、 以及细胞质结构域， 以该 顺序共价连接在一起， 而编码了该预测全长 hCD86 多肽序列的一种示例性核酸示于 SEQ ID NO ： 176。 该 hCD86 ECD 的多肽序列示于 SEQ ID NO ： 180。 一些此类多肽具有对于 hCD86 的一 种结合亲和力或亲合力， 该结合亲和力或亲合力是至少大约等于或大于具有在 SEQ ID NO ： 168 中所示的序列的 LEA29Y ECD 多肽对于 hCD86 的结合亲和力或亲合力。具有对于 hCD86 或 hCD86 ECD 的结合亲和力或结合亲合力的本发明的示例性多肽 ( 这种结合亲和力或结 合亲合力是对应地至少等于或大于 hCTLA-4 ECD 以及 LEA29Y ECD( 也被称为 “A29YL104E” 或 “L104EA29Y” ECD) 对于 hCD86 或 hCD86 ECD 的那些 ) 包括例如但不限于 ： 包括一个多肽 序列的那些， 该多肽序列具有与 SEQ ID NOS ： 4、 10 至 12、 15、 17、 24、 26、 28、 35、 以及 61 中任 何一个的序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％的序列一致性。见， 如， 实例 4 中的 表 5。在表 5 中所给出的数据反映了一种代表性 CTLA-4-Ig 与单体 CD86 ECD 之间的单体 相互作用。若未另有指明， 术语 LEA29Y( 或 A29YL104E 或 L104EA29Y) 是指 LEA29Y ECD( 或 A29YL104E 或 L104EA29Y ECD)。
     一些此类多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与该人类 CTLA-4 细胞外结构 域的氨基酸长度大约为相等的氨基酸长度。 此类多肽可被说明为突变 CTLA-4 ECD 多肽。 一 些此类突变 CTLA-4 ECD 多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列长度是大约 110 个氨基酸至大 约 138 个氨基酸残基、 大约 112 至大约 136 个氨基酸残基、 大约 114 至大约 134 个氨基酸残 基、 大约 116 至大约 132 个氨基酸残基、 大约 118 至大约 130 个氨基酸残基、 大约 119 至大 约 129 个氨基酸残基、 大约 120 至大约 128 个氨基酸残基、 大约 121 至大约 127 个氨基酸残 基、 大约 122 至大约 126 个氨基酸残基、 大约 123 至大约 125 个氨基酸残基。一些此类突变 CTLA-4 ECD 多肽包括一个序列， 该序列长度为 124 个氨基酸残基。示例性的多肽包括例如 但不限于 ： 包括一个多肽序列的一种多肽， 该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序 列至少 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％或 100 ％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中这种多肽结合 CD80 和 / 或 CD86( 或二者之一的或 两者的一个 ECD)。
     一些以上说明的此类多肽具有调整或调节一种免疫应答的能力， 这些多肽包括例 如， 那些分离或重组的多肽， 这些多肽每个包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组 的至少一种多肽序列至少 75％、 80％、 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 99.5％、 或 100％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 并且它们结合 CD80 和 / 或 CD86 和 / 或它的一个 ECD。多种免疫应答中的一 种或多种可通过本发明的此类多肽进行调整或调节， 包括但不限于 ： 例如， T 细胞的活化或 增殖、 细胞因子的合成或产生 ( 例如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2、 等的产生 )、 不同活化标记的诱 导 ( 例如， CD25、 IL-2 受体、 等 )、 炎症分子的合成或产生、 炎症、 关节肿胀、 关节触痛、 疼痛、 僵硬、 C- 反应性蛋白的血清水平、 抗胶原抗体的产生、 和 / 或 T 细胞依赖的抗体反应。在一 些情形下， 与 hCTLA-4 或 hCTLA-4 ECD 相比， 这种多肽具有阻抑或抑制至少一种此类免疫应 答的更大的能力。
     例如， 一些此类多肽在体外测定中可以抑制 T 细胞活化或 T 细胞增殖。例如， 以下 给出的实例 4 至 9 证明了本发明的代表性融合蛋白在体外抑制 T 细胞增殖的能力， 这些融 合蛋白包括一种代表性突变 CTLA-4 ECD 多肽序列， 如在本文中所说明的那些。一些此类多肽可以在体内抑制或阻抑受试者体内的一种免疫应答， 如通过将一个治疗或预防有效量 的至少一种此类多肽给予需要免疫抑制疗法的受试者。 一些此类多肽预期用于不同的应用 中， 包括例如但不限于 ： 用于治疗其中希望免疫调节的疾病、 紊乱、 以及病况的预防和 / 或 治疗方法， 如以下更为详细地讨论。此类多肽预期用于用来在受试者体内阻抑或抑制一种 免疫应答的预防和 / 或治疗方法 ( 例如， 哺乳动物 ( 例如， 人类 ) 的免疫系统疾病或紊乱的 体内治疗， 其中免疫抑制或免疫调节是希望的 )、 用于抑制由一个受方 ( 例如， 由一种哺乳 动物， 例如人类 ) 对于来自供方的一个组织或器官的移植体排斥的方法、 以及在本文的其 他地方说明的其他方法。
     额外地或可替代地， 一些此类多肽具有阻抑或抑制一种免疫应答的一种能力， 该 能力是至少大约等于或大于 hCTLA-4 或 hCTLA-4 ECD 阻抑或抑制一种或多种类型的免疫应 答的能力。例如， 一些此类多肽在体外和 / 或体内测定和 / 或应用 ( 如以上说明的并且以 下进行更为详细地说明的那些 ) 中具有抑制 T 细胞活化或增殖的一种能力， 该能力是至少 大约等于或大于 hCTLA-4 或 hCTLA-4 ECD 在此类应用中抑制 T 细胞活化或增殖的能力。额 外地， 一些此类多肽具有阻抑或抑制一种免疫应答的一种能力 ( 例如， T 细胞活化或增殖、 细胞因子的产生、 T 细胞依赖的抗体反应 )， 该能力大于一种 LEA29Y 多肽 ( 一种特异的突 变 CTLA-4 ECD， 包括在 SEQ ID NO ： 168 中所示的多肽序列 ) 阻抑或抑制一种免疫应答的 能力。例如， 以下给出的实例 4 至 9 将本发明的示例性融合蛋白 ( 包括本发明的一个突变 CTLA-4ECD 多肽序列 ) 在体外抑制 T 细胞增殖的能力相对于一种融合蛋白 ( 包括 hCTLA-4 ECD 或 LEA29Y 多肽 ) 在体外抑制 T 细胞增殖的能力进行了比较。此类分子预期在不同的治 疗性应用中具有有益的用途， 包括自身免疫疾病和紊乱的治疗， 以及用于抑制器官、 细胞、 或组织移植体的移植的排斥的预防和治疗的方法。
     一些此类多肽彼此之间可具有例如， 一种氨基酸缺失、 添加和 / 或取代的差异。一 个氨基酸取代可以是一个保守性或非保守性取代。见， 如， 标题为 “序列变异” 的部分。
     在另一个方面， 本发明还提供了分离或重组的多肽， 这些多肽各组包括一个多肽 序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该组的成为 ： SEQID NOS ： 1 至 73， 其中该多肽结合一个单体 hCD80 或单体 hCD86 或二者之一的或两者的一个 ECD。一些此类多肽具有 (1) 对于单体 hCD86 的 一种结合亲和力， 该结合亲和力是大约等于或大于单体 hCTLA-4 或一种 LEA29Y 多肽对于单 体 hCD86 或它的一个 ECD 的结合亲和力， 以及 (2) 对于单体 hCD80 的一种结合亲和力， 该结 合亲和力是大约等于或大于单体 hCTLA-4 对于单体 hCD80 的结合亲和力。该 LEA29Y 多肽 包括 SEQ ID NO ： 168 的多肽序列。此外， 一些此类多肽与单体 hCTLA-4、 单体 hCTLA-4 ECD、 或 LEA29Y 多肽相比具有阻抑在本文中说明的一种或多种免疫应答的更高的能力 ( 例如， T 细胞的活化 / 增殖、 细胞因子的合成 / 产生、 活化标记的诱导、 炎症分子的产生、 炎症、 抗胶 原 Ab 的产生、 T 细胞依赖的 Ab 应答 )。
     本发明还提供了分离或重组的多肽， 这些多肽各自包括一个多肽序列， 该多肽序 列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列 一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该多肽具有对于一个 hCD86 ECD 或 hCD80 ECD 的一种结合亲和力， 该结合亲和力对应地是大约等于或大于一个 hCTLA-4 ECD 对于该 hCD86 ECD 或 hCD80 ECD 的结合亲和力。一些此类多肽具有对于该 hCD86 ECD 的一种结合亲和力， 该结合亲和力大于该 hCTLA-4 ECD(SEQ ID NO ： 159) 或该 LEA29Y 多肽 (SEQ ID NO ： 168) 对于该 hCD86 ECD 的结合亲和力。 一些此类多肽具有对于该 hCD80 ECD 的一种结合亲 和力， 该结合亲和力大于该 hCTLA-4 ECD 对于该 hCD80 ECD 的结合亲和力。一些此类多肽 具有阻抑一种免疫应答的能力， 在一些情形下是与该 hCTLA-4 ECD 或该 LEA29Y 多肽相比阻 抑一种或多种免疫应答 ( 包括以上说明的以及全文中说明的 ) 的更大的能力。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的 CTLA-4 多肽变体， 该多肽变体包 括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 它与在 SEQ ID NO ： 159 中所示的一个人类 CTLA-4 ECD 的 多肽序列具有不超过 15 个氨基酸残基、 不超过 14 个氨基酸残基、 不超过 13 个氨基酸残基、 不超过 12 个氨基酸残基、 不超过 11 个氨基酸残基、 不超过 10 个氨基酸残基、 不超过 9 个氨 基酸残基、 不超过 8 个氨基酸残基、 不超过 7 个氨基酸残基、 不超过 6 个氨基酸残基、 不超过 5 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 或 14 个氨基酸残基 ) 的 差异， 并且 (b) 其中在该 hCTLA-4ECD 多肽序列 (SEQ ID NO ： 159) 的位置 24、 30、 32、 39、 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 85、 104 或 106 上的氨基酸残基， 在该 CTLA-4 多肽变体序列中被一 个不同的氨基酸残基取代， 其中根据 SEQ ID NO ： 159 对该 CTLA-4 多肽变体的氨基酸残基位 置进行编号， 并且其中该 CTLA-4 多肽变体具有结合 CD80 或 CD86 或二者之一的一个细胞外 结构域或片段的能力， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。一些此类变体具有选 自下组的一个或多个 ( 如， 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14 或 15 个 ) 氨基酸取代， 该 组的构成为 ： A24E、 A24S、 S25A、 G27H、 K28N、 T30N、 T30D、 T30A、 V32I、 Q39K、 Q39E、 D41G、 D41N、 D41S、 A50M、 A50G、 M54K、 M54E、 M54V、 G55E、 G55K、 N56D、 D63K、 S64P、 I65S、 I65F、 I65T、 S70F、 M85A、 M85V、 M85A、 L104E、 L104D、 以及 I106M、 I106F、 以及 I106L。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的突变 CTLA-4 多肽， 该多肽包括一 个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 细胞外结构域的多 肽序列具有不超过 12 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 或 12 个氨基 酸残基 ) 的差异， 并且 (b) 包括选自下组的 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 或 12 个氨基酸取代， 该组的构成为 ： 对应于 SEQ ID NO ： 159 的氨基酸位置 24、 30、 32、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 以 及 104 的氨基酸残基位置， 其中根据 SEQID NO ： 159 对该突变 CTLA-4 多肽的氨基酸位置进 行编号， 并且其中该突变 CTLA-4 多肽具有结合 CD80 或 CD86 或二者之一的一个细胞外结构 域或片段的能力， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。在这些位置中的示例性氨 基酸取代包括但不限于 ： 在 WT hCTLA-4 ECD 中存在的氨基酸残基的保守性氨基酸取代和 / 或 A24S/E( 即， A24S 或 A24E)、 T30N/D/A( 即， T30N 或 T30D 或 T30A)、 V32I/L/M/V、 A50M/G、 M54E/V/K、 G55E/K/R、 N56D/A、 S64P/M/C、 I65S/T/F/V、 S70F/Y/W、 L104E/M、 或它们的任何取 代组合。
     在另一个方面， 本发明提供了分离或重组的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4ECD 多肽 )， 这 些多肽各自包括多一个肽序列， 该多肽序列 (a) 与选自下组的多肽序列具有不超过 14、 13、 12、 11、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2 或 1 个氨基酸残基的差异， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 并且 (b) 其中在该多肽序列中在氨基酸位置 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的氨基酸残 基是与在所述所选择的多肽序列 ( 例如， 选自 SEQ ID NOS ： 1 至 73 的多肽 ) 的对应位置上 的氨基酸残基相同， 其中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个细 胞外结构域， 和 / 或抑制一种或多种免疫应答。在一些情形下， 该多肽与所选择的多肽 ( 例如， 选自 SEQ ID NOS ： 1 至 73) 具有不超过 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 个氨基酸残基 ) 的差异， 但占据氨基酸残基位置 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 以及 85 中一个或多个的氨基酸是与在所选择的多肽序列 ( 例如， 选自 SEQ NOS ： 1 至 73 中的一个 ) 中的位置上所包括的氨基酸残基相同， 并且未缺失或被另一个氨基酸取 代。一些此类多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列与所选择的多肽序列具有不超过 10、 9、 8、 7、 或 6 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 个氨基酸残基 ) 的差异， 并且它在氨基酸残基位置 24、 30、 32、 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 85、 104 以及 106 中的一个 或多个上包括多个氨基酸残基， 这些氨基酸残基与在所选择的多肽序列中在对应位置上的 氨基酸残基相同。 此类多肽可以在一个或多个位置上与所选择的多肽序列具有一个或多个 氨基酸缺失、 一个或多个添加、 和 / 或一个或多个氨基酸取代的差异， 这个或这些位置并未 限定为具有与所选择序列的氨基酸相同的氨基酸。包括了具有对于 hCD86 或它的一个片段 ( 例如， hCD86 ECD) 的一种结合亲和力或亲合力的此类多肽， 该结合亲和力或亲合力对应 地是至少大约等于或大于该 hCTLA-4 ECD 或 LEA29Y 多肽对于 hCD86 或它一个片段 ( 例如， ECD) 的结合亲和力或亲合力。 一些此类多肽具有对于 hCD80 或它的一个片段 ( 例如， hCD80 ECD) 的一种结合亲和力， 该结合亲和力对应地是至少大约等于或大于该 hCTLA-4ECD 多肽 对于 hCD80 或它的一个片段的结合亲和力或亲合力。一些此类多肽包括一个多肽序列， 该 多肽序列具有大约等于该 hCTLA-4 ECD 的氨基酸长度的长度， 例如， 长度为 118 至 130、 119 至 129、 120 至 128、 121 至 127、 122 至 126、 123 至 125、 或 124 个氨基酸残基。
     一些此类多肽可阻抑不同免疫应答中的一种或多种， 包括例如， T 细胞活化、 T细 胞增殖、 细胞因子的合成或产生 ( 例如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2 的产生 )、 活化标记的诱导 ( 例如， CD25、 IL-2 受体 )、 炎症、 炎症分子的产生、 抗胶原 Ab 的产生、 和 / 或 T 细胞依赖的 Ab 应答。与 hCTLA-4、 hCTLA-4 ECD 多肽、 或 LEA29Y 多肽相比， 一些此类多肽具有阻抑一种或 多种此类免疫应答的更大的能力。例如， 一些此类多肽可在体外测定中阻抑 T 细胞活化或 T 细胞增殖。例如， 实例 4 至 9 将本发明的代表性融合蛋白 ( 本发明的一个突变 CTLA-4ECD 多肽序列 ) 在体外抑制 T 细胞增殖的能力相对于一种融合蛋白 ( 包括该 hCTLA-4 ECD 或 LEA29Y 多肽 ) 这样做的能力进行了比较。 一些此类多肽可在体内抑制或阻抑受试者体内的 一种免疫应答， 如， 通过将一个治疗或预防有效量的至少一种此类多肽给予需要免疫抑制 疗法的受试者。 此类多肽预期用于不同的应用中， 包括例如但不限于 ： 用于治疗其中希望阻 抑一种免疫应答的免疫系统疾病、 紊乱、 以及病况的预防和 / 或治疗方法， 包括例如， 用于 治疗自身免疫疾病以及紊乱的预防和 / 或治疗方法， 用于抑制由一个受方 ( 例如， 由一种哺 乳动物， 例如人类 ) 对于来自供方的一个组织或器官移植的排斥的方法、 以及在本文的地 方所说明的其他方法。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD 多 肽 )， 该多肽各自包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 细胞外结构域的多肽序列具有不超过 10 个氨基酸残基、 不超过 9 个氨基酸残基、 不 超过 8 个氨基酸残基、 不超过 7 个氨基酸残基、 不超过 6 个氨基酸残基、 不超过 5 个氨基酸 残基、 不超过 4 个氨基酸残基、 不超过 3 个氨基酸残基、 不超过 2 个氨基酸残基、 或不超过 1 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 个氨基酸残基 ) 的差异， 并且 (b) 包括至少一个氨基酸取代， 该取代是在对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的多肽序列的位置 50、54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的一个氨基酸残基位置上， 其中该多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个 ECD， 和 / 或抑制一种免疫应答 ( 例如， T 细胞的活化或增 殖、 细胞因子的合成或产生 ( 例如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2 的产生 )、 活化标记的诱导 ( 例 如， CD25、 IL-2 受体 )、 炎症、 炎症分子的产生、 抗胶原 Ab 的产生、 和 / 或 T 细胞依赖的 Ab 应 答 )， 如， 在以下更为详细说明的体外或体内方法和 / 或测定中。一些此类多肽包括一个多 肽序列， 该多肽序列长度是 124 个氨基酸残基。一些此类多肽包括 2、 3、 4、 5 或 6 个氨基酸 取代， 这些取代是在相对在 SEQ ID NO ： 159 中给出的多肽序列、 选自下组的位置上， 该组的 构成为 ： 氨基酸残基位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70 或 85。 一些此类多肽进一步包括一个氨基 酸取代， 该氨基酸取代是在对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 104 和 / 或 30 的氨基酸残基 位置上。 一些此类多肽包括至少一个氨基酸取代， 该氨基酸取代是在相对 SEQ IDNO ： 159 在 位置 70( 可任选地 S70F)、 位置 64( 可任选地 S64P)、 位置 50( 可任选地 A50M/G， 例如 A50M、 A50G)、 位置 54( 可任选地 M54K/V， 例如 M54K)、 位置 65( 可任选地 I65S)、 位置 56( 可任选地 为 N56D)、 位置 55( 可任选地 G55E/K， 例如 G55E、 G55K)、 位置 85( 可任选地 M85A)、 和 / 或位 置 24( 可任选地 A24E/S， 例如 A24E) 上。 任何此类多肽可进一步包括一个氨基酸取代， 该氨 基酸取代是相对 SEQ ID NO ： 159 在位置 104( 可任选地 L104E/D， 例如 L104E)、 位置 30( 可 任选地 T30N/D/A， 例如 T30N、 T30D 或 T30A)、 和 / 或位置 32( 可任选地 V32I)。在一些情形 下， 该多肽包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的氨基酸位置上的一个或多个氨基酸取代， 这些氨基 酸取代选自下组的， 其构成为 ： A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 以及 S70F。一些此类多 肽展示了对于 CD86( 例如， hCD86) 或 CD86ECD( 例如， hCD86 ECD) 一种的结合亲和力， 该结 合亲和力对应地是大约等于或大于一个单体 hCTLA-4 ECD 对于 CD86 或 CD86 ECD 的结合亲 和力。一些此类多肽展示了对于 CD80( 例如， hCD80) 或 CD80 ECD( 例如， hCD80 ECD) 的一 种结合亲和力， 该结合亲和力对应地是大于一种单体 hCTLA-4 ECD 对 CD80 或 CD80 ECD 的 结合亲和力。
     一些此类多肽具有阻抑或抑制一种或多种免疫应答的能力 ( 例如， T 细胞的活化 或增殖、 细胞因子的产生、 等 )， 如， 在体外和 / 或在体内。 一些此类多肽与 hCTLA-4、 hCTLA-4 ECD、 或 LEA29Y 多肽相比以一种更大的程度来抑制一种或多种此类免疫应答。此类多肽预 期在不同的治疗应用中具有有益的用途， 包括用于治疗自身免疫疾病以及紊乱的预防和 / 或治疗性方法， 以及用于抑制器官、 细胞、 或组织移植体的移植的排斥的预防和 / 或治疗方 法。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4ECD 多 肽 )， 这些多肽每个包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 细胞外结构域的多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 或 6 个氨基酸残基 ) 的差异， 并且 (b) 包括在相对 SEQ ID NO ： 159 的氨基酸位置上的一个或 多个取代， 该取代选自下组， 其构成为 ： A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 以及 S70F， 其中 该多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86、 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或在体外 测定和 / 或体内方法中阻抑一种免疫应答 ( 例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞因子的合成或 产生、 活化标记的诱导、 炎症分子的产生、 炎症、 关节肿胀或触痛、 疼痛、 僵硬、 C- 反应性蛋白 的血清水品、 抗胶原 Ab 的产生和 / 或 T 细胞依赖的 Ab 应答、 等 )。此类多肽预期用于治疗 患有其中免疫抑制疗法会具有益处的疾病、 紊乱、 以及病况的受试者， 包括例如， 用于治疗自身免疫疾病和紊乱的治疗及预防方法， 以及用于阻抑器官、 细胞、 或组织移植体的移植的 预防及治疗方法。
     本发明还提供了一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 包括 (i) 与 SEQ ID NOS ： 24 的多肽序列至少 95％的序列一致性， 以及 (ii) 一个苯丙胺酸 残基， 该苯丙胺酸残基在对应于由 SEQ IDNOS ： 1 至 73 所构成的组中选出的所述多肽序列的 位置 70 的氨基酸位置上， 其中该多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86、 或二者之一的一个细胞外 结构域， 和 / 或在体外测定和 / 或体内方法中抑制一种免疫应答 ( 例如， T 细胞的活化或增 殖、 细胞因子的合成或产生、 活化标记的诱导、 炎症分子的产生、 炎症、 关节或触痛、 疼痛、 僵 硬、 C- 反应性蛋白的血清水平、 抗胶原 Ab 的产生、 和 / 或 T 细胞依赖的 Ab 应答、 等 )。一些 此类多肽包括相对于所选择序列的以下中的一个或多个 ： 在对应于位置 24 的一个氨基酸 位置上的一个谷氨酸残基、 在对应于位置 30 的一个氨基酸位置上的一个天冬酰胺残基、 在 对应于位置 32 的一个氨基酸位置上的一个异亮氨酸残基、 在对应于位置 50 的一个氨基酸 位置上的一个甲硫氨酸残基、 在对应于位置 54 的一个氨基酸位置上的一个赖氨酸残基、 在 对应于位置 55 的一个氨基酸位置上的一个谷氨酸残基、 在对应于位置 56 的一个氨基酸位 置上的一个天冬氨酸残基、 在对应于位置 64 的一个氨基酸位置上的一个脯氨酸残基、 在对 应于位置 65 的一个氨基酸位置上的一个丝氨酸残基、 以及在对应于位置 104 的氨基酸位置 的谷氨酸残基。此类多肽预期在不同的应用中具有有益的用途， 包括用于治疗自身免疫疾 病和紊乱的方法， 以及用来抑制器官、 细胞、 或组织移植体的移植的方法。
     例如， 在一个非限制性的方面， 本发明包括一种分离或重组的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD)， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列包括 (i) 与 SEQ ID NOS ： 24 的多肽序 列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％的序列一致性， 以及 (ii) 一个苯丙胺酸残基， 该苯丙氨酸残基在对应于 SEQ IDNO ： 24 的多肽序列的位置 70 的一个氨基酸位置上， 其中该 多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个 ECD， 和 / 或在体外和 / 或 体内阻抑一种免疫应答。该多肽可包括相对 SEQ ID NO ： 24 的以下中的至少一项 ： 在位置 24 上的一个谷氨酸残基、 在位置 30 上的一个天冬酰胺残基、 在位置 32 上的一个异亮氨酸残 基、 在位置 50 上的一个甲硫氨酸残基、 在位置 54 上的一个赖氨酸残基、 在位置 55 上的一个 谷氨酸残基、 在位置 56 上的一个天冬氨酸残基、 在位置 64 上的一个脯氨酸残基、 在位置 65 上的一个丝氨酸残基、 以及在位置 104 上的一个谷氨酸残基。
     本发明还包括一种分离或重组的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD 多肽 )， 该多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86( 和 / 或二者之一的或两者的一个 ECD)， 和 / 或抑制一种免疫应答 ( 如 以上所说明 )， 例如， 在体外和 / 或体内， 其中该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与 在 SEQ ID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 ECD 多肽的多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基 的差异， 并且 (b) 包括至少一个氨基酸取代， 其中所述至少一个氨基酸取代包括 S70F， 其中 根据 SEQ ID NO ： 159 对氨基酸残基位置进行编号。 该多肽可进一步包括至少一个氨基酸取 代， 这些氨基酸取代选自下组， 其构成为 A24E、 T30N、 V32I、 D41G、 A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 M85A、 L104E、 以及 I106F。此类多肽据信用于不同的应用中， 包括用于治疗自身 免疫疾病及紊乱的方法， 以及用于阻抑器官、 细胞、 组织、 或移植体移植的方法。
     本发明还包括一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 31 中所示的多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 额 (b) 包括以下的至少一项 ： 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 50 的一个位置上的一个甲硫氨酸残基、 在对应 于 SEQ ID NO ： 31 的位置 54 的一个位置上的一个赖氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位 置 55 的一个位置上的一个谷氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 64 的一个位置上的 一个脯氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 65 的一个位置上的一个丝氨酸残基、 在对 应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 70 的一个位置上的一个苯丙氨酸残基， 其中根据 SEQ ID NO ： 31 对氨基酸残基位置进行编号， 并且该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或两者 的一个 ECD， 和 / 或在体外和 / 或体内阻抑如以上所说明的一种免疫应答。该多肽可包括 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 104 的一个位置上的一个谷氨酸残基、 在对应的位置 30 的 一个位置上的一个天冬酰胺残基、 和 / 或在对应的位置 32 的一个位置上的一个异亮氨酸残 基。 此类多肽据信用于不同的应用中， 包括用于治疗自身免疫疾病及紊乱的方法， 以及用于 抑制器官、 细胞、 或组织移植体的移植的方法。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列包括 (i) 与 SEQ ID NOS ： 36 至 46 以及 55 所构成的组中选出的一个多肽序列至 少 95％、 96％、 97％、 98％、 或 99％的序列一致性， 以及 (ii) 一个谷氨酸残基， 该谷氨酸残基 在所述所选择的多肽序列的氨基酸位置 55 上， 其中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 或二者之 一的或两者的一个 ECD， 和 / 或阻抑一种免疫应答。可受到阻抑的免疫应答包括例如， T细 胞的活化或增殖、 细胞因子的合成或产生 ( 例如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2 的产生 )、 活化标记 的诱导 ( 例如， CD25、 IL-2 受体 )、 炎症、 炎症分子的产生、 抗胶原 Ab 的产生、 和 / 或 T 细胞 依赖的 Ab 应答。这种多肽序列可进一步包括一个在氨基酸位置 70 上的苯丙氨酸残基。这 种多肽序列可进一步包括一个在位置 64 上的脯氨酸残基和 / 或一个在位置 30 上的天冬酰 胺残基。这种多肽序列可进一步包括一个在位置 50 上的甲硫氨酸残基和 / 或一个在位置 54 上的赖氨酸残基。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列包括 (i) 与 SEQ ID NOS ： 28、 30、 36 至 46、 55 至 57、 以及 65 至 73 所构成的组中 选出的一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 或 99％的序列一致性， 以及 (ii) 一个谷 氨酸残基， 该谷氨酸残在所述所选择的多肽序列的氨基酸位置 55 上， 其中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或阻抑一种免疫应答， 如， T细 胞的活化或增殖、 细胞因子的合成或产生 ( 例如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2 的产生 )、 活化标记 的诱导 ( 例如， CD25、 IL-2 受体 )、 炎症、 炎症分子的产生、 抗胶原 Ab 的产生、 和 / 或 T 细胞 依赖的 Ab 应答。这种多肽序列可进一步包括一个在氨基酸位置 70 上的苯丙氨酸残基。这 种多肽序列可进一步包括一个在位置 64 上的脯氨酸残基和 / 或一个在位置 30 上的天冬酰 胺残基。这种多肽序列可进一步包括一个在位置 50 上的甲硫氨酸残基和 / 或一个在位置 54 上的赖氨酸残基。
     以上说明的本发明的任何多肽可进一步包括一种肽， 这种肽协助所述多肽的分 泌。因此， 在一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的多肽， 该多肽包括 (a) 如以上所说 明的任何多肽 ( 例如， 以上说明的一个突变 CTLA-4 ECD)， 以及 (b) 一种肽， 这种肽协助了 经表达的多肽从宿主细胞中的分泌。这种肽可任选地是一种信号肽。该信号肽的 C- 端典 型地共价连结到该多肽的 N- 端上。该信号肽可包括一个氨基酸序列， 该氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 182 或 SEQ ID NO ： 216 的氨基酸序列至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性。 该信号肽可包括一个氨基酸序列， 该氨基酸 序列具有与包括 SEQ ID NO ： 160 的氨基酸残基 1 至 35、 1 至 36、 或 1 至 37 的氨基酸序列至 少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性。
     以上说明的本发明的任何多肽可进一步包括一个跨膜结构域和 / 或细胞质结构 域。因此， 在一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的多肽， 该多肽包括 (a) 以上说明的 本发明的任何多肽 ( 例如， 以上说明的一个突变 CTLA-4 ECD)， 以及 (b) 一个跨膜结构域。 这种蛋白可以可任选地进一步包括以上说明的一种信号肽， 其中该信号肽的 C- 端共价连 接到本发明的多肽的 N- 端上。该信号肽的 C- 端典型地共价连接到该跨膜结构域的 N- 端 上。该跨膜结构域的 C- 端典型地共价连接到该细胞质结构域的 N- 端上。在一些情形下， 该跨膜结构域包括一个氨基酸序列， 该氨基酸序列具有与包括 SEQID NO ： 160 的氨基酸残 基 162 至 182 的一个氨基酸序列至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的一致性。 在一些情形下， 该细胞质结构域包括一个氨基酸序列， 该氨基酸序 列具有与包括 SEQID NO ： 160 的氨基酸残基 183 至 223 的一个氨基酸序列至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的一致性。以上说明的多肽中的任 何一个可包括一个或多个经糖基化或聚乙二醇化的氨基酸残基。
     本发明还包括一种分离或重组的多肽多聚体， 该多肽多聚体包括二个或多个多 肽， 其中这些多聚体的多肽中的至少一个是如在本文所说明的本发明的一种突变 CTLA-4 多肽 ( 例如， 一个突变 CTLA-4 ECD 或突变 CTLA-4-Ig)。 这种多聚体包括本发明的至少一个 多肽， 并且可进一步包括并不需要为本发明的一种多肽的至少一个额外的多肽。 例如， 该多 聚体可包括本发明的至少一个多肽， 以及至少一个其他多肽， 它们可以是例如， 一种野生型 多肽 ( 例如， hCTLA-4 ECD 或 hCTLA-4-Ig)， 和 / 或至少一种其他的突变多肽 ( 如， 非本发明 的一种多肽的突变多肽 )。 该多聚体 ( 或多聚体多肽 ) 中的一些或所有的多肽可以是彼此相 同的， 或者在一些情况下， 该多聚体中的所有多肽可以是彼此不同的。在一些情况下， 该多 肽多聚体是一个二聚体， 该二聚体包括本发明的两个多肽， 它们可以可任选地是相同的多 肽 ( 即， 同型二聚体 ) 或不同的多肽 ( 即， 异型二聚体 )。在一些情况下， 该多肽多聚体是一 个四聚体， 该四聚体包括本发明的四个多肽。该四聚体可包括四个相同的多肽 ( 即， 同型四 聚体 )， 或本发明的四个多肽的任何组合， 这样使得至少一个多肽是与其他三个多肽不相同 的 ( 即， 异型四聚体 )。本发明还包括一个四聚体， 该四聚体包括四个相同的 WT CTLA-4ECD 多肽 ( 例如， hCTLA-4 ECD) 或四个相同的 WT CTLA-4-Ig( 例如， hCTLA-4-Ig) 的四聚体。在 一些情况下， 该多聚体可结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或二者之一的或两者的一个 ECD)、 和 / 或可在体外和 / 或体内方法中阻抑或抑制一种免疫应答 ( 例如， T 细胞的增殖或活化、 细 胞因子的产生、 等 )。与 hCTLA-4 或 hCTLA-4-Ig( 例如， hCTLA-4-IgG2 或 蛋白 ) 相比， 一些此类多聚体在体外和 / 或体内具有阻抑或抑制一种免疫应答的更大的能力。这 些多聚体的多肽可以连接在一起， 如， 通过共价连接体， 如经由在一个或多个多肽中的一个 或多个半胱氨酸之间的二硫键。
     本发明的一些此类四聚体包括一种结构， 该结构与一种抗体的结构示意上类似， 但其中该抗体的可变结构域各自被在此说明的本发明的任何突变 CTLA-4ECD 多肽替换。一 种抗体的重链包括一个重链可变结构域 (VH)， 该重链可变结构域融合到一个免疫球蛋白 (Ig)CH1 结构域 ( 例如， IgG2CH1) 上， 它又融合到一条铰链上。 该铰链融合到一个 Ig CH2 结构域 ( 例如， IgG2 CH2) 上， 其又融合到一个 Ig CH3 结构域 ( 例如， IgG2 CH3) 上。 一个抗体 的轻链包括一条轻链可变结构域 (VL)， 该轻链可变结构域融合到 Ig Cκ(Cκ) 或 Cλ(Cλ) 结 构域上。 这两条重链和两条轻链通过经由在这些重链及轻链中的半胱氨酸残基所形成的一 个或多个二硫键而共价连接在一起。本发明包括一个突变 CTLA-4 四聚体， 其中这些重链及 轻链的可变结构域中的每个被本发明的一种突变 CTLA-4 ECD 多肽替换。因此， 这种四聚体 包括两条轻链和两条重链。 每条轻链包括一个突变 CTLA-4 ECD 多肽， 该多肽融合到一个 Ig Cκ 或 Cλ 结构域上。每条重链包括一个突变 CTLA-4ECD， 该 ECD 融合到一个 Ig CH1 结构域 ( 例如， IgG2 CH1)， 它又融合到一个铰链上。 该铰链融合到一个 Ig CH2 结构域 ( 例如， IgG2 CH2) 上， 它又融合到一个 Ig CH3 结构域 ( 例如， IgG2 CH3) 上。 这两条重链和两条轻链通过 经由在这些重链及轻链中的半胱氨酸残基所形成的一个或多个二硫键而共价连接在一起。 这种四聚体可被说明为一个 CTLA-4-Ig 四聚体。构建这种 CTLA-4-Ig 四聚体的方法是已知 的， 并且是本领域中的普通技术人员会理解的。 一个四聚体 CD4-Ig 构建体 ( 它包括一种 CD4 多肽， 并且它中和了原代 HIV 1 型分离物 ) 说明于 Allaway， G.P.et al.， AIDS Res.Hum. Retroviruses 11(5) ： 533-9(1995) 中。 该四聚体可包括四个相同的突变 CTLA-4 ECD 多肽， 或本发明的四个突变 CTLA-4 ECD 多肽的任何组合， 这样使得至少一个突变 CTLA-4 ECD 是 与其他三个突变 CTLA-4 ECD 多肽不相同的。一些此类四聚体与 hCTLA-4( 或 hCTLA-4-Ig) 相比可以具有更高的结合亲合力来结合 CD80 和 CD86。一些此类四聚体可阻抑或抑制一种 免疫应答 ； 在一些情形下， 这种四聚体与 hCTLA-4 或 hCTLA-4-Ig( 例如， hCTLA-4-IgG2 或 ) 相比在体外测定或体内应用中具有阻抑或抑制一种免疫应答 ( 例如， T 细胞的 增殖或活化、 细胞因子的产生、 等 ) 的更大的能力。本发明的多聚体预期在不同的应用中具 有有益的用途， 包括用于治疗自身免疫疾病及紊乱的方法， 以及用于抑制器官、 细胞、 或组 织移植体的移植的方法。
     本发明还包括一种分离或重组的偶联物多聚体， 该多聚体包括二个或多个偶联 物， 其中该偶联物中的至少一个是本发明的一种偶联物， 该偶联物包括本发明的一种突变 CTLA-4 多肽 ( 例如， 一个突变 CTLA-4 ECD 或突变 CTLA-4-Ig)。在该多聚体中的一些或所 有的偶联物可以是彼此相的， 或者该多聚体中的所有偶联物可以是彼此不同的。在一些情 况下， 该偶联物多聚体是一个二聚体， 该二聚体包括两个偶联物， 或是一个四聚体， 该四聚 体包括四个偶联物。一些此类偶联物多聚体可结合 CD80 及 /CD86( 或二者之一的或两者的 一个 ECD)、 和 / 或在体外和 / 或体内阻抑或抑制一种免疫应答。在该多聚体中的偶联物分 子可以连接在一起， 如通过共价连接体， 如经由在一个或多个偶联物中的一个或多个半胱 氨酸之间的二硫键。
     本发明包括一种分离或重组的多肽二聚体， 该多肽二聚体包括以上所说明的本发 明的任何两个多肽 ( 例如， 以上说明的突变 CTLA-4 ECD)， 其中该二聚体具有对于人类 CD86 或它的一个细胞外结构域的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是大约等于或大于包括 两个人类 CTLA-4 细胞外结构域的一个二聚体对于人类 CD86 或它的一个细胞外结构域的结 合亲合力。
     本发明包括分离或重组的多肽二聚体， 这些多肽二聚体包括以上说明的本发明的 两个多肽 ( 例如， 以上说明的突变 CTLA-4 ECD)， 其中该二聚体具有对于 hCD80 或它的一 个 ECD 的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是大约等于或大于包括两个 hCTLA-4 ECD多肽 (SEQ ID NO ： 159) 的一个二聚体对于 hCD80 或它的一个 ECD 的结合亲合力。例如， 在 一个非限制性的方面中， 该二聚体可包括两个多肽， 其中每个多肽包括一个多肽序列， 该多 肽序列具有与选自下组的一个序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致 性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 并且每个多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86， 和 / 或抑 制一种免疫应答。 在另一个非限制性的方面中， 该二聚体可包括两个多肽， 其中每个多肽与 该 hCTLA-4ECD 的多肽序列 (SEQ ID NO ： 159) 具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且包括 至少一个氨基酸取代， 这些氨基酸取代是在相对 SEQ ID NO ： 159 的一个氨基酸位置上， 这些 氨基酸取代选自下组， 其构成为 ： A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 以及 S70F ； 并且该多 肽可任选地进一步包括取代 L104E， 并且每个多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86， 和 / 或抑制一 种免疫应答。
     在一些情形下， 该二聚体具有对于 hCD80 或它的一个 ECD 的一种结合亲合力， 该结 合亲合力对应地是大约等于或大于包括两个 hCTLA-4 ECD 多肽的一个二聚体对于 hCD80 或 它的一个 ECD 的结合亲合力。在一些情形下， 该二聚体具有对于 hCD86 或它的一 ECD 的一 种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是大于包括两个 LEA29Y 多肽的一个二聚体对于 hCD86 或它的一个 ECD 的结合亲合力， 其中每个 LEA29Y 多肽包括在 SEQ ID NO ： 168 中所示的多肽 序列。在一些情形下， 该二聚体以一种速率从结合的 hCD86 或它的一个 ECD 中解离， 该速率 对应地是小于包括两个 hCTLA-4 ECD 多肽的一个二聚体从结合的 hCD86 或它的一个 ECD 中 解离的速率。在一些情形下， 该二聚体以一种速率从结合的 hCD86 或它的一个 ECD 中解离， 该速率对应地是小于包括两个 LEA29Y 多肽的一个二聚体从结合的 hCD86 或它的一个 ECD 中解离的速率， 其中每个 LEA29Y 多肽包括在 SEQ ID NO ： 168 中所示的多肽序列。
     在一些情形下， 该二聚体以一种速率与 hCD86 或它的一个 ECD 相结合， 该速率对应 地是大于包括两个 hCTLA-4 ECD 多肽的一个二聚体与 hCD86 或它的一个 ECD 相结合的速 率。在一些情形下， 该二聚体以一种速率与 hCD86 或它的一个 ECD 相结合， 该速率对应地是 大于包括两个 LEA29Y 多肽的一个二聚体与 hCD86 或它的一个 ECD 相结合的速率， 其中每个 LEA29Y 多肽包括在 SEQ ID NO ： 168 中所示的多肽序列。
     在一些情形下， 这种包括一个突变 CTLA-4 ECD， 该 ECD 与包括两个人类 CTLA-4 细 胞外结构域或两个 LEA29Y 多肽的一个二聚体相比具有阻抑一种免疫应答 ( 例如， T 细胞的 增殖或活化、 细胞因子的产生、 等 ) 的更大的能力。
     一些此类二聚体具有一个 CD86 平衡解离常数 (KD)， 该 CD86 平衡解离常数小于包 括两个 hCTLA-4 ECD 多肽或两个 LEA29Y 多肽的一个二聚体的 CD86 平衡解离常数 (KD)。 一些 此类二聚体具有一个 CD86 平衡解离常数 (KD)， 该 CD86 平衡解离常数小于包括两个 LEA29Y 多肽的一个二聚体的 CD86 平衡解离常数 (KD)， 每个 LEA29Y 多肽包括在 SEQ ID NO ： 168 中 所示的多肽序列。
     与一个相同化合价的全长 hCTLA-4 的多聚体 ( 即， 一个包括相同数目的全长 CTLA-4 多肽的多聚体 ) 相比， 包括本发明的至少两个多肽的一些此类多聚体 ( 例如， 包括 本发明的两个突变 CTLA-4 ECD 多肽的一个二聚体 ) 具有阻抑一种免疫应答的增强的能力。 与一个相同化合价的 hCTLA-4 ECCD 的多聚体 ( 即， 一个包括相同数目的 hCTLA-4 ECD 多肽 的多聚体 )， 包括本发明的至少两个多肽的一些此类多聚体具有阻抑一种免疫应答的增强 的能力。以上说明的本发明的任何多肽可进一步包括一个额外的增强溶解度的多肽序列， 如， 一种免疫球蛋白 (Ig) 多肽序列， 由此形成例如， 一种可溶性融合蛋白， 如以下更为详细 地讨论。 一个多肽多聚体的每个多肽可进一步包括一个额外的增强溶解度的多肽序列， 如， 一个 Ig 多肽序列， 由此形成例如， 一种可溶性融合蛋白。因此， 例如， 如以上所说明包括本 发明的二个或多个多肽的一个二聚体的每个多肽可进一步包括一个额外的增强溶解度的 多肽序列， 如， 一个 Ig 多肽序列， 由此形成例如， 一种可溶性融合蛋白。
     本发明的此类多肽和二聚体预期在不同的应用中具有有益的用途， 包括用于治疗 自身免疫疾病及紊乱的方法， 以及用于抑制器官、 细胞、 或组织移植体的移植的方法。
     如之前所讨论的， 该成熟 hCTLA-4 蛋白序列典型地以在 SEQ IDNO ： 160 中所示的全 长 hCTLA-4 蛋白序列的氨基酸位置 38 上的甲硫氨酸残基起始， 并且该成熟 hCTLA-4 蛋白序 列的氨基酸残基典型地以这个甲硫氨酸残基作为该第一氨基酸 ( 即， 占据位置 1) 起始来进 行编号。
     本发明的一些突变 CTLA-4 多肽 ( 包括单体以及二聚体融合蛋白以及多聚性多肽 ) 包括在一个氨基酸位置上的至少一个氨基酸取代， 该氨基酸位置对应于经典的 hCTLA-4/ hB7-2 结 合 界 面 ( 见， 如， Schwartz et al.， Nature410 ： 604-608(2001)) 之 外 的 成 熟 hCTLA-4 蛋白序列中的一个氨基酸位置， 包括但不限于例如， 氨基酸位置 24、 41、 54、 55、 56、 64、 65、 70 及 85 中的任何一个。大体上， 本领域中的普通技术人员不会预期， 在以上提及的 位置 (24、 41、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 和 / 或 85) 上的一个氨基酸取代， 或选自下组的一个或多 个取代的任何组合， 该组的构成为 ： 位置 24、 41、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 以及 85， 会具有增强 hCTLA-4 对于 hB7-2 的结合亲和力或亲合力的能力， 会具有抑制 CD28- 阳性细胞与 B7-2- 阳 性细胞的相互作用的增强的能力， 或会提供与例如， hCTLA-4 ECD 或 hCTLA-4-Ig 相比阻抑 或抑制一种免疫应答的更大的能力 ( 例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞因子的合成或产生、 活化标记的诱导、 炎症分子的合成或产生、 抗胶原抗体的产生、 T 细胞依赖的抗体反应、 以 及类似物 )。此外， 本领域中的普通技术人员将不会预期， 在以上说明的位置 (24、 41、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 和 / 或 85) 中的任何一个上或此类位置的任何组合上在本文中所说明的 一个或多个具体的氨基酸取代或多个具体的氨基酸取代的组合， 会具有增进 hCTLA-4 对于 hB7-2 的结合亲和力或亲合力的能力， 具有抑制 CD28- 阳性细胞与 B7-2- 阳性细胞的相互作 用的增强的能力， 或提供与例如， hCTLA-4 ECD 或 hCTLA-4-Ig 相比阻抑或抑制一种免疫应 答的更大的能力。
     突变 CTLA-4 融合蛋白
     本发明还提供了新颖的分离或重组融合蛋白， 该融合蛋白包括一个第一多肽 ( 它 是以上说明的并且全文说明的本发明的这些多肽中的至少一个 ( 如， 本发明的一种突变 CTLA-4 多肽， 例如， 一种突变 CTLA-4 ECD 多肽 ))， 该第一多肽连接或融合到一个第二多肽 上， 由此形成一种融合蛋白。该第二多肽典型地协助了该第一多肽的分泌或表达。示例性 的突变 CTLA-4ECD 多肽包括了包括识别为 SEQ ID NOS ： 1 至 73 的序列的那些。本发明包括 融合蛋白， 这些融合蛋白包括免疫球蛋白 (Ig) 结构域 ( 如， Ig Fc 结构域 )， 这些结构域融 合到或附连到本发明的生物活性分子部分 ( 如， 本发明的突变 CTLA-4 多肽 ) 上。本发明的 融合蛋白据信用作预防和 / 或治疗剂， 因为在免疫抑制和 / 或免疫调节中不同的免疫系统 疾病以及紊乱以及病况的预防和 / 或治疗性治疗在诊断测定中是有益的、 以及用于制备具有免疫调节和 / 或免疫抑制活性或特性的药物或试剂， 如在本文的其他地方更为详细地讨 论。
     包括一种突变 CTLA-4 多肽以及一种 Ig 多肽 ( 例如， Ig Fc) 的本发明的融合蛋白 被典型地称为 CTLA-4-Ig 融合蛋白。本发明的这些融合蛋白中的任何一个 ( 包括以下以及 实例中更为详细说明的本发明的单体以及二聚体融合蛋白 ) 可包括 ( 作为一种 Ig 多肽 ) 例如， 一种 Ig Fc 多肽， 如在本文中以及以上和以下的其他地方所说明。该第二多肽可直 接连结到该第一多肽上。例如， 该第二多肽 ( 例如， 一种 Ig 多肽， 如， 一种 Ig Fc 多肽 ) 的 N- 端可直接共价融合到本发明的第一多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD 多肽 ) 的 C- 端。可替 代地， 该第二多肽可间接地连接到该第一多肽上， 如， 其中在该第一以及第二多肽之间包括 了一个连接物氨基酸序列， 该连接物氨基酸序列包括 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 或 10 个或更多 的氨基酸残基。在其中包括了一个连接物的情形下， 该氨基酸连接物序列的 N- 端典型地共 价融合到该第一多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD) 的 C- 端上， 而该第二多肽 ( 例如， Ig 多肽， 如， 一种 Ig Fc) 的 N- 端典型地共价融合到该氨基酸连接物序列的 C- 端上。
     在一些情形下， 该第二多肽包括一种 Ig 多肽的至少一部份， 例如， 一个 Ig 重链恒 定区的一个或多个结构域。 该第二多肽可包括一种 Ig 多肽的一个铰链区、 CH2 结构域、 以及 CH3 结构域。在一些情形下， 该第二多肽包括一种 WT Ig 多肽的一个 Fc 结构域 ( 即， WT Ig Fc 多肽 )， 例如， 一种 WT 人类 Ig 多肽的一个 Fc 结构域 ( 即， WT 人类 Ig Fc 多肽 )。如其 他地方所讨论， 该 Ig 多肽可以来自不通过的物种， 包括例如， 哺乳动物， 例如， 人类、 小鼠、 非人类灵长类 ( 例如， 猴、 大猩猩 )、 猫、 狗、 马、 等， 并且可以来自不同类别 ( 例如， IgG、 IgM、 IgE、 等 ) 以及亚型 ( 例如， 对 IgG 而言包括 IgG1、 IgG2、 IgG4、 等 )， 并且可包括任何这种 Ig 多肽的一个 Fc 结构域或部分。此类不同物种的 Ig 多肽的氨基酸以及核酸序列在本领域内 是已知的。
     在一个方面， 本发明提供了新颖的分离或重组融合蛋白， 这些融合蛋白各自包括 以上说明的本发明的一种分离或重组的突变 CTLA-4 多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD)， 该突变 CTLA-4 多肽在其 C- 端直接地或间接地 ( 经由一个氨基酸连接物序列 ) 共价连接或融合到 一种 Ig Fc 多肽 ( 即， 一种 Ig 多肽的 Fc 结构域 ) 的 N- 端上。本发明的这些融合蛋白中的 任何 ( 包括以下以及实例中更为详细说明的本发明的单体以及二聚体突变 CTLA-4-Ig 融合 蛋白 ) 可包括一种 Ig Fc 多肽， 如在本文中以及以上和以下的其他地方所说明的。一种 Ig Fc 多肽典型地包括该 Ig 多肽的铰链区、 CH2 结构域、 以及 CH3 结构域。该 Ig Fc 多肽可衍 生自不同的物种， 包括例如， 人类、 小鼠、 灵长类、 等， 并且可包括一种野生型 Ig Fc 多肽 ( 例 如， WT IgG1、 IgG2 或 IgG4)。示例性的人类 IgG Fc 多肽包括例如但不限于 ： 人类 IgG1、 人 类 IgG2、 人类 IgG4、 等。示例性人类 IgG1Fc 的多肽序列在 SEQ ID NO ： 185 中给出。示例性 的人类 IgG2 Fc 多肽的多肽序列对应地在 SEQ ID NO ： 184 及以 218 中给出。可替代地， 该 Ig Fc 多肽可包括一种突变 Ig 多肽。例如， 可以在一种突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白中包括一 种突变 IgG1 Fc， 其中一个或多个半胱氨酸残基已经被另一个氨基酸 ( 例如， 一个丝氨酸残 基 ) 取代， 由此消除了在两个 Ig 链之间形成的一个或多个二硫键， 或者其中一个或多个脯 氨酸残基被另一个氨基酸 ( 例如， 脯氨酸残基 ) 取代， 以降低效应子功能 ( 降低的 Fc 受体 结合 )。一种示例性的突变 IgG1 Fc 多肽的多肽序列示于 SEQ IDNO ： 186。本发明包括一种 分离或重组的融合蛋白， 如， 一种突变 CTLA-4-Ig 二聚体或突变 CTLA-4-Ig 单体， 该融合蛋白包括以上说明的至少一种重组突变 CTLA-4 多肽， 该重组突变 CTLA-4 多肽在其 C- 端连结 到一种重组 Ig Fc 多肽的 N- 端上， 该重组的 Ig Fc 多肽包括一个氨基酸序列， 该氨基酸序列 具有与选自下组的一个氨基酸序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 184( 人类 IgG2 Fc 多肽 )、 185( 人类 IgG1 Fc 多肽 )、 186( 突 变 IgG1 Fc 多肽 )、 以及 218( 无 C- 端赖氨酸 (K) 残基的人类 IgG2 Fc 多肽 )。
     在一个方面， 本发明的一种突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的预测多肽序列包括以下片 段： 一个信号肽序列， 它协助了该融合蛋白的分泌 ( 例如， hCTLA-4 信号肽 (SEQ ID NO ： 182 或 SEQ ID NO ： 216)) ； 一种突变 CTLA-4ECD 多肽， 该突变 CTLA-4 ECD 多肽典型地但非必须包 括从大约 118 至 130 个氨基酸残基的长度， 并且通常是大约 124 个氨基酸残基 ； 以及一种 Ig Fc 多肽。示例性的突变 CTLA-4 ECD 多肽包括以上和以下所说明的那些。在一些情形下， 在 该突变 CTLA-4 ECD 多肽的 C- 端与该大类 Ig Fc 多肽的 N- 端之间并不包括氨基酸连接物序 列； 即， 在该突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白中， 一种突变 CTLA-4 ECD 多肽的 C- 端被直接地共价 融合到该 Ig Fc 多肽的 N- 端上。然而， 若希望， 一种突变 CTLA-4-Ig 可以在该突变 CTLA-4 ECD 多肽的 C- 端与该人类 Ig Fc 多肽的 N- 端之间包括一个连接物 ( 例如， 一个或多个氨基 酸残基 )。本发明的预测性单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的信号肽典型地在加工过程中从 该突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的 N- 端被切割， 并且因此本发明的一种突变 CTLA-4-Ig 融合蛋 白的成熟或分泌形式通常并不包括一个信号肽序列。包括两个这种单体突变 CTLA-4-Ig 融 合蛋白的一种融合蛋白二聚体典型地是在细胞加工过程中通过产生共价二硫键而形成， 这 些二硫键是在 (1) 一个这种单体融合蛋白的突变 CTLA-4 ECD 以及 IgG2 Fc 中的半胱氨酸 残基与 (2) 该第二 ( 典型地但并非必须相同 ) 单体融合蛋白的突变 CTLA-4 ECD 以及 IgG2 Fc 中的半胱氨酸残基之间。
     本发明包括二聚体融合蛋白 ( 也被称为融合蛋白二聚体 )， 这些二聚体融合蛋白 每个包括本发明的两个单体融合蛋白。该二聚体可包括两个相同或不同的单体融合蛋白。 该二聚体融合蛋白是通过在这两个单体融合蛋白之间的一个或多个连接体而形成的。 包括 两个这种单体融合蛋白的一种二聚体融合蛋白典型地是在细胞加工过程中通过产生共价 二硫键而形成， 这些二硫键是在一个单体融合蛋白中的半胱氨酸残基与在该第二单体融合 蛋白中的半胱氨酸残基之间。因此， 在一些情形下， 本发明的一种突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 被表达为包括本发明的两个单体融合蛋白的一个二聚体。
     在一个方面， 本发明提供了包括两个单体融合蛋白的一种分离或重组二聚体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 其中每个单体融合蛋白包括本发明的一种突变 CTLA-4 ECD 多肽， 如 以上以及以下进一步地详细说明， 该突变 CTLA-4 ECD 多肽在其 C- 端融合到一种 Ig Fc 多肽 上。该二聚体是在细胞加工过程中通过产生共价二硫键而形成， 这些二硫键是在一个单体 融合蛋白的突变 CTLA-4 ECD 以及 Ig Fc 中的半胱氨酸残基与该第二单体融合蛋白的突变 CTLA-4 ECD 以及 Ig Fc 中的半胱氨酸残基之间。 这两个单体融合蛋白典型地但并非必须地 包括相同的序列。分泌或成熟形式的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白并不包括一种信号肽， 因为 该信号肽典型地在加工过程中从该蛋白的 N- 端上切割。该预测的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋 白包括一种信号肽， 该信号肽的 C- 端被典型地共价连接到该突变 CTLA-4-Ig 蛋白的 N- 端 上。一种成熟突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的每个单体的 N- 端典型地包括一个甲硫氨酸 (M)。
     作为一种非限制性的实例， 本发明提供了包括两个单体 CTLA-4-Ig 融合蛋白的二聚体融合蛋白， 其中每个单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白包括一种突变 CTLA-4 ECD 多肽， 该 突变 CTLA-4 ECD 多肽在其 C- 端连接到一种 Ig Fc 多肽的 N- 端上， 其中该突变 CTLA-4 ECD 多肽包括一个多肽序列， 该序列选自 SEQ ID NOS ： 1 至 73 中的任何一个。在一些此类二聚 体融合蛋白中， 这两个单体融合蛋白是通过一个共价二硫键共价地连接在一起的， 该二硫 键是在细胞加工过程中在每个 CTLA-4 突变 ECD 多肽序列中的位置 120 上的一个半胱氨酸 残基之间形成的。 可替代地， 或此外， 这两个单体融合蛋白是通过一个共价二硫键共价地连 接在一起的， 该二硫键是在该第一单体融合蛋白的 Ig Fc 多肽中的一个或多个半胱氨酸残 基与该第二单体融合蛋白的 Ig Fc 多肽中的一个或多个半胱氨酸残基之间产生的。这些单 体融合蛋白可由多个二硫键 ( 例如， 一、 二、 三、 四、 或多个二硫键 ) 连接在一起， 该二硫键是 在细胞加工过程中在它们对应的 Ig Fc 多肽中存在的半胱氨酸残基之间形成的。在一些情 形下， 每个单体融合蛋白是由相同的 Ig Fc 多肽构成 ( 例如， 人类 IgG2 Fc， 如例如在 SEQ ID NO ： 184 或 218 中所示 )， 并且一个或多个共价二硫键可以在细胞加工过程中在每个 Ig Fc 多肽中的等效位置上的半胱氨酸残基之间产生。
     一种示例性的突变 CTLA-4 ECD 多肽是 D3-12 突变 CTLA-4 ECD 多肽， 该多肽包括 SEQ ID NO ： 11 的多肽序列。 本发明的一种示例性的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白是 D3-12 突变 CTLA-4ECD 多肽， 该多肽在其 C- 端直接地 ( 无连接物 ) 共价连接到或融合到在 SEQ ID NO ： 218 中所示的人类 IgG2Fc 多肽的 N- 端上， 由此形成在 SEQ ID NO ： 205 中所示的 D3-12-IgG2 融合蛋白， 或者在其 C- 端直接地 ( 无连接物 ) 共价连接到或融合到在 SEQ IDNO ： 184 中所 示的人类 IgG2 Fc 多肽的 N- 端上， 由此形成在 SEQ ID NO ： 74 中所示的 D3-12-IgG2 融合蛋 白。SEQ ID NO ： 74 的序列与 SEQ ID NO ： 205 的序列具有一个残基的差异 - 即， 在 SEQ ID NO ： 74 的 C- 端存在着一个额外的赖氨酸残基。我们在通过液相色谱质谱分析 (LCMS)、 或类 似分析实验性地发现， 在 CHO 细胞中通过转染一个表达载体 ( 包括编码了一个突变 CTLA-4 ECD 的一个核苷酸序列 ( 例如， 在 SEQ ID NO ： 11 中所示的 D3-12ECD 多肽序列 )) 而得到的 一种突变 CTLA-4 融合蛋白、 以及在 SEQ IDNO ： 184 中所示的 hIgG2 Fc 多肽典型地并不包括 该预期的 C- 端赖氨酸 (K) 残基， 如基于在 SEQ ID NO ： 184 中所示的 hIgG2Fc 序列而会预期 的。
     例如， SEQ ID NO ： 153 的核苷酸序列编码了该 hCTLA-4 信号肽以及 D3-12-IgG2 融 合蛋白， 并且在其 C- 端包括终止密码子 TAA。密码子 AAA( 它编码了一个赖氨酸残基 ) 直 接在 SEQ ID NO ： 153 的序列中位于该终止密码子 TAA 之前。通过将包括了 SEQ ID NO ： 153 的核苷酸序列的一个表达载体转染到 CHO 细胞中而产生的一种成熟 D3-12-IgG2 融合蛋白 的预测多肽序列示于 SEQ ID NO ： 74。该信号肽不存在于成熟形式的 D3-12-IgG2 融合蛋白 中， 因为它在加工过程中已经从该成熟的融合蛋白中北切割。然而， 基于 LCMS 分析， 我们发 现， 在这种情形下该成熟 D3-12-IgG2 典型地并不包括该预测的 C- 端赖氨酸， 如基于 SEQ ID NO ： 153 的核苷酸序列而可预期的。 相反地， 通过这种方法所产生的得到的成熟 D3-12-IgG2 多肽序列是在 SEQ ID NO ： 205 中所示的那个。据信该 IgG2Fc 多肽的 C- 端赖氨酸是在加工 过程或在分泌之前被切割。
     据信使用另一个哺乳动物细胞系， 通过将这种包括 SEQ ID NO ： 153 的核苷酸序 列的载体转染到这种哺乳细胞 ( 例如， COS 细胞或类似细胞 ) 中而进行的 D3-12-IgG2 蛋白制备， 会因为类似的加工或分泌机制而产生缺乏预测 C- 端赖氨酸残基的一种类似D3-12-IgG2 融合蛋白。
     该二聚体 D3-12-IgG2 融合蛋白包括两个这种 D3-12-IgG2 单体， 这两个单体通过 一个或多个二硫键连接在一起， 这些二硫键是在细胞加工过程中通过在多个半胱氨酸残基 之间产生共价二硫键而形成的。D3-12-IgG2 以及本发明的其他融合蛋白可例如， 通过使用 在实例 3 中给出的方法而制得。例如， 可将编码了一种 D3-12 多肽的核酸序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 90) 克隆到该 IgG2Fc 融合载体中， 可以用该载体转染哺乳动物细胞， 并且将得到的 融合蛋白表达 ( 典型地是二聚体形式 )， 纯化， 并进行评估， 如实例 3 中所说明。
     另一个示例性的突变 CTLA-4 ECD 多肽是 D3-54 突变 CTLA-4 ECD 多肽， 该多肽包 括 SEQ ID NO ： 36 的多肽序列， 而一种示例性的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白包括 D3-54 突变 CTLA-4 ECD 多肽， 该多肽在其 C- 端直接地 ( 无连接物 ) 共价连接到或融合到在 SEQ ID NO ： 218 中所示的 hIgG2 Fc 多肽的 N- 端 ( 无 C- 端赖氨酸 ) 上， 由此形成在 SEQ ID NO ： 211 中 所示的 D3-54-IgG2 融合蛋白， 或者在其 C- 端直接地 ( 无连接物 ) 共价连接到或融合到在 SEQ IDNO ： 184 中所示的 hIgG2 Fc 多肽的 N- 端 ( 无 C- 端赖氨酸 ) 上， 由此形成在 SEQ ID NO ： 197 中所示的 D3-54-IgG2 融合蛋白。如以上所讨论， 实验性分析指出在 CHO 细胞中制 得的成熟 D3-54-IgG2 融合蛋白典型地并不包括该预期的 C- 端赖氨酸残基。据信该 hIgG2 Fc 的 C- 端赖氨酸是在加工过程或在分泌之前被切割， 这造成了在 SEQ ID NO ： 211 中所示 的 D3-54-IgG2 融合蛋白序列。 此外， 如以上所指出， D3-29-IgG2 可使用实例 3 的方法制得。 二聚体 D3-54-IgG2 融合蛋白包括两个 D3-54-IgG2 单体， 这两个单体通过一个或多个二硫 键连接在一起， 这些二硫键是在细胞加工过程中通过在多个半胱氨酸残基之间产生共价二 硫键而形成。在 SEQ ID NO ： 201 中所示的核酸序列编码了在 SEQ ID NOS ： 197 以及 211 中 所示的融合蛋白。
     本发明的其他融合蛋白可类似地包括一种突变 CTLA-4 ECD 多肽， 该多肽连接到或 融合到 hIgG2(SEQ ID NO ： 218 或 84) 上。本发明的示例性成熟突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白 包括例如， SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222 中每个的多肽序 列。SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 220、 以及 222 的多肽序列中的每个包括一个 C- 端赖 氨酸残基 ； 这个 C- 端赖氨酸残基典型地是在加工过程或在分泌之前受到切割， 这对应地造 成在 SEQ ID NOS ： 205 至 210、 211 至 214、 219、 以及 221 中所示的无 C- 端赖氨酸的多肽序 列。
     图 10 是一个示意图， 显示了本发明的一个示例性突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白的一 个示例性构型或结构。示意性地显示了两个相同的单体突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白， 每个 包括一个成熟突变 CTLA-4 ECD 多肽， 该多肽在其 C- 端共价连接到一种人类 IgG2 Fc 多肽 的 N- 端上。每个人类 IgG2 Fc 多肽包括一个人类 IgG2 的铰链区、 CH2 结构域、 以及 CH3 结 构域。还显示了存在于该 ECD 与 Ig Fc 多肽之间的接合处的示例性氨基酸残基。在此类组 分之间的接合处的氨基酸残基可有差异， 这取决于该突变 CTLA-4 ECD 多肽序列和 / 或 Ig 多 肽序列。这种二聚体突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白是由至少一个二硫键的形成而产生， 这些 二硫键是在这两个突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白单体中的类似位置上的半胱氨酸残基之间。 这些潜在地涉及这两个单体之间形成二硫键的半胱氨酸 (C) 残基用星号标记。每个单体融 合蛋白的信号肽典型地是在加工过程中受到切割， 并且因此该分泌 ( 成熟 ) 融合蛋白典型 地并不包括该信号肽序列。该人类 IgG2 多肽的多肽序列 ( 它包括人类 IgG2 的铰链区、 CH2结构域、 以及 CH3 结构域 ) 示于 SEQ ID NO ： 184。在另一个方面， 该人类 IgG2 多肽的多肽 序列 ( 它包括人类 IgG2 的铰链区、 CH2 结构域、 以及 CH3 结构域 ) 示于 SEQ ID NO ： 218 ； 在 此情形下， 该 IgG2 多肽当与 SEQ ID NO ： 184 的序列相比并不包括 C- 端赖氨酸 (K) 残基。
     可以将本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的特性 ( 在其他地方进行详细说明 ) 与 一种或多种参比 Ig 融合蛋白的特性 ( 例如， hCTLA-4-IgG1、 hCTLA-4-IgG2、 融合 蛋白、 以及 LEA29Y-Ig) 进行比较。可进行比较的特性包括例如， 结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig) 的能力、 和 / 或阻抑或抑制一种免疫应答的能力 ( 例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞因子的产生、 等 )。该成熟 hCTLA-4-IgG1 融合蛋白在溶液中典 型地是作为一个 hCTLA-4-IgG1 融合蛋白二聚体而存在的， 该二聚体包括两个相同的单体 hCTLA-4-IgG1 蛋白， 每个单体 hCTLA-4-IgG1 融合蛋白包括连接到一种 IgG1 Fc 多肽上的 hCTLA-4 ECD 多肽 (SEQ ID NO ： 159)。该成熟 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白在溶液中典型地作为 一种 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白二聚体而存在， 该二聚体包括两个相同的单体 hCTLA-4-IgG2 蛋白， 每个单体 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白 (SEQ ID NO ： 162) 包括连接到一种 IgG2 Fc 多肽上 159)。 该成熟 的 hCTLA-4 ECD 多肽 (SEQ ID NO ： 该融合蛋白二聚体包括两个相同的单体 融合蛋白是一种融合蛋白二聚体， 融合蛋白， 每个单体融合蛋白 (SEQ IDNO ： 164) 包括连接到一种特异的突变 IgG1Fc 多肽 (SEQ ID NO ： 186) 上的 hCTLA-4 ECD 多肽 (SEQ ID NO ： 159)。 该成熟 LEA29Y-Ig 融合蛋白在溶液中典型地作为一种 LEA29Y-Ig 融合蛋 白二聚体而存在， 该二聚体包括两个相同的单体 LEA29Y-Ig 融合蛋白， 每个单体 LEA29Y-Ig 融合蛋白 (SEQ ID NO ： 166) 包括连接到一个特异的突变 IgG1 多肽 (SEQ ID NO ： 186) 上的 特异突变 CTLA-4 ECD 多肽 (SEQ ID NO ： 168)。据信 二聚体的两个融合蛋白单体 是由一个单一的二硫键共价连接在一起的， 该二硫键是在每个 hCTLA-4- 突变 IgG1 单体的 位置 120 上的半胱氨酸残基之间形成， 并且在这两个突变 IgG1 Fc 多肽之间并未形成任何 二硫键。
     一些突变 CTLA-4 融合蛋白结合 CD80( 例如， hCD80) 和 / 或 CD86( 例如， hCD86)。 一些此类突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白结合一种 CD80-Ig 融合蛋白和 / 或一种 CD86-Ig 融合 蛋白。示例性的 CD80-Ig 融合蛋白包括该 hCD80-mIg 融合蛋白 (SEQ ID NO ： 225)， 它包括 连接到一种鼠 Ig Fc 多肽的人类 CD80 ECD ； 以及该 hCD80-hIgG1 融合蛋白 (SEQ ID NO ： 171)， 它包括连接到人类 IgG1 Fc 多肽上的 hCD80ECD 的序列。示例性的 CD86-Ig 融合蛋白 包括该 hCD86-mIg 融合蛋白 (SEQ ID NO ： 226)， 它包括连接到一种鼠 Ig Fc 多肽上的 hCD86 ECD(SEQ ID NO ： 180) ； 以及该成熟 hCD86-hIgG1 融合蛋白 (SEQ ID NO ： 178)， 它包括连结到 该人类 IgG1 Fc 多肽 (SEQ IDNO ： 185) 上的 hCD86 ECD(SEQ ID NO ： 180) 的序列。编码了 hCD86-mIg 以及 hCD80-mIg 的示例性核酸序列对应地示于 SEQ ID NOS ： 227 以及 228。
     在一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白， 该融合蛋白包括 (a) 一 种多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 80％、 85％、 90 ％、 91％、 92 ％、 93％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 99.5 ％、 或 100 ％的 序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 以及 (b) 一种 Ig Fc 多肽 ( 例如， hIgG2 Fc)， 其中该融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86， 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig 融合蛋白， 和/ 或展示了阻抑或抑制一种免疫应答的能力。 该 Ig Fc 多肽可包括一个多肽序列， 该多肽序列 具有与选自下组的一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的一致性， 该组为 SEQ ID NO ： 184、 185、 186、 以及 218。 在一些情形下， 该多肽 (a) 的 C- 端共价连接到 (b) 的 Ig Fc 多肽的 N- 端上。 一些此类突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白结合一种哺乳动物 CD80 和 / 或 CD86( 例如， hCD80 和 / 或 hCD86)， 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig 融合蛋白。一种 CD80-Ig 可包括例如， 连接到一种 Ig Fc 上的人类 CD80ECD( 例如， hCD80-Ig)。 在一个实施方案中， 一 种 hCD80-Ig 是连接到一种人类 Ig Fc 上的人类 CD80 ECD( 例如， hCD80-hIg) ； 在另一个实施 方案中， 一种 hCD80-Ig 是连结到一种鼠 Ig Fc 上的人类 CD80 ECD(hCD80-mIg)。在一个实 施方案中， 一种 hCD86-Ig 是连接到一种人类 Ig Fc 上的人类 CD86 ECD(hCD86-hIg) ； 在另一 个实施方案中， 一种 hCD86-Ig 是连接到一种鼠 Ig Fc 上的人类 CD86 ECD(hCD86-mIg)。一 些此类融合蛋白在体外和 / 或体内的测定和 / 或方法中具有抑制或阻抑不同免疫应答种的 一个或多个的能力， 例如， T 细胞活化、 T 细胞增殖、 细胞因子的合成或产生 ( 例如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2 的产生 )、 活化标记 ( 例如， CD25、 IL-2 受体 ) 或炎症分子的诱导、 炎症、 抗胶 原 Ab 的产生和 / 或 T 细胞依赖的 Ab 应答。此类融合蛋白预期在不同的应用中具有有益的 用途， 包括用于治疗免疫系统疾病及紊乱 ( 例如， 自身免疫疾病 ) 的方法， 以及用于抑制器 官、 细胞、 或组织移植体的移植的方法， 如以下所讨论。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚 体， 该融合蛋白二聚体包括经由至少一个二硫键连接的两个单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋 白， 这些二硫键是在每个单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白中存在的两个半胱氨酸残基之间形 成。每个突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白单体包括 ： (a) 一种突变 CTLA-4ECD 多肽， 该多肽包括一 个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 99.5％、 或 100％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 以及 (b) 一种 Ig Fc 多肽 ( 例如， hIgG2 Fc)， 其中该融合蛋白二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86， 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig 融合蛋白， 和 / 或展示了阻抑或抑制一种免疫 应答的能力。在一些情形下， (a) 的多肽的 C- 端共价连接到或融合到 (b) 的 Ig Fc 多肽的 N- 端上。该 Ig Fc 多肽可包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的一个多肽序列 至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的一致性， 该组的构成为 ： SEQID NO ： 184 至 186 以及 218。在一些情形下， 该融合蛋白二聚体通过一个共价二硫键而形成， 该二硫键是在每 个突变 CTLA-4 ECD 多肽序列的氨基酸位置 120 上的半胱氨酸残基之间， 或在对应于相对 在 SEQ ID NO ： 159 中所示的 hCTLA-4 ECD 多肽序列的每个突变 CTLA-4 ECD 多肽序列中的 位置 120 的一个氨基酸位置上。一些此类融合蛋白在体外和 / 或体内的测定和 / 或方法中 具有抑制或阻抑不同免疫应答中的一个或多个的能力， 例如， T 细胞活化、 T 细胞增殖、 细胞 因子的合成或产生 ( 例如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2 的产生 )、 活化标记 ( 例如， CD25、 IL-2 受 体 ) 或炎症分子的诱到、 炎症、 抗胶原 Ab 的产生、 和 / 或 T 细胞依赖的 Ab 应答。此类融合 蛋白二聚体预期在不同的应用中具有有益的用途， 包括用于治疗免疫系统疾病及紊乱 ( 例 如， 自身免疫疾病 ) 的方法， 以及用于抑制器官、 细胞、 或组织移植体的移植的方法， 如以下 所讨论。
     一些此类突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白单体具有对于 hCD86 或 hCD86 ECD 的结合亲和 力， 这些结合亲和力对应地是至少等于或大于 hCTLA-4 ECD 以及 LEA29 对于 hCD86 或 hCD86 ECD 的那些。见， 如， 实例 4 中的表 5。在一些此类二聚体以及单体融合蛋白中存在的突变 CTLA-4 ECD 多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有大约等于该 hCTLA-4 ECD 氨基酸长度的氨基酸长度。例如， 一些此类突变 CTLA-4 ECD 多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列长度 为大约 110 至 138、 112 至 136、 114 至 134、 116 至 132、 118 至 130、 119 至 129、 120 至 128、 121 至 127、 122 至 126、 或 123 至 125 个氨基酸残基。一些此类突变 CTLA-4 ECD 多肽包括 一个具有 124 个氨基酸残基的序列。示例性的突变 CTLA-4 ECD 多肽包括例如但不限于， 包 括一种多肽序列的那些， 该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQID NOS ： 1 至 73， 其中这种突变 CTLA-4 ECD 多肽结合 CD80 和 / 或 CD86( 或二者之一的或两者的一个 ECD)、 和 / 或具有抑 制一种免疫应答的能力。
     一些此类突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体具有对于 hCD86 和 / 或 hCD86-Ig 的一 种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是至少大约等于或大于一种 hCTLA-4-Ig 融合蛋白二 聚体 ( 例如， hCTLA-4-IgG2 或 hCTLA-4-IgG1 二聚体 )、 / 或 hCD86-mIg 的一种结合亲合力， 该结合亲合力与 二聚体、 和 / 或 LEA29Y-Ig 二聚体对于 hCD86 和 / 或 对于 hCD86 和 / 或 hCD86-Ig 的结合亲合力。一些此类融合蛋白二聚体具有对于 hCD86 和 hCD86-mIg 的亲和力相比高出 2-10 倍 (2x-10x)、 5-10 倍 (5x-10x)、 10-20 倍 (10x-20x)、 20-40 倍 (20x-40x)、 或超过 40 倍 ( ＞ 40x)。见， 如， 以下表 3 中的本发明的示例性二聚体 融合蛋白。可替代地或额外地， 一些此类融合蛋白二聚体具有对于 hCD80 和 / 或 hCD80-Ig 的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是至少大约等于或大于一种 hCTLA-4-Ig 二聚体 ( 例如， hCTLA-4-IgG2 或 hCTLA-4-IgG1 二聚体 )、 / 或 hCD80-mIg 的一种结合亲合力， 该结合亲合力与 二聚体、 和 / 或 LEA29Y-Ig 对 二聚体对于 hCD86 和 / 或 于 hCD80 和 / 或 hCD80-Ig 的结合亲合力。一些此类融合蛋白二聚体具有对于 hCD80 和 hCD86-mIg 的结合亲合力相比高出 0.5-2 倍 (0.5x-2x)、 2-4 倍 (2x-4x)、 或超过 2 倍 ( ＞ 2x)。见， 如， 以下表 4 中的本发明的示例性二聚体融合蛋白。 一些此类突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体以一种速率从结合的 hCD86 和 / 或 hCD86-Ig 中 解 离， 该 速 率 对 应 地 是 小 于 一 种 hCTLA-4-Ig 二 聚 体 ( 例 如， hCTLA-4-IgG2
     或 hCTLA-4-IgG1 二聚体 )、二聚体、 和 / 或 LEA29Y-Ig 从结合的 hCD86 和 / 或hCD86-Ig 中解离的速率。一些此类融合蛋白以一种速率与 hCD86 和 / 或 hCD86-Ig 相结 合， 该速率对应地是至少等于或大于一种 hCTLA-4-Ig 二聚体 ( 例如， hCTLA-4-IgG2 或 hCTLA-4-IgG1 二聚体 )、 二聚体、 和 / 或 LEA29Y-Ig 与 hCD86 和 / 或 hCD86-Ig 相 结合的速率。对于一些此类融合蛋白二聚体， 针对在 CD86( 或 CD86-Ig) 与本发明的融合 蛋白二聚体之间的结合反应的平衡解离常数 (KD) 小于针对在 CD86( 或 CD86-Ig) 与一种 hCTLA-4-Ig 二聚体 ( 例如， hCTLA-4-IgG2 或 hCTLA-4-IgG1 二聚体 )、 二聚体、 如， 表 3 中的本发明 和 / 或 LEA29Y-Ig 二聚体之间的结合反应的平衡解离常数 (KD)。见， 的示例性融合蛋白二聚体。对于一些此类融合蛋白二聚体， 针对在 CD80( 或 CD80-Ig) 与 本发明的融合蛋白二聚体之间的结合反应的平衡解离常数 (KD) 是大约等于或小于针对在 CD80( 或 CD80-Ig) 与一种 hCTLA-4-Ig 二聚体 ( 例如， hCTLA-4-IgG2 或 hCTLA-4-IgG1 二聚 体 )、 二聚体、 或 LEA29Y-Ig 二聚体之间的结合反应的平衡解离常数 (KD)。见， 如， 表 4 中的本发明的示例性融合蛋白二聚体。
     一些此类突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体具有阻抑或抑制一种免疫应答的一种能力 ( 例如， 抑制 T 细胞的活化或增殖、 抑制细胞因子的产生、 等 )， 该能力对应地是大约 等 于 或 大 于 一 种 hCTLA-4-Ig 二 聚 体 ( 例 如， hCTLA-4-IgG2 或 hCTLA-4-IgG1 二 聚 体 )、 二聚体、 和 / 或 LEA29Y-Ig 二聚体抑制或阻抑所述免疫应答的能力。例如， 一些 此类融合蛋白二聚体可在体外测定中抑制 T 细胞活化或 T 细胞增殖。例如， 以下所示的实 例 4 至 9 证明了本发明的代表性融合蛋白二聚体 ( 包括一种代表性突变 CTLA-4ECD 多肽序 列 ) 在体外抑制 T 细胞增殖的能力。一些此类二聚体可以在体内抑制或阻抑受试者体内的 一种免疫应答， 如， 通过将一个治疗或预防有效量的至少一种这种二聚体给予需要免疫抑 制疗法的受试者。 一些此类融合蛋白二聚体预期用于不同的应用， 包括例如但不限于， 用于 在患有其中希望免疫抑制的免疫系统疾病或紊乱 ( 例如， 自身免疫疾病 ) 的受试者体内阻 抑或抑制一种免疫应答的预防和 / 或治疗方法， 以及用于通过一个受方对于来自供方的一 个组织、 细胞、 或器官移植体的排斥的方法。
     一些此类二聚体具有调整或阻抑通过 CD28 的信号传导的经变化的能力， 因为他 们具有对于 CD80 和 CD86 的不同的比较性结合亲合力。此类二聚体用于其中希望 T 细胞应 答的差异操纵的应用， 包括用于治疗免疫系统疾病及紊乱的治疗及预防方法， 例如， 免疫缺 陷疾病及紊乱 ( 例如， RA、 MS、 牛皮癣、 等 )。包括本发明多肽的示例性二聚体融合蛋白 ( 具 有以上说明的差异 CD80/CD86 结合亲合力以及免疫抑制特性 ) 示于实例 4。
     一些此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体具有阻抑或抑制一种免疫应答的一种能力， 该能 力对应地是大约等于或大于 hCTLA-4 蛋白或 hCTLA-4-Ig 二聚体阻抑或抑制一种或多种类 型免疫应答的能力。 例如， 一些此类二聚体在体外和 / 或活体内的测定和 / 或应用 ( 如以上 和以下所说明的那些 ) 中具有抑制 T 细胞的活化或增殖的一种能力， 该能力是至少大约等 于或大于该 hCTLA-4 蛋白或一种 hCTLA-4-Ig 二聚体 ( 例如， hCTLA-4-IgG2 二聚体、 或 hCTLA-4-IgG1 二聚体 ) 在此类应用中抑制 T 细胞的活化或增殖的能力。额外地， 一 些此类二聚体具有抑制或阻抑一种免疫应答的一种能力 ( 例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞 因子的产生、 T 细胞依赖的抗体反应 )， 该能力大于一个 LEA29Y-Ig 二聚体抑制或阻抑一种 免疫应答的能力。例如， 实例 4 至 9 将本发明的代表性二聚体融合蛋白 ( 包括本发明的一 个突变 CTLA-4ECD 多肽序列 ) 在体外抑制 T 细胞增殖的能力相对于二聚体 hCTLA-4-IgG2、 以及 LEAY29-Ig 在体外阻抑 T 细胞增殖的能力进行了比较。见， 如， 以下表 6 至 9。一些此类二聚体具有结合 hCD80 和 / 或 hCD86( 或 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig) 的能力， 以及在体外和 / 或体内的测定和 / 或应用 ( 如以上以及以下更为详细说明的那些 ) 中抑制 或阻抑一种免疫应答的能力 ( 例如， 一种体内方法， 其中给予了一个治疗或预防有效量的 至少一种此类二聚体 )。 一些此类二聚体具有对于 hCD80 和 / 或 hCD86( 或 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig) 的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是至少大约等于或大于 hCTLA-4 蛋白、 一种二聚体 hCTLA-4-Ig( 例如， hCTLA-4-IgG2、 ) 或二聚体 LEA29Y-Ig 对于 hCD80 和 / 或 hCD86( 或 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig) 的结合亲合力， 以及阻抑一种免疫应答的能 力， 该能力是至少等于或大于 hCTLA-4 蛋白、 一种二聚体 hCTLA-4-Ig( 例如， hCTLA-4-IgG2、 ) 或二聚体 LEA29Y-Ig 抑制一种免疫应答的能力。此类突变 CTLA-4-Ig 融合蛋 白二聚体预期用于不同的应用， 包括例如， 用于治疗免疫系统疾病、 紊乱、 及病况的预防和 / 或治疗方法， 如以下更为详细地讨论。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白二聚体 ( 例如， 突变CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 )， 该融合蛋白二聚体包括两个相同的单体融合蛋白 ( 例如， 两个单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )， 其中每个这种单体融合蛋白包括一个多肽序列， 该 多肽序列具有与选自下组的一个多肽序列至少 90％、 90.5％、 91％、 91.5％、 92％、 92.5％、 93％、 93.5％、 94％、 94.5％、 95％、 95.5％、 96％、 96.5％、 97％、 97.5％、 98％、 98.5％、 99％、 99.5％、 或 100％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以 及 219 至 222， 其中该二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或一种 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig， 对应地如 hCD80-mIg 和 / 或 hCD86-mIg)， 和 / 或具有抑制一种免疫应答的能力， 包括以上 所说明并且以下进一步说明的那些。在 SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222 中给出的多肽序列中的每个是一个成熟突变 CTLA-4ECD， 该 ECD 在其 C- 端融合到 一种 IgG2 Fc 多肽的 N- 端上， 并且每个这种序列可被称为一种突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白。 SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 220、 以及 222 中每个的多肽序列是与 SEQ ID NOS ： 205 至 214、 219、 以及 221 相同的， 除了 SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 220、 以及 222 中的每个 在其 C- 端包括一个赖氨酸之外。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白单体， 该融合蛋白单体 包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与包括 SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222 中任何一个的氨基酸残基 1 至 351 的一个多肽序列至少 90 ％、 90.5 ％、 91％、 91.5％、 92％、 92.5％、 93％、 93.5％、 94％、 94.5％、 95％、 95.5％、 96％、 96.5％、 97％、 97.5％、 98％、 98.5％、 99％、 99.5％、 或 100％的一致性， 其中该融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或一种 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig， 对应地如 hCD80-mIg 和 / 或 hCD86-mIg)、 和/ 或具有抑制一种免疫应答的能力， 包括以上所说明并且以下进一步说明的那些。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白二聚体， 该融合蛋白二 聚体包括两个相同的单体融合蛋白， 其中每个这种单体融合蛋白包括一个多肽序列， 该多 肽序列具有与包括 SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222 中任何一个 的氨基酸残基 1-351 的多肽序列具有至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的一致性， 其中该融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig， 对应地如 hCD80-mIg 和 / 或 hCD86-mIg)， 和 / 或具有抑制一种免疫应答的能 力， 包括以上所说明并且以下进一步说明的那些。
     还提供了一种突变单体 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 该融合蛋白包括一个多肽序列， 该 多肽序列具有与选自下组的一个多肽序列至少 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97％、 98％、 99％或 100％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222， 其中所述单体融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig， 对应地如 hCD80-mIg 和 / 或 hCD86-mIg)、 和 / 或具有抑制一种免疫应答的能力。 一些此类融合蛋白单体以及二聚体在体外和 / 或体内的测定和 / 或方法中具有抑制或阻抑 一种或多种免疫应答的能力， 包括例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞因子的合成或产生 ( 例 如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2 的产生 )、 活化标记的诱导 ( 例如， CD25、 IL-2 受体 )、 炎症、 抗胶 原 Ab 的产生、 和 / 或 T 细胞依赖的 Ab 应答 ( 例如， 在患有一种疾病、 紊乱、 或病况的一位受 试者体内， 其中免疫抑制疗法会具有益处， 并且对该受试者给予一个治疗有效量的这种二 聚体融合蛋白的受试者体内， 如以下更为详细地讨论 )。 此类融合蛋白单体以及二聚体预期 用于不同的应用， 包括用于治疗免疫系统疾病的治疗和 / 或预防方法， 包括以下所讨论的那些。 在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白二聚体 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 )， 该融合蛋白二聚体包括两个单体融合蛋白 ( 例如， 单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )， 其中每个这种单体融合蛋白包括 ： (1) 一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 细胞外结构域多肽 )， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列与选自下组的一个多肽序列具 有不超过 6 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 或 6 个氨基酸残基 ) 的差异， 该组的 构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 并且其中在该多肽序列中在氨基酸位置 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的氨基酸残基是与在所述所选择的多肽序列 ( 例如， 选自 SEQ ID NOS ： 1 至 73 的一种多肽 ) 的对应位置上的氨基酸残基相同， 以及 (2) 一种 Ig Fc 多肽 ( 例如， IgG2 Fc)， 其中该融合蛋白二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)、 和 / 或在 体外和 / 或体内的测定和 / 或方法中抑制一种免疫应答 ( 例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞 因子的产生、 活化标记或炎症分子的诱导、 抗胶原 Ab 的产生、 和 / 或 T 细胞依赖的 Ab 应答、 等 )， 如以下所详细讨论。本发明还包括如以上所说明的一种分离或重组的单体融合蛋白， 它结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或在体外或体内诱导一种 免疫应答。在该融合蛋白二聚体中， 这两个单体融合蛋白 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 单体 ) 可 任选地通过经由在每个单体中的半胱氨酸残基的一个或多个二硫键而共价连接在一起， 并 且这两个单体典型地是彼此相同的。在一些情形下， 在这种融合蛋白二聚体或单体中的突 变 CTLA-4 ECD 多肽与所选择的多肽 ( 例如， 选自 SEQ ID NOS ： 1 至 73) 具有不超过 6 个氨基 酸残基的差异， 但占据位置 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 及 85 中的氨基酸是与在所选择的 多肽序列中的位置上的氨基酸残基相同 ； 即， 在这种位置上的氨基酸残基不能缺失或取代。 在这种融合蛋白中的一些此类 CTLA-4 ECD 多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列与所选择 的多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且它包括了在位置 24、 30、 32、 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 85、 104、 以及 106 上的氨基酸残基， 这些氨基酸残基与在所选择的多肽序 列中的对应位置上的氨基酸残基相同。此类 CTLA-4 ECD 多肽可以与所选择的多肽序列具 有一种或多种氨基酸缺失、 一种或多种氨基酸添加、 和 / 或一种或多种氨基酸取代的差异。 一个氨基酸取代可以是一个保守性或非保守性取代。见， 如， “序列变异” 章节。一些此类 二聚体融合蛋白具有对于 hCD86 或 hCD86-Ig 的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是 至少大约等于或大于 hCTLA-4、 二聚体 hCTLA-4-Ig、 二聚体 LEA29Y-Ig、 或 蛋白对 于 hCD86 或 hCD86-Ig 的结合亲合力。一些此类单体融合蛋白具有对于 hCD86、 hCD86-Ig、 或 hCD86ECD 的一种结合亲和力或亲合力， 该结合亲和力或亲合力对应地是至少大约等于 或大于该单体 hCTLA-4、 单体 hCTLA-4-Ig、 或单体 LEA29Y-Ig 对于 hCD86、 hCD86-Ig 或 hCD86 ECD 的结合亲和力或亲合力。可替代地或额外地， 一些此类二聚体融合蛋白具有对于 hCD80 或 hCD80-Ig 的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是至少大约等于或大于 hCTLA-4 或 hCTLA-4-Ig 对于 hCD80 的亲合力。可替代地或额外地， 一些此类单体融合蛋白具有对于 hCD80、 hCD80-Ig、 或 hCD80ECD 的一种结合亲和力或亲合力， 该结合亲和力或亲合力对应地 是至少大约等于或大于单体 hCTLA-4 或单体 hCTLA-4-Ig 对于 hCD80、 hCD80-Ig、 或 hCD80 ECD 的一种结合亲和力或亲合力。在一些情形下， 在这种融合蛋白二聚体或单体中的突变 CTLA-4 ECD 多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有大约等于该 hCTLA-4 ECD 氨基酸长度 的长度， 例如从大约 118 至 130、 119 至 129、 120 至 128、 121 至 127、 122 至 126、 123 至 125、
     或 124 个氨基酸残基的长度。该 Ig Fc 多肽 ( 例如， IgG2 Fc、 IgG1 Fc、 IgG4Fc、 或一种降低 效应子功能或 Fc 受体结合的一种突变 IgG Fc) 的 N- 端可直接地或间接地 ( 经由包括例如 从 1 至 10 个氨基酸残基的一个连接物 ) 共价地连接到或融合到该突变 CTLA-4 ECD 多肽的 C- 端上。该 Ig Fc 多肽可包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的一个多肽序列 至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 184 至 186 以及 218， 例如 SEQ ID NO ： 184、 185、 186 以及 218 的任何一个。
     一些此类突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体或单体可阻抑不同免疫应答中的一个 或多个， 包括例如， T 细胞活化、 T 细胞增殖、 细胞因子的合成或产生 ( 例如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2 的生成 )、 活化标记 ( 例如， CD25、 IL-2 受体 ) 或炎症分子的诱导、 炎症、 抗胶原 Ab 的产 生、 和 / 或一种或多种 T 细胞依赖的 Ab 应答。一些此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体与 hCTLA-4、 二聚体 hCTLA-4-Ig、 或二聚体 LEA29Y-Ig 相比具有阻抑一种或多种此类免疫应答的更大的 能力。例如， 实例 4 至 9 提供了以下数据， 这些数据将本发明的代表性二聚体融合蛋白 ( 包 括本发明的一种突变 CTLA-4 ECD 多肽 ) 在体外抑制 T 细胞增殖的能力相对于一种二聚体 hCTLA-4-Ig 或二聚体 LEA29Y-Ig 这样做的能力进行了比较。 一些此类突变 CTLA-4-Ig 单体 与单体 hCTLA-4、 单体 hCTLA-4-Ig、 或单体 LEA29Y-Ig 相比具有阻抑一种或多种此类免疫应 答的更大的能力。一些此类单体及二聚体可以在受试者体内阻抑或抑制一种免疫应答， 如 通过将一个治疗或预防有效量的至少一种此类多肽给予需要免疫抑制疗法的受试者。 此类 融合蛋白预期在不同的应用中具有有益的用途， 包括用于治疗一种疾病、 紊乱、 或病况的方 法， 其中免疫抑制会具有益处， 如， 用于治疗自身免疫疾病及紊乱的预防和 / 或治疗方法， 以及用于抑制器官、 细胞、 或组织移植体的移植的方法。
     在 另 一 个 方 面， 本 发 明 提 供 了 一 种 分 离 或 重 组 的 蛋 白 二 聚 体 ( 例 如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 )， 该蛋白二聚体包括两个单体融合蛋白 ( 例如， 两个单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )， 其中每个这种单体融合蛋白包括 ： (1) 一种突变 CTLA-4 细胞外结构 域 (ECD) 多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与选自下组的一个多肽序列具有 不超过 6 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5 或 6 个氨基酸残基 ) 的差异， 该组的构成 为： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 并且 (b) 包括在对应于相对 SEQ IDNO ： 159 多肽序列的位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的一个氨基酸位置上的至少一个氨基酸取代 ； 以及 (2) 一种 Ig Fc 多肽， 其中该融合蛋白二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)、 和 / 或在体外和 / 或体内的测定和 / 或方法中抑制一种免疫应答 ( 例如， T 细胞的活化或 增殖、 细胞因子的产生、 活化标记的诱导、 炎症、 抗胶原抗体的产生、 T 细胞依赖的抗体反应、 等 )， 如以下更为详细地说明。本发明还包括一种分离或重组的单体融合蛋白， 如以上所说 明， 它结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)、 和 / 或在体外或体内诱导 一种免疫应答。在一些情形下， CD80 是 hCD80， 并且 CD86 是 hCD86。在该融合蛋白二聚体 中， 这两个单体融合蛋白 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 单体 ) 是可任选地通过经由在每个单体中 的半胱氨酸残基的一个或多个二硫键而共价连接在一起， 并且这两个单体典型地是彼此相 同的。该 Ig Fc 多肽 ( 例如， IgG2 Fc、 IgG1 Fc、 IgG4 Fc、 或降低效应子功能或 Fc 受体结合 的一种突变 IgG Fc) 的 N- 端可直接地或间接地 ( 经由包括例如从 1 至 10 个氨基酸残基的 一个连接物 ) 共价连接到或融合到该突变 CTLA-4ECD 多肽的 C- 端上。该 Ig Fc 多肽可包 括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、99％、 或 100％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 184 至 186 以及 218。
     一些此类融合蛋白二聚体或单体包括一种突变 CTLA-4 ECD 多肽， 该多肽包括一个 多肽序列， 该多肽序列具有大约等于该 hCTLA-4 ECD 氨基酸长度的长度， 例如 118 至 130、 119 至 129、 120 至 128、 121 至 127、 122 至 126、 或 123 至 125 个氨基酸残基的长度。在这种 融合蛋白二聚体或单体中的一些此类突变 CTLA-4 ECD 多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 长度是 124 个氨基酸残基。一些此类突变 CTLA-4 ECD 多肽包括 2、 3、 4、 5、 或 6 个氨基酸取 代， 这些氨基酸取代是在相对在 SEQ ID NO ： 159 中所示的序列的、 选自下组的位置上， 该组 的构成为 ： 位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 以及 85。一些此类突变 CTLA-4 ECD 多肽进一步包 括一个氨基酸取代， 该氨基酸取代是在对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的位置 104 和 / 或 30 的 一个位置上。一些此类突变 CTLA-4 ECD 多肽包括相对 SEQ ID NO ： 159 的至少一个氨基酸 取代， 这些氨基酸取代是在位置 70( 可任选地 S70F)、 位置 64( 可任选地 S64P)、 位置 50( 可 任选地 A50M)、 位置 54( 可任选地 M54K/V， 例如 M54K)、 位置 65( 可任选地 I65S)、 位置 56( 可 任选地 N56D)、 位置 55( 可任选地 G55E)、 位置 85( 可任选地 M85A)、 和 / 或位置 24( 可任选 地 A24E/S， 例如 A24E) 上。任何此类突变 CTLA-4 ECD 多肽可进一步包括相对 SEQ ID NO ： 159 的一个氨基酸取代， 该氨基酸取代是在位置 104( 可任选地 L104E/D， 例如 L104E)、 位置 30( 可任选地 T30N/D/A， 例如 T30N、 T30D、 或 T30A)、 和 / 或位置 32( 可任选地 V32I)。一些 此类突变 CTLA-4 ECD 多肽包括至少一个氨基酸取代， 这些氨基酸取代是在相对 SEQ ID NO ： 159 的一个氨基酸位置上， 这些氨基酸取代选自下组， 其构成为 ： A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 以及 S70F。一些此类突变 CTLA-4ECD 多肽包括 2、 3、 4、 5、 或 6 个氨基酸取代， 这 些氨基酸取代是在相对 SEQ ID NO ： 159 的多个氨基酸位置上， 这些氨基酸取代选自下组， 其 构成为 ： A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 以及 S70F。
     一 些 此 类 突 变 CTLA-4-Ig 二 聚 体 展 示 了 对 于 CD86( 例 如， hCD86) 或 二 聚 体 CD86-Ig( 例如， hCD86-Ig) 的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是大约等于或大于 hCTLA-4 蛋 白、 二 聚 体 hCTLA-4-Ig( 例 如， hCTLA-4-IgG1 或 hCTLA-4-IgG2)、 蛋 白、 或二聚体 LEA29Y-Ig 对于 CD86 或二聚体 CD86-Ig 的结合亲合力。一些此类二聚体具有 对于 CD80( 例如， hCD80) 或二聚体 CD80-Ig( 例如， hCD80-Ig) 的一种结合亲合力， 该结合 亲合力对应地大于 hCTLA-4 蛋白、 一种二聚体 hCTLA-4-Ig、 蛋白、 和 / 或二聚体 LEAY29-Ig 对于 CD80 或二聚体 CD80-Ig 的结合亲合力。
     一些此类突变 CTLA-4-Ig 单体展示了对于 CD86( 例如， hCD86) 或 CD86-Ig( 例如， hCD86-Ig) 的一种结合亲和力或亲合力， 该结合亲和力或亲合力对应地是大约等于或大于 单体 hCTLA-4、 单体 hCTLA-4-Ig、 或单体 LEA29Y-Ig 对于 CD86 或二聚体 CD86-Ig 的结合亲 和力或亲合力。一些此类单体具有对于 CD80( 例如， hCD80) 或 CD80-Ig( 例如， hCD80-Ig) 的一种结合亲和力或亲合力， 该结合亲和力或亲合力对应地是大于单体 hCTLA-4 或单体 hCTLA-4-Ig( 例如， 单体 CTLA-4-IgG1 或 CTLA-4-IgG2) 对于 CD80 或二聚体 CD80-Ig 的结合 亲和力或亲合力。
     一些此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体以及单体在体外和 / 或体内的测定和 / 或方法 中 ( 例如， 在患有一种疾病、 紊乱、 或病况的一位受试者体内， 其中免疫抑制疗法会具有益 处， 并且对该受试者给予一个治疗有效量的至少一种此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体 ) 阻抑 或抑制一种或多种免疫应答的能力， 包括以上以及全文中所说明的 ( 例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞因子的产生、 活化标记的诱导、 炎症、 抗胶原抗体的产生、 T 细胞依赖的抗体反 应 )。一些此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体与 hCTLA-4、 一种二聚体 hCTLA-4-Ig( 例如， 二聚 体 CTLA-4-IgG1 或 CTLA-4-IgG2)、 蛋白、 和 / 或二聚体 LEAY29-Ig 相比以更大 的程度来抑制一种或多种此类免疫应答。一些此类突变 CTLA-4-Ig 单体与 hCTLA-4、 单体 hCTLA-4-Ig、 和 / 或单体 LEAY29-Ig 相比以更大的程度来阻抑一种或多种此类免疫应答。 此 类突变 CTLA-4-Ig 二聚体以及单体预期在不同的应用中具有有益的用途， 包括用于治疗自 身免疫疾病及紊乱的方法， 以及用于抑制器官、 细胞、 或组织移植体的移植的方法。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白二聚体 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 )， 该融合蛋白二聚体包括两个单体融合蛋白 ( 例如， 单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )， 其中每个这种单体融合蛋白包括 ： (1) 一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 细胞外结构域 )， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (i) 具有与选自下组的任何多肽序 列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQID NOS ： 1 至 73， 并且 (ii) 包括一个苯丙氨酸残基， 该苯丙氨酸残基在对应于所述多肽序列的位置 70 的一个氨基酸位置上， 该多肽序列选自下组， 其构成为 ： SEQ ID NO ： 1 至 73， 以及 (2) 一种 Ig Fc 多肽 ( 例如， IgG2 Fc、 IgG1Fc、 IgG4 Fc、 或降低效应子功能或 Fc 受体结合的一种突 变 IgG Fc)， 其中该融合蛋白二聚体结合 CD80( 例如， hCD80) 和 / 或 CD86( 例如， hCD86)( 和 / 或 CD80-Ig， 例如 hDC80-Ig、 和 / 或 CD86-Ig， 例如 hCD86-Ig)、 和 / 或在体外和 / 或体内诱 导一种免疫应答的能力。本发明还包括如以上所说明的一种分离或重组的单体融合蛋白， 该单体融合蛋白结合 CD80( 例如， hCD80) 和 / 或 CD86( 例如， hCD86)( 和 / 或 CD80-Ig， 例如 hDC80-Ig、 和 / 或 CD86-Ig， 例如 hCD86-Ig)、 和 / 或在体外或体内诱导一种免疫应答。在一 些情形下， 该 Ig Fc 多肽包括一个序列， 该序列具有与选自下组的一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 184 至 186 以及 218。该 Ig Fc 多肽的 N- 端可直接地或间接地 ( 经由包括例如从 1 至 10 个氨基酸残基的 一个连接物 ) 共价连接到或融合到该突变 CTLA-4 ECD 多肽的 C- 端上。
     在一些此类突变 CTL-4-Ig 二聚体及单体中， 该突变 CTLA-4 ECD 多肽包括以下的 相对所述所选择的多肽序列中的一个或多个 ： 在对应于位置 24 的一个氨基酸位置上的一 个谷氨酸残基 ； 在对应于位置 30 的一个氨基酸位置上的一个天冬酰胺残基 ； 在对应于位 置 32 的一个氨基酸位置上的一个异亮氨酸残基 ； 在对应于位置 50 的一个氨基酸位置上的 一个甲硫氨酸残基 ； 在对应于位置 54 的一个氨基酸位置上的一个赖氨酸残基 ； 在对应于位 置 55 的一个氨基酸位置上的一个谷氨酸残基 ； 在对应于位置 56 的一个氨基酸位置上的一 个天冬氨酸残基 ； 在对应于位置 64 的一个氨基酸位置上的一个脯氨酸残基 ； 在对应于位置 65 的氨基酸位置上的一个丝氨酸残基 ； 以及在对应于位置 104 的氨基酸位置上的一个谷氨 酸残基。例如， 在此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体或单体中， 一些此类突变 CTLA-4 ECD 多肽包 括一个多肽序列， 该多肽序列包括 (i) 与 SEQ ID NO ： 2 的多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 以及 (ii) 一个苯丙氨酸残基， 该苯丙氨酸残基在对应 于 SEQ ID NO ： 24 的多肽序列的位置 70 的一个氨基酸位置上， 其中该多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86( 和 / 或 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig)、 和 / 或在体外和 / 或体内的测定和 / 或方法 中抑制一种免疫应答。在此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体或单体中， 一些此类突变 CTLA-4ECD 多肽包括以下的相对 SEQ ID NO ： 24 中的一个或多个 ： 在位置 24 上的一个谷氨酸残基、 在位置 30 上的一个天冬酰胺残基、 在位置 32 上的一个异亮氨酸残基、 在位置 50 上的一个甲硫 氨酸残基、 在位置 54 上的一个赖氨酸残基、 在位置 55 上的一个谷氨酸残基、 在位置 56 上的 一个天冬氨酸残基、 在位置 64 上的一个脯氨酸残基、 在位置 65 上的一个丝氨酸残基、 以及 在位置 104 上的一个谷氨酸残基。
     一 些 此 类 突 变 CTLA-4-Ig 二 聚 体 具 有 对 于 CD86( 例 如， hCD86) 或 二 聚 体 CD86-Ig( 例 如， hCD86-Ig) 的 一 种 结 合 亲 合 力， 该结合亲合力对应地是大约等于或大 于 hCTLA-4、 二 聚 体 hCTLA-4-Ig、 蛋 白、 或 二 聚 体 LEA29Y-Ig 对 于 CD86 或 二 聚体 CD86-Ig 的结合亲合力。一些此类二聚体具有对于 CD80( 例如， hCD80) 或二聚体 CD80-Ig( 例如， hCD80-Ig) 的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是大于 hCTLA-4、 一种 二聚体 hCTLA-4-Ig、 或
     蛋白对于 CD80 或二聚体 CD80-Ig 的结合亲合力。一些此类突变 CTLA-4-Ig 单体展示了对于 CD86( 例如， hCD86) 或 CD86-Ig( 例如， hCD86-Ig) 的一种结合亲和力或亲合力， 该结合亲和力或亲合力对应地是大约等于或大于 单体 hCTLA-4、 单体 hCTLA-4-Ig、 和 / 或单体 LEA29Y-Ig 对于 CD86 或 CD86-Ig 的结合亲和 力或亲合力。一些此类单体具有对于 CD80( 例如， hCD80) 或 CD80-Ig( 例如， hCD80-Ig) 的一种结合亲和力或亲合力， 该结合亲和力或亲合力对应地是大于单体 hCTLA-4 或单体 hCTLA-4-Ig 对于 CD80 或二聚体 CD80-Ig 的结合亲和力或亲合力。
     一些此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体以及单体具有在体外和 / 或体内的测定和 / 或 方法中 ( 例如， 在患有一种疾病、 紊乱、 或病况的一位受试者体内， 其中免疫抑制疗法将会 具有益处， 并且对该受试者给予一个治疗有效量的至少一种此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体 ) 阻抑或抑制一种或多种免疫应答的能力 ( 例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞因子的产生、 活 化标记的诱导、 炎症、 抗胶原 Ab 的产成、 T 细胞依赖的 Ab 应答 )。一些此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体与 hCTLA-4、 一种二聚体 hCTLA-4-Ig( 例如， 二聚体 CTLA-4-IgG1 或 CTLA-4-IgG2)、 蛋白、 和 / 或二聚体 LEA29Y-Ig 相比以更大的程度来阻抑或抑制一种或多种此类 免疫应答的能力。一些此类突变 CTLA-4-Ig 单体与单体 hCTLA-4、 单体 hCTLA-4-Ig、 和/或 单体 LEAY29-Ig 相比以更大的程度来阻抑或抑制一种或多种此类免疫应答的能力。此类突 变 CTLA-4-Ig 二聚体以及单体预期在不同的治疗和 / 或预防方法中具有有益的用途， 这些 方法用于治疗其中免疫抑制治疗将具有益处的疾病或紊乱， 包括例如， 用于治疗自身免疫 疾病的方法， 以及用于抑制器官、 细胞、 或组织移植体的移植物的排斥的方法。
     在又另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白二聚体 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 )， 该融合蛋白二聚体包括两个单体融合蛋白 ( 例如， 单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )， 其中每个这种单体融合蛋白包括 ： (1) 一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 细胞外结构域 )， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 所述的人 类 CTLA-4 细胞外结构域多肽的多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且 (b) 包括 至少一个氨基酸取代， 其中所述至少一个氨基酸取代包括 S70F， 其中根据 SEQ ID NO ： 159 对氨基酸残基位置是进行编号 ； 以及 (2) 一种 IgG Fc 多肽 ( 例如， IgG2 Fc、 IgG1 Fc、 IgG4 Fc。 或降低效应子功能或 Fc 受体结合的一种突变 IgG Fc)， 其中所述二聚体结合 hCD80 和 / 或 hCD86( 和 / 或 hCD86-Ig 和 / 或 hCD86-Ig)、 和 / 或在体外和 / 或体内的测定和 / 或方法中 抑制一种免疫应答 ( 例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞因子的产生、 活化标记的诱导、 炎症、 抗胶原抗体的产生、 T 细胞依赖的抗体反应、 等 )， 如以下详细地讨论。本发明还包括如以上所说明的一种分离或重组的单体融合蛋白， 该单体融合蛋白结合 CD80( 例如， hCD80) 和 / 或 CD86( 例如， hCD86)( 和 / 或 CD80-Ig， 例如 hCD80-Ig、 和 / 或 CD86-Ig， 例如 hCD86-Ig)、 和/ 或在体外或体内诱导一种免疫应答。 该 Ig Fc 多肽可包括一个序列， 该序列具有与选自下组 的一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 184 至 186 以及 218。该 Ig Fc 多肽的 N- 端可直接地或间接地 ( 经由包括例 如从 1 至 10 个氨基酸残基的一个连接物 ) 共价连接到或融合到该突变 CTLA-4ECD 多肽的 C- 端所。在一些此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体或单体中， 该突变 CTLA-4ECD 多肽进一步包括 选自下组的至少一个氨基酸取代， 该组的构成为 ： A24E、 T30N、 V32I、 D41G、 A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 M85A、 L104E、 以及 I106F。在一些此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体或单体中， 该突变 CTLA-4ECD 多肽进一步包括取代 L104E， 和 / 或二、 三、 或四个额外的取代， 这些取代 选自下组， 其构成为 ： T30N、 V32I、 A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 以及 I65S。
     一些此类二聚体具有对于 CD86( 例如， hCD86) 或二聚体 CD86-Ig( 例如， hCD86-Ig) 的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是大约等于或大于 hCTLA-4、 二聚体 hCTLA-4-Ig、 和/或 蛋白对于 CD86 或二聚体 CD86-Ig 的结合亲合力。一些此类二聚体具有对 蚤白对于 CD80 或二聚 于 CD80( 例如， hCD80) 或二聚体 CD80-Ig( 例如， hCD80-Ig) 的一种结合亲合力， 该结合亲 合力对应地是大于 hCTLA-4、 二聚体 hCTLA-4-Ig、 和/或 体 CD80-Ig 的结合亲合力。一些此类单体具有对于 CD86( 例如， hCD86) 或 CD86-Ig( 例如， hCD86-Ig) 的一种结合亲和力或亲合力， 该结合亲和力或亲合力对应地是大约等于或大于 单体 hCTLA-4、 单体 hCTLA-4-Ig 或单体 LEA29Y-Ig 对于 CD86 或 CD86-Ig 的结合亲和力或亲 合力。一些此类单体具有对于 CD80( 例如， hCD80) 或 CD80-Ig( 例如， hCD80-Ig) 的一种结 合亲和力或亲合力， 该结合亲合力或亲合力对应地是大于单体 hCTLA-4 或单体 hCTLA-4-Ig 对于 CD80 或二聚体 CD80-Ig 的结合亲和力或亲合力。
     一些此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体以及单体在体外和 / 或体内的测定和 / 或方法中 ( 例如， 在患有一种疾病、 紊乱、 或病况的一个受试者体内， 其中免疫抑制疗法将具有益处， 并且对该受试者给予一个治疗有效量的至少一种此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体 ) 阻抑或抑制 一种或多种免疫应答的能力 ( 例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞因子的产生、 活化标记的诱 导、 炎症、 抗胶原抗体的产生、 T 细胞依赖的抗体反应 )。一些此类二聚体与 hCTLA-4、 一种 二聚体 hCTLA-4-Ig( 例如， 二聚体 CTLA-4-IgG1 或 CTLA-4-IgG2)、 蛋白、 和 / 或二 聚体 LEAY29-Ig 相比具有以更大的程度来阻抑或抑制一种或多种此类免疫应答的能力。一 些此类单体与单体 hCTLA-4、 单体 hCTLA-4-Ig、 和 / 或单体 LEAY29-Ig 相比具有以更大的程 度来阻抑或抑制一种或多种此类免疫应答的能力。此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体以及单体预 期在不同的治疗和 / 或预防方法中具有有益的用途， 这些方法用于治疗其中免疫抑制治疗 将具有益处的疾病或紊乱， 包括例如， 用于治疗自身免疫疾病的方法， 以及用于抑制器官或 组织移植体的移植的方法。 在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的融合蛋白二聚体 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 )， 该融合蛋白二聚体包括两个单体融合蛋白 ( 例如， 单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )， 其中每个这种单体融合蛋白包括 ： (1) 一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 细胞外结构域 )， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与 SEQ ID NO ： 31 的多肽序列 具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且 (b) 包括以下的至少一项 ： 在对应于 SEQ IDNO ： 31
     的位置 50 的一个位置上的一个甲硫氨酸残基、 在对应于 SEQ IDNO ： 31 的位置 54 的一个位 置上的一个赖氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 55 的一个位置上的一个谷氨酸残 基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 64 的一个位置上的一个脯氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 65 的一个位置上的一个丝氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 70 的一 个位置上的一个苯丙氨酸残基， 其中根据 SEQ ID NO ： 31 对氨基酸残基位置进行编号 ； 以及 (2) 一种 Ig Fc 多肽， 其中所述二聚体结合 hCD80 和 / 或 hCD86( 和 / 或 hCD86-Ig 和 / 或 hCD86-Ig)、 和 / 或抑制一种免疫应答。本发明还包括如以上所说明的一种分离或重组的单 体融合蛋白， 它结合 CD80( 例如， hCD80) 和 / 或 CD86( 例如， hCD86)( 和 / 或 CD80-Ig， 例如 hCD80-Ig、 和 / 或 CD86-Ig， 例如 hCD86-Ig)、 和 / 或在体外或体内诱导一种免疫应答。该 Ig Fc 多肽可包括一种 IgG2 Fc、 IgG1 Fc、 IgG4 Fc、 或降低效应子功能或 Fc 受体结合的一种 突变 IgG Fc。该 Ig Fc 多肽可包括一个序列， 该序列具有与选自下组的一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 184 至 186 以 及 218。该 Ig Fc 多肽的 N- 端可直接地或间接地 ( 经由包括例如从 1 至 10 个氨基酸残基 的一个连接物 ) 共价连接到或融合到该突变 CTLA-4 ECD 多肽的 C- 端上。在一些此类二聚 体或单体中， 该突变 CTLA-4 ECD 多肽包括在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 104 的一个位置 上的一个谷氨酸残基、 在对应于位置 30 的一个位置上的一个天冬酰胺残基、 和 / 或在对应 于位置 32 的一个位置上的一个异亮氨酸残基。
     一 些 此 类 二 聚 体 具 有 对 于 CD86( 例 如， hCD86) 或 二 聚 体 CD86-Ig( 例 如， hCD86-Ig) 的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是大约等于或大于 hCTLA-4 蛋白、 二 聚体 hCTLA-4-Ig、 蛋白、 和 / 或二聚体 LEAY29-Ig 对于 CD86 或二聚体 CD86-Ig 的结合亲合力。一些此类二聚体具有对于 CD80( 例如， hCD80) 或二聚体 CD80-Ig( 例如， hCD80-Ig) 的一种结合亲合力， 该结合亲合力对应地是大于 hCTLA-4、 二聚体 hCTLA-4-Ig、 和/或 蛋白对于 CD80 或二聚体 CD80-Ig 的结合亲合力。一些此类单体展示了对 于 CD86( 例如， hCD86) 或 CD86-Ig( 例如， hCD86-Ig) 的一种结合亲和力或亲合力， 该结合亲 和力或亲合力对应地是大约等于或大于单体 hCTLA-4、 单体 hCTLA-4-Ig、 或单体 LEA29Y-Ig 对于 CD86 或 CD86-Ig 的结合亲和力或亲合力。一些此类单体具有对于 CD80( 例如， hCD80) 或 CD80-Ig( 例如， hCD80-Ig) 的一种结合亲和力或亲合力， 该结合亲和力或亲合力对应地 是大于单体 hCTLA-4 或单体 hCTLA-4-Ig 对于 CD80 或二聚体 CD80-Ig 的结合亲和力或亲合 力。
     一些此类突变 CTLA-4-Ig 二聚体以及单体在体外和 / 或体内具有阻抑或抑制一 种或多种免疫应答的能力 ( 例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞因子的产生、 活化标记的诱导、 炎症、 抗胶原抗体的产生、 T 细胞依赖的抗体反应 )， 如以下详细讨论。一些此类二聚体与 hCTLA-4、 一种二聚体 hCTLA-4-Ig、 蛋白、 和 / 或二聚体 LEAY29-Ig 相比具有以更 大的程度来阻抑一种或多种此类免疫应答的能力。一些此类单体与单体 hCTLA-4 或单体 hCTLA-4-Ig 相比具有以更大的程度来阻抑或抑制一种或多种此类免疫应答的能力。 此类突 变 CTLA-4-Ig 二聚体以及单体预期在不同的治疗和 / 或预防方法中具有有益的用途， 这些 方法用于治疗其中免疫抑制治疗将具有益处的疾病或紊乱， ( 例如， 自身免疫疾病及紊乱， 以及用于抑制器官或组织移植体的移植的方法 )。
     以上所说明的任何这种二聚体以及单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体或单体可进一步包括一种肽， 这种肽协助该融合蛋白从宿主细胞中分泌。这种肽可任选地是一种 信号肽。该信号肽的 C- 端典型地共价连接到一种融合蛋白的 N- 端上。该信号肽可包括一 个氨基酸序列， 该氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 182 或 SEQ ID NO ： 216 的氨基酸序列至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的一致性。该信号肽可 包括一个氨基酸序列， 该氨基酸序列具有与包括 SEQ ID NO ： 160 的氨基酸残基 1 至 35、 1至 36、 或 1 至 37 的一个氨基酸序列至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的一致性。此外， 如以下所讨论， 以上所说明的任何这种二聚体及单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白可包括一个或多个经糖基化或聚乙二醇化的氨基酸残基。
     本发明还提供了一种成熟 / 分泌的突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白， 其长度是 352 个 氨基酸， 并且包括一种突变 CTLA-4 ECD 多肽 ( 包括 124 个氨基酸残基 )， 以及一种人类 IgG2 Fc 多肽， 它包括 228 个氨基酸残基。示例性的突变 CTLA-4 ECD 多肽包括那些多肽， 这些多 肽包括通过 SEQ ID NOS ： 1 至 73 中的任何一个所识别的序列。示例性的突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白包括那些， 它们包括通过 SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 中 222 中任何一个所识别的一个多肽序列。 若需要， 一种成熟突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白的氨 基酸能够以该突变 CTLA-4-IgG2 的第一个氨基酸残基 ( 即， 该突变 CTLA-4 ECD 多肽的第一 个残基 ) 起始进行编号。在一些方面， 该突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白 ( 或突变 CTLA-4ECD) 的第一个残基是甲硫氨酸， 并且因此该突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白 ( 或突变 CTLA-4 ECD) 的氨基酸编号将会由甲硫氨酸起始 ( 被指定为氨基酸残基 1)。
     本发明还包括一种分离或重组的多聚体融合蛋白， 该多聚体融合蛋白包括二个或 多个以上说明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白。在一些情形下， 该多聚体是一个融合蛋白二 聚体， 该融合蛋白二聚体包括两个突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 它们可以是相同的融合蛋白 ( 即， 同型二聚体 ) 或不同的融合蛋白 ( 即， 异型二聚体 )。在一些情形下， 该多聚体是一种 四聚体融合蛋白， 它包括四个本发明的突变 CTLA-4-ECD 多肽。该四聚体可包括四个相同的 突变 CTLA-4 ECD 多肽 ( 即， 同型四聚体 )、 或本发明的四个突变 CTLA-4ECD 多肽的任何组 合， 这样使得所有四个突变 CTLA-4 ECD 多肽都不相同 ( 即， 异四聚体 )。 一些此类多聚体结 合 CD80 和 /CD86( 和 / 或 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig)、 和 / 或阻抑或抑制一种免疫应答。
     本发明包括以上说明的可溶形式的多肽、 融合蛋白、 以及多聚体中的任何一种。 还 包括了以下说明的可溶形式的本发明的偶联物。本发明的可溶性分子 - 如， 本发明的可溶 性的多肽、 二聚体融合蛋白、 单体融合蛋白、 多聚体、 以及偶联物 - 并未连接或结合或结合 到细胞上。一些此类可溶性分子可以在溶液中或可以进行循环， 例如， 在一种液体中 ( 例 如， 在受试者的体内 )。可以典型地使用一种信号肽来协助这种分子的分泌， 但该信号肽在 该分子从宿主细胞中分泌的过程中被切割。因此， 在大部分的情形下， 一种可溶性的分子， 如， 一种可溶性的多肽、 二聚体融合蛋白、 单体融合蛋白、 或多聚体， 并不包括一种信号肽。 如以上所讨论， 本发明的一个突变 CTLA-4 细胞外结构域多肽可以连接到一种 Ig 分子上， 该 分子包括例如， 一种 Ig 多肽的一部份， 例如， 一种 Ig Fc 多肽， 它造成一种可溶性的融合蛋 白。因此， 在一个方面， 本发明包括可溶性的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 该融合蛋白包括如 在本文中所说明的本发明的任何突变 CTLA-4 ECD 多肽， 该多肽融合到或连接到一种 Ig 多 肽的至少一个部分上， 例如， 一种野生型 Ig Fc( 例如， 人类 IgG2 Fc) 或突变 Ig Fc 多肽。 此 类可溶性的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白可以是单体或二聚体的融合蛋白， 并且包括以上以及其他地方 ( 包括在以下实例中 ) 详细说明的的那些突变 CTIA-4-Ig 融合蛋白单体以及二聚 体。如以上以及本文中的其他地方所详细说明， 一些此类可溶性的单体或二聚体融合蛋白 可具有结合 CD80 和 / 或 CD86 的能力、 和 / 或在体外和 / 或体内的应用中阻抑或抑制一种 免疫应答的能力 ( 例如， T 细胞的活化或增殖 )。
     本发明的此类可溶性分子预期在不同的应用中具有具体的益处， 包括例如， 用于 治疗免疫系统疾病及紊乱 ( 例如， 自身免疫疾病 ) 的治疗及预防方法， 以及用于抑制细胞、 器官或组织移植体的移植的预防及治疗方法。本发明的可溶性分子 - 例如， 本发明的可溶 性重组突变 CTLA-4 ECD 多肽、 单体以及二聚体的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白、 突变 CTLA-4 ECD 偶联物、 突变 CTLA-4-Ig 偶联物、 包括突变 CTLA-4 ECD 多肽或突变 CTLA-4-Ig 的多聚 体、 包括突变 CTLA-4 偶联物或突变 CTLA-4-Ig 偶联物的多聚体 - 它们结合 CD80 和 / 或 CD86， 在以一个治疗或预防有效量给予一个受试者时， 抑制了内源性 CD80 和 / 或 CD86 与内 源性 CD28 之间的相互作用， 由此在该受试者体内阻抑一种免疫系统反应或对该受试者的 健康的身体组织、 器官、 和 / 或细胞的免疫系统进行攻击。在其中一个受试者是来自一个供 方的健康的身体组织、 器官、 和 / 或细胞的受方情形下 ( 例如， 当该受试者受方已接受了一 个供方的组织移植体或细胞或器官移植物时 )， 此类可溶性的分子抑制了内源性 CD80 和 / 或 CD86 与内源性 CD28 之间的相互作用， 由此抑制该受试者的免疫系统对由该供方捐献到 该受试者的健康的身体组织、 器官、 和 / 或细胞的有害应答或攻击。经由阻抑一种免疫系统 应答或对健康的身体组织的攻击， 降低了该受试者体内与这种免疫系统应答或对健康的身 体组织、 器官、 或细胞的攻击相关联的副作用 ( 例如， 疼痛、 关节炎症、 等 )， 并延迟或防止由 这种响应或攻击所造成的损伤。
     用于测量以上说明的本发明的多肽 ( 包括例如， 突变 CTLA-4 ECD 多肽、 二聚体 以及单体的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白、 以及多聚体 ) 的结合亲和力以及亲合力的方法对 于本领域中的普通技术人员而言将是已知的， 并且包括例如但不限于 ： BiacoreTM 技术 (GE Healthcare)、 等温滴定微量热法 (MicroCal LLC， Northampton， MA)、 ELISA、 结合亲合力噬 菌体展示法、 以及 FACS 法。Biacore 法在以下实例 4 中详细说明。FACS 或其他分选方法在 以上以及本文的其他地方进行更为详细地说明。通过噬菌体 ELISA 来测量本发明的多肽对 hCD80 和 / 或 hCD86 的结合亲合力的方法说明于以下实例 2 中。
     用于检测并测量由本发明的分子 ( 包括例如， 本发明的突变 CTLA-4ECD 多肽、 二聚 体以及单体的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白、 以及多聚体 ) 所诱导的 T 细胞应答的方法是本领 域的普通技术人员所熟知的。T 细胞活化常见地特征在于生理学事件， 包括例如， T 细胞相 关的细胞因子合成 ( 例如， IFN-γ 的产生 ) 以及活化标记 ( 例如， CD25、 IL-2 受体 ) 的诱 导。CD4+T 细胞在 MHC II 型分子的背景中识别它们的免疫原肽， 而 CD8+T 细胞则在 MHC I 型分子的背景中识别它们的免疫原肽。 用于评估并测量以上说明的本发明的分子抑制或阻 抑 T 细胞活化和 / 或 T 细胞增殖或阻断通过 CD86 和 / 或 CD80 的信号传导的能力的示例性 方法说明于实例 5 至 8 以及本文的其他地方。
     本发明的多肽、 单体以及二聚体的融合蛋白、 以及多聚体 ( 包括以上所讨论的那 些 ) 可任选地进一步包括一种额外的氨基酸 ( 例如， 甲硫氨酸 )， 将该氨基酸加到至 N- 端和 / 或一种肽标签上用于进行纯化或识别。本发明的多肽 ( 包括以上所讨论的那些 ) 可任选 地进一步包括一个多肽纯化亚序列， 例如， 选自一种表位标签、 一种 FLAG 标签、 一种聚组氨酸序列、 以及一种 GST 融合物的亚序列。
     此外， 如以下更为详细地讨论， 本发明包括分离的、 重组的、 或合成的核酸， 这些核 酸编码了以上说明的以及以下额外详细说明的本发明的所有多肽、 融合蛋白、 以及多聚体。
     序列一致性
     如以上所讨论， 在一个方面， 本发明包括一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个 多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的一个多肽序列至少 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 99.5％、 或 100％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ IDNOS ： 1 至 73， 其中该多肽结合 CD80 或 CD86 或二者之一的一个细胞 外结构域， 和 / 或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。在另一个方面， 如以下详细说明， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编 码了包括一个多肽序列的一种多肽， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至 少 75％、 80％、 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 99.5％或 100％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该多肽 具有结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或它的一个 ECD 的能力， 和 / 或具有阻抑一种免疫应答的 能力， 或它的一个互补的多核苷酸序列。
     一个序列 ( 多肽或核酸 ) 与另一个的相似程度提供了对于这两个序列的类似结构 以及功能特性的指示。 因此， 在本发明的背景中， 具有与任何给定的示例性序列的一个相似 序列的序列是本发明的一个特征。 具有如以下所定义的序列一致性百分比的序列是本发明 的一个特征。可使用确定序列关系的不同方法， 包括手动比对以及计算机辅助性序列比对 以及分析。用于进行序列比对的不同的计算机程序是可获得的， 或能够由技术人员产生。
     如以上所指出， 在本发明中所采用的核酸以及多肽的序列不需要对应地与本发明 的一种核酸或本发明的多肽的对应序列相同， 但可以是实质上相同的。 例如， 可使本发明的 多肽经受不同的变化， 如一个或多个氨基酸的插入、 缺失、 和 / 或取代 ( 保守性或非保守性 的 )， 包括例如， 在此类变化可对其用途提供某些优势的情形下， 如， 在其治疗及预防的用途 中， 或其给药或诊断的应用中。 也可使本发明的核酸经受不同的变化， 如一个或多个氨基酸 在一个或多个密码子中的一个或多个取代， 这样使得一个特定的密码子编码了相同或不同 的氨基酸， 造成沉默变化 ( 例如， 在一个核苷酸序列中的突变造成该氨基酸序列的沉默突 变， 例如， 当经编码的氨基酸并未被该核酸突变而改变时 ) 或非沉默变化， 该序列中一个或 多个核酸 ( 或密码子 ) 的一个或多个缺失， 该序列中一个或多个核酸 ( 或密码子 ) 的一个 或多个添加或插入， 该序列中一个或多个核酸 ( 或密码子 ) 的切割或一个或多个截段。还 可对这些核酸进行修饰以包括一个或多个密码子， 这种或这些密码子在一个表达系统 ( 例 如， 细菌或哺乳动物 ) 中提供最佳表达， 同时， 若希望， 所述一个或多个密码子仍编码了这 种或这些相同的氨基酸。此类核酸变化可对其治疗及预防性用途， 或其给药或诊断性应用 提供某些优势。这些核酸以及多肽能够以多种方式进行修饰， 只要它们包括与本发明的一 个对应核酸或多肽中的一个序列实质上相同 ( 如以下所定义 ) 的序列。
     在二个或多个核酸或多肽序列的背景中， 术语 “相同的” 或 “一致性” 是指二个或 多个序列， 当为了最大相似性而进行比较并且比对时， 这些序列是相同的或具有一个限定 百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸， 如使用以下说明的序列比较算法或通过目视检验所 确定。一个受试序列与一个参比 ( 即， 查询 ) 序列的 “序列一致性百分比 (“％一致性” )”意思是该受试序列在一个比较长度中与该查询序列相同所达到的一个限定百分比 ( 即， 对 于一个多肽序列而言在一个又一个氨基酸的基础上， 或对于一个多核苷酸序列而言在一个 又一个核苷酸的基础上 )。
     一个受试序列与一个查询序列的序列一致性百分比 (“％序列一致性” 或 “％一致 性” ) 可计算如下。首先， 使用一种具有特定比对参数的序列比较算法来确定这两个序列的 最适比对。这种最适比对的确定可使用计算机进行， 或可以进行手动计算， 如以下所说明。 接着， 在该比较长度中对这两个经最适比对的序列进行比较， 并确定在该最适比对中在这 两序列中发生的相同残基的位置数目， 它提供了匹配位置的数目。接着将该匹配位置数目 除以该比较长度的总位置数目 ( 除非另有限定， 它是该查询序列的长度 )， 并接着再将该结 果乘以 100， 以便得到该受试序列与该查询序列的序列一致性百分比。
     就多肽序列而言， 典型地将一个序列视为一个 “查询序列” ( 例如， 本发明的一个 多肽序列 )， 件该序列与一个或多个其他序列 ( 即， “一个或多个受试序列” ， 例如， 存在于一 个序列数据库中的序列 ) 进行比较。这种序列比较算法使用了这些指定的比对参数来确 定在该查询序列与这个或这些受试序列之间的最适比对。当将一个查询序列与一个序列 数据库 ( 例如， 数据库 (Genetic Sequence Data Bank ； U.S.Department of Healthand Human Services) 或 数据库 (Thomson Derwent ； 也可以作为 STN 上 数据库而获得 )) 进行比较时， 通常仅将该查询序列与这些比对参数输入计 算机 ； 对于达到一个限定数目的受试序列返回了在查询序列与每个受试序列之间的最适比 对。
     1. 确定最适比对
     这 两 多 肽 序 列 当 使 用 指 定 的 参 数 ( 即， 一种定义的氨基酸替换矩阵 (substitution matrix)、 间隙存在罚分 (gap existence penalty)( 也被称为间隙开放 罚分 (gap open penalty))、 以及间隙延伸罚分 (gap extensionpenalty)) 进行比对以达 到该对序列可能的最高相似性评分时， 是 “最适比对” 的。BLOSUM62 矩阵 (Henikoff and Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(22) ： 10915-10919) 经常用作在多肽序列比 对算法 ( 如， BLASTP， 以下所说明 ) 中的一个默认评分替换矩阵。针对在这些比对序列之一 中引入的一个单一的氨基酸间隙强加间隙存在罚分， 并且针对该间隙中的每个残基位置强 加间隙延伸罚分。除非另有指明， 在本文中所采用的比对参数为 ： BLOSUM62 评分矩阵， 间隙 存在罚分＝ 11， 并且间隙延伸罚分＝ 1。通过比对开始以及结束处 ( 例如， 比对窗口 ) 的每 个序列的氨基酸位置来定义比对评分， 并且可任选地通过将一个间隙或多个间隙插入到一 个或这两个序列中， 以便达到最高可能的相似性评分。
     尽管在二个或多个序列之间的最适比对可以通过手动进行确定 ( 如以下所说 明 )， 通过使用一种计算机执行的比对算法协助了该过程， 这种比对算法如， (National Library of Medicine)， 例如， 针对多肽序列的 BLASTP 以及针对核酸序列的 BLASTN， 说 明 于 Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25 ： 3389-3402 中， 并且通 过不同来源而使公众可以获得， 这些来源如， 国家生技信息中心 (National Center for BiotechnologyInformation)(NCBI) 网站。 当使用一个计算机化的 BLAST 界面时， 如果该选 项存在使用一个 “低复杂性过滤器 (low complexity filter)” ， 应当将这个选项关闭 ( 即， 不使用过滤器 )。在两个多肽序列之间的最适比对也可以使用以上限定的相同比对参数 ( 矩阵＝ BLOSUM62， 间隙开放罚分＝ 11， 以及间隙延伸罚分＝ 1)， 通过 BLASTP 算法的手动计算 ( 即， 无计算机辅助 ) 来确定。开始时， 通过目视对这两个序列进行初始比对。接着， 按照以下方 法计算了一个初始比对评分 ： 对于该比对的每个位置 ( 即， 对于各对经比对的残基配对 )， 根据 BLOSUM62 矩阵指定一个数字值 ( 图 13)。 对该比对中的每对残基所指定的数值之和是 比对评分。如果这两个正在进行比对的序列是高度相似的， 通常这种初始比对提供了最高 可能比对评分。具有最高可能比对评分的比对是基于所采用的比对参数的最适比对。
     在图 14A 至 14D 中提供了对于两个序列的手动计算比对评分的实例。图 14A 显示 了针对一个 “查询 (query)” 序列 ( 在本文中识别为人类 CTLA-4ECD 序列 (SEQ ID NO ： 159) 的残基 39-53) 与一个 “受试” 序列 ( 在本文中被识别为 D3(SEQ ID NO ： 61) 的残基 40-54) 的一个任意比对 ( 比对 14A) 的比对评分计算。通过 BLOSUM62 矩阵针对每对经比对的氨基 酸所指定的数字值显示在该比对中的各个位置之下。
     图 14B 显示了对于这相同的两个序列的最适比对的比对评分。为了协助可视化， 将该比对中的每个相同的氨基酸对用粗体显示。以下图 14B 中的比对 ( 比对 14B) 造成这 两个序列的最高可能比对评分 ( 每个比对位置下所示数值之和 ) ； 这两个序列的任何其他 比对 ( 具有或没有间隙 ) 会造成一个较低的比对评分。
     在一些情形下， 可通过将一个或多个间隙引入到在该比对中引入而获得一个较高 的比对评分。当将一个间隙引入到一个比对中时， 指定了一个间隙开放罚分， 并且针对该 间隙内的每个残基位置额外地评估了一个空隙延伸罚分。因此， 使用以上说明的比对参数 ( 包括间隙开放罚分＝ 11 并且间隙延伸罚分＝ 1)， 在该比对中的一个残基长度的间隙将对 应于指定到该间隙上的 -(11+(1x1)) ＝ -12 数值 ； 两个残基的间隙将对应于指定到该间隙 上的 -(11+(2x1)) ＝ -13 数值、 等等。针对引入到该比对中的每个新间隙来重复这个计算。
     以下是一个实例， 它证明了将一个间隙引入到一个比对中怎样能够造成一个较高 的比对评分， 尽管在有间隙罚分的情况下。图 14C 显示了一个 “查询” 序列 ( 在本文中被识 别为该人类 CTLA-4 ECD 序列 (SEQ ID NO ： 159) 的残基 39-53) 与一个 “受试” 序列 ( 在本 文中被识别为 D3(SEQ ID NO ： 61) 的残基 41-55) 的比对 ( 比对 14C)， 但在此情形下氨基酸 49-50 缺失。比对 14C( 它是最佳的可能比对， 没有引入任何间隙 ) 产生比对评分 34。
     图 14D 中的比对 ( 比对 14D) 显示了在该下侧序列中引入一个两个残基的间隙对 该比对评分的作用。尽管总间隙罚分为 13( 间隙开放罚分是 11， 并且 2 次 1 分的间隙延伸 罚分 )， 这两个序列的整体比对评分增加至 43。以下的比对 D 产生了最高可能比对评分， 并 且因此是这两个序列的最适比对 ； 这两个序列的任何其他比对 ( 具有或没有间隙 ) 会造成 一个较低的比对评分。
     应当理解的是， 以上说明的序列比对计算的实例 ( 它使用了相对较短的序列 ) 仅是出于说明性目的而提供。实际上， 所才用的比对参数 (BLOSUM62 矩阵， 间隙开放罚分 ＝ 11， 并且间隙延伸罚分＝ 1) 总体上旨在用于长度为 85 个氨基酸或更长的多肽序列。 NCBI 网站针对其他长度的序列提供了以下比对参数， 这些比对参数适用于计算机辅助性 连同手动的比对计算， 使用如以上所说明的相同过程进行。对于长度为 50-85 个氨基酸的 序列， 最适参数是 BLOSUM80 矩阵 (Henikoff and Henikoff， 以上说明文献 )， 间隙开放罚 分＝ 10， 并且间隙延伸罚分＝ 1。对于长度为 35-50 个氨基酸的序列， 最适参数是 PAM70矩阵 (Dayhoff， M.O.， Schwartz， R.M.&Orcutt， B.C.(1978)“A model of evolutionary change in proteins” in Atlas of ProteinSequence and Structure， vol.5， suppl.3， M.O.Dayhoff(ed.)， pp.345-352， Natl.Biomed.Res.Found.， Washington， DC.)， 间隙开放罚 分＝ 10， 并且间隙延伸罚分＝ 1。对于长度为小于 35 个氨基酸的序列， 最适参数是 PAM30 矩阵 (Dayhoff， M.O.， 以上说明文献 )， 间隙开放罚分＝ 9， 并且间隙延伸罚分＝ 1。
     2. 计算一致性百分比
     一旦对这些序列进行最适比对， 即可通过对在该最适比对中含有相同残基对的位 置数目进行计数， 将其除以在该比较长度 ( 也称为比较窗口 ) 中的残基数目 ( 除非另有限 定， 它是该查询序列中的残基数目 )， 再将得到的数目乘以 100， 来计算该受试序列相对于 该查询序列的一致性百分比。返回参照以上的比对， 在每个实例中， 指定为查询 ( 上侧 ) 序 列的序列长度是 15 个氨基酸。在比对 B 中， 在该查询序列 ( 上侧 ) 与受试序列 ( 下侧 ) 的 最适比对中， 有 12 对的比对氨基酸残基 ( 以粗体字显示 ) 是完全相同的。因此， 这个特定 的受试序列具有与该 15 个残基的查询序列的完整长度 (12/15)x100 ＝ 80％的一致性 ； 换 言之， 在比对 B 中的受试序列具有与该查询序列至少 80％的氨基酸序列一致性。在比对 D 中， 在该最适比对中有 11 对的氨基酸残基 ( 以粗体字显示 ) 是相同的 ； 因此， 这个特定的受 试序列具有与该 15 个残基的查询序列的完整长度 (11/15)x100 ＝ 73.3％的一致性 ； 换言 之， 在比对 D 中的受试序列具有与该查询序列至少 73％的氨基酸序列一致性。
     当应用于多肽时， 术语 “实质的一致性” (或 “实质上相同” ) 典型地意思指当使 用 BLASTP 算法 ( 手动或经由计算机 ) 使用以上说明的适当参数来对两个氨基酸序列 ( 即， 一个查询序列以及一个受试序列 ) 进行最适比对时， 该受试序列具有与该查询序列至少 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97％、 98％、 99％、 99.5％、 或 100％的氨基酸序列一致性。 在一些情形下， 这种实质的一致性 存在于至少 100 个氨基酸残基的比较长度中， 例如， 至少 110、 115、 118、 119、 120、 121、 122、 123、 124、 125、 130、 135、 140、 145、 150、 200、 250、 300、 345、 346、 347、 348、 349、 350、 351、 352、 353、 354、 355、 356、 357、 358、 359、 360、 375、 400、 450、 或 500 个氨基酸残基。
     类似地， 当应用在两核酸序列的背景中时， 术语实质的一致性 ( 或实质上相同 ) 意思指当使用 BLASTN 算法 ( 手动或经由计算机 ) 使用以上说明的适当参数来对两核 酸序列 ( 即， 一个查询序列以及一个受试序列 ) 进行最适比对时， 该受试序列具有与该 查询序列至少约 70 ％、 75 ％、 80 ％、 85 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98％、 99％、 99.5％、 或 100 ％的核酸序列一致性。用于核酸序列比对的参数为 ： 配对给分 (matchreward)1， 错配罚分 (mismatch penalty)-3， 间隙存在罚分 5， 间隙延伸罚分 2( 在 BLASTN 算法中并不使用替换矩阵 )。在一些情形下， 实质的一致性存在于至少 300 个核 苷 酸 残 基 的 比 较 长 度 中， 例 如， 至 少 330、 345、 354、 357、 360、 363、 366、 369、 362、 365、 375、 390、 405、 420、 435、 450、 600、 750、 900、 1035、 1038、 1041、 1044、 1047、 1050、 1053、 1056、 1059、 1062、 1065、 1068、 1071、 1074、 1077、 1080、 1200、 1350、 或 1500 个核苷酸残基。
     可使用本领域所已知的其他序列比对程序。ALIGN 程序使用了由 Myers and Miller CABIOS 4 ： 11-17(1988) 所说明的一种动态规划算法的改进而产生了这两种所选定 的蛋白或核酸序列的最适全体 ( 整体 ) 比对。ALIGN 程序典型地 ( 但并非必须 ) 与加权末 端间隙 (weighted end-gap) 一起使用。如果间隙开放罚分和间隙延伸罚分是可获得的时，对于氨基酸序列比对通常将它们对应地设定在大约 -5 至 -15 以及 0 至 -3 之间， 更优选地对 应地是大约 -12 以及 -0.5 至 -2， 并且对于核酸序列比对对应地是大约 -10 至 -20 以及 -3 至 -5， 更常见地对应地是大约 -16 以及 -4。ALIGN 程序进一步说明于 Pearson et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 2444-48(1988)，以 及 Pearson etal.， Meth.Enzymol.18 ： 63-98(1990) 中。
     可替代地， 并且特别针对多重序列分析 ( 即， 超过三种序列的比较 )， 可使用 CLUSTALW 程序 ( 说明于例如， Thompson et al.， Nucl.Acids Res.22 ： 4673-4680(1994))。 CLUSTALW 程序是一种适合于多重 DNA 和氨基酸序列比对的算法 (Thompson et al.， Nucl. Acids Res.22 ： 4673-4680(1994))。CLUSTALW 在多个序列的组之间进行多重的逐对比较， 并基于同源性将它们组合成为一个多重比对。在一个方面， 将间隙开放和间隙延伸罚分 对应地设定为 10 和 0.05。可替代地或额外地， CLUSTALW 程序是使用 “动态” ( 对比 “固 定” ) 设置而运行。典型地， 用 CLUSTALW 进行的核苷酸序列分析是使用 BESTFIT 矩阵进行 的； 而氨基酸序列是使用一个不同组的 BLOSUM 矩阵进行评估的， 这取决于这些序列之间 的一致性程度 ( 例如， 如通过经由圣地亚哥超级计算机中心 (San Diego Supercomputer Center(SDSC)) 获 得 的 CLUSTALW 1.6 版 程 序 或 可 从 欧 洲 生 物 信 息 中 心 (European Bioinformatics Institute， Cambridge， UK) 获 得 的 W 1.8 版 所 使 用 的 )。 优 选 地， 将 CLUSTALW 设定成 SDSC CLUSTALW 系统默认设置 ( 例如， 考虑到氨基酸序列分析中的特定 疏水性间隙罚分 )。CLUSTALW 程序进一步说明于例如， Higgins et al.， CABIOS 8(2) ： 189-91(1992)， Thompsonet al.， Nucleic Acids Res.22 ： 4673-80(1994)， 以及 Jeanmougin et al.， TrendsBiochem.Sci.2 ： 403-07(1998)。
     在另一个可替代的形式中， 在一个特定的比对氨基酸序列对之间的一致性或一致 性百分比是指通过以下步骤所获得的氨基酸序列一致性百分比 ： 通过 CLUSTALW 分析 ( 如 W 1.8 版 )， 对该比对中的相同配对数目进行计数， 并且将这个相同配对数目除以 (i) 这些比 对序列的长度与 (ii)96 中的较大的， 并且使用以下的默认 ClustalW 参数以达成减缓 / 计 算逐对的比对 - 间隙开放罚分 ： 10 ； 间隙延伸罚分 ： 0.10 ； 蛋白重量矩阵 ： Gonnet 系列 ； DNA 重量矩阵 ： IUB ； Toggle 慢速 / 快速逐对比对＝ SLOW 或 FULL 比对。
     用于确定一致性百分比或类似性百分比的另一个有用的算法是 FASTA 算法， 该 算法说明于 Pearson et al.， Proc Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 2444(1988) 以及 Pearson， Methods Enzymol.266 ： 227-258(1996)。将用于 DNA 序列的 FASTA 比对中以计算一致性 百分比的典型参数最适化， BL50 矩阵 15 ： -5， k 序列 (k-tuple) ＝ 2 ； 结合罚分 (joining penalty) ＝ 40， 最适化 (optimization) ＝ 28 ； 间隙罚分 (gap penalty) ＝ -12， 间隙长度 罚分 (gap length penalty) ＝ -2 ； 并且宽度 (width) ＝ 16。
     其他适合的算法包括 BLAST 和 BLAST 2.0 算法， 它们协助至少两个氨基酸或核苷 酸序列的分析， 这是通过将一种所选择的序列与在一个数据库 ( 例如， GenSeq) 中的多个序 列进行比对， 或者， 当通过一种额外的算法 ( 如 BL2SEQ) 进行修饰时， 是在两个选定的序列 之间进行。 用于进行 BLAST 分析的软件可通过国家生技信息中心 (NCBI)( 万维网网址 ncbi. nlm.nih.gov) 而公开地获得。BLAST 算法涉及首先通过在该查询序列中识别长度为 W 的短 字序而识别高分序列对 (HSP)， 它们在与数据库序列中具有相同长度的字序进行比对时是 匹配或符合一些正值阈值的评分 T。T 是指邻近字序评分阈值 (neighborhood word scorethreshold)(Altschul etal.， 以上说明文献 )。此类初始的邻近字序相符结果充当种子用 于起始搜寻来发现含有它们的较长 HSP。将这些字序相符结果沿着每个序列向两个方向延 伸， 只要可增加累积比对评分便继续进行。针对核苷酸序列， 使用参数 M( 对一个匹配的残 基对给分 ； 总是＞ 0) 以及 N( 错配残基的罚分 ； 总是＜ 0) 来计算累积评分。针对氨基酸序 列， 使用一个评分矩阵来计算该累积评分。这些字序相符结果在每个方向上的延伸在下列 情形下停止 ： 该累积比对评分从其所到达的最大值下滑 X 的量 ； 该累积评分由于一个或多 个负分残基比对的累积而到达 0 或以下 ； 或到达任一个序列的末端。BLAST 算法参数 W、 T、 以及 X 确定了该比对的灵敏性和速度。BLASTN 程序 ( 对于核苷酸序列 ) 可以与字序长度 (W)11、 以及期望值 (E)10、 M ＝ 5、 N ＝ -4 与两股的比较一起使用。对于氨基酸序列， BLASTP 程序 ( 例如， BLASTP2.0.14 ； Jun-29-2000) 可以与字序长度 3 以及期望值 (E)10 一起使用。 BLOSUM62 评分矩阵 ( 见 Henikoff&Henikoff， (1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 ： 10915) 使用了比对 (B)50、 期望值 (E)10、 M ＝ 5、 N ＝ -4、 以及两股的比较。同样， 如同其他适合的 算法， 可增加比较的严格性， 直到该程序仅识别出与在本文的序列表中的序列更为密切相 关的序列 ( 例如， 包括一个多肽序列的多肽， 该多肽序列具有与选自 SEQ ID NOS ： 1 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222 的一个多肽序列至少 85、 90、 91、 92、 93、 49、 95、 96、 97、 98、 99％、 或 100％的一致性， 或包括一个核苷酸序列的核酸， 该核苷酸序列具有与选自 90、 SEQ ID NOS ： 80 至 158、 201 至 204、 223、 以及 224 中的任何的一个核苷酸序列至少 85、 91、 92、 93、 49、 95、 96、 97、 98、 99％、 或 100％的一致性， 或它的一个互补的核苷酸序列。
     BLAST 算 法 还 对 两 序 列 之 间 的 相 似 性 或 一 致 性 进 行 统 计 分 析 ( 见， 如， Karlin&Altschul， (1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90 ： 5873-5787)。 一种由 BLAST 算法所 提供的相似性或一致性的度量是最小总和机率 (smallestsum probability)(P(N))， 它提 供了在两个核苷酸或氨基酸序列至间随机发生一个配对的机率的一个指示。例如， 若在该 试验核酸与一种参比核酸的比较中， 该最小总和机率是小于约 0.2( 如， 小于约 0.01 或小于 约 0.001)， 则该核酸即被视为与该参比序列相似。
     BLAST 程序分析还可以或可替代地可以由低复杂度过滤程序 ( 如， DUST 或 SEG 程序 ) 进行修饰， 它们是优选地整合到该 BLAST 程序的操作中 ( 见， 如， Wootton et al.， Comput.Chem.17 ： 149-63(1993)， Altschul etal.， Nat.Genet.6 ： 119-29(1991)， Hancock et al.， Comput.Appl.Biosci.10 ： 67-70(1991)， 以及 Wootton et al.， Meth.Enzymol.266 ： 554-71(1996))。在此类方面中， 若使用 λ 比例 (lambda ratio)， 该比例的可用设置是在 0.75 与 0.95 之间， 包括在 0.8 与 0.9 之间。若在此类方面中使用了间隙存在代价 ( 或间 隙评分 )， 则将该间隙存在代价典型地设定在大约 -5 至 -15 之间， 更典型地是大约 -10， 并 且将每个残基间隙代价典型地设定在大约 0 至 -5 之间， 如在 0 与 -3 至间 ( 例如， -0.5)。 适当时， 将类似的间隙参数可以与其他程序一起使用。BLAST 程序以及其下的原则进一步 说明于， 例如， Altschul etal.， J.Mol.Biol.215 ： 403-10(1990)， Karlin and Altschul， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 ： 2264-68(199)( 如 由 Karlin and Altschul， Proc.Natl. Acad.Sci.USA90 ： 5873-77(1993) 修 饰 )， 以 及 Altschul et al.， Nucl.Acids Res.25 ： 3389-3402(1997)。
     可使用的算法的另一个实例被纳入到 PILEUP 软件中。PILEUP 程序使用了渐进 式的逐对比对， 从一组相关的序列中创造出一个多重序列比对， 以显示其关系以及序列一致性百分比或序列相似性百分比。PILEUP 使用了 Feng&Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35 ： 351-360 的渐进式比对法的简化版本， 它类似于 Higgins&Sharp(1989)CABIOS 5 ： 151-153 所说明的方法。该程序可以对高达 300 个序列进行比对， 每个的最大长度为 5,000 个核苷 酸或氨基酸。该多重比对操作始于这两个最相似序列的逐对比对， 产生两个经比对序列的 群。接着将该群与下一个最为相关的序列或经比对序列的群进行比对。通过两个单个序列 的逐对比对的简单延伸而进行来对两个群的序列进行比对。终比对是通过一系列的渐进 式逐对比对而完成。 该程序是通过指定特定的序列以及它们的氨基酸或核苷酸针对序列比 较区域的坐标， 并且通过指定这些程序参数而运行。使用 PILEUP， 使用特定的参数将一个 参比序列与其他试验序列进行比较， 以确定序列一致性百分比 ( 或序列相似性百分比 ) 关 系。PILEUP 程序的示例性参数为 ： 默认间隙权数 (3.00)， 默认间隙长度权数 (0.10)， 以及 加权的末端间隙。PILEUP 是 GCG 序列分析软件包的一个组件， 例如， 7.0 版 (Devereaux et al.(1984)Nucl.Acids Res.12 ： 387-395)。
     用于进行一致性分析的其他可用算法包括 Smith and Waterman(1981)Adv.Appl. Math.2 ： 482 的局部同源性算法， Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48 ： 443 的同源 性比对算法， 以及 Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 2444 的相似性 搜寻法。 这些算法的计算机化实施 ( 例如， GAP、 BESTFIT、 FASTA 及 TFASTA) 提供于 Wisconsin Genetics 软件包 7.0 版 (Genetics Computer Group， 575Science Dr.， Madison， WI)。
     序列变异
     如以上所讨论， 本发明提供了一种分离或重组的突变 CTLA-4 细胞外结构域多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与选自下组的一个多肽序列具有不超过 6 个氨 基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5、 或 6 个氨基酸残基 ) 的差异， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该突变 CTLA-4 ECD 多肽结合 CD80 和 / 或 CD86， 和 / 或二者之一的或两 者的一个细胞外结构域， 和 / 或抑制一种免疫应答。这种或这些氨基酸取代包括一种或多 种保守性的氨基酸取代。
     作为一种非限制性的实例， 本发明的一种多肽可具有一个多肽序列， 该多肽序列 与 SEQ ID NO ： 1 具有总共达到 6 个氨基酸的差异 ( 它可以是氨基酸取代、 缺失、 和 / 或插入 的组合， 包括以上所说明的那些 )。在一些情形下， 这些取代中的无、 一些、 或所有是根据以 下所定义的一个取代组中的取代。
     根据本发明的氨基酸取代可包括但不限于 ： 一个或多个保守性氨基酸取代。一个 保守性的氨基酸残基取代典型地涉及将一种氨基酸残基功能类型中的成员与属于该相同 功能类型的一个残基进行交换 ( 相同的氨基酸残基在计算功能同源性百分比时是认为为 功能上同源的或保守的 )。提供功能类似性氨基酸的保守性取代表是本领域中所熟知。一 个实例提供于表 1， 其中给出了六种示例性的组， 这些组含有彼此可被认为为 “保守性取代” 的氨基酸。
     表 1. 保守的氨基酸残基取代组
     1 2 丙氨酸 (A) 甘氨酸 (G) 丝氨酸 (S) 苏氨酸 (T) 天冬氨酸 (D) 谷氨酸 (E)95101998965 A CN 1019989713 4 5 6说天冬酰胺 (N) 谷氨酰胺 (Q)明书63/188 页精氨酸 (R) 赖氨酸 (K) 组氨酸 (H) 异亮氨酸 (I) 亮氨酸 (L) 甲硫氨酸 (M) 缬氨酸 (V) 苯丙氨酸 (F) 酪氨酸 (Y) 色氨酸 (W)还考虑了氨基酸的其他取代基。例如， 可以通过相似的功能或化学结构或组成 ( 例如， 酸性的、 碱性的、 脂肪族的、 芳香族的、 含硫 ) 对氨基酸进行分组。例如， 一个脂肪族 的分组可包括 ： 甘氨酸 (G)、 丙氨酸 (A)、 缬氨酸 (V)、 亮氨酸 (L)、 异亮氨酸 (I)。其他含有 彼此间被认为是保守性取代的氨基酸的组包括 ： 芳香族的 ： 苯丙氨酸 (F)、 酪氨酸 (Y)、 色氨 酸 (W) ； 含硫的 ： 甲硫氨酸 (M)、 半胱氨酸 (C) ； 碱性的 ： 精氨酸 (R)、 赖氨酸 (K)、 组氨酸 (H) ； 酸性的 ： 天冬氨酸 (D)、 谷氨酸 (E) ； 非极性不带电的残基， 半胱氨酸 (C)、 甲硫氨酸 (M)、 以 及脯氨酸 (P) ； 亲水性不带电的残基 ： 丝氨酸 (S)、 苏氨酸 (T)、 天冬酰胺 (N)、 以及谷氨酰胺 (Q)。对于氨基酸的其他分组， 还见 Creighton(1984)Proteins， W.H.Freemanand Company。 在本文中的一个多肽序列列表， 结合以上的取代基， 提供了所有保守取代的多肽序列的表 达列表。
     更多的保守性取代存在于以上说明的氨基酸残基类别中， 它还可以或可替代地可 以是适当的。更为保守的取代保守组包括 ： 缬氨酸 - 亮氨酸 - 异亮氨酸、 苯丙氨酸 - 酪氨 酸、 赖氨酸 - 精氨酸、 丙氨酸 - 缬氨酸、 以及天冬酰胺 - 谷氨酰胺。因此， 例如， 在一个特定 方面中， 本发明提供了一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有 与 SEQ ID NO ： 1( 或 SEQ ID NOS ： 1 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222 中的任何 一个 ) 至少 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 或 99％的同一性， 并且它与 SEQ ID NO ： 1 的序 列具有相当大 ( 例如， 至少 50％、 60％、 70％、 75％、 80％、 90％ ) 的差异 ( 如非全部 )， 这是 由此类更为保守的氨基酸取代所造成的。
     也可以确定适当的额外的氨基酸取代组， 这是使用在例如， Creighton(1984) Proteins ： Structure and Molecular Properties(2d Ed.1993)， W.H.Freeman and Company 中所说明的的原则进行的。在一些方面， 在一个氨基酸序列变体中至少 33 ％、 50％、 60％、 70％、 或更多 ( 例如， 至少 75％、 80％、 90％、 95％、 96％、 97％或更多 ) 的取代包 括对本发明的一个多肽序列中一个或多个氨基酸残基的取代， 这些取代是用在与它们所取 代的多肽序列的这些氨基酸残基相同的功能同源性类别中的残基 ( 如通过任何适当的分 类系统所确定的， 如以上所说明的那些系统 ) 进行的。
     本发明的一个多肽序列的保守性取代变体包括一个小百分比的 ( 典型地小于该 多肽序列的氨基酸的 10％、 9％、 8％、 7％、 或 6％， 或更典型地小于该多肽序列的氨基酸的 5％、 4％、 3％、 2％、 或 1％ )、 用该相同保守性取代基中的一种保守选择的氨基酸的取代。
     本发明包括多肽， 这些多肽包括在本文中所说明的本发明的一个多肽序列的氨 基酸变体。如以上所讨论的， 在一个方面， 本发明提供了分离或重组的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 多肽， 例如， 突变 CTLA-4 ECD 多肽 )， 这些多肽每个包括一个多肽序列， 该多肽序列 具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 75％、 80％、 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 99.5％、 或 100％的序列同一性， 该组
     的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 或 CD80 和 / 或 CD86 的 一个多肽片段 ( 或二者之一的或两者的一个 ECD)， 和 / 或阻抑一种免疫反应。此类多肽可 通过一个或多个氨基酸缺失、 添加、 或取代的差异 ( 包括一个或多个保守性或非保守性的 取代 ) 发生变化， 然而， 其条件为这些多肽具有所说明的功能特性。在一个特定的方面中， 本发明提供了多肽变体， 这些多肽变体包括在本文中所说明的任何这种多肽 ( 例如， 包括 一个多肽序列的多肽， 该多肽序列选自下组 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73) 的保守性修饰变化。
     还如以上所讨论， 在另一个方面， 本发明提供了分离或重组的融合蛋白 ( 例如， 突 变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )， 这些融合蛋白各自包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自 下组的至少一个多肽序列至少 75％、 80％、 85％、 86％、 87％、 88％、 89％、 90％、 91％、 92％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 99.5 ％、 或 100 ％的序列同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222， 其中该融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或阻抑一种免疫反应。此类融合蛋白可通 过一个或多个氨基酸缺失、 添加、 或取代 ( 包括一个或多个保守性或非保守性的取代， )发 生变化， 然而， 其条件为所述融合蛋白具有所说明的功能特性。在一个特定的方面， 本发明 提供了多肽变体， 这些多肽变体包括在本文中所说明的任何这种融合蛋白 ( 例， 包括一个 多肽序列的融合蛋白， 该多肽序列选自下组 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222) 的保守性修饰变化。＜ 0}
     还提供了以上或本文其他地方所说明的本发明的任何分离或重组多肽的多肽变 体， 其中该多肽变体的氨基酸序列与该参比序列的对应多肽序列具有一个或多个保守性氨 基酸残基取代的差异， 尽管非保守性的取代有时是允许的或甚至是优选的 ( 此类非保守性 取代的实例在本文中进行进一步讨论 )。例如， 该多肽变体的序列可以与一个突变 CTLA-4 多肽序列通过将该突变 CTLA-4 ECD 多肽序列中的一个或多个氨基酸残基取代成一个或多 个具有类似重量的氨基酸残基 ( 即， 一个残基， 该残基具有与它替换的对应多肽序列中的 残基的重量同源性 ) 而发生变化。一种多肽的氨基酸残基的重量 ( 以及对应的大小 ) 可以 显著地影响该多肽的结构。 基于重量的保守性或同源性是基于一种非相同的对应氨基酸是 否与在本文中所说明的基于重量的矩阵之一 ( 例如， BLOSUM50 矩阵 ； PAM250 矩阵 ) 上的一 个正评分相关联。 ＜ 0}
     与以上说明的功能性氨基酸类别相类似， 可以将自然发生的氨基酸残基分为基于 重量的保守组 ( 它们被分为 “强” 和 “弱” 保守组 )。常用的八个基于重量的强保守组是 Ser Thr Ala、 Asn Glu Gln Lys、 Asn His Gln Lys、 Asn AspGlu Gln、 Gln His Arg Lys、 Met Ile Leu Val、 Met Ile Leu Phe、 His Tyr、 以及 Phe Tyr Trp。基于重量的弱保守性包括 Cys Ser Ala、 Ala Thr Val、 Ser Ala Gly、 Ser Thr Asn Lys、 Ser Thr Pro Ala、 Ser Gly Asn Asp、 Ser Asn Asp Glu Gln Lys、 Asn Asp Glu Gln His Lys、 Asn Glu Gln His Arg Lys、 Phe Val Leu Ile Met、 以及 His Phe Tyr。一些版本的 CLUSTAL W 序列分析程序在比对的 输出中提供了基于重量的强保守性以及弱保守性组的分析， 由此提供了一种用于确定基于 重量的保守性的便利技术 ( 例如， 由 SDSC 所提供的 CLUSTAL W， 它典型地是与 SDSC 系统默 认设置一起使用的 )。在一些方面中， 在这种多肽变体中至少 33％、 50％、 60％、 70％、 80％、 或 90％的取代包括其中在一个基于重量的保守性中的一个残基替换了在该相同的基于重 量的保守性组中的多肽序列的一个氨基酸残基。 换言之， 就氨基酸残基重量的特征而言， 这个百分比的取代是保守性的。
     一种多肽变体的序列可以不同于本发明的一种突变 CTLA-4 多肽之处在于一个或 多个氨基酸的取代， 其中一个或多个氨基酸残基具有与该突变 CTLA-4 多肽的经取代 ( 原 始 ) 残基相似的一种亲水性分布特性 ( 即， 它们展示了相似的亲水性 )。一个亲水性分 布图可以使用 Kyte&Doolittle 指数来确定， 不同自然发生的氨基酸在该指数中的评分如 下： I(+4.5)、 V(+4.2)、 L(+3.8)、 F(+2.8)、 C(+2.5)、 M(+1.9) ； A(+1.8)、 G(-0.4)、 T(-0.7)、 S(-0.8)、 W(-0.9)、 Y(-1.3)、 P(-1.6)、 H(-3.2) ； E(-3.5)、 Q(-3.5)、 D(-3.5)、 N(-3.5)、 K(-3.9)、 以及 R(-4.5)( 进一步的讨论见， 如， 美国专利号 4,554,101 以及 Kyte&Doolittle、 J.Molec.Biol.157 ： 105-32(1982))。在该变体多肽序列中的至少 75％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的氨基酸残基 ( 这些氨基酸残基不 同于在本文中所披露的同一性或功能性同源突变 CTLA-4 多肽序列 (“最相关的同源物” ) 中的对应残基， 该同源物可以是选自 SEQ ID NOS ： 1 至 73 中的任何一个 )， 相对于在该最相 关的同源物中对应位置上的非同一性氨基酸残基， 展示了小于 +/-2 的亲水性变化， 包括小 于 +/-1 的亲水性变化以及小于 +/-0.5 的亲水性变化。 该变体多肽相对于它的选自 SEQ ID NOS ： 1 至 73 的组的最相关同源物， 可展示了小于约 150、 小于约 100、 和 / 或小于约 50( 例 如， 小于约 30、 20 或 10) 的总亲水性变化。
     保留类似或相同亲水性的典型氨基酸取代的实例包括精氨酸 - 赖氨酸取代、 谷氨 酸酯 - 天冬氨酸酯取代、 丝氨酸 - 苏氨酸取代、 谷氨酰胺 - 天冬酰胺取代、 以及缬氨酸 - 亮 氨酸 - 异亮氨酸取代。算法及软件 ( 如， 可通过 SDSC 获得的 GREASE 程序 ) 提供了用于快 速评估一个氨基酸序列的亲水性分布图的便利方式。 由于在一个多肽变体的序列中一个实 质比例 ( 例如， 至少约 33％ )( 若非大部分 )( 至少 50％ ) 或将近所有 ( 例如， 大约 65、 80、 90、 95、 96、 97、 98、 99％ ) 的氨基酸取代通常将会与它们在该 ( 参比 ) 多肽序列中替换的氨 基酸残基具有一个相似的亲水性分数， 该多肽变体的序列预期会展示出一个与该多肽序列 类似的 GREASE 程序输出。例如， 在一个特定方面中， 可预期 SEQ ID NO ： 61 的一个多肽变体 会有的一个 GREASE 程序 ( 或类似的程序 ) 输出， 该输出与通过输入 SEQ ID NO ： 61 的多肽 所获得的 GREASE 输出相似性大于与通过使用一种 WT CTLA-4 多肽 ( 如， hCTLA-4) 所获得 的输出， 这可通过将该试验变体序列与 SEQ ID NO ： 1 经受该程序而提供的图形 ( 例如， 图形 重迭 / 比对 ) 和 / 或数字输出的视觉检查或比较来确定。
     就功能同源性、 重量同源性、 以及亲水性特征而言， 氨基酸残基的保守性也可应用 到由本发明所提供的其他多肽序列变体上， 这些变体包括但不限于 ： 例如， 一个多肽序列 的多肽序列变体， 该多肽序列选自下组， 其构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222。
     在一个特定的方面中， 本发明包括至少一个这种多肽变体， 该多肽变体包括一个 氨基酸序列， 该氨基酸序列与选自下组的一个重组多肽序列不同， 该组为 ： SEQ ID NOS ： 1至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222， 其中该变体的氨基酸序列具有至少一个这种氨 基酸残基取代， 该氨基酸残基取代是根据以上所讨论的基于重量的保守性或同源性或相似 的亲水性分布图而选择的。以上说明的此类多肽变体典型地具有结合 CD80 和 / 或 CD86 的 能力， 和 / 或阻抑至少一种类型的免疫反应的能力， 如以上以及以下在实例中进一步详细 说明。信号肽序列
     本发明的多肽也可进一步包括任何适当数目以及类型的额外氨基酸序列， 如， 一 个或多个肽片段。在一个实施方案中， 本发明的这种多肽进一步包括一种信号肽。总体上， 当该重组多肽在动物细胞中表达时， 该信号肽指导该重组多肽到达内质网。可以包括指导 该多肽 ( 当在细胞中表达时 ) 的至少一部分的细胞器运输和 / 或分泌的信号肽序列。此类 序列典型地存在于该多肽的不成熟 ( 即， 未经完全加工 ) 形式中， 并且随后通过细胞的蛋白 酶去除 / 降解， 以达到该蛋白的成熟形式。例如， 本发明的一个突变 CTLA-4 多肽或融合蛋 白可包括任何适当的信号序列或多个信号序列的组合， 这些序列指导该多肽到达细胞内的 区室中， 如指导该多肽被运输 ( 例如， 移位 ) 进入内质网或分泌途径 ( 例如， ER、 高基氏体、 以及其他分泌相关的细胞器和细胞区室 )( 例如， 这样使得该蛋白通过其进行加工或从其 中释放 )， 细胞核， 和 / 或它指导有待从该细胞中分泌的、 在细胞膜中移位的、 或靶向一个第 二细胞 ( 除了分泌该蛋白的细胞 )。在此方面中， 该多肽可包括一个细胞内靶向序列 ( 或 “分选信号” )， 它指到该多肽到达一个或多个内涵体和 / 或溶酶体区室或其他富含 MHC II 的区室， 以促进 CD4+ 和 / 或 CD8+T 细胞呈递和响应， 如， 衍生自溶酶体相关膜蛋白 1 的一种 溶酶体 / 内涵体靶向的分选信号 ( 例如， LAMP-1- 见， 如， Wu et al.Proc.Natl.Acad.Sci. USA92 ： 1161-75(1995) 以及 Ravipraskash et al.， Virology 290 ： 74-82(2001))、 它的一 个部分或同源 ( 见， 如， 美国专利号 5,633,234)、 或其他适当的溶酶体、 内涵体和 / 或靶向 ER 的序列 ( 见， 如， 美国专利号 6,248,565)。在一些方面中， 可能希望该细胞内靶向的序列 在接近或邻近在该多肽中的一个或多个经证实 / 识别的表位序列 ( 它们可通过本领域内已 知的技术进行识别 )， 由此增加了包括这种或这些表位的多肽片段的 T 细胞呈递的可能性。 此类多肽可以从通过一个或多个核苷酸转移载体而递送至宿主细胞中的一个分离的、 重组 的、 或合成的 DNA 或 RNA 进行表达， 这些载体包括例如， 这些基因转移载体中的一个或多个， 如在本文中进一步说明。
     该多肽可包括一种信号序列， 当该多肽表达于哺乳动物细胞中时该序列指导该多 肽到达内质网 (ER)( 例如， 协助了该多肽的 ER 移位 )。该多肽可包括任何适当的靶向 ER 的序列。多个靶向 ER 的序列是本领域所已知。此类信号序列的实例说明于美国专利号 5,846,540。经常采用的 ER/ 分泌信号序列包括酵母 α 因子信号序列， 以及哺乳动物病毒 信号序列， 如， 疱疹病毒 gD 信号序列。大肠杆菌生产的示例性信号肽包括大肠杆菌的 STII 或 Ipp 信号序列。信号序列的其他实例说明于例如， 美国专利号 4,690,898、 5,284,768、 5,580,758、 5,652,139、 以及 5,932,445。适当的信号序列可使用本领域中已知的技术来识 别。 例如， 可使用 SignalP 程序 ( 说明于， 例如， Nielsen et al.(1997)Protein Engineering 10 ： 1-6)， 它可在指定为 cbs.dtu.dk/services/SignalP 的万维网网址通过生物序列分析 中心 (Center forBiological Sequence Analysis)、 或通过可识别信号序列样结构域的类 似序列分析软件而公开地获得。在 Nielsen et al.， Protein Eng.10(1) ： 1-6(1997) 提供 了用于识别适当信号肽的相关技术。 可以针对常与信号序列相关联的特征来对序列进行手 动分析， 如说明于， 例如， 欧洲专利申请 (Appn) 号 0 621 337， Zheng and Nicchitta(1999) J.Biol.Chem.274(51) ： 36623-30， 以及 Ng et al.(1996)J.Cell Biol.134(2) ： 269-78。
     其他方面
     本发明的任何多肽 ( 包括本发明的任何融合蛋白 ) 可作为一个较大多肽序列的部分而存在， 如， 在加入一个或多个结构域或序列用于稳定或检测或纯化该多肽时发生。 此类 结构域或序列可共价融合到本发明的多肽上， 如本领域中的普通技术人员将容易理解并可 以建构的。一个多肽纯化序列可包括例如， 一个表位标签、 一个 FLAG 标签、 一个聚组氨酸序 列、 一个 GST 融合物、 或在本领域内已知的任何其他检测 / 纯化亚序列或 “标签” 。这些额外 的结构域或亚序列对于本发明的多肽的活性具有极少或没有作用， 或者可通过合成后的加 工步骤去除， 如， 通过用一种蛋白酶的处理、 一种内含肽的包入、 或类似加工。
     本发明的任何多肽 ( 包括本发明的任何融合蛋白 ) 也可包括一个或多个经修饰的 氨基酸。该经修饰的氨基酸可以是例如， 一种糖基化的氨基酸、 一种聚乙二醇化的氨基酸、 一种法尼基化 (farnesylated) 的氨基酸、 一种乙酰基化的氨基酸、 一种生物素酰化的氨基 酸、 一种偶联着脂类部分的氨基酸、 和 / 或偶联着一种有机衍化剂的氨基酸。经修饰氨基酸 的存在在以下方面可以是有优势的， 例如， (a) 增加多肽的血清半衰期和 / 或功能性体内半 衰期， (b) 降低多肽的抗原性或免疫原性， (c) 增加多肽的贮存稳定性， (d) 增加生物利用 率， (e) 降低效应子功能， 和 / 或 (f) 在本发明的二个或多个分子之间 ( 如在本发明的二个 或多个的融合蛋白二聚体之间 ) 降低或抑制的不希望的自体结合 ( 例如， 聚集体形成 )。 对 一种或多种氨基酸进行修饰， 例如， 在重组产生的过程中与翻译同时进行或在翻译之后进 行 ( 例如， 在哺乳动物细胞中表达过程中在 N-X-S/T 基序上的 N- 连接的糖基化作用 )， 或通 过合成手段进行修饰。
     在本文中所说明的本发明的多肽 ( 包括本发明的融合蛋白 ) 能够以不同的方式进 行进一步修饰， 例如， 通过翻译后的修饰和 / 或合成修饰或变化。例如， 本发明的多肽或融 合蛋白可被适当地糖基化， 典型地经由在哺乳动物细胞中的表达。例如， 在一个方面， 本发 明提供了糖基化的多肽， 这些多肽可结合 CD86 和 / 或 CD80， 和 / 或具有阻抑一种免疫反应 的能力 ( 例如， T 细胞的增殖或活化 )， 如在本文的其他地方所说明， 其中每个所述糖基化 的多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的一个序列至少 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222。
     可以使本发明的多肽经受任何数目的额外适当形式的翻译后的和 / 或合成的修 饰或变化。例如， 本发明提供了本发明的多肽的蛋白模拟物。肽模拟物说明于例如， 美国专 利号 5,668,110 以及其中所引述的参考文献中。
     在另一个方面， 本发明的一种多肽或融合蛋白可通过将保护性基团加至该多肽融 合蛋白的一个或多个氨基酸的侧链上而进行修饰。 此类保护性基团可促建该多肽或融合蛋 白运输通过一个或多个膜 ( 若希望 )， 或通过某个或某些组织， 例如， 通过降低该多肽或融 合蛋白的亲水性或增加其亲脂性。适当的保护性基团的实例包括酯保护性基团、 氨基保护 性基团、 酰基保护性基团、 以及羧酸保护性基团， 它们在本领域内是已知的 ( 见， 如， 美国专 利号 6,121,236)。本发明的合成融合蛋白可以采用任何适当的形式。例如， 该融合蛋白能 够由其自然发生的构型经结构修饰而形成一种环肽或其他经结构修饰的肽。
     本发明的多肽也可连接到一个或多个非蛋白性的聚合物上， 典型地是一种亲水性 合成聚合物， 例如， 聚乙二醇 (PEG)、 聚丙二醇、 或聚氧化烯， 使用了本领域内所熟知的技术， 如， 说明于例如， 美国专利号 4,179,337、 4,301,144、 4,496,689、 4,640,835、 4,670,417、 以 及 4,791,192 中， 或一种类似的聚合物， 如， 聚乙烯醇、 或聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)。本 发 明 包 括 偶 联 物， 这 些 偶 联 物 包 括 本 发 明 的 至 少 一 种 多 肽 ( 例 如， 突变 CTLA-4 ECD 多肽、 二聚体或单体突变 CTLA-4-Ig、 多聚体突变 CTLA-4ECD 多肽、 多聚体突变 CTLA-4-Ig) 以及一种非多肽部分。术语 “偶联物” ( 或可交换使用的 “偶联的多肽” ) 旨在 是指一种异源 ( 在复合物或嵌合体的意义上 ) 分子， 该分子是由一个或多个多肽与一个或 多个非多肽部分的共价附连而形成。术语 “共价附连” 意思指该多肽以及该非多肽部分彼 此直接地共价结合， 或通过一个或多个干扰部分或 ( 如， 一个桥、 间隔基、 或一个或多个连 接体部分 )， 使用存在于该多肽中的一个附连基团而间接地共价结合。优选地， 该偶联物在 相关的浓度及条件下是可溶的， 即， 可溶于生理液体中， 如血液。本发明的偶联的多肽的实 例包括糖基化和 / 或聚乙二醇化的多肽。术语 “未偶联的多肽” 可用于说明该偶联物的多 肽部分。这种偶联物典型地结合 CD80( 例如， hCD80) 和 / 或 CD86( 例如， bCD86)、 和 / 或二 者之一的或两者的一个细胞外结构域 ( 包括 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig)， 和 / 或具有抑制 一种免疫反应的能力。 这种免疫反应可包括但不限于， 例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞因子 的合成 / 产生、 活化标记的诱导、 炎症分子的产生、 炎症、 抗胶原 Ab 的产生和 / 或 T 细胞依 赖的 Ab 应答。示例性的多肽包括具有与选自下组的一个序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％同一性的那些， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222。
     术语 “非多肽部分” 旨在是指一个分子， 该分子可与本发明的一个多肽的一个附连 基团相偶联。这种分子的优选的实例包括聚合物分子、 糖部分、 亲脂性化合物、 或有机衍化 剂。 当用于如在本文中所说明的一种偶联物的背景中时， 应当理解的是， 该非多肽部分是通 过该多肽的一个附连基团而与该偶联物的多肽部分连接的。
     术语 “聚合物分子” 是定义为一个分子， 它是通过二个或多个单体的共价连接体所 形成的， 其中这些单体中没有一个是氨基酸残基， 除了其中该聚合物是人类白蛋白或另一 中大量的血浆蛋白。术语 “聚合物” 可以与术语 “聚合物分子” 交换使用。
     一个 N- 糖基化位点具有序列 N-X-S/T/C， 其中 X 是除脯氨酸之外的任何氨基酸残 基， N 是天冬酰胺， 并且 S/T/C 是丝氨酸、 苏氨酸、 或半胱氨酸， 优选地是丝氨酸或苏氨酸， 并 且最优选地是苏氨酸。
     一个 “O- 糖基化位点” 包括一个丝氨酸或苏氨酸残基的 OH- 基团。
     术语 “附连基团” 旨在是指该多肽的一个氨基酸残基基团， 该基团能够偶合到该相 关的非多肽部分 ( 如， 一个聚合物分子或一个糖部分 ) 上。以下在表 2 中提供了有用的附 连基团的非限制性实例以及一些对应的非多肽部分。
     表 2. 有用的附连基团以及对应非多肽部分的实例
     附连基团氨基酸非多肽部分的 实例偶联方法 / 活化的 PEG 的实例参考文献101101998965 A CN 101998971说N- 端， Lys PEG明书mPEG-SPA mPEG2-NHS mPEG2butyrALD69/188 页-NH2聚合物， 例如，Nektar Inc. 2003 Catalog ； 还见 Nektar Therapeutics， 2005-06 Catalog-COOHC- 端， Asp， Glu聚合物， 例如， PEG 糖部分mPEG-Hz 活体外的偶合Nektar， Inc. 2003 Catalog ； 还见 Nektar Therapeutics 2005-06 Catalog-SHCys聚合物， 例如， PEGmPEG-VS mPEG2-MAL (mPEGmaleimide)(mPEG马来酰亚胺 )Nektar Inc. 2003 Catalog ； Nektar Therapeutics 2005-2006 Catalog ； Delgado et al.， Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9 (3.4) ： 249-304 (1992)糖部分体外偶合-OHSer， Thr， OH-糖部分体内 O- 连接的糖 基化作用 体内 N- 糖基化作 用-CONH2Asn 作为一个 N糖基化位点的部 分 Phe， Tyr， Trp糖部分芳香族残 基糖部分体外偶合102101998965 A CN 101998971说Gln 糖部分明书体外偶合70/188 页-CONH2Yan and Wold， Biochemistry， 1984， Jul 31 ； 23(16) ： 3759-65附连基团氨基酸非多肽部分的 实例偶联方法 / 活化的 PEG 的实例 聚乙二醇化作用参考文献醛 酮氧化的碳水化合 物聚合物， 例如， PEG， PEG- 酰肼Andresz et al.， 1978， Makromol. Chem. 179 ： 301 ； WO 92/16555， WO 00/23114胍基Arg糖部分体外偶合Lundblad and Noyes， Chemical Reagents for Protein Modification， CRC Press Inc. Boca Raton， FI咪唑环
     His糖部分体外偶合如同胍对于体内 N- 糖基化作用， 以一种非常规的方式使用术语 “附连基团” 以指明构成 一个 N- 糖基化位点的氨基酸残基 ( 具有序列 N-X-S/T/C， 其中 X 是除脯氨酸之外的任何氨 基酸残基， N 是天冬酰胺， 并且 S/T/C 是丝氨酸、 苏氨酸、 或半胱氨酸， 优选地是丝氨酸或苏 氨酸， 并且最优选地是苏氨酸 )。尽管 N- 糖基化位点的天冬酰胺残基是糖基化作用过程中 该糖部分所附连的残基， 这种附连无法达成， 除非存在着该 N- 糖基化位点的其他氨基酸残 基。因此， 当该非多肽部分是一个糖部分并且该偶联应当通过 N- 糖基化作用实现时， 术语 “包括该非多肽部分附连基团的氨基酸残基” 当结合本发明的多肽的氨基酸序列的变化而 使用时， 应当被理解为构成一个 N- 糖基化位点的氨基酸残基中的一个、 两个或所有有待以 一种方式进行改变， 该方式或者将一个功能性 N- 糖基化位点引入到该氨基酸序列中、 将其 从该序列中去除或者将一个功能性 N- 糖基化位点保留在该氨基酸序列中 ( 例如， 通过用一 个苏氨酸残基取代已构成一个 N- 糖基化位点的部分的丝氨酸残基， 或反之亦然 )。
     术语 “引入” ( 即， 一个 “引入” 的氨基酸残基， 一个氨基酸残基的 “引入” ) 主要是
     旨在是指将另一个氨基酸残基取代一个既有的氨基酸残基， 但也可指插入一个额外的氨基 酸残基。
     术语 “去除” ( 即， 一个 “去除的” 氨基酸残基， 一个氨基酸残基的 “去除” ) 主要旨 在是指将另一个氨基酸残基取代有待去除的氨基酸残基， 但也可指有待去除的氨基酸残基 的缺失 ( 无取代 )。
     术语 “包括该非多肽部分附连基团的氨基酸残基” 是旨在指该氨基酸残基是该非 多肽部分所结合 ( 在一种引入的氨基酸残基的情况下 ) 或原本可能结合 ( 在一种去除的氨 基酸残基的情况下 ) 的残基。
     通过去除和 / 或引入包括该非多肽部分附连基团的氨基酸残基， 有可能特异地修 改本发明的多肽， 以便使得该分子更易与该所选的非多肽部分偶联、 使该偶联模式最适化 ( 例如， 确保非多肽部分在该多肽表面的最适分布， 并且由此， 例如， 有效遮蔽表位以及该多 肽的其他表面部分， 同时不显著损害其功能 )。例如， 通过引入附连基团， 该多肽在该相关 非多肽部分所结合的特异氨基酸残基的背景中被改变， 由此达到一个更为有效、 特异、 和/ 或广泛的偶联。通过去除一个或多个附连基团， 有可能避免偶联到该多肽的部分中的非多 肽部分上 ( 其中这种偶联是不利的 )， 例如， 偶联到在或接近该多肽的一个功能位点的氨基 酸残基上 ( 因为在这种位点上的偶联作用可造成得到的偶联物的失活或降低的 CD80- 或 CD86- 结合或降低的免疫抑制活性 )。此外， 去除在另一个附连基团附处的附连基团可能是 有利的。
     包括一个非多肽部分附连基团的氨基酸残基 ( 不论是既有的残基或去除或引入 的残基 ) 是在该非多肽部分的本质的基础上进行选择， 并且在一些情形下， 在有待使用的 偶联方法的基础上进行选择。例如， 当该非多肽部分是一个聚合物分子 ( 如， 一种聚乙二 醇 (PEG) 或聚氧化烯烃 (POA) 衍生的分子 ) 时， 可作为附连基团发挥作用的氨基酸残基可 选自下组， 其构成为 ： 半胱氨酸、 赖氨酸 ( 和 / 或该多肽的 N- 端氨基基团 )、 天冬氨酸、 谷氨 酸、 组氨酸、 以及精氨酸。当该非多肽部分是一个糖部分时， 该附连基团是一个体内或体外 的 N- 或 O- 糖基化位点， 优选地是一个 N- 糖基化位点。
     在一些情形下， 在本发明的一种偶联物的突变 CTLA-4 多肽部分中， 去除了在或接 近该受体结合位点的附连基团， 如， 通过取代包括这种基团的氨基酸残基。在一些情形下， 通常不会将包括一个非多肽部分附连基团的氨基酸残基 ( 如， 半胱氨酸或赖氨酸 ) 引入到 在或接近该突变 CTLA-4 多肽的受体结合位点。
     通过偶联到一个非多肽部分上， 可以对本发明的一种突变 CTLA-4 多肽进行修饰， 以便遮蔽并且由此修饰或破坏存在于该突变 CTLA-4 多肽中的表位或以其他方式使其失 活。突变 CTLA-4 多肽的表位可通过使用本领域中已知的方法而识别， 它还被称为表位作 图， 见， 如， Romagnoli et al.， J.Biol.Chem.380(5) ： 553-9(1999)， DeLisser HM， Methods Mol Biol， 1999， 96 ： 11-20， Van de Water et al.， Clin.Immunol.Immunopathol.85(3) ： 229-35(1997)， Saint-Remy JM， Toxicology 119(1) ： 77-81(1997)。
     可用于进行偶联并且存在于该突变 CTLA-4 多肽中的附连基团的确切数目取决于 有待通过偶联而达到的所希望的作用。这种有待获得的效应是例如， 取决于偶联作用的性 质和程度 ( 例如， 该非多肽部分的身份、 所希望的或可能偶联到该多肽上的非多肽部分的 数目、 它们应偶联的位置或应避免偶联的位置、 等 )。例如， 若希望降低的免疫原性， 附连基团的数目 ( 以及它们的位置 ) 应足以遮蔽大部分或全部的表位。这通常是在较大比例的突 变 CTLA-4 多肽获得遮蔽的情形下获得的。表位的有效遮蔽通常是在可用于偶联的附连基 团的总数是在 1 至 6 个附连基团的范围中 ( 例如， 1 至 5 个， 如在 1 至 3 个附连基团的范围 中， 如， 1、 2 或 3 个附连基团 ) 时达成的。
     功能性的体内半衰期可取决于该偶联物的分子量， 而用于提供增加的半衰期所需 要的附连基团的数目因此取决于所讨论的非多肽部分的分子量。一些此类偶联物包括 1 至 6 个 ( 例如， 1 至 5 个， 如 1 至 3 个， 例如， 1、 2 或 3 个 ) 非多肽部分， 每个具有大约 100 至 2000 道尔顿 (Da) 的分子量， 如大约 200Da、 大约 300Da、 大约 400Da、 大约 600Da、 大约 900Da、 大约 1000Da、 或大约 2 至 40kDa， 如大约 2kDa、 大约 5kDa、 大约 12kDa、 大约 15kDa、 大约 20kDa、 大 约 30kDa、 大约 40kDa、 或大约 60kDa。
     在本发明的偶联物中， 一些、 大部分、 或实质上所有的可偶联的附连基团都被这种 相关的非多肽部分占据着。
     本发明的偶联物可展示以下改进特性中的一个或多个 ： (a) 增加的血清半衰期和 / 或功能性体内半衰期， (b) 降低的抗原性或免疫原性， (c) 增加的贮存稳定性， (d) 增加的 生物利用率， (e) 降低的效应子功能， 或 (f) 降低或抑制的本发明的二个或多个分子之间的 自体结合 ( 例如， 降低的聚集体形成 )。例如， 该偶联物与 hCTLA-4 相比或与对应的未偶联 的多肽相比可展示一种降低的免疫原性， 例如， 至少 10％的降低， 如至少 25％的降低， 如至 少 50％的降低， 例如， 与该未偶联多肽相比或与一种 hCTLA-4 相比， 至少 75％的降低。该 偶联物与一个参比分子 ( 如， hCTLA-4) 相比或与该对应的未偶联的多肽相比可展示一种增 加的功能性体内半衰期和 / 或增加的血清半衰期。特别优选的偶联物是此类偶联物， 其中 在所述偶联物的功能性体内半衰期 ( 或血清半衰期 ) 与所述参比分子的功能性体内半衰期 ( 或血清半衰期 ) 之间的比例是至少 1.25， 如至少 1.50， 如至少 1.75， 如至少 2， 如至少 3， 如至少 4， 如至少 5， 如至少 6， 如至少 7， 如至少 8。该半衰期是在实验动物 ( 如， 大鼠或猴 ) 体内， 并且可基于静脉或皮下给药而便利地测定。 在另一个方面， 该偶联物与一种参比分子 ( 如， hCTLA-4) 或一种对应的未偶联的多肽相比可展示一种增加的生物利用率。
     有待偶合到该多肽上的聚合物分子可以是任何适当的聚合物分子， 如， 一种天然 或合成的同型聚合物或异型聚合物， 典型地具有在 300 至 100,000Da 的范围内的分子量， 如， 300 至 20,000Da， 更优选地是在 500 至 10,000Da 的范围内， 甚至更优选地是在 500 至 5000Da 的范围内。
     同型聚合物的实例包括一种多元醇 ( 即， 聚 -OH)、 一种聚胺 ( 即， 聚 -NH2)、 以及一 种聚羧酸 ( 即， 聚 -COOH)。一种异型聚合物是一种聚合物， 它包括一种或多种不同的偶合 基团， 例如， 一个羟基基团以及一个氨基基团。适当聚合物分子的实例包括选自下组的聚 合物分子， 该组的构成为 ： 聚氧化烯烃 (PAO)， 包括聚亚烷基二醇 (PAG)， 如， 聚乙二醇 (PEG) 以及聚丙二醇 (PPG)、 分支的 PEG、 聚乙烯醇 (PVA)、 聚羧酸酯、 聚 ( 乙烯吡咯烷酮 )、 聚乙 烯 - 共 - 马来酸酸酐、 聚苯乙烯 - 共 - 苹果酸酸酐、 右旋糖酐 ( 包括羧甲基右旋糖酐 )、 或适 合于降低免疫原性、 和 / 或增加功能性体内半衰期和 / 或血清半衰期的任何其他生物聚合 物。一种聚合物分子的另一个实例是人类白蛋白或另一种大量的血浆蛋白。总体上， 聚乙 二醇衍生的聚合物是生物相容的、 无毒的、 无抗原的、 无免疫原的， 具有不同的水溶解特性、 并且易于从生物体中排出。PEG 是有待使用的优选的聚合物分子， 因为当与例如， 多醣类， 如右旋糖酐， 或类似 物相比， 它仅具有极少数的可进行交联的反应基团。确切地， 单功能性 PEG， 例如， 单甲氧基 聚乙二醇 (mPEG) 是感兴趣的， 因为它的偶合化学性相对简单 ( 仅有一个反应基团可用于 与该多肽上的附连基团进行偶联 )。因此， 排除了交联的风险， 而得到的多肽偶联物是较为 匀质的， 并且该聚合物分子与该多肽的反应是较易控制的。当该分子被聚乙二醇化时， 它 通常包括 1、 2、 3、 4、 或 5 个聚乙二醇 (PEG) 分子。每个 PEG 分子可具有大约 5kDa( 千道尔 顿 ) 至 100kDa 的分子量， 包括例如， 大约 10kDa、 大约 12kDa、 大约 20kDa、 大约 40kDa。适当 的 PEG 分子可获自 ShearwaterPolymers， Inc. 以及 Enzon， Inc.， 并且它们可选自 SS-PEG、 NPC-PEG、 醛 -PEG、 mPEG-SPA、 mPEG-SCM、 mPEG-BTC、 SC-PEG、 三氟乙磺酸化的 (tresylated) mPEG(US 5,880,255)、 或氧羰基 - 氧基 -N- 二甲酰亚胺 -PEG(US 5,122,614)。
     在一个方面， 本发明提供了一种分离或合成的偶联物， 该偶联物包括 ： (a) 本发 明的一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4ECD 多肽、 二聚体或单体突变 CTLA-4-Ig、 多聚体突变 CTLA-4ECD 多肽、 多聚体突变 CTLA-4-Ig) ； 以及 (b) 至少一种非多肽部分， 例如， 1 至 10、 1 至 9、 1 至 8、 1 至 7、 1 至 7、 1 至 6、 1 至 5、 1 至 4、 1 至 3、 1、 2、 或 3 个非多肽部分附连到该多肽 上， 其中该偶联物结合 CD80( 例如， hCD80) 和 / 或 CD86( 例如， hCD86)、 和 / 或二者之一的 或两者的以细胞外结构域 ( 包括 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig)， 和 / 或具有诱导一种免疫反 应的能力 ( 例如， T 细胞相依赖的免疫反应 )。示例性的多肽包括具有与选自下组的一个多 肽序列至少 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的同一性， 该组为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222。在一些情形下， 该偶联物包括一 个非多肽部分。在一些情形下， 该偶联物包括二、 三、 四或多个非多肽部分。在一些情形下， 该偶联物的多肽的氨基酸序列进一步包括一个或多个取代， 这种或这些取代各自引入该非 多肽部分的一个附连基团 ( 例如， 通过用包括该非多肽部分附连基团的不同残基取代该多 肽序列的氨基酸残基， 或通过在该多肽序列中插入包括该非多肽部分附连基团的一个额外 氨基酸残基 )。
     一个偶联物可包括本发明的二个或多个多肽。在一些情形下， 一个非多肽部分是 共价附连到此类多肽的任一或两者上的。若该偶联物包括本发明的二个或多个相同的多 肽， 典型地将该相同类型及数目的非多肽部分附连到每个此类多肽上， 通常是以相同方式 附连到每个多肽的一个或多个对应的附连基团上。如以上所指出， 该非多肽部分可包括例 如， 糖类分子， 该糖类分子能够可任选地附连到一个 N- 糖基化位点上， 或一个聚合物， 例 如， 一个聚乙二醇部分上。该聚乙二醇部分可以共价附连到本发明的多肽的一个半胱氨 酸残基或赖氨酸残基上。在一些情形下， 该聚乙二醇部分是共价附连到该多肽的 N- 端氨 基基团上的。包括本发明的一种突变 CTLA-4-Ig 的偶联物可被说明为本发明的一种突变 CTLA-4-Ig 偶联物。 还包括偶联物的多聚体。 多聚体偶联物包括二个或多个偶联物， 其中至 少一个偶联物是本发明的一种偶联物， 该偶联物包括本发明的至少一种多肽。在一种多聚 体偶联物中的偶联物可以 ( 但不一定必须 ) 是彼此相同的。
     如以上所讨论， 本发明的多肽 ( 包括本发明的融合蛋白 ) 可经常经受糖基化作 用。本发明的多肽以及融合蛋白可进一步经受 ( 或进行修饰这样使得它们经受 ) 其他形 式的翻译后修饰， 包括例如， 羟化作用、 脂类或脂类衍生物的附连、 甲基化作用、 十四烷基化 作用、 聚乙二醇化作用、 磷酸化作用、 以及硫酸化作用。可致使本发明的一种多肽及融合蛋白经受的其他翻译后修饰包括乙酰化作用、 酰化作用、 ADP- 核糖基化作用、 酰胺化作用、 黄 素的共价附连、 一个血红素部分的共价附连、 一种核苷酸或核苷酸衍生物的共价附连、 磷脂 酰肌醇的共价附连、 交联、 环化作用、 二硫键形成、 脱甲基作用、 甲酰化作用、 GPI 锚的形成、 碘化作用、 氧化作用、 蛋白水解加工、 异戊二烯化作用、 外消旋作用、 硒化作用、 精氨酰作用、 以及泛素化作用。其他常见的蛋白修饰说明于， 例如， Creighton， 以上说明文献， Seifter et al.， Meth.Enzymol.18 ： 626-646(1990)， 以及 Rattan et al.， Ann.NY Acad.Sci.663 ： 48-62(1992)。在宿主细胞中从核酸表达的多肽或融合蛋白的翻译后修饰发生变化， 这取 决于该多肽表达所在的宿主种类或宿主细胞类型。例如， 糖基化作用通常不会在细菌宿主 ( 如， 大肠杆菌 ) 中发生， 并且与哺乳动物细胞系统相比在杆状病毒系统中变化相当大。因 此， 当希望糖基化作用时 ( 这通常是本发明的大部分多肽的情形 )， 一种肽或融合蛋白应当 在糖基化的宿主中表达 ( 生产 )， 总体上是真核细胞 ( 例如， 一种哺乳动物细胞或昆虫细 胞 )。就翻译后修饰而言该多肽或融合蛋白的修饰可由任何适当的技术验证， 包括例如， X 光衍射、 NMR 成像、 质谱法、 和 / 或色谱法 ( 例如， 反相色谱法、 亲和层析法、 或 GLC)。
     该多肽或融合蛋白还能够或可替代地能够包括任何适当数目的非自然发生的氨 基酸 ( 例如， β 氨基酸 )， 和 / 或可替代的氨基酸 ( 例如， 硒代半胱氨酸 (selenocysteine))， 或 氨 基 酸 类 似 物，如 列 于 Manual of PatentExamining Procedure§2422(7th Revision-2000) 的那些， 它们可通过蛋白合成而纳入， 如， 通过固相蛋白合成 ( 如说明于， 例如， Merrifield， Adv.Enzymol.32 ： 221-296(1969) 以及在本文中所引述的其他参考文 献 )。 本发明的一种多肽或融合蛋白可通过至少一个经修饰的氨基酸的包含而进一步修饰。 该一个或多个经修饰氨基酸的包含在以下方面可以是有利的， 例如， (a) 增加多肽或融合蛋 白的血清半衰期， (b) 降低多肽或融合蛋白的抗原性， 或 (c) 增加多肽或融合蛋白的贮存稳 定性。 在重组产生过程中对一种或多种氨基酸进行 ( 例如， 共翻译地或翻译后地 ) 修饰 ( 例 如， 在哺乳动物细胞中表达过程中在 N-X-S/T 基序上的 N- 连接的糖基化作用 )， 或通过合成 手段进行修饰。 一种经修饰的氨基酸的非限制性实例包括 ： 一种糖基化的氨基酸、 一种硫酸 化的氨基酸、 一种异戊二烯化 ( 例如， 法尼基化、 四异戊二烯化 (geranylgeranylated)) 的 氨基酸、 一种乙酰化的氨基酸、 一种酰化的氨基酸、 一种聚乙二醇化的氨基酸、 一种生物素 酰化的氨基酸、 一种羧基化的氨基酸、 一种磷酸化的氨基酸、 以及类似氨基酸。足够指导本 领域中的普通技术人员进行氨基酸修饰的参考文献在文献中相当充分。 实例操作操作可见 于 Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROM Humana Press， Towata， NJ。该经修饰的 氨基酸可选自 ： 一种糖基化的氨基酸、 一种聚乙二醇化的氨基酸、 一种法尼基化的氨基酸、 一种乙酰化的氨基酸、 一种生物素酰化的氨基酸、 一种偶联到脂类部分上的氨基酸、 以及一 种偶联到有机衍化剂上的氨基酸。
     本发明进一步提供了具有以上说明特性的多肽 ( 包括融合蛋白 )， 这些多肽进一 步包括可影响该多肽 ( 或融合蛋白 ) 的生物功能 ( 例如， 免疫原性、 靶向、 和 / 或半衰期 ) 的额外氨基酸序列。
     本发明的一种多肽或融合蛋白可进一步包括除了一种信号序列的靶向序列， 或在 一种信号序列之外尚包括靶向序列。 例如， 该多肽或融合蛋白可包括一个序列， 该序列可靶 向一种特定细胞类型上的受体 ( 例如， 一种单核细胞、 树状细胞、 或相关联的细胞 )， 以提供 该多肽对此类细胞和 / 或相关组织的靶向递送。信号序列在以上进行说明， 并且包括膜定位 / 锚定序列 ( 例如， 中止转移序列、 GPI 锚序列 ) 及类似序列。
     本发明多肽 ( 包括本发明的融合蛋白 ) 的一种特别有用的融合配偶体是一个协助 该多肽纯化的肽序列， 例如， 一个多肽纯化亚序列。 本发明的一种多核苷酸可包括一个编码 序列， 该编码序列以符合阅读框的方式融合到一个标记氨基酸序列上， 该标记氨基酸序列 例如协助了该经编码的多肽的纯化。 此类纯化协助肽结构域或多肽纯化亚序列包括但不限 于， 金属螯合肽， 如， 组氨酸 - 色氨酸模块， 它允许在经固定的金属上进行纯化， 如， 一个六 组氨酸肽或其他一个聚组氨酸序列， 编码了这种被纳入到可由 QIAGEN， Inc.(Chatsworth， California) 获得的载体中标签的序列、 结合了谷胱甘肽的序列 ( 例如， 谷胱甘肽 -S- 转移 酶 (GST))、 一种血球凝集素 (HA) 标签 ( 对应于衍生自流感血球凝集素蛋白的一个表位 ； Wilson et al.， Cell 37 ： 767(1984))、 麦芽糖结合蛋白序列、 用于 FLAGS 延伸 / 亲和纯化系 统中的 FLAG 表位 (Immunex Corp， Seattle， WA)( 可商购的 FLAG 表位也可通过 Kodak(New Haven， Connecticut) 获得 )、 一种 E- 表位标签 (E-tag)、 硫氧还蛋白 (TRX)、 抗生物素蛋 白， 以及类似物质。协助纯化的表位标签在本领域内已经进行说明 ( 见， 如， Whitehorn et al.， Biotechnology 13 ： 1215-19(1995))。一种多肽可包括一种 e-his 标签， 该标签可包 括一个聚组氨酸序列以及一个抗 -e- 表位序列 (Pharmacia BiotechCatalog) ； e-his 标签 可以通过标准技术而制得。在该纯化结构域与该多肽之间包含一个蛋白酶可切割的多肽 连接物序列可用于协助纯化。这些组氨酸残基协助了在 IMIAC 上进行纯化 ( 固定金属离 子亲和层析 (IMAC)， 如说明于 Porath et al.Protein Expression and Purification 3 ： 263-281(1992))， 而肠激酶切割位点则提供了一种用于将该多肽从该融合蛋白中分离的方 法。pGEX 载体 (Promega ； Madison， WI) 也可与谷胱甘肽 -S- 转移酶 (GST) 一起用于将外源 多肽表达成融合蛋白。总体上， 此类融合蛋白是可溶性的， 并且可易于通过吸收到配体 - 琼 脂糖珠上 ( 如， 谷胱甘肽 - 琼脂糖， 在 GST- 融合物的情形下 )、 之后跟随在游离配体的存在 下进行溶析而容易地从裂解的细胞中进行纯化。 多肽纯化协助性亚序列的额外的实例以及 它们对蛋白纯化的用途说明于例如， 国际专利申请公开号 WO 00/15823。 在表达了所感兴趣 的多肽并且通过此类融合配偶体或如以上所说明的其他方法将其分离之后， 可使用蛋白再 折叠步骤 ( 若希望 )， 以完成该成熟多肽的构型。
     本发明的一种融合蛋白也可包括一个或多个额外的肽片段或肽部分， 它们促进了 该融合蛋白的检测。例如， 可将一个报告肽片段或部分 ( 例如， 绿荧光蛋白 (GFP)、 β- 半乳 糖苷酶、 或它的一种可检测的结构域 ) 纳入该融合蛋白中。可与本发明的多肽相偶联的额 外的标记分子包括放射核素、 酶类、 荧光团、 小分子配体、 以及类似物。 此类检测促进性融合 配偶体特别用于在本文其他地方所讨论的诊断技术中使用的融合蛋白。
     在另一个方面， 本发明的一种多肽可包括一个融合配偶体， 它促进了该多肽的稳 定性、 该多肽的分泌 ( 非信号靶向 ) 或这两者。例如， 该多肽可包括一个免疫球蛋白 (Ig) 结构域， 如， 包括 Fc 铰链区、 CH2 结构域、 以及 CH3 结构域的 IgG 多肽， 它促进了该多肽的稳 定性和 / 或分泌。
     这些融合蛋白肽片段或肽部分能够以任何适当方式相结合。 该融合蛋白的不同多 肽片段或部分可进行共价结合 ( 例如， 通过一个肽或二硫键 )。这些多肽片段或部分可直 接地进行融合 ( 例如， 本发明的一个抗原性或免疫原性序列的 C- 端可融合到一个纯化序列 或异源免疫原性序列的 N- 端上 )。该融合蛋白可以在这些肽部分内或之间包括任何适当数目的经修饰的键， 例如， 排列体。可替代地或额外地， 该融合蛋白可以在一个或多个多肽 片段或部分之间包括一个肽连接物， 该肽连接物包括一个或多个不形成该生物活性肽部分 的部分的氨基酸序列。可使用任何适当的肽连接物。这种连接物可是任何适当的大小的。 典型地， 该连接物小于约 30 个氨基酸残基， 小于约 20 个氨基酸残基， 和 / 或小于约 10 个氨 基酸。该连接物主要可包括中性氨基酸残基， 或由其组成。适当的连接物总体上说明于， 例 如， 美国专利号 5,990,275、 6,010,883、 6,197,946， 以及欧洲专利申请 0 035 384。若希望 肽片段或肽部分的分离， 可使用一种协助分离的连接物。这种连接物的一个实例说明于美 国专利号 4,719,326。 “柔韧的” 连接物可以是有利的， 这种连接物典型地是由甘氨酸和 / 或丝氨酸残基的组合构成的。 此类连接物的实例说明于， 例如， McCafferty et al.， Nature 348 ： 552-554(1990)， Hustonet al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ： 5879-5883(1988)， Glockshuber et al.， Biochemistry 29 ： 1362-1367(1990)， 以 及 Cheadle et al.， Molecular Immunol.29 ： 21-30(1992)， Bird et al.， Science 242 ： 423-26(1988)， 以及美 国专利号 5,672,683、 6,165,476 及 6,132,992。
     连接物的使用也可降低对于该融合蛋白的不希望的免疫反应， 该融合蛋白是通过 这两个肽片段或肽部分的融合而产生， 它可造成一个不希望的、 存在于该融合蛋白中的 MHC I 和 / 或 MHC II 表位。除了使用连接物之外， 经识别的不希望的表位序列或邻近序列可被 聚乙二醇化 ( 例如， 通过插入赖氨酸残基以促进 PEG 附连 ) 以遮蔽经识别的表位不使其暴 露。 其他用于降低本发明的融合蛋白的免疫原性的技术可以于该融合蛋白的给予相结合而 使用， 包括提供于美国专利号 6,093,699 的技术。
     制备多肽
     用于产生并分离本发明的多肽 ( 包括本发明的融合蛋白 ) 的重组方法在以下进行 说明。除了重组产生之外， 这些多肽可使用固相技术通过直接的肽合成进行生产 ( 见， 如， Stewart et al.(1969)Solid-Phase PeptideSynthesis， W.H.Freeman Co， San Francisco ； Merrifield(1963)J.Am.Chem.Soc 85 ： 2149-2154)。肽合成可使用手动技术或经由自动化 而进行。 自动化的合成可以例如， 使用 Applied Biosystems 431A 肽合成仪 (Perkin Elmer， Foster City， Calif.)， 根据制造商所提供的指示而达到。例如， 可分开地通过化学方法合 成亚序列， 并且使用化学方法将它们结合， 以提供突变 CTLA-4 多肽或他们的功能性片段。 可替代地， 此类序列可从任何专门生产多肽的公司订购。 最常见地， 本发明的多肽是通过表 达了编码核酸并回收多肽而产生的， 例如， 如以下所说明。
     本发明提供了用于产生本发明的多肽 ( 包括融合蛋白 ) 的方法。一个这种方法包 括将在本文中所说明的任何核酸引入多个细胞的一个群体中 ( 该核酸是可操作地连接到 一个有效生产该经编码的多肽的调节序列上 )， 在培养基中培养这些细胞以生产该多肽， 并 且将该多肽在从这些细胞或从培养基中分离。使用了足以协助这些细胞摄入 ( 转染 ) 和 / 或表达该多肽的核酸量。该培养基可以是在本文以及实例中所说明的任何。额外的培养 基是本领域的普通技术人员所已知的。 将该核酸以在本文中所说明的任何递送方法引入此 类细胞中， 包括例如， 注射、 无针注射装置、 基因枪、 电穿孔 ( 例如， DNA 电穿孔装置， Inovio Biomedical Corp.(San Diego))、 经皮递送、 被动摄入、 等。本发明的核酸可以是一个载体 ( 如一个重组表达载体 ) 的部分， 包括一个 DNA 质粒载体、 病毒载体、 或在本文中所说明的任 何载体。 这种包括本发明的一种核酸的核酸或载体可以如本文、 以上、 以及以下实例所说明进行制备和配置。可以将这种核酸或表达载体引入一个哺乳动物体内多个细胞的群体中， 或可将所选择的哺乳动物细胞 ( 例如， 种瘤细胞 ) 从该哺乳动物中去除， 并且将这种核酸表 达载体以一个足够的量值离体引入此类细胞的群体中， 这样就造成了该经编码的多肽的摄 入和表达。或者， 在体外使用培养的细胞来产生包括本发明的一种核酸的核酸或载体。在 一个方面， 产生本发明的一种多肽的方法包括以一个量值和配方向多个细胞的一个群体引 入一种重组表达载体， 该表达载体包括在本文中所说明的任何核酸， 这样就造成了该载体 的摄入以及该多肽的表达 ； 通过在本文中说明的任何引入 / 递送形式将该表达载体给予一 个哺乳动物体内 ； 并且从该哺乳动物或从该哺乳动物的副产物中将该多肽分离。适当的宿 主细胞、 表达载体、 以一种表达载体转染宿主细胞的方法 ( 该表达载体包括编码了本发明 的一种多肽的核酸序列 )、 细胞培养、 以及用于生产并从一个细胞培养物中回收这种多肽的 操作在以下标题为 “本发明核酸” 的章节中详细说明。额外的生产方法在以下的实例中进 行讨论。
     如以上所指出， 本发明的多肽 ( 它包括本发明的融合蛋白 ) 可经受不同的变化， 如， 一个或多个氨基酸或核酸的插入、 缺失、 及取代， 这些变化可以是保守性或非保守性的， 包括其中例如， 此类变化在其用途中可能提供某些优势， 例如， 在其治疗或预防用途， 或给 药或诊断应用中。用于通过使用氨基酸的取代、 缺失、 插入、 以及添加而制得多肽变体的操 作在本领域内是常规的。多肽以及它们的变体 ( 具有所希望的结合 CD80 和 / 或 CD86 或它 的一个片段 ( 例如， ECD) 的能力、 或如本文的其他地方详细说明的在体外或体内阻抑一种 免疫反应的能力 ) 可通过本领域的普通技术人员所已知的测定并且通过在本文中所说明 的测定容易进行识别。见， 如， 提供于以下实例中的测定。
     本发明的核酸 ( 以下更为详细地讨论 ) 也可经受不同的变化， 如， 在一个或多个密 码子中的一个或多个核酸的一个或多个取代， 这样使得一个特定的密码子编码了相同的或 不同的氨基酸， 造成一个保守性的或非保守性的取代， 或该序列中的一个或多个核酸的一 个或多个缺失。还可以对这些核酸进行修饰以便包括一个或多个密码子， 这种或这些密码 子在一个表达系统 ( 例如， 哺乳动物细胞或哺乳动物表达系统 ) 中提供了最适表达， 同时， 若希望， 所述一个或多个密码子仍编码这种或这些相同的氨基酸。用于通过使用核酸的取 代、 缺失、 插入、 以及添加、 以及简并密码子来制得核酸变体的操作是本领域中的例行操作， 而编码了具有在本文中所说明的希望特性的多肽的核酸变体 ( 例如， 结合 CD80 和 / 或 CD86 的能力， 和 / 或在体外或体内阻抑一种免疫反应的能力 ) 使用在本文中所说明的测定容易 进行识别。 此类核酸变化在其治疗或预防用途或给药、 或诊断应用中可能提供某些优势。 在 一个方面， 这些核酸和多肽能够以多种方式进行修饰， 只要它们对应地包括一种核酸或多 肽序列， 该多肽序列实质上与本发明的对应的突变 CTLA-4 多肽编码核酸或突变 CTLA-4 多 肽相同。
     本发明的核酸
     本发明提供了分离或重组的核酸 ( 在本文中也被称为多核苷酸 )， 集合称为 “本发 明的核酸” (或 “本发明的多核苷酸” )， 它们编码了本发明的多肽。本发明的核酸 ( 包括以 下说明的所有 ) 用于重组生产 ( 例如， 表达 ) 本发明的多肽， 典型地是通过一个质粒表达载 体， 该载体包括编码了该多肽或它的一个片段的序列 ； 作为治疗剂 ； 作为预防剂 ； 作为诊断 工具 ； 在互补的或部分地互补的核酸的存在下作为诊断探针 ( 包括用于一种野生型 CTLA-4核酸的检测 )。例如， 本发明的核酸 ( 包括以下说明的所有 ) 是有用的， 这是因为他们编码 了在体外和 / 或体内的应用中用于阻抑或抑制一种免疫反应 ( 例如， T 细胞的活化、 T 细胞 的增殖、 细胞因子的合成或产生 ( 例如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2 的产生 )、 活化标记 ( 例如， CD25、 IL-2 受体 ) 的诱导、 炎症、 抗胶原抗体的产生和 / 或 T 细胞依赖的抗体反应 ) 的多肽， 这些应用包括例如， 用于治疗其中希望抑制一种免疫反应的免疫系统疾病、 紊乱、 以及病况 的预防或治疗方法 ( 例如， 用于治疗自身免疫疾病及紊乱的方法， 以及用于抑制由一位受 方对于来自供方的一个组织、 细胞、 或器官移植体的排斥的方法 )。本发明的核酸也可纳入 到表达载体中用于基因疗法、 DNA 疫苗接种、 以及免疫抑制疗法。在本文的其他地方说明了 包括此类核酸的本发明的核酸和载体的额外用途。
     在一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个核苷酸序列， 该核苷酸序列编码了以上在标题为 “本发明的多肽” 的章节中以及本文的其他地方说明的 本发明的多肽 ( 包括任何融合蛋白、 等 )。本发明还提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸 包括一个核苷酸序列， 该核苷酸序列编码了以上以本文的其他地方所说明的本发明的多肽 ( 包括任何融合蛋白 ) 中的二个或多个的组合。 还包括了一种核酸， 该核酸编码了本发明的 任何多肽， 例如， 一种突变 CTLA-4 ECD 多肽或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 该核酸包括一系列 的实质上优化用于在哺乳动物宿主 ( 如， 人类 ) 体内表达的密码子。
     例如， 在一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个核苷酸 序列， 该核苷酸序列编码了包括一个多肽序列的一种多肽， 该多肽序列具有与选自下组的 至少一个多肽序列至少 75 ％、 80 ％、 85 ％、 86 ％、 87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 99.5％、 或 100％的序列同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 或它的一个互补的多核苷酸序列， 其中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86， 或 CD80 和 / 或 CD86 的一个多肽片段 ( 例如， CD80 和 / 或 CD86 的一个细胞外结构域 )， 和 / 或在体 外或体内阻抑一种免疫反应， 或它的一个互补的多核苷酸序列。其他有关此类多肽的功能 特性和特征的细节说明于以上的 “本发明的多肽” 中。一些此类核酸编码了一种多肽， 该多 肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有大约等于该 hCTLA-4 ECD 氨基酸长度的氨基酸长度 ； 如同例如， 110 至 138、 112 至 132、 118 至 130、 119 至 129、 120 至 128、 121 至 127、 122 至 126、 123 至 125、 或 124 个氨基酸残基。编码该突变 CTLA-4ECD 多肽的示例性核酸包括在 SEQ ID NOS ： 1 至 73 给出的序列， 但不限于例如， 对应地具有在 SEQ ID NOS ： 80-152 给出的核苷酸 序列的核酸。例如， 编码在 SEQ ID NO ： 1 所示的多肽 ( 克隆 D3-1) 的一种示例性核酸是在 SEQID ： 80 中所示的核酸。还包括了任何此类核酸的片段， 其中这种片段编码了一种多肽， 该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个 ECD， 和 / 或具有阻抑一种 免疫反应的能力。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个核苷酸序 列， 该核苷酸序列编码了包括一个多肽序列的一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD 多肽 )， (a) 该多肽序列与选自下组的一个多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基 ( 例如， 不超过 1、 2、 3、 4、 5 或 6 个氨基酸残基 ) 的差异， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 并且 (b) 其中该多肽 序列中在位置 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的氨基酸残基是与在所述多肽序列的对应 位置处上的氨基酸残基相同， 该多肽序列选自下组， 其构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该 多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或在体外或体内抑制一种免疫反应， 或它的一个互补的多核苷酸序列。 即， 在此类所选择的多肽序列 中在此类位置 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 上的氨基酸残基是未缺失或取代的。一些 此类核酸编码了一种多肽， 该多肽包括一个序列， 该序列与所选择的多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且该序列在选自氨基酸位置 24、 30、 32、 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 85、 104、 以及 106 组在 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 和 / 或 14 个位置上包括氨基酸 残基， 这些氨基酸残基是与在所选择的多肽序列中在对应位置上的氨基酸残基相同的。此 类多肽可以与所选择的多肽序列具有一个或多个氨基酸缺失、 一个或多个添加、 和 / 或一 个或多个氨基酸取代的差异。一个氨基酸取代可以是一个保守性或非保守性的取代。示例 性的保守性取代在标题为 “序列变体” 的章节中进行讨论。一些此类多肽包括一个序列， 该 序列具有大约 118 至 130、 119 至 129、 120 至 128、 121 至 127、 122 至 126、 123 至 125、 或 124 个氨基酸残基的长度。以上讨论了此类多肽的功能特性和特征的其他细节。示例性的核酸 包括但不限于例如， 包括在 SEQ IDNOS ： 80 至 152 中所示的核苷酸序列的那些。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了包括一个多肽序列的一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD)， 该 多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 中给出的人类 CTLA-4 细胞外结构域的多肽序列具有不 超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且 (b) 包括至少一个氨基酸取代， 该氨基酸取代是在对应于 相对 SEQ IDNO ： 159 的多肽序列的位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 上的一个氨基酸位置 上， 其中该多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86、 和 / 或二者之一或的两者的一个 ECD， 和 / 或在体 外和 / 或体内抑制一种免疫反应， 或它的一个互补的多核苷酸序列。一些此类核酸编码了 多肽， 这些多肽包括在相对在 SEQID NO ： 159 中给出的、 选自下组的序列的位置上的 2、 3、 4、 5、 或 6 个氨基酸取代， 该组的构成为 ： 位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85。编码了多肽的一 些此类核酸进一步包括一个氨基酸取代， 该氨基酸取代是在对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的 位置 104 和 / 或 30 的一个位置上。一些此类核酸编码了多肽， 这些多肽包括相对 SEQ ID NO ： 159 的至少一个氨基酸取代， 这些取代是在位置 70( 如， S70F)、 位置 64( 例如， S64P)、 位 置 50( 例如， A50M)、 位置 54( 例如， M54K/V)、 位置 65( 例如， I65S)、 位置 56( 例如， N56D)、 位置 55( 例如， G55E)、 位置 85( 例如， M85A) 和 / 或位置 24( 例如， A24E) 上。任何这种多 肽可进一步包括相对 SEQ IDNO ： 159 的一个氨基酸取代， 该氨基酸取代是在位置 104( 可任 选地是 L104E/D， 例如， L104E)、 位置 30( 例如， T30N/D/A)、 和 / 或位置 32( 例如， V32I)。一 些此类核酸编码了多肽， 这些多肽包括一个或多个取代， 这种或这些取代是在相对 SEQ ID NO ： 159 的、 选自下组的氨基酸位置上， 该组的构成为 ： A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 以及 S70F。一些此类经编码的多肽包括一个序列， 该序列具有大约 118 至 130、 119 至 129、 120 至 128、 121 至 127、 122 至 126、 123 至 125。或 124 个氨基酸残基的氨基酸长度。以上 讨论了此类多肽的功能特性及特征的其他细节。
     本发明还提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核 苷酸序列编码了包括一种多肽序列的一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD)， 该多肽序列包括 (i) 至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％同一性的任何多肽序列， 该多肽序列选自下 组， 其构成为 ： SEQ IDNOS ： 1 至 73， 以及 (ii) 一个苯丙氨酸残基， 该苯丙氨酸残基是在对应 于所述多肽序列的位置 70 的一个氨基酸位置上， 该多肽序列选自下组， 其构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个 ECD， 和/ 或抑制一种免疫反应， 或它的一个互补的多核苷酸序列。一些此类核酸编码了多肽， 这些 多肽包括以下的相对该所选择序列中的一个或多个 ： 在对应于位置 24 的一个氨基酸位置 上的一个谷氨酸残基、 在对应于位置 30 的一个氨基酸位置上的一个天冬酰胺残基、 在对应 于位置 32 的一个氨基酸位置上的一个异亮氨酸残基、 在对应于位置 50 的一个氨基酸位置 上的一个甲硫氨酸残基、 在对应于位置 54 的一个氨基酸位置上的一个赖氨酸残基、 在对应 于位置 55 的一个氨基酸位置上的一个谷氨酸残基、 在对应于位置 56 的一个氨基酸位置上 的一个天冬氨酸残基、 在对应于位置 64 的一个氨基酸位置上的一个脯氨酸残基、 在对应于 位置 65 的氨基酸位置上的一个丝氨酸残基、 以及在对应于位置 104 的一个氨基酸位置上的 一个谷氨酸残基。 一些此类核酸编码了多肽， 这些多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有 大约 118 至 130、 119 至 129、 120 至 128、 121 至 127、 122 至 126、 123 至 125、 或 124 个氨基酸 残基的长度。以上讨论了此类多肽的功能特性和特征的其他细节。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码包括一个多肽序列的一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD)， 该多 肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4 ECD 多肽的多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且 (b) 包括至少一个氨基酸取代， 其中所述至少一个氨基酸取代 是 S70F， 其中根据 SEQ ID NO ： 159 对氨基酸残基位置进行编号， 其中该多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86( 和 / 或二者之一的或两者的以 ECD)， 和 / 或抑制一种免疫反应， 或它的一个互补 的多核苷酸序列。一些此类核酸编码了一种多肽， 该多肽进一步包括选自下组的至少一个 氨基酸取代， 该组的构成为 ： A24E、 T30N、 V32I、 D41G、 A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 M85A、 L104E、 以及 I106F。一些此类核酸编码了多肽， 这些多肽包括一个多肽序列， 该多肽 序列具有大约 118 至 130、 119 至 129、 120 至 128、 121 至 127、 122 至 126、 123 至 125、 或 124 个氨基酸残基的长度。以上讨论了此类多肽的功能特性和特征的其他细节。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了包括一个多肽序列的一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD)， 该 多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 31 中所示的多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且 (b) 包括以下的至少一项 ： 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 50 的一个位置上的一个甲 硫氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 54 的一个位置上的一个赖氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 55 的一个位置上的一个谷氨酸残基、 在对应于 SEQID NO ： 31 的位置 64 的一个位置上的一个脯氨酸残基、 在对应于 SEQ IDNO ： 31 的位置 65 的一个位置上的一个 丝氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 70 的一个位置上的一个苯丙氨酸残基， 其中根 据 SEQ ID NO ： 31 对氨基酸残基位置进行编号， 并且其中该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和/ 或二者之一的或两者的一个 ECD， 和 / 或抑制一种免疫反应， 或它的一个互补的多核苷酸序 列。一些此类经编码的多肽包括在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 104 的一个位置上的一个 谷氨酸残基、 在对应于位置 30 的一个位置上的一个天冬酰胺残基、 和 / 或在对应于位置 32 的一个位置上的一个异亮氨酸残基。一些此类核酸编码了多肽， 这些多肽包括一台多肽序 列， 该多肽序列具有大约 118 至 130、 119 至 129、 120 至 128、 121 至 127、 122 至 126、 123 至 125、 或 124 个氨基酸残基的长度。以上讨论了此类多肽的功能特性和特征的其他细节。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列具有与选自下组的至少一个的多核苷酸序列至少 80％、 85％、 86％、87 ％、 88 ％、 89 ％、 90 ％、 91 ％、 92 ％、 93 ％、 94 ％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 99.5 ％、 或 100％的同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 80 至 158、 201 至 204、 223、 以及 224， 或它的一 个互补的多核苷酸序列， 其中该核酸编码了一种多肽， 该多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86、 和/ 或二者之一的或两者的一个 ECD， 和 / 或抑制一种免疫反应， 或它的一个互补的多核苷酸序 列。包括以 SEQ ID NOS ： 80 至 158 所识别的多核苷酸序列的示例性核酸对应地编码了包括 以 SEQ ID NOS ： 1 至 79 所识别的多肽序列的示例性多肽。包括以 SEQ ID NOS ： 201 至 204 所识别的多核苷酸序列的示例性核酸对应地编码了包括以 SEQ ID NOS ： 197 至 200 所识别 的多肽序列的示例性多肽。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括 ： (a) 一个多 核苷酸序列， 该多核苷酸序列具有与一个 RNA 多核苷酸序列至少 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99％、 或 100％的同一性， 其中该 RNA 多核苷酸序列包括选自下组的一个 DNA 序列， 该组的构 成为 ： SEQ ID NOS ： 80 至 158、 201 至 204、 223、 以及 224， 其中在该 DNA 序列中所有的胸腺嘧 啶核苷酸残基被尿嘧啶核苷酸残基置换 ； (b)(a) 的一个互补的多核苷酸序列 ； 或 (c)(a) 或 (b) 的任何多核苷酸序列的一个片段， 其中该核酸编码了一种多肽， 该多肽 (i) 结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个 ECD， 和 / 或 (ii) 在体外或体内具有阻抑一种免 疫反应的能力 ( 例如， T 细胞的活化或增殖、 细胞因子的合成或产生 ( 如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2 的产生 )、 活化标记 ( 如， CD25、 IL-2 受体 ) 的诱导、 炎症、 抗胶原抗体的产生和 / 或 T 细胞依赖的抗体反应 )， 或它的一个互补的多核苷酸序列。
     本发明包括一种分离或重组的核酸， 该核酸编码了以上说明的本发明的任何多肽 的任何多聚体 ( 例如， 二聚体、 四聚体、 等 )。如其他地方更为详细地讨论， 包括本发明的两 个多肽 ( 包括两个融合蛋白 ) 的一个二聚体典型地是在细胞加工过程中通过产生一个或 多个共价二硫键而形成， 这个或这些二硫键是在一个多肽中的一个或多个半胱氨酸残基与 该第二多肽中的一个多多个半胱氨酸残基之间产生。其他多聚体可以类似方式形成。例 如， 在一个非限制性的方面中， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核 苷酸序列， 该多核苷酸序列编码了包括两个多肽的一个重组多肽二聚体， 其中每个这种多 肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的一个序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％的同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该二聚体结合 hCD80 和 / 或 hCD86， 和 / 或抑制一种免疫反应， 或它的一个互补的多核苷酸序列。还包括了一种分离 或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码了包括两个多肽的一 个多肽二聚体， 其中每个这种多肽与该 hCTLA-4 ECD 的多肽序列 (SEQ ID NO ： 159) 具有不 超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且包括至少一个氨基酸取代， 这些氨基酸取代是在相对 SEQ IDNO ： 159 的一个氨基酸位置上， 这些氨基酸取代选自下组， 其构成为 ： A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 以及 S70F ； 并且该多肽可任选地进一步包括取代 L104E， 其中该二聚体结 合 hCD80 和 / 或 hCD86， 和 / 或抑制一种免疫反应， 或它的一个互补的多核苷酸序列。以上 讨论了此类二聚体的功能特性的其他细节。
     本发明还提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸编码了本发明的任何融合蛋白， 包括本发明的任何多聚体融合蛋白 ( 例如， 二聚体、 四聚体、 等 )。在一个方面， 本发明提供 了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸序列， 该多核苷酸序列编码了一种融 合蛋白， 该融合蛋白包括 (a) 一种多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 80％、 85％、 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 99.5％、 或 100％的同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 以及 (b) 一种 Ig 多肽， 其中该融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和/或 具有阻抑一种免疫反应的能力， 或它的一个互补的多核苷酸序列。该 Ig 多肽可包括一种 Ig Fc 多肽， 包括例如， 一种 Ig Fc 多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自 下组的一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 184 至 186 以及 218。包括两个此类单体融合蛋白的一个二聚体融合蛋白典型 地是在细胞加工过程中通过产生共价二硫键而形成， 这些二硫键是在一个单体融合蛋白中 的半胱氨酸残基与该第二单体融合蛋白中的半胱氨酸残基之间产生。 其他多聚体可以类似 方式形成。以下讨论了此类融合蛋白的功能特性和特征的其他细节。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了包括两个单体融合蛋白 ( 例如， 单体突变 CTLA-4-Ig) 的一个 蛋白二聚体 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 二聚体 )， 每个单体融合蛋白包括 ： (a) 一种多肽 ( 例 如， 突变 CTLA-4ECD)， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多 肽序列至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 99.5％、 或 100％的 同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 以及 (b) 一种 Ig 多肽， 其中该融合蛋白二聚体 结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或具有抑制或限制一种免疫 反应的能力， 或它的一个互补的多核苷酸序列。这两个单体融合蛋白在表达时是经由至少 一个二硫键而连接在一起， 这些二硫键在每个单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白中存在的两个 半胱氨酸残基之间形成。该 Ig 多肽可包括一种 Ig Fc 多肽， 包括例如， 一种 Ig Fc 多肽， 该 多肽包括一个序列， 该序列具有与选自下组的一个序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的同一性， 该组的构成为 ： SEQ IDNOS ： 184 至 186 以及 218。在一些情形下， (a) 的 多肽的 C- 端共价连接到货融合到 (b) 的 Ig Fc 多肽的 N- 端上。以上讨论了此类二聚体的 功能特性和特征的其他细节。
     当将该序列被包括在表达载体中以表达感兴趣的蛋白时， 典型地会在每个核酸 序列的 C- 端包括一个终止密码子 ( 例如， tga)。例如， 编码一种突变 CTLA-4 多肽或突变 CTLA-4 融合蛋白的本发明的核苷酸序列中的任何可以可任选地进一步在其 C- 端包括终止 密码子， 如， TAA。可以将一种不同的终止密码子取代 TAA， 如， 一个 TGA 终止密码子。编码 了一种野生型融合蛋白 ( 例如， hCTLA-4-Ig、 hCD86-Ig、 等 ) 的核酸序列也可在其 C- 端包括 一个终止密码子。这些核苷酸序列中的每个可以可任选地进一步在其 N- 端包括一个编码 信号肽的核苷酸序列， 以协助一种突变 CTLA-4 多肽或融合蛋白的分泌。
     示例性的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体包括包含了在 SEQ IDNOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222 中所示的多肽序列的那些。编码了 SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 220。以及 222 的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的示例性核酸对应地在 SEQ ID NO ： 153 至 158、 201 至 204、 以及 223 至 224 中给出。SEQ ID NOS ： 205 至 210、 211 至 214、 219、 以及 221 的融合蛋白序列对应地与 SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 220、 以及 222 的 蛋白序列相同， 除外 SEQ ID NOS ： 205-210 的蛋白序列并不包括该 C- 端赖氨酸 (K) 残基 ； 如以上所解释， 据信该预测 C- 端赖氨酸残基 ( 它是由紧邻在每个这种多核苷酸序列的 TAA 终止密码子之前的 AAA 密码子编码 ) 在加工或分泌的过程中从该得到的融合蛋白中切割。SEQ ID NOS ： 153 至 158、 201 至 204、 以及 223 至 224 的核酸序列对应地编码 SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 220、 以及 222 的融合蛋白序列， 它们中的每个在切割 / 丧失该 C- 端 K 残基后， 对应地产生在 SEQ ID NOS ： 205 至 210、 211 至 214、 219、 以及 221 中所示的融合蛋 白序列。
     多核苷酸序列 SEQ ID NOS ： 153 至 158、 201 至 204、 以及 223 至 224 中的每个还在 其 N- 端包括编码了在 SEQ ID NO ： 181 或 215 中所示的信号肽的核苷酸序列， 该信号肽最终 从该成熟融合蛋白切割。多核苷酸序列 SEQ IDNOS ： 153 至 158、 201 至 204、 以及 223 至 224 中的每个的核苷酸残基 1 至 111， 当从每个这种多核苷酸序列的 N- 端开始计数时， ( 核苷酸 残基 1 至 111 示于 SEQ ID NO ： 215) 编码了在 SEQ ID NO ： 216 中所示的 37 个氨基酸残基 的 WT hCTLA-4 信号肽， 该信号肽最终在该成熟突变 CTLA-4 融合蛋白单体或二聚体表达时 受到切割 ； 因此， 就 SEQ ID NOS ： 153 至 158、 201 至 204、 以及 223 至 224 的核酸序列中的每 个而言， 编码该成熟 IgG2 融合蛋白的第一氨基酸残基 ( 甲硫氨酸 ) 的第一密码子是由所述 核苷酸序列的核苷酸残基 112 至 114 构成。如以上所指出， 在一些情形下， 该信号肽序列可 仅包括如在 SEQ ID NO ： 182 中所示的氨基酸残基 1 至 35， 而编码这种 35- 氨基酸残基信号 肽的核苷酸序列则示于 SEQ ID NO ： 181。然而， 对应地在位置 36 及 37 上的经编码赖氨酸 (K) 及丙氨酸 (A)( 由这两个密码子 AAA-GCC 编码 ) 并不存在于得到的成熟突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白中， 并且据信是在加工过程中从该成熟的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白中切割。该成 熟的突变 CTLA-4 蛋白序列典型地是以存在于该经编码突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的氨基酸 残基位置 38 上的甲硫氨酸残基起始。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了包括两个相同单体融合蛋白 ( 例如， 单体突变 CTLA-4-Ig) 的 一个融合蛋白二聚体 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 二聚体 )， 其中每个这种单体融合蛋白包括一 个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％ 或 100％的同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222， 其中该融合蛋白二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和/ 或具有抑制一种免疫反应的能力， 或它的一个互补的多核苷酸序列。还提供了一种分离或 重组的核酸， 该核酸编码了这种单体融合蛋白， 该融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或具有抑制一种免疫反应的能力。示例性的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体包含了包括在 SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 220、 以及 222 中所示的 多肽序列的那些 ； 编码了此类突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的示例性核酸 ( 它们被表达为突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 ) 包含了包括对应地在 SEQ ID NOS ： 153 至 158、 201 至 204、 以 及 223 至 224 中所示的多核苷酸序列。额外的示例性的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体包 括 SEQ IDNOS ： 205 至 210、 211 至 214、 219、 以及 222 的多肽序列， 这些多肽序列被表达为融 合蛋白二聚体 ； 这些融合蛋白缺乏 C- 端赖氨酸残基， 因为它典型地在加工过程中或分泌的 过程中受到切割。编码这些融合蛋白序列与该 C- 端赖氨酸 ( 该赖氨酸随后被切割 ) 的示 例性核酸对应地包括 SEQ ID NOS ： 153 至 158、 201 至 204、 以及 223 至 224 的多核苷酸序列。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了一种融合蛋白， 其中所述融合蛋白包括一个多肽序列， 该多肽 序列具有与选自下组的一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％的同一性，该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222， 其中该融合 蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或具有抑制一种免疫反 应的能力， 或它的一个互补的多核苷酸序列。
     在另一个方面， 本发明包括一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个核苷酸序列， 该核苷酸序列具有与选自下组的一个多核苷酸序列至少 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％或 100％的序列同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 153 至 158、 201 至 204、 以及 223 至 224， 其中这种核酸编码了一种突变 CTLA-4-Ig 蛋白二聚体， 该二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或具有抑制一种免疫反应的能力， 或它的一个互补的多 核苷酸序列。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了包括两个单体融合蛋白 ( 例如， 单体突变 CTLA-4-Ig) 的一个 融合蛋白二聚体 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 二聚体 )， 其中每个这种单体融合蛋白包括 ： (1) 一 种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4ECD)， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列与选自下组的一个 多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 并且其中 在该多肽序列中在氨基酸位置 41、 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 上的氨基酸残基是与在所 述所选择的多肽序列 ( 例如， 选自 SEQ IDNOS ： 1 至 73 的一种多肽 ) 的对应位置上的氨基酸 残基相同， 以及 (2) 一种 Ig Fc 多肽， 其中该二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86( 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或抑制一种免疫反应， 或它的一个互补的多核苷酸序列。以上讨论了此 类二聚体的功能特性和特征的其他细节。还提供了一种重组或分离的核酸， 该核酸包括一 个核苷酸序列， 该核苷酸序列编码了这种单体融合蛋白， 该单体融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或具有抑制一种免疫反应的能力。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个多核苷酸 序列， 该多核苷酸序列编码了包括两个单体融合蛋白 ( 例如， 两个单体突变 CTLA-4-Ig) 的 一个融合蛋白二聚体 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 二聚体 )， 其中每个这种单体融合蛋白包括 ： (1) 一种突变 CTLA-4 细胞外结构域多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与选 自下组的一个多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 该组的构成为 ： SEQ IDNOS ： 1至 73， 并且 (b) 包括至少一个氨基酸取代， 这些氨基酸取代是在对应于相对 SEQ ID NO ： 159 的 多肽序列的位置 50、 54、 55、 56、 64、 65、 70、 或 85 的一个氨基酸位置上 ； 以及 (2) 一种 Ig 多 肽， 其中该融合蛋白二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86( 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或抑 制一种免疫反应， 或它的一个互补的多核苷酸序列。以上讨论了此类二聚体的功能特性和 特征的其他细节。该 Ig 多肽可包括一种 Ig Fc 多肽， 包括例如， 一种 Ig Fc 多肽， 该多肽 包括一个序列， 该序列具有与选自下组的一个序列至少 90％、 91％、 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 184 至 186 以及 218。 一些这类 (a) 的多肽包括至少一个取代， 这些取代是在相对 SEQ ID NO ： 159 的一个氨基酸 位置上， 这些取代选自下组， 其构成为 ： A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 以及 S70F。一 些这类 (a) 的多肽可进一步包括相对 SEQ IDNO ： 159 的一个氨基酸取代， 该氨基酸取代是在 位置 104( 例如， L104E/D)、 位置 30( 例如， T30N/D/A) 和 / 或位置 32( 例如， V32I) 上。还提 供了一种重组或分离的核酸， 该核酸编码了这种单体融合蛋白， 该单体融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或具有抑制一种免疫反应的能力。在另一个方面， 本发明包括一种分离或重组的核酸， 该核酸编码了包括两个单体 融合蛋白 ( 例如， 单体突变 CTLA-4-Ig) 的一个融合蛋白二聚体 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 二 聚体 )， 其中每个这种单体融合蛋白包括 ： (1) 一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4ECD)， 该多肽包 括一个多肽序列， 该多肽序列 (i) 具有与选自下组的一个多肽序列至少 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 并且 (ii) 包括一个苯丙氨酸残基， 该苯丙氨酸残基是在对应于所述多肽序列的位置 70 的一个 氨基酸位置上， 该多肽序列选自下组， 其构成为 ： SEQ IDNOS ： 1 至 73， 以及 (2) 一种 Ig 多肽， 其中该融合蛋白二聚体结合 CD80 和 / 或 CD86( 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或具有 抑制一种免疫反应的能力， 或它的一个互补的多核苷酸序列。该经编码的 Ig 多肽可包括 一种 Ig Fc 多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的一个多肽序列 至少 92％、 93％、 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 184 至 186 以及 218。一些此类经编码的二聚体包括以下的相对 (1)(i) 的所述所 选择的多肽序列中的一个或多个 ： 在对应于位置 24 的一个位置上的一个 Glu 残基、 在对应 于位置 30 的一个位置上的一个 Asn 残基、 在对应于位置 32 的一个位置上的一个 Ile 残基、 在对应于位置 50 的一个位置上的一个 Met 残基、 在对应于位置 54 的一个位置上的一个 Lys 残基、 在对应于位置 55 的一个位置上的一个 Glu 残基、 在对应于位置 56 的一个位置上的一 个 Asp 残基、 在对应于位置 64 的一个位置上的一个 Pro 残基、 在对应于位置 65 的一个位 置上的一个 Ser 残基、 以及在对应于位置 104 的一个位置上的一个 Glu 残基。以上讨论了 此类二聚体的功能特性和特征的其他细节还提供了一种重组或分离的核酸， 该核酸包括一 个核苷酸序列， 该核苷酸序列编码了这种单体融合蛋白， 该单体融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或具有抑制一种免疫反应的能力。
     在另一个方面， 本发明包括一种分离或重组的核酸， 该核酸编码了包括两个单体 融合蛋白 ( 例如， 单体突变 CTLA-4-Ig) 的一个融合蛋白二聚体 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 二 聚体 )， 其中每个这种单体融合蛋白包括 ： (1) 一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4ECD)， 该多肽包 括一台多肽序列， 该多肽序列 (a) 与在 SEQ ID NO ： 159 中所示的人类 CTLA-4ECD 多肽的多 肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基的差异， 并且 (b) 包括至少一个氨基酸取代， 其中所述 至少一个氨基酸取代包括 S70F， 其中根据 SEQ ID NO ： 159 对氨基酸残基位置进行编号 ； 以 及 (2) 一种 IgG Fc 多肽， 其中所述二聚体结合 hCD80 和 / 或 hCD86( 和 / 或 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig)， 和 / 或抑制一种免疫反应， 或它的一个互补的多核苷酸序列。该 Ig Fc 多肽 可包括一个序列， 该序列具有与选自下组的一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％ 或 100％的同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 184 至 186 以及 218。该经编码的 (1) 的多 肽可进一步包括选自下组的至少一个氨基酸取代， 该组的构成为 ： A24E、 T30N、 V32I、 D41G、 A50M、 M54K、 G55E、 N56D、 S64P、 I65S、 M85A、 L104E、 以及 I106F。以上讨论了此类二聚体的 功能特性和特征的其他细节。还提供了一种重组或分离的核酸， 该核酸包括一个核苷酸序 列， 该核苷酸序列编码了这种单体融合蛋白， 该单体融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或具有抑制一种免疫反应的能力。
     在另一个方面， 本发明提供了一种分离或重组的核酸， 该核酸编码了包括两个单 体融合蛋白 ( 例如， 单体突变 CTLA-4-Ig) 的一个融合蛋白二聚体 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 二 聚体 )， 其中每个这种单体融合蛋白包括 ： (1) 一种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4ECD)， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列 (a) 与 SEQ ID NO ： 31 的多肽序列具有不超过 6 个氨基酸残基 的差异， 并且 (b) 包括以下中的至少一个 ： 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 50 的一个位置上 的一个甲硫氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 54 的一个位置上的一个赖氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 55 的一个位置上的一个谷氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 64 的一个位置上的一个脯氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 65 的一个 位置上的一个丝氨酸残基、 在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 70 的一个位置上的一个苯丙氨 酸残基， 其中根据 SEQ ID NO ： 31 对氨基酸残基位置进行编号 ； 以及 (2) 一种 Ig 多肽， 其中 该二聚体结合 hCD80 和 / 或 hCD86( 和 / 或 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig)， 和 / 或抑制一种免 疫反应， 或它的一个互补的多核苷酸序列。该 Ig 多肽可包括一种 Ig Fc 多肽， 包括例如， 一 种 Ig Fc 多肽， 该多肽包括一个序列， 该序列具有与选自下组的一个序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的同一性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 184 至 186 以及 218。在 一些此类二聚体或单体中， 该 (1) 的多肽包括在对应于 SEQ ID NO ： 31 的位置 104 的一个位 置上的一个谷氨酸残基、 在对应于位置 30 的一个位置上的一个天冬酰胺残基、 和 / 或在对 应于位置 32 的一个位置上的一个异亮氨酸残基。以上讨论了此类二聚体的功能特性和特 征的其他细节。 还提供了一种重组或分离的核酸， 该核酸包括一个核苷酸序列， 该核苷酸序 列编码了这种单体融合蛋白， 该单体融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86( 和 / 或 CD80-Ig 和 / 或 CD86-Ig)， 和 / 或具有抑制一种免疫反应的能力。
     本发明还包括的是以上说明的本发明的任何此类核酸的片段， 其中此类片段编码 了一种多肽， 该多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86、 和 / 或二者之一的或两者的一个 ECD， 和/ 或具有阻抑或抑制一种免疫反应的能力。多个这些核酸的片段将表达多肽， 这些多肽结合 hCD80 和 / 或 hCD86 或它的一个 ECD， 或阻抑一种免疫反应， 这些特性能够以合理的实验容 易进行识别。核苷酸片段典型地包括至少 250、 300、 400、 500、 600、 700、 800、 900、 950、 1000 个或以上的核苷酸碱基。
     本发明包括一种分离或重组的核酸， 该核酸编码了一种蛋白， 该蛋白包括本发明 的一种信号肽以及一种多肽 ( 它包括本发明的二聚体或单体融合蛋白 )， 如本发明的一种 突变 CTLA-4 ECD 多肽或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 它结合 CD80 和 / 或 CD86， 和 / 或在体 外或体内的测定和 / 或在本文的其他地方详细说明的方法中阻抑一种免疫反应。该经编码 的信号肽序列 ( 它指导该成熟多肽通过一个原核或真核细胞膜而分泌 ) 典型地是共价连接 到所述多肽的胺端上。 可使用不同的信号肽， 包括例如， 在 SEQ ID NO ： 182 中所示的信号肽 序列， 它是由例如在 SEQ ID NO ： 181 中所示的核苷酸序列编码的， 或在 SEQ ID NO ： 216 中 所示的信号肽序列编码的， 它是由例如在 SEQ ID NO ： 215 中所示的核苷酸序列编码的。本 发明还包括一种分离或重组的核酸， 该核酸编码了一种蛋白， 该蛋白包括一种信号肽、 突变 CTLA-4 ECD 多肽、 跨膜结构域、 和 / 或胞质域， 如以上所详细讨论。
     可使用该全长人类 CTLA-4 蛋白的信号肽序列以指导本发明的一种重组突变 CTLA-4 ECD 多肽或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的表达或分泌。在一个方面， 该 hCTLA-4 蛋 白的信号肽 (SP) 包括该 hCTLA-4 蛋白的氨基酸残基 1 至 37 ； 这种信号肽序列示于 SEQ ID NO ： 216。在此情形下， 该成熟 hCTLA-4 蛋白序列典型地是以在位置 38 上的甲硫氨酸残基起 始， 并且因此该成熟 hCTLA-4 蛋白的氨基酸残基是将此甲硫氨酸残基指定为该第一氨基酸 ( 即， 占据位置 1) 而开始编号的。因此， 可以将包括在 SEQ ID NO ： 216 中所示的多肽序列的一种信号肽融合到或连接到本发明的一种突变 CTLA-4 ECD 多肽或突变 CTLA-4-Ig 融合 蛋白的胺 (N) 端上， 如通过一个共价连接体， 以便对应地协助该突变 CTLA-4 ECD 多肽或突 变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的表达或分泌。包括编码了 SEQ ID NO ： 216 的 hCTLA-4 信号肽序列 的一种核苷酸序列的一种示例性核酸示于 SEQ ID NO ： 215。
     当 SEQ ID NO ： 216 的信号肽序列融合到本发明的一种突变 CTLA-4ECD 多肽或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的 N- 端上时， 在所述多肽或融合蛋白表达或分泌时， 该信号肽受到切 割； 该得到的成熟突变 CTLA-4 ECD 多肽或成熟突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白典型地是以在位置 38 上的甲硫氨酸残基起始， 并且因此该成熟突变 CTLA-4 ECD 多肽或成熟突变 CTLA-4-Ig 融 合蛋白的氨基酸残基是以此甲硫氨酸残基指定为该第一氨基酸 ( 即， 占据位置 1) 而开始编 号的。
     本发明包括一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一种信号肽 ( 例如， SEQ ID NO ： 216) 以及一种突变 CTLA-4 ECD 多肽 ( 例如， 选自 SEQ ID NOS ： 1 至 73 的组的一个序列 )， 其中该信号肽共价连接到该突变 CTLA-4 ECD 多肽的 N- 端上。还包括了一种分离或重组的 多肽， 该多肽包括一种信号肽 ( 例如， SEQ ID NO ： 216) 以及一种突变 CTLA-4-Ig( 例如， 选自 下组的一个序列， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222)， 其中该信号肽共价连接到该突变 CTLA-4-Ig 的 N- 端上。还提供了一种分离或重组的 核酸， 该核酸包括编码了一种信号肽 ( 例如， SEQ IDNO ： 216) 的核苷酸序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 215)， 以及编码了一种突变 CTLA-4ECD 多肽 ( 例如， 选自 SEQ ID NOS ： 1 至 73 的组的一 个序列 ) 或一种突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 例如， 选自下组的一个序列， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222) 的核苷酸序列。
     在另一个方面， 该全长 hCTLA-4 蛋白的信号肽包括该全长 hCTLA-4 蛋白的残基 1 至 35 ； 这种信号肽包括在 SEQ ID NO ： 182 中所示的肽序列。然而， 在此情形下， 该 hCTLA-4 蛋白对应地在位置 36 及 37 上的这两个氨基酸残基赖氨酸 (K) 及丙氨酸 (A) 典型地并不存 在于该成熟的分泌 hCTLA-4 蛋白中， 如通过蛋白测序所确定。因此， 该得到的成熟 hCTLA-4 蛋白是类似地以在位置 38 上的甲硫氨酸残基起始， 并且因此该成熟 hCTLA-4 蛋白的氨基酸 残基是以在该 hCTLA-4 蛋白的位置 38 上的此甲硫氨酸残基指定为该成熟 hCTLA-4 蛋白的 第一氨基酸而开始编号的。由于该全长 hCTLA-4 蛋白对应地在位置 36 及 37 上的氨基酸残 基赖氨酸 (K) 及丙氨酸 (A) 并不存在于该得到的成熟 hCTLA-4 蛋白中， 据信它们已经在加 工过程中从该成熟 hCTLA-4 蛋白中切割。包括编码了该 hCTLA-4 信号肽序列 (SEQ ID NO ： 182) 的一个核苷酸序列的一个示例性核酸示于 SEQ IDNO ： 181。
     可将包括在 SEQ ID NO ： 182 中所示的肽序列的一种信号肽融合到或连接到本发明 的一种突变 CTLA-4 ECD 多肽或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的 N- 端上， 如通过一个共价连接 体， 以便对应地协助该突变 CTLA-4 ECD 多肽或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的表达或分泌。当 SEQ ID NO ： 182 的信号肽序列融合到或连接到一种突变 CTLA-4 ECD 多肽或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的 N- 端上时， 在该多肽或融合蛋白表达或分泌时， 该信号肽受到切割 ； 然而， 该得 到的成熟突变 CTLA-4 ECD 多肽或成熟突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白典型地是以在位置 38 上的 甲硫氨酸残基起始， 并且因此该成熟突变 CTLA-4ECD 多肽或成熟突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 的氨基酸残基是将此甲硫氨酸残基指定为该第一氨基酸 ( 即， 占据位置 1) 而开始编号的。 由于该全长 hCTLA-4 蛋白对应地在位置 36 及 37 上的氨基酸残基赖氨酸 (K) 及丙氨酸 (A)并不存在于该得到的成熟突变 CTLA-4 ECD 多肽或成熟突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白中， 据信它 们已经在加工过程中从该突变 CTLA-4 ECD 多肽或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白中切割。
     本发明包括一种分离或重组的多肽， 该多肽包括一种信号肽 ( 例如， SEQ ID NO ： 182) 以及一种突变 CTLA-4 ECD 多肽 ( 例如， 选自 SEQ ID NOS ： 1 至 73 的组的一个序列 )， 其中该信号肽共价连接到该突变 CTLA-4 ECD 多肽的 N- 端上。还包括一种分离或重组的多 肽， 该多肽包括一种信号肽 ( 例如， SEQ ID NO ： 182) 以及一种突变 CTLA-4-Ig( 例如， 选自 下组的一个序列， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222)， 其中该信号肽共价连接到该突变 CTLA-4-Ig 的 N- 端上。还提供一种分离或重组的 核酸， 该核酸包括编码了一种信号肽 ( 例如， SEQ IDNO ： 182) 的核苷酸序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 181)， 以及编码了一种突变 CTLA-4ECD 多肽 ( 例如， 选自 SEQ ID NOS ： 1 至 73 的组的一 个序列 ) 或一种突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 例如， 选自下组的一个序列， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222) 的核苷酸序列。
     本发明的核酸可进一步包括一种或多种适当的额外的核苷酸序列。例如， 若本发 明的一种多肽 ( 它包括本发明的一种融合蛋白 ) 可包括一种或多种额外的多肽序列 ( 例 如， 一种多肽纯化亚序列 ( 例如， 选自一个表位标签、 一种 FLAG 标签、 一种聚组氨酸序列、 以 及 GST 融合物的亚序列 )、 信号肽序列、 等 )， 则本发明包括编码了此类额外序列的所有此类 多肽。以上讨论了示例性的信号肽， 它们在表达时典型地是共价连接到本发明的一种多肽 的 N- 端上。例如， 编码了 SEQ ID NOS ： 1 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222 中任 何一个的一种多肽序列的核酸可进一步包括编码了一种信号肽 ( 例如， SEQ ID NO ： 182 的 信号肽序列 ) 的核酸， 例如， 在 SEQ ID NO ： 181 中给出的核苷酸序列， 或在 SEQ ID NO ： 216 中给出的信号肽序列， 它是由例如在 SEQ ID NO ： 215 中所示的核苷酸序列编码的。此类核 苷酸序列可直接以适当的阅读框而融合在一起， 这样使得该得到的核酸包括编码了本发明 的一种信号肽的核苷酸序列以及编码了本发明的一种多肽的核苷酸序列。
     本发明的一种核酸能够以任何适当的技术分离， 这些技术中有几种是在本领域内 所已知的。本发明的一种分离的核酸 ( 例如， 在一种宿主细胞中制备并且随后以任何适当 的核酸纯化技术进行实质上纯化的核酸 ) 可再次引入一种宿主细胞中或再次引入一种细 胞的或其他生物学的环境或组合物中， 其中该核酸不再是主要的核酸种类， 并且不再与其 他核酸分离。
     可使用标准的技术将本发明的几乎任何分离或重组的核酸插入或融合到一个适 当的较大核酸分子 ( 包括例如但不限于 ： 一个染色体、 一个质粒、 一个表达载体或基因盒、 一个病毒基因组、 一个基因序列、 一个线性表达元件、 一个细菌基因组、 一个植物基因组、 或 一个人工染色体， 如， 一种哺乳动物人工染色体 (MAC)， 或它的酵母或细菌对应物 ( 即， YAC 或 BAC)) 上， 以形成一种重组核酸。作为另一个实例中， 一种分离的本发明核酸可融合到较 小的核苷酸序列 ( 如， 启动子序列、 免疫刺激序列、 和 / 或编码其他氨基酸的序列， 如， 其他 抗原表位和 / 或连接物序列 ) 上， 以形成一种重组核酸。
     在一些情形下， 一种重组或合成的核酸可通过应用于宿主细胞的背景之外的化学 合成技术而产生 ( 例如， 通过聚合酶链式反应 (PCR) 或化学合成技术而产生的核酸， 这种核 酸的实例在本文中进一步说明 )。
     编码了本发明的多肽 ( 包括融合蛋白 ) 的核酸可具有任何适当的化学组分， 该组分可容许本发明的一种多肽的表达或其他所希望的生物活性 ( 例如， 与其他核酸的杂交 )。 本发明的多核苷酸可处于 RNA 的形式或 DNA 的形式， 并且包括 mRNA、 cRNA、 重组或合成的 RNA 及 DNA、 以及 cDNA。本发明的核酸典型地是 DNA 分子， 并且通常是双股 DNA 分子。然而， 还提供了包括本发明的核苷酸序列中任何的单股 DNA、 单股 RNA、 双股 RNA、 以及杂交 DNA/ RNA 核酸或它们的组合。本发明的一种核酸可包括任何适当的核苷酸碱基、 碱基类似物、 和 / 或骨架 ( 例如， 通过 ( 或包括 ) 一种磷酸酯 ( 而不是磷酸二酯 ) 连接体所形成的骨架， 例 如， 包括一种磷酸酯或硫代磷酸酯骨架的 DNA)。本发明的一种核酸 ( 若是单股 ) 可以是该 编码股或该非编码 ( 即， 反义或互补 ) 股。除了编码本发明的一种多肽的核苷酸序列 ( 例 如， 包括一种突变 CTLA-4 ECD 多肽或突变 CTLA-4-Ig 的编码序列的核苷酸序列 ) 之外， 本 发明的多核苷酸序列尚可包括一种或多种额外的编码核苷酸序列， 以便编码例如， 一种融 合蛋白、 靶向序列 ( 而不是一种信号序列 ) 或类似物 ( 它的更为特定的实例在本文中进一 步讨论 )， 和 / 或可包括非编码核苷酸序列， 如内含子、 终止子序列、 或 5′和 / 或 3′未翻译 区域 ( 这些区域可有效用于该编码序列在适当宿主中的表达 )、 和 / 或对照元件， 如， 一种启 动子 ( 例如， 自然发生的或重组或穿梭 (shuffled) 的启动子 )。
     对一种核酸的修饰在编码了这种多肽的一个 mRNA 密码子序列的第三位置上是看 特别耐受的。 在特定方面中， 该核酸的至少一个部分包括一个硫代磷酸酯骨架， 该骨架取代 核酸序列中的自然发生的核苷酸或附加于其上而结合了至少一个合成核苷酸类似物。 此外 或可替代地， 该核酸可包括除了鸟嘌呤、 腺嘌呤、 尿嘧啶、 胸腺嘧啶、 以及胞嘧啶之外的碱基 添加。 此类修饰可以与较长的半衰期相关联， 并且因此在本发明的核酸载体中是希望的。 因 此， 在一个方面， 本发明提供了重组核酸和核酸载体 ( 例如以下进一步讨论 )， 这些核酸或 载体包括以上修饰中的至少一个， 或它的任何适当组合， 其中与无这种修饰或此类修饰的 一种实质上相同核酸相比， 该核酸在哺乳动物宿主体内持续较长。可纳入本发明的一个核 苷酸序列中的经修饰和 / 或非胞嘧啶、 非腺嘌呤、 非鸟嘌呤、 非胸腺嘧啶核苷酸的实例提供 于例如， the Manual of Patent Examining Procedure§2422(7th Revision-2000)。
     应当理解的是， 编码了本发明的这些多肽中至少一种 ( 它包括本发明的融合蛋 白 ) 的核酸 ( 包括在以上及本文其他地方所说明的那些 ) 并不限于直接编码用于本发明 的一种多肽的表达或产生的序列。例如， 该核酸可包括一个核苷酸序列， 该核苷酸序列可 通过内含肽氧的表达而造成本发明的一种多肽 ( 如说明于力如， Colson and Davis(1994) Mol.Microbiol.12(3) ： 959-63， Duan et al.(1997)Cell 89(4) ： 555-64， Perler(1998) Cell92(1) ： 1-4， Evans et al.(1999)Biopolymers 51(5) ： 333-42，及 de Grey， Trends Biotechnol.18(9) ： 394-99(2000))， 或一个核苷酸序列， 该核苷酸序列包括自体剪接的 内含子 ( 或其他自体剪接的 RNA 转录物 )， 它们形成一个中间体重组多肽编码序列 ( 如 说明于例如， 美国专利号 6,010,884)。The nucleic acid also or alternatively can comprise sequences which result inother splice modifications at the RNA level to produce an mRNA transcriptencoding the polypeptide and/or at the DNA level by way of trans-splicingmechanisms prior to transcription(principles related to such mechanisms aredescribed in， e.g.， Chabot， Trends Genet.(1996)12(11) ： 472-78， Cooper(1997)Am.J.Hum.Genet.61(2) ： 259-66， and Hertel et al.(1997)Curr. Opin.Cell.Biol.9(3) ： 350-57). 该核酸还能够包括或可替代地能够包括多个序列， 它们在 RNA 水平上和 / 或在通过转录之前的转移剪切机制在 DNA 水平上导致其他剪切修饰以 产生编码该多肽的 mRNA 转录物 ( 有关此类机制的原则说明于例如 Chabot， Trends Genet. (1996)12(11) ： 472-78， Cooper(1997)Am.J.Hum.Genet.61(2) ： 259-66， and Hertel et al.(1997)Curr.Opin.Cell.Biol.9(3) ： 350-57)。 由于遗传密码的固有简并性， 几种核酸可 编码本发明的任何特定多肽。 因此， 例如， 在本文中说明的特定核酸的中的任何可通过用基 于基因密码简并性的一个等效密码子 ( 就该密码子所代表的氨基酸而言 ) 取代一个或多个 密码子而进行修饰。 也可使用编码与本发明的一种多肽序列具有相同或一个功能等效序列 的多肽的其他核苷酸序列以合成、 克隆或表达这种多肽。
     总体上， 考虑到编码了本发明的一种多肽的以上说明核酸 ( 例如， 编码突变 CTLA-4 ECD 或突变 CTLA-4-Ig 的核酸 )， 使用在本文中所例示的技术对本发明的核酸中的 任何进行修饰以增加在特定宿主中的表达。 在本文中所说明的本发明的这些核酸中的任何 可经密码子最适化用于在特定宿主 ( 通常是人类 ) 中进行表达。用于密码子最适化的不 同技术是在本领域内所已知的。最常在特定宿主中使用的密码子被称为最适密码子， 并且 那些不常使用的被归类为罕见的或低使用密码子 ( 见， 如， Zhang， S.P.et al.(1991)Gene 105 ： 61-72)。 密码子可被取代以反映该宿主的偏好密码子使用， 这是一种被称为 “密码子最 适化” 或 “控制生物种密码子偏好” 的过程。包括特定原核或真核宿主的偏好密码子的最适 化密码子序列可用于增加翻译的速率， 或产生具有所希望特性的重组 RNA 转录物， 如与从 一个非最适化序列所产生的转录物相比较长的半衰期， 。用于产生密码子最适化序列的技 术是已知的 ( 见， 如， Murray， E.et al.(1989)Nuc.Acids Res.17 ： 477-508)。也可对翻译 终止密码子进行修饰以反映宿主偏好。例如， 酿酒酵母及哺乳动物的偏好终止密码子对应 地是 UAA 及 UGA。单子叶植物的偏好终止密码子是 UGA， 而昆虫及大肠杆菌偏好使用 UAA 作 为终止密码子 ( 见， 如， Dalphin， M.E.et al.(1996)Nuc.Acids Res.24 ： 216-218)。在其他 密码子背景中的密码子安排也可影响核酸序列的生物特性， 而诸位发明人也考虑了核酸修 饰以便为特定宿主提供一个常见的密码子背景安排。因此， 本发明的一个核酸序列可包括 一个密码子最适化核苷酸序列， 即， 针对一个特定物种的密码子频率最适化物和 / 或密码 子对 ( 即， 密码子背景 ) 最适化物 ( 例如， 该多肽可从针对人类中的表达而进行最适化的多 核苷酸序列表达， 该最适化是通过置换基于密码子频率 ( 或密码子背景 ) 的 “稀有” 人类密 码子进行的， 如通过使用诸如说明于 Buckingham et al.(1994)Biochimie 76(5) ： 351-54 及美国专利号 5,082,767、 5,786,464 及 6,114,148 中的那些的技术 )。
     本发明的核酸可通过切截或该序列的 C- 端部分的一个或多个残基而修饰。额外 地， 可将不同的中止或终止密码子包括在该核苷酸序列的末端， 如以下进一步讨论。
     可将本发明的一种或多种核酸包括于一个载体、 细胞或宿主环境中， 其中本发明 的一个编码核苷酸序列是一个异源基因。
     本发明的多核苷酸包括编码了本发明的任何多肽的多核苷酸序列 ( 或它的多肽 片段 )， 该多肽结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或阻抑一种免疫反应， 在最低严格条件下杂交到 在本文中所说明的一种或多种此类多核苷酸序列杂交上的多核苷酸， 与任何此类多核苷酸 序列互补的多核苷酸序列， 以及以上的所有的变体、 类似物、 或同源衍生物。一个编码序列 是指编码了一种特定多肽或所述多肽的一个结构域、 该多肽的亚序列、 区域、 或片段。一个 编码序列可编码一种突变 CTLA-4 多肽或它的片段， 它具有一种功能特性， 如结合 CD80 和 /或 CD86 的能力、 和 / 或阻抑或抑制一种免疫反应的能力。本发明的一种核酸可包括本发明 的一种突变 CTLA-4 多肽的对应编码序列， 以及它的变体、 类似物、 或同源衍生物。
     本发明的核酸也可见于与核酸的典型组合配制品的组合中， 包括载体、 缓冲剂、 佐 剂、 赋形剂、 稀释剂、 以及类似物的存在下， 如本领域中的普通技术人员所已知。
     除非另有指明， 在本文中所说明的一种特定核酸还暗示性地涵盖了它的经保守 修饰的变体 ( 例如， 简并密码子取代物 ) 及互补序列， 连同所明示的序列。确切地， 简并 密码子取代物可通过产生其中一个或多个所选 ( 或全部 ) 密码子的第三位置经混合碱基 和 / 或脱氧肌苷残基取代的序列而达到 (Batzer et al.(1991)Nucl.Acid Res.19 ： 5081 ； Ohtsuka et al.(1985)J.Biol.Chem.260 ： 2605-2608 ； Cassol et al.(1992) ； Rossolini et al.(1994)Mol.Cell.Probes 8 ： 91-98)。
     核酸的杂交
     如以上所指出， 本发明包括与本发明的一种靶核酸杂交的核酸， 例如， 选自下组的 一种多核苷酸， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 80 至 158、 201 至 204、 223、 以及 224， 或它的一 个互补的多核苷酸序列， 其中杂交是在基本上该靶核酸的整个长度上。该杂交性核酸可在 最低严格条件下或在最低限度的高严格条件下杂交到本发明的一个核苷酸序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 80) 上。核酸杂交实验的中严格、 严格、 以及高严格杂交条件是已知的。可以组合以 达到此类严格性水品的因素的实例简要地在本文中讨论。＜ 0}
     核酸当它们结合时 ( 典型地是在溶液中 ) 即 “杂交” 。核酸由于已经详细特征 的不同物理化学力 ( 如， 氢键键合、 溶剂排斥、 碱基堆积、 以及类似力 ) 而杂交。关于核酸 杂交的广泛指导可见于 P.Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicAcid Probes， vol.24， part I， chapter 2， “Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid probe assays， (Elsevier， NY)( 以下称为 “Tijssen” )， 连同 Ausubel， 以上说明文献， Hames and Higgins(1995)GeneProbes 1， IRL Press at Oxford University Press， Oxford， England(Hames andHiggins 1) 以及 Hames and Higgins(1995)Gene Probes 2， IRL Press at OxfordUniversity Press， Oxford， England(Hames and Higgins 2)， 提供了对于 DNA 及 RNA( 包括寡核苷酸 ) 的合成、 标记、 检测及定量的细节。
     两核酸序列实质上相同的指示是该两分子在最低严格条件下彼此杂交。短语 “特 异地杂交到” 是指一个分子在严格条件下仅可与一个特定核苷酸序列 ( 当该序列存在于一 种络合物混合物 ( 例如， 全细胞的 )DNA 或 RNA 中时 ) 结合、 双链化、 或杂交， 。 “实质上结 合” 是指在一种探针核酸与一个靶核酸之间的互补性杂交， 并且涵盖了少量的错配， 这些错 配可通过降低该杂交介质的严格性而适应， 以达到该靶多核苷酸序列的所希望的检测。
     在核酸杂交实验 ( 如， DNA 及 RNA 杂交 ) 背景中的 “严格杂交洗涤条件” 及 “严格 杂交条件” 是序列依赖的， 并且在不同的环境参数下是不同的。 关于核酸杂交的广泛指导可 见于 Tijssen(1993)， 以上说明文献， 以及 Hamesand Higgins 1 及 Hames and Higgins 2， 以上说明文献。
     总体上， 选择了高严格条件， 这样使得杂交在大约 5℃或低于该特定序列在指定离 子力及 pH 下的热熔点 (Tm) 下发生。Tm 是 50％的试验序列杂交稻一个完全配对的探针上的 温度 ( 在指定离子力及 pH 下 )。换言之， Tm 是指该核酸双链体在给定条件下进行 50％变性的温度， 并且它代表该核酸杂交物的稳定性的一种直接度量。 因此， Tm 对应于由螺旋转化为 随机卷曲的中点的温度 ； 它取决于长度、 核苷酸组成、 以及较长核苷酸段落的离子力。典型 地， 在 “严格条件” 下， 一个探针将与其靶亚序列杂交， 但不会与其他序列杂交。 “极度严格 条件” 是选择为针对一个特定探针的 Tm。
     DNA-DNA 双 链 体 的 T m 可 使 用 等 式 (1) 估 计 ： T m( ℃ ) ＝ 81.5℃ +16.6(log10M)+0.41(％ G+C)-0.72(％ f)-500/n， 其中 M 是这些单价阳离子 ( 通常 是 Na+) 的摩尔浓度， (％ G+C) 是鸟嘌呤核苷 (G) 与胞嘧啶 (C) 核苷酸的百分比， (％ f) 是 形式化的百分比， 并且 n 是该杂交物的核苷酸碱基的数目 ( 即， 长度 )。见， Rapley， R.and Walker， J.M.eds.， MolecularBiomethods Handbook(1998)， Humana Press， Inc.( 以下称为 Rapley andWalker)， Tijssen(1993)， 以上说明文献。RNA-DNA 双链体的 Tm 可使用等式 (2) 估计 ： Tm(℃ ) ＝ 79.8℃ +18.5(log10M)+0.58(％ G+C)-11.8(％ G+C)2-0.56(％ f)-820/n， 其 中 M 是这些单价阳离子 ( 通常是 Na+) 的摩尔浓度， (％ G+C) 是鸟嘌呤 (G) 与胞嘧啶 (C) 核 苷酸的百分比， (％ f) 是形式化的百分比， 并且 n 是该杂交物的核苷酸碱基的数目 ( 即， 长 度 )。同以上说明文献。以上说明的等式 1 及 2 典型地仅对于长度大于约 100 至 200 个核 苷酸的杂交双链体是准确的。同以上说明文献。长度短于 50 个核苷酸的核酸序列的 Tm 可 计算如下 ： Tm(℃ ) ＝ 4(G+C)+2(A+T)， 其中 A( 腺嘌呤 )、 C、 T( 胸腺嘧啶 ) 及 G 是对应的核 苷酸的数目。
     典型地， 在进行杂交分析时， 未杂交的核酸材料通过一系列的洗涤而被去除， 其严 格度可根据所希望的结果而调整。低严格度洗涤条件 ( 例如， 使用较高的盐度及较低的温 度 ) 增加灵敏性， 但可产生非特异的杂交信号及高背景信号。高严格度条件 ( 例如， 使用较 低的盐度及较接近杂交温度的较高温度 ) 降低了背景信号， 典型地仅保留该特异信号。有 关此类杂交技术的额外有用指导提供于例如， Rapley and Walker， 以上说明文献 ( 确切地， 有关此类杂交实验， part I， chapter 2， “Overview of principles ofhybridization and the strategy of nucleic acid probe assays” )， Elsevier， NewYork， 以及 Ausubel， 以 上说明文献， Sambrook， 以上说明文献， Watson， 以上说明文献， Hames and Higgins(1995) Gene Probes 1， IRL Press at OxfordUniv.Press， Oxford， England， 及 Hames and Higgins(1995)Gene Probes 2， IRL Press， Oxford Univ.Press， Oxford， England。
     用于分析包括至少两个核酸 ( 至少 100 个核苷酸 ) 的示例性严格 ( 或普通严格 ) 条件包括 ： 在包括 50％福尔马林 ( 或甲酰胺 ) 及 1 毫克 (mg) 肝素的溶液中或在 DNA 或 RNA 印迹中的滤膜上在 42℃下进行孵育， 其中该杂交过夜进行。一种普通严格度洗涤可使用例 如， 包括 0.2x SSC 的溶液在大约 65℃下大约 15 分钟而执行 ( 关于 SSC 缓冲液的说明， 见 Sambrook， 以上说明文献 )。通常， 在普通严格度洗涤之前会先进行一种低严格度洗涤， 以 去除背景探针信号。一种低严格度洗涤可例如， 在包括 2x SSC 的溶液中在大约 40℃下大 约 15 分钟而执行。一种高严格度洗涤可使用例如， 包括 0.15M NaCl 的溶液在大约 72℃下 大约 15 分钟而执行。用于例如， 超过 100 个核苷酸的双链体的一种示例性中 ( 普通 ) 严格 度洗涤 ( 严格度低于以上说明的普通严格度洗涤 ) 可在包括 1x SSC 的溶液中在大约 45℃ 下大约 15 分钟而执行。用于例如， 超过 100 个核苷酸的双链体的一种低严格度洗涤实例是 在包括 4-6x SSC 的溶液中在 40℃下 15 分钟而执行。对于短探针而言 ( 例如， 大约 10-50 + 个核苷酸 )， 严格条件典型地涉及小于约 1.0MNa 离子的盐浓度， 典型地是在 pH 7.0 至 8.3下大约 0.01 至 1.0M Na+ 离子浓度 ( 或其他盐类 )， 并且该温度典型地是小于约 30℃。严 格条件也可通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂而达到。
     示例性的中度严格条件包含在包括 20％福尔马林 ( 或甲酰胺 )、 0.5xSSC、 50mM 磷 酸钠 (pH 7.6)、 5x 丹哈德溶液 (Denhardt′ s solution)、 10％硫酸右旋糖酐、 以及 20mg/ ml 变性剪切鲑鱼精子 DNA 的溶液中， 于 37 ℃下过夜孵育， 之后跟随在 1x SSC 中在大约 37-50℃下洗涤这些滤膜， 或实质上类似的条件， 例如， 说明于 Sambrook， 以上说明文献， 和 / 或 Ausubel， 以上说明文献的中度严格条件。
     高严格度条件是使用了以下各项的条件 ： 例如， (1) 低离子力及高温度进行洗涤， 如， 0.015M 氯化钠 /0.0015M 柠檬酸钠 /0.1％十二烷基硫酸钠 (SDS)， 于 50℃下， (2) 在杂 交过程中采用一种变性剂， 如， 甲酰胺， 例如， 50％ ( 体积 / 体积 ) 甲酰胺与 0.1％牛血清白 蛋白 (BSA)/0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)/50mM 磷酸钠缓冲液 (pH 6.5)， 以 及 750mM 氯化钠， 75mM 柠檬酸钠， 于 42℃下， 或 (3) 采用 50％甲酰胺， 5x SSC(0.75M NaCl， 0.075M 柠檬酸钠 )， 50mM 磷酸钠 (pH 6.8)， 0.1％焦磷酸钠， 5x 丹哈德溶液， 经超音处理的鲑 鱼精子 DNA(50μg/ml)， 0.1％ SDS， 以及 10％硫酸右旋糖酐， 于 42℃下， 并且在 (i)42℃下于 0.2x SSC 中， (ii) 在 55℃下于 50％甲酰胺中， 以及 (iii) 在 55℃下于 0.1x SSC 中 ( 优选 结合 EDTA) 进行洗涤。
     总体上， 在特定的杂交测定中与针对一种非相关探针所观察到的相比， 2x 或 2.5x-5x( 或较高 ) 的信号对噪声比指出检测到一种特异性杂交。在本发明的背景中， 在两 个序列之间的最低严格杂交的检测指出与例如本发明的核酸的相对较强的结构相似性或 同源性。
     如所指出， “高严格” 条件是经选择为大约 5℃或低于该特定序列在指定离子力及 pH 下的热熔点 (Tm)。与所感兴趣的核苷酸序列 ( 例如， 探针 ) 密切相关或相同的靶序列可 在高严格条件下识别。较低严格度的条件则适用于互补性较低的序列。见， 如， Rapley and Walker ； Sambrook， 皆为以上说明文献。
     可使用竞争性杂交以识别本发明的核酸， 并且此竞争性杂交是区别本发明的核酸 的一种优选方法。在本发明的背景中， 在两个核苷酸序列之间的高严格杂交的检测可指出 与例如， 在本文的序列表中所提供的核酸的强结构相似性 / 同源性。在两个核苷酸序列之 间的高严格杂交证明了结构、 核苷酸碱基组成、 排列或规则的相似性或同源性的一种程度， 该程度大于通过严格杂交条件所检测到的。确切地， 在本发明的背景中， 高严格杂交相互 作用的检测可指出与例如， 在本文的序列表中所提供的核酸的强结构相似性或结构同源性 ( 例如， 核苷酸结构、 碱基组成、 排列或规则 )。例如， 希望的是识别出在严格条件下与在本 文中的示例的核酸进行杂交的试验核酸。
     因此， 严格杂交的度量之一即是在高严格条件下 ( 或极度严格条件， 或超高严格 杂交条件， 或超 - 超高严格杂交条件 ) 与本发明的核酸 ( 例如， 一种核酸， 该核酸包括选自 下组的一个多核苷酸序列， 该组的构成为 ： SEQID NOS ： 80 至 158、 201 至 204、 223、 以及 224， 或它的一个互补的多核苷酸序列的核酸 ) 进行杂交的能力。可由经验容易地确定任何试验 核酸的严格杂交 ( 包括例如， 高严格、 超高严格或超 - 超高严格杂交条件 ) 及洗涤条件。
     例如， 在确定高严格杂交其洗涤条件时， 可逐渐增加该杂交及洗涤条件 ( 例如， 在 该杂交或洗涤中通过增加温度、 降低盐浓度、 增加洗涤剂浓度和 / 或增加有机溶剂 ( 如， 福尔马林 ) 的浓度 )， 直到满足一个所选的指标组。 例如， 可逐渐增加该杂交及洗涤条件， 直到 一种探针 ( 包括选自下组的一种或多种核酸序列， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 80 至 158、 201 至 204、 223、 以及 224， 以及它的一个互补的多核苷酸序列 ) 结合到一个完全配对互补 靶上 ( 同样， 一个核酸， 该核酸包括选自下组的至少一种核酸序列， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 80 至 158、 201 至 204、 223、 以及 224， 或它的一个互补的多核苷酸序列的核酸 )， 其信号 对噪声比是该探针与一种非配对靶的杂交所观察到的至少 2.5x 高， 并且最佳为 5x 或更高。 该未匹配的靶可以包括一种核酸， 该核酸对应于例如， 一种编码 CTLA-4 多肽的核酸序列。
     通常地， 杂交分析是在经选择的杂交条件下进行， 这样使得包括一种核酸 ( 包括 一个披露的参比 ( 或已知 ) 核苷酸序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 80) 完全互补的序列 ) 杂交到 该重组抗原编码序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 80 核酸序列的核苷酸序列变体 ) 上， 其信号对噪 声比与在该完全互补核酸与一种核酸 ( 包括与该参比核酸至少约 80 或 90％相同的核苷酸 序列 ) 的杂交中所观察到的相比高出至少约 5、 7 或 10 倍。此类条件可被认为是特异性杂 交的指标。
     可调整以上说明的杂交条件， 或所选择的可替代的杂交条件， 以达到在选择一个 杂交核酸序列时的任何所希望的严格水平。例如， 可逐渐增加以上说明的高严格杂交及洗 涤条件 ( 例如， 在该杂交或洗涤中， 通过增加温度、 降低盐浓度、 增加洗涤剂浓度和 / 或增加 有机溶剂 ( 如， 福尔马林 ) 的浓度 )， 直到满足一个所选择的指标组。 例如， 可逐渐增加该杂 交及洗涤条件， 直到一个所希望的探针结合到一个配对的互补靶上， 其信号对噪声比为与 从该探针和非本发明的一种核酸 ( 如， 编码了 WT CTLA-4 ECD 多肽的核酸 ) 的杂交中所观 察到的信号对噪声比相比高出至少约 2.5x， 并且可任选地为至少约 5x( 例如， 大约 10x、 大 约 20x、 大约 50x、 大约 100x 或甚至大约 500x)。
     制备并修饰核酸
     本发明的核酸可通过应用任何适当的合成、 操纵、 和 / 或分离技术或他们的组合 而获得和 / 或产生。以下对示例性的操作进行说明。例如， 本发明的多核苷酸典型地是通 过标准的核酸合成技术 ( 如， 在本领域内已知的固相合成技术 ) 而产生的。在此类技术中， 通常逐个地合成达到大约 100 个碱基的片段， 接着将它们结合 ( 例如， 功过酶促或化学接 合方法， 或聚合酶介导的重组方法 ) 以实质上形成任何所希望的连续的核酸序列。本发明 的核酸的合成也可通过化学合成而协助 ( 或可替代地实现 )， 这是使用例如， 经典的亚磷酸 酰胺法 ( 它说明于例如， Beaucage et al.(1981)TetrahedronLetters 22 ： 1859-69， 或由 Matthes et al.(1984)EMBO J.3 ： 801-05 中 )， 例如， 如同以自动化的合成法典型地实施。 本发明的核酸也可通过使用自动化 DNA 合成仪而产生。用于合成核酸的其他技术及相关 原则说明于例如， Itakura et al.， Annu.Rev.Biochem.53 ： 323(1984)， Itakura et al.， Science198 ： 1056(1984)， 及 Ike et al.， Nucl.Acid Res.11 ： 477(1983)。
     便利地， 定做的核酸可以从不同的商业来源订购， 如， The MidlandCertified Reagent Company(mcrc@oligos.com)、 the Great American GeneCompany( 万 维 网 网 站 genco.com)、 ExpressGen Inc.( 万维网网站 expressgen.com)、 Operon Technologies Inc. (Alameda， CA)。类似地， 定做的肽类和抗体可经常订购自不同来源中的任何一个， 例如， PeptidoGenic(pkim@ccnet.com)、 HTI Bio-products， Inc.( 万维网网站 htibio.com)、 以及 BMA Biomedicals Ltd.(U.K.)、 Bio.Synthesis， Inc.。某些本发明的核苷酸还可通过使用可杂交或 PCR- 扩增编码本发明多肽的多核苷 酸的探针筛选 cDNA 库而获得。筛选并分离 cDNA 克隆的操作以及 PCR 扩增的操作是本领 域的普通技术人员所熟知的 ； 示例的操作说明于以下 ( 见， 如， 说明于以下实例的操作 )。 此类技术说明于例如， Bergerand Kimmel， “Guide to Molecular Cloning Techniques” ， Methods in Enzymol.Vol.152， Acad.Press， Inc.， San Diego， CA(“Berger” )； Sambrook， 以上说明文献 ； 及 Ausubel， 以上说明文献。本发明的一些核酸可通过改变一种自然发生的 骨架而获得， 例如通过诱变、 体外重组 ( 例如， 穿梭 (shuffling))、 或寡核苷酸重组。 在其他 情形下， 此类多核苷酸可在计算机芯片中， 或通过寡多核苷酸重组方法而制备， 如说明于在 本文中所引述的参考文献中。
     用于修饰核酸的重组 DNA 技术是在本领域内所熟知的 ( 例如， 限制核酸内切酶消 化、 接合、 逆转录以及 cDNA 产生、 以及 PCR)。 可用的重组 DNA 技术性技术及与其相关的原则 提供于例如， Mulligan(1993)Science260 ： 926-932， Friedman(1991)Therapy For Genetic Diseases， OxfordUniversity Press， Ibanez et al.(1991)EMBO J.10 ： 2105-10， Ibanez et al.(1992)Cell 69 ： 329-41(1992)， 以及美国专利号 4,440,859、 4,530,901、 4,582,800、 4,677,063、 4,678,751、 4,704,362、 4,710,463、 4,757,006、 4,766,075 及 4,810,648， 并 且更确切地说明于 Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning ： A LaboratoryManual， Cold Spring Harbor Press， 及其第三版 (2001)， Ausubel et al.(1994-1999)， Current Protocols in Molecular Biology， Wiley IntersciencePublishers( 一些版本是 Greene Publishing Associates)， Berger， 以上说明文献， 及 Watson， 以上说明文献。
     经修饰的编码序列
     在适当时， 可对本发明的核酸进行修饰以便通过考虑到密码子使用和 / 或密码子 背景的序列修饰而增加或增进在一种特定宿主中的表达， 条件是该核酸表达所在的这种 或这些特定宿主是所希望的。最常用在特定宿主中的密码子称为最适密码子， 并且那些 不常使用的被归类为罕见或低使用密码子 ( 见， 如， Zhang， S.P.et al.(1991)Gene 105 ： 61-72)。密码子可被取代以反映该宿主的偏好密码子使用， 这是一种被称为 “密码子最适 化” 或 “控制物种密码子偏好” 的过程。
     包括特定原核或真核宿主的偏好密码子的最适化编码序列可用于增加翻译的速， 或产生具有所希望特性的重组 RNA 转录物， 如与从一种非最适化的序列所产生的转录物 相比较长的半衰期， 。用于产生密码子最适化序列的技术是已知的 ( 见， 如， Murray， E.et al.(1989)Nuc.Acids Res.17 ： 477-508)。也可对翻译终止密码子进行修饰以反映宿主偏 好。例如， 酿酒酵母及哺乳动物的偏好终止密码子对应地是 UAA 及 UGA。单子叶植物的偏 好终止密码子是 UGA， 而昆虫及大肠杆菌偏好使用 UAA 作为终止密码子 ( 对于讨论， 如， Dalphin， M.E.et al.(1996)Nuc.Acids Res.24 ： 216-218)。在其他密码子背景中的密码 子安排也可影响核酸序列的生物特性， 并且诸位发明人还考虑了核酸修饰以便提供特定宿 主所常用的密码子背景安排。因此， 本发明的一个核酸序列可包括一个密码子最适化核苷 酸序列， 即， 针对特定物种的密码子频率最适化物和 / 或密码子对 ( 即， 密码子背景 ) 最适 化物 ( 例如， 该多肽可从针对在人类中的表达而进行最适化的多核苷酸序列中表达， 该最 适化是通过置换基于密码子频率 ( 或密码子背景 ) 的 “稀有” 人类密码子， 如通过使用诸 如说明于 Buckingham et al.(1994)Biochimie76(5) ： 351-54 及美国专利号 5,082,767、5,786,464 及 6,114,148 中的那些的技术。例如， 本发明提供了一种核酸， 该核酸包括 SEQ ID NO ： 80 的一个核苷酸序列变体， 其中该核苷酸序列变体与 SEQ ID NO ： 80 的核苷酸序列 的差异在于用在该宿主中经常表达的密码子取代对于特定宿主的 “罕见” 密码子， 这些密码 子编码了与 SEQ ID NO ： 80 中的经取代 “罕见” 密码子相同的氨基酸残基。
     载体、 载体组分、 及表达系统
     本发明还包括重组构建体， 它们包括本发明的一种或多种核酸， 如以上广泛说明。 此类构建体可包括一种载体， 如， 一种质粒、 一种黏粒 (cosmid)、 一种噬菌体、 一种病毒、 一 种病毒颗粒、 一种病毒样颗粒、 一种细菌人工染色体 (BAC)、 一种酵母人工染色体 (YAC)、 或 类似物， 或一种非复制性的载体， 如， 脂质体、 裸或偶联的 DNA、 DNA- 微颗粒， 其中已经以正 向或逆向插入本发明的至少一种核酸序列， 它可为排列。在这个实施方案的一个特定方面 中， 该构建体进一步包括一种或多种调节序列， 包括例如， 一个启动子， 可操作地连接到本 发明的一个核酸序列 ( 例如， 编码了一种分离或重组的突变 CTLA-4ECD 多肽或二聚体或单 体突变 CTLA-4-Ig 的核酸 ) 上。大量的适当载体及启动子皆为本领域中的普通技术人员所 已知的并且可商购。 在一些情形下， 一种载体， 例如， 一种病毒或病毒样颗粒， 也可包括或可 替代地包括本发明的一种或多种多肽， 例如， 纳入该病毒或病毒样颗粒的包被中。 载体可用 作递送剂， 用于将外源基因或蛋白递送或给予一个受试者。本发明的载体 ( 包括在本文中 所说明的那些 ) 可用作递送剂， 用于递送或给予本发明的核酸和 / 或多肽。
     说明了在本文中使用的分子生物学技术 ( 包括载体、 启动子的使用 )， 以及诸多 其他相关主题的一般性文献包括 Berger， 以上说明文献， Sambrook(1989)， 以上说明文献， 及 Ausubel， 以上说明文献。足以指导本领域中的普通技术人员进行体外扩增的技术实 例， 包括聚合酶链式反应 (PCR)、 接合酶链式反应 (LCR)、 Q- 复制酶扩增以及其他 RNA 聚合 酶介导的技术 ( 例如， NASBA)， 例如， 用于产生本发明的同源核酸， 见于 Berger、 Sambrook 及 Ausubel， 皆为以上说明文献， 以及 Mullis et al.(1987) 美国专利号 4,683,202 ； PCR Protocols ： A Guide to Methods and Applications(Innis etal.， eds.)Academic Press Inc.San Diego， CA(1990)(“Innis” )； Arnheim&Levinson(October 1， 1990)C&EN 36-47 ； The Journal Of NIH Research(1991)3 ： 81-94 ； (Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86 ： 1173-1177 ； Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 ： 1874-1878 ； Lomeli et al.(1989)J.Clin.Chem.35 ： 1826-1831 ； Landegren et al.(1988)Science241 ： 1077-1080 ； Van Brunt(1990)Biotechnology 8 ： 291-294 ； Wu and Wallace(1989)Gene 4 ： 560-569 ； Barringer et al.(1990)Gene 89 ： 117-122， 及 Sooknanan and Malek(1995) Biotechnology 13 ： 563-564。
     PCR 总体上是指其中通过本领域内所熟知的方法来扩增微量的一个特定核酸片段 ( 例如， RNA 或 DNA) 的操作 ( 见， 如， 美国专利号 4,683,195 以及以上所引述的其他参考文 献 )。 总体上， 使用了从该感兴趣的区域的末端或以外的序列信息来设计寡核苷酸引物。 此 类引物在序列上将会与有待扩增的模板的股相同或相似的。这些相对股的 5′端核苷酸可 与该经扩增材料的末端重合。PCR 可用于扩增特异的 RNA 或特异的 DNA 序列、 重组 DNA 或 RNA 序列、 来自总体基因组 DNA 的 DNA 及 RNA 序列、 以及转录自总体细胞 RNA 的 cDNA、 噬菌 体或质粒序列、 等。PCR 是包括使用另一种 ( 例如， 已知 ) 核酸作为引物而用于扩增一个核 酸试验样本的核酸聚合酶链式反应法的一个实例， 但并非唯一的实例。克隆体外扩增核酸的改进方法说明于 Wallace et al.， 美国专利号 5,426,039。通过 PCR 扩增的大核酸的改 进方法概述于 Cheng et al.(1994)Nature 369 ： 684685 及其中所引述的参考文献， 其中可 产生达到 40 千碱基 (kb) 的 PCR 扩增子。本领域的普通技术人员应当理解， 可使用逆转录 酶以及一种聚合酶， 实质上将任何 RNA 转化成为适合进行限制消化、 PCR 扩增、 以及测序的 双股 DNA。见， Ausubel、 Sambrook 及 Berger， 皆为以上说明文献。
     可将本发明的核酸纳入不同载体中的任何一个 ( 例如， 表达载体 ) 中， 用于表达一 种多肽， 包括例如， 本发明的一种多肽。可使用可与原核宿主细胞相容的表达载体 ； 此类原 核表达载体是本领域内所已知的并可商购。此类载体包括但不限于例如， BLUESCRIPT 载体 (Stratagene)， T7 表达载体 (Invitrogen)， pET 载体 (Novagen)， 以及类似的原核载体。
     可替代地使用可与真核宿主细胞相容的表达载体 ； 此类真核表达载体是本领域内 所已知的并可商购。此类载体包括但不限于例如， pCMV 载体 ( 例如， Invitrogen)， pIRES 载体 (Clontech)， pSG5 载体 (Stratagene)， pCDNA3.1(Invitrogen Life Technologies)， pCDNA3(Invitrogen LifeTechnologies)， 遍在染色质开放元件 (Ubiquitous Chromatin TM OpeningElement)(UCOE ) 表达载体 (Millipore)， 以及类似的真核表达载体。该 UCOETM 载 体典型地是在哺乳动物细胞 ( 例如， CHO 细胞 ) 中用于蛋白产生。根据 Millipore， UCOETM 表达技术可阻碍转基因沉默， 并且提供稳定的高水平的基因表达， 而不考虑染色体整合的 位置。见万维网网站 millipore.com 的 Millipore 网站。其中可例如， 纳入本发明的核酸 的一种示例性 UCOE 表达载体是被称为 CET1019AS-puro-SceI 的 UCOE 表达载体， 它可由 Millipore 的授权获得。 有关 UCOE 表达载体 CET1019AS-puro-SceI 的信息可见于例如， John TM Wynne， “UCOE Technology Maximizes ProteinExpression” ， BioProcess International 4(7) ： 104-105(July/August 2006)(RP1725EN00)( 可 在 万 维 网 网 站 millipore.com/ bibliography/tech1/rp1725en00 获得 ) ； 有关此载体以及由 Millipore 授权此载体的 e 额 外信息可见于 Millipore 网站， 包括例如， 万维网网站 millipore.com/company/cp3/ucoe_ licensing 及 millipore.com/techpublications/tech1/ps1013en00。因此， 例如， 可将融 合到编码了一种 IgG2 Fc 多肽的 DNA 序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 184) 上的编码突变 CTLA-4 ECD 的 DNA 序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 36 或 SEQ ID NO ： 50)( 造成 SEQ ID NO ： 201 的 DNA 序 列 ) 插入 UCOE CET1019AS 载体 (Millipore)， 并将该得到的 DNA 质粒用于转染宿主细胞。
     表达载体包括染色体、 非染色体、 以及合成的 DNA 序列， 例如， SV40 的衍生物， 细 菌载体 ( 例如， 伤寒沙门氏菌 (S.typhimurium)、 伤寒沙门氏菌 (S.typhi)、 弗氏志贺氏 菌 (S.flexneri)、 单核细胞增生性李斯特菌 (Listeria monocytogenes)、 炭疽芽胞杆菌 (B.anthracis)) ； 质粒 ； 细菌质粒 ； 噬菌体 DNA ； 杆状病毒 ； 酵母质粒 ； 衍生自质粒以及噬菌 体 DNA 的组合的载体 ； 病毒 DNA 或 RNA 载体， 包括例如， 痘疮病毒、 腺相关病毒 (AAV)、 腺病 毒、 Semliki-Forest 病毒 ( 例如， Notka et al..Biol.Chem.380 ： 341-52(1999))、 痘病毒 ( 例如， MVA)、 α 病毒 ( 如， 委内瑞拉马脑炎病毒 (VEE)、 西部马脑炎病毒 (WEE)、 东部马脑炎 病毒 (EEE))、 水泡性口炎病毒 (VSV)、 禽痘病毒、 假性狂犬病病毒、 单纯疱疹病毒、 逆转录病 毒， 以及诸多其他的。可使用将基因材料转导至细胞中， 并 ( 如果希望进行复制 ) 是可复制 且可在相关宿主中存活的任何载体。充当递送运载体的病毒及细菌载体可经减毒 ； 减毒应 足以降低 ( 若非消除 ) 不希望的疾病症状的诱导。图 1 是编码了本发明的突变 CTLA-4-Ig 的一种示例的质粒表达载体 pCDNA 突变 CTLA-4-Ig 的示意图。有关适当表达载体的其他细节提供于以下， 包括在实例之中。
     包括如在本文中所说明的本发明的一个核酸序列、 连同一个适当的启动子或控制 序列的本发明载体可用于转化适当的宿主， 以容许该宿主表达该蛋白。适当表达宿主的实 例包括 ： 细菌细胞， 如， 大肠杆菌、 链霉菌属、 以及鼠伤寒沙门菌 ； 真菌细胞， 如， 酿酒酵母、 巴斯德毕赤酵母以及粗糙脉孢菌 ； 昆虫细胞， 如， 果蝇及草地贪夜蛾 ； 哺乳动物细胞， 如， 中 国仓鼠卵巢细胞 (CHO)( 例如， CHO-K1)、 COS( 例如， COS-1， COS-7)、 幼仓鼠肾细胞 (BHK) 及 人类胚胎肾细胞 (HEK)( 例如， HEK 293)、 Bowes 黑色素瘤细胞， 以及植物细胞。应当理解的 是， 不是所有细胞或细胞系都需要能够产生本发明的全功能肽或它们的片段。本发明不限 于所采用的这些宿主细胞。有关适当宿主细胞的其他细节提供于以下。
     在细菌系统中， 可选择多种表达载体， 这取决于所感兴趣的多肽或它的片段的预 期用途。例如， 在需要大量的特定多肽或其片段用于诱导抗体时， 指导高水平表达的容易 纯化的融合蛋白表达的载体可以是希望的。此类载体包括但不限于， 多功能性大肠杆菌 克隆以及表达载体， 如， BLUESCRIPT(Stratagene)， 其中所感兴趣的核苷酸编码序列 ( 例 如， 编码了一种重组突变 CTLA-Ig 的核苷酸序列 ) 可以接合到符合 β 半乳糖苷酶的胺 端 Met 以及随后的 7 个残基的阅读框的载体中， 这样产生了一种杂交蛋白 ； pIN 载体 (Van Heeke&Schuster(1989)J.Biol.Chem.264 ： 5503-5509) ； pET 载体 (Novagen， Madison WI) ； 以及类似物。
     类似地， 在酵母酿酒酵母中， 可将包括组成性或诱导性启动子 ( 如， α 因子、 醇氧 化酶、 以及 PGH) 的多种载体用于生产本发明的多肽。对于综述， 见， Ausubel， 以上说明文 献， Berger， 以上说明文献， 及 Grant et al.(1987)Meth.Enzymol.153 ： 516-544。
     在哺乳动物宿主细胞中， 可使用多种表达系统， 如， 基于病毒的系统。就其中使用 一种腺病毒作为表达载体的情形中， 可任选地将一个编码序列接合到由后期启动子及三联 引导子所构成的腺病毒转录 / 翻译络合物中。插入到该病毒基因组的一个非实质性 E1 或 E3 区域中的结果导致了一种可存活的病毒， 它可以在经感染的宿主细胞中表达所感兴趣的 多肽 (Logan andShenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 ： 3655-3659)。此外， 转录增强 子 ( 如劳氏肉瘤病毒 (RSV) 增强子 ) 可用来增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
     一种载体 ( 例如， 本发明的表达载体、 或多核苷酸 ) 可包括一个或多个表达控制序 列。 一个表达控制序列典型地接合到和 / 或可操作地连接到本发明的一个核酸序列 ( 如， 一 种核酸， 该核酸编码了一种重组突变 CTLA-4ECD 多肽或重组突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) 上。 一个表达控制序列典型地是一个核苷酸序列， 它启动、 增强、 或控制另一个核苷酸序列的表 达 ( 典型地是转录 )。可采用的适当表达控制序列包括一个启动子 ( 包括一个组成性启动 子、 诱导性启动子、 和 / 或阻抑性启动子 )、 一个用于扩增表达的增强子、 一个起始序列、 一 个终止翻译序列、 一个剪切控制序列、 以及类似物。
     当本发明的核酸被包括在一个载体中时， 该核酸典型地是可操作地连接到一个适 当的转录控制序列 ( 启动子 ) 以指导 mRNA 的合成。启动子对于重组多肽表达的水平具有 特别重要的影响。可使用任何适当的启动子。适当启动子的实例包括巨细胞病毒 (CMV) 启动子 ( 具有或没有第一内含子 ( 内含子 A))、 HIV 长末端重复启动子、 磷酸甘油酸激酶 (PGK) 启动子、 劳氏肉瘤病毒 (RSV) 启动子 ( 如 RSV 长末端重复 (LTR) 启动子 )、 SV40 启动 子、 小鼠乳腺肿瘤病毒 (MMTV) 启动子、 HSV 启动子 ( 如， Lap2 启动子或疱疹胸苷激酶启动子 ( 如说明于例如， Wagner et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.78 ： 144-145)、 衍生自 SV40 或 Epstein Barr 病毒的启动子、 腺相关的病毒 (AAV) 启动子 ( 如， p5 启动子 )、 金属硫蛋 白启动子 ( 如， 绵羊金属硫蛋白启动子或小鼠金属硫蛋白启动子 )( 见， 如， Palmiter et al.(1983)Science 222 ： 809-814)、 人类泛素 C 启动子、 大肠杆菌启动子 ( 如， lac 及 trp 启 动子 )、 噬菌体 λPL 启动子、 以及已知可控制基因在原核或真核细胞中 ( 直接在该细胞中 或在感染该细胞的病毒中 ) 表达的其他启动子。可使用在哺乳动物中 ( 特别是人类 ) 展 示强组成性基线表达的启动子， 如， CMV 启动子， 如， CMV 立即早期启动子 ( 说明于例如， 美 国专利号 5,168,062、 5,385,839、 5,688,688 及 5,658,759)， 以及具有与此类 CMV 启动子实 质性序列一致性的启动子。也可使用具有增强特性的重组启动子， 如在国际专利公开号 WO 02/00897 中。
     可操作地连接到本发明的一种核酸上用于该核酸表达的启动子可具有任何适当 的作用机制。因此， 该启动子可以是例如， 一个 “诱导性” 启动子 ( 例如， 一个生长激素启动 子、 金属硫蛋白启动子、 热休克蛋白启动子、 E1B 启动子、 缺氧诱导性启动子、 放射诱导性启 动子、 或腺病毒 MLP 启动子以及三联引导子 )、 一个诱导 - 阻遏型启动子、 一个发育阶段相关 的启动子 ( 例如， 一个球蛋白基因启动子 )、 或一个组织特异性启动子 ( 例如， 一个平滑肌 细胞 α- 肌动蛋白启动子、 肌球蛋白轻链 1A 启动子、 或血管内皮钙黏着蛋白启动子 )。适 当的诱导性启动子包括蜕皮激素以及蜕皮激素类似物诱导性启动子。 蜕皮激素类似物诱导 可通过使用一个诱 性启动子是可商购的， 例如， 通过 Stratagene(La Jolla， CA)。若希望， 导性开 - 及关 - 基因表达系统 (on-and off-gene expression system) 来诱导本发明的核 酸。 这种开 - 及关 - 基因表达系统的实例对应地包括 Tet-OnTM 基因表达系统以及 Tet-OffTM 基因表达系统 (Clontech， Palo Alto， CA ； 对于每个此类系统的详细说明， 见， 如， Clontech Catalog 2000， pg.110-111)。这种诱导性启动子可以是对一个适当信号进行正 - 和 / 或负 调节响应的任何启动子。额外的诱导性启动子包括阿拉伯糖诱导性启动子、 类固醇诱导性 启动子 ( 例如， 糖皮质素诱导性启动子 )， 连同 pH、 应激、 及热诱导性启动子。
     该启动子可为， 并且通常是， 一个宿主天然启动子， 或衍生自感染了特定宿主的病 毒的启动子 ( 例如， 一个人类 β 肌动蛋白启动子、 人类 EF1α 启动子、 或衍生自人类 AAV 的 启动子， 它被可操作地连接到所感兴趣的核酸上 )， 特别是在考虑到严格避免由于对于并非 经常存在于该宿主中的序列的宿主免疫反应而造成的基因表达沉默时。 也可使用连接到所 感兴趣的多个核苷酸序列上的双向性启动子系统 ( 如说明于， 例如， U.S.5,017,478)。
     其他适当的启动子以及与适当启动子的选择、 使用、 以及构建相关的原则提供于， 例如， Werner(1999)Mamm Genome 10(2) ： 168-75， Walther etal.(1996)J.Mol.Med.74(7) ： 379-92， Novina(1996)Trends Genet.12(9) ： 351-55， Hart(1996)Semin.Oncol.23(1) ： 154-58 ， Gralla(1996)Curr.Opin.Genet.Dev.6(5) ： 526-30 ， Fassler et al.(1996) Methods Enzymol 273 ： 3-29， Ayoubi et al.(1996)， 10(4)FASEB J 10(4) ： 453-60， Goldsteine et al.(1995)Biotechnol.Annu.Rev.1 ： 105-28， Azizkhan et al.(1993)Crit. Rev.Eukaryot.Gene Expr.3(4) ： 229-54， Dynan(1989)Cell 58(1) ： 1-4， Levine(1989) Cell59(3) ： 405-8， 以及 Berk et al.(1986)Annu.Rev.Genet.20 ： 45-79， 连同美国专利号 6,194,191。其他适当的启动子可通过使用真核启动子数据库 (68 版 )( 可在万维网网站 epd.isb-sib.ch/ 获得 ) 以及其他类似的数据库， ( 如， 转录调控区域数据库 (TRRD)(4.1版 )( 可在万维网网站 bionet.nsc.ru/trrd/ 获得 ) 以及转录因子数据库 (TRANSFAC)( 可 在万维网网站 transfac.gbf.de/TRANSFAC/index.html 获得 ) 而识别。
     作为启动子的一个替代物， 特别是在 RNA 载体以及构建体中， 本发明的一种载体 或核酸可包括一个或多个内部核糖体进入位点 (IRES)、 IRES- 编码序列、 或 RNA 序列增强子 (Kozak 共有序列类似物 )， 如， 烟草镶嵌病毒 Ω 启动序列。
     本发明的一种载体或多核苷酸可包括一个上游激活子序列 (UAS)， 如， 一个 Gal4 激活子序列 ( 见， 如， 美国专利号 6,133,028) 或其他适当的上游调节序列 ( 见， 如， 美国专 利号 6,204,060)。
     本发明的一种载体或多核苷酸可包括一个 Kozak 共有序列， 它可在哺乳动物细胞 中发挥作用。该 Kozak 序列可以是一个自然发生的或经修饰的序列， 如说明于美国专利号 6,107,477 的经修饰 Kozak 共有序列。
     特定的起始信号可辅助有效翻译本发明的一个编码序列， 如， 一个突变 CTLA-4ECD 多肽编码核苷酸序列。此类信号可包括在本发明的一个载体中。此类信号可包括例如， ATG 起始密码子及邻近序列。在其中将一个编码序列、 它的起始密码子、 以及上游序列插入适 当表达载体中的情形下， 可能不需要额外的翻译控制信号。然而， 在其中仅插入一个编码 序列 ( 例如， 一个成熟蛋白编码序列 ) 或它的一个部分的情形下， 必须提供包括该 ATG 起 始密码子的外源核酸转录控制信号。此外， 该起始密码子必须是在正确的阅读框中， 以确 保该完整插入物的转录。外源转录元件及起始密码子可以是不同来源的 - 包括天然及合 成两者。表达的效率可通过纳入适用于所使用的细胞系统的增强子而得到增强 ( 见， 如， 125-62(1994) ； 及 Bittner et al.， Meth. Scharfet al.， Results Probl.Cell.Differ.20 ： Enzymol.153 ： 516-544(1987))。 适当的增强子包括劳氏肉瘤病毒 (RSV) 增强子以及说明于 美国专利号 6,225,082 的 RTE 增强子。
     技术行家将认定， 将一个起始密码子 (ATG) 引入所感兴趣的一个特定核苷酸序 列的 5′端通常会造成该经编码的氨基酸序列在哺乳动物细胞中表达该序列时添加一个 N- 端甲硫氨酸 ( 其他修饰可能发生在细菌和 / 或其他真核细胞中， 如在一个起始密码子上 引入一个甲酰基 - 甲硫氨酸残基 )。 就本发明的核酸在真核细胞中的表达而言， 典型地是将 一个起始密码子及一个编码了信号肽的核苷酸序列包括于本发明的一个核酸序列 ( 例如， SEQ IDNO ： 80) 的 5′端， 并且典型地将一个终止密码子包括于该核酸 ( 例如， SEQID NO ： 80) 的 C 端。一种示例性的信号肽序列是该 hCTLA-4 信号肽序列 (SEQID NO ： 182) ； 编码该组织 型纤维蛋白溶酶原激活剂信号肽的核酸示于 SEQID NO ： 181。另一种示例性的信号肽序列 是该 hCTLA-4 信号肽序列 (SEQ IDNO ： 216) ； 该序列是由在 SEQ ID NO ： 215 中所示的核酸序 列编码的。
     终止序列于以下详细讨论。
     此类元件可包括在所选的载体构建体中。在表达时， 由该核酸 ( 例如， SEQ ID NO ： 80) 编码的多肽变体最初将包括一个 N- 端甲硫氨酸残基及该信号肽序列。 然而， 该 N- 端甲 硫氨酸及信号肽序列在分泌时会被切割， 由此产生该经编码的多肽 ( 例如， SEQ ID NO ： 1)。
     本发明的一种核酸 ( 或本发明的一种对应多肽 ) 的表达水平可通过任何适当 的技术进行评估。实例包括 RNA 印迹分析 ( 讨论于例如， McMasteret al.， Proc.Natl. Acad.Sci.USA 74(11) ： 4835-38(1977) 及 Sambrook， 以 上 说 明 文 献 中 )、 逆转录酶 - 聚合酶链反应 (RT-PCR)( 如说明于例如， U.S.5,601,820 以及 Zaheer et al.， Neurochem. Res.20 ： 1457-63(1995))、 以 及 原 位 杂 交 技 术 ( 如 说 明 于 例 如， 美 国 专 利 号 5,750,340 及 5,506,098)。 蛋 白 的 定 量 也 可 通 过 Lowry 测 定 仪 及 其 他 蛋 白 定 量 测 定 来 实 现 见， 如， Bradford， Anal.Biochem.72 ： 248-254(1976) ； Lowry et al.， J.Biol.Chem.193 ： 265(1951))。 获自用编码了此类重组多肽的多核苷酸所转染的细胞裂解物的本发明重组多 肽的蛋白质印迹分析是用于评估重组多肽表达水平的另一种适当技术。
     本发明的一种载体 ( 例如， 表达载体 ) 或多核苷酸可包括用于翻译起始的一个核 糖体结合位点以及一个转录终止区域。一个适当的转录终止区域是例如， 一个聚腺苷酸序 列， 它协助了由 DNA 序列所产生的 RNA 转录物的切割以及聚腺苷酸化。可使用任何适当 的聚腺苷酸序列， 包括一个合成性的最适化序列， 连同 BGH( 牛生长激素 )、 人生长激素基 因、 多瘤病毒、 TK( 胸苷激酶 )、 EBV( 爱泼斯坦 - 巴尔病毒 )、 兔 β 球蛋白、 以及乳头状瘤病 毒 ( 包括人乳头状瘤病毒及 BVP( 牛乳头状瘤病毒 )) 的聚腺苷酸序列。适当的聚腺苷酸 (polyA) 序列还包括 SV40( 人肉样瘤病毒 -40) 聚腺苷酸序列及 BGH polyA 序列。 此类 polyA 序列说明于， 例如， Goodwinet al.(1998)Nucleic Acids Res.26(12) ： 2891-8， Schek et al.(1992)Mol.Cell.Biol.12(12) ： 5386-93， 及 van den Hoff et al.(1993)Nucleic Acids Levittet Res.21(21) ： 4987-8。有关适当聚腺苷酸序列的 选择的其他原则说明于例如， al.(1989)Genes Dev.19893(7) ： 1019-1025， Jacob et al.(1990)Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.1(1) ： 49-59， Chen et al.(1995)Nucleic Acids Res.23(14) ： 2614-2620， Moreira et al.(1995)EMBO J.14(15) ： 3809-3819， Carswellet al.(1989)Mol.Cell.Biol.9(10) ： 4248-4258。
     本发明的一种载体或多核苷酸可进一步包括位点特异性重组位点， 这些特异 性重组位点可用于调整所感兴趣的一个核苷酸序列的转录， 如说明于例如， 美国专利号 4,959,317、 5,801,030 及 6,063,627， 欧洲专利申请号 0987326， 以及国际专利申请公开号 WO 97/09439。
     本发明的一种载体或多核苷酸也可包括编码了一个分泌 / 定位序列的核酸， 以便 将多肽表达靶向至一个所希望的细胞区室、 膜、 或细胞器， 或指导多肽分泌至周质空间或进 入细胞培养基。 此类序列是本领域中所已知的， 并且包括分泌肽引导子或信号肽、 细胞器靶 向序列 ( 例如， 核定位序列、 ER 滞留信号、 粒线体转运序列、 叶绿体体转运序列 )、 膜定位 / 锚定序列 ( 例如， 终止转运序列、 GPI 锚定序列 )、 以及类似序列。本发明的多核苷酸可以例 如， 符合阅读框地融合到编码了一个分泌和 / 或定位序列的核酸上。通过此类本发明的多 核苷酸所表达的多肽可包括对应于这种或这些分泌和 / 或定位序列的氨基酸序列。
     此外， 本发明的一种载体或多核苷酸可包括一种或多种选择性标记核苷酸序列或 基因， 以便提供一个表型特色用于选自经转化宿主细胞， 如， 对于真核细胞培养物的二氢叶 酸还原酶抗性、 新霉素抗性、 G418 抗性、 嘌罗霉素抗性、 和 / 或杀稻瘟菌素抗性， 或如大肠杆 菌中的四环霉素或氨苄青霉素抗性。
     本发明的一种载体或多核苷酸也可包括用于在微生物中进行增殖的一个复制起 点。所使用的细菌复制起点 (Ori) 优选是并不会负面影响哺乳动物细胞中的基因表达的那 个。可用的复制起点序列的实例包括 f1 噬菌体 ori、 RK2 oriV、 pUC ori、 以及 pSC101 ori。 复制起点序列包括 ColEI ori 以及 p15( 可获自 pACYC177， New England Biolab， Inc.)， 可替代地另一个低拷贝 ori 序列 ( 类似 p15) 可以是在一些内容中所希望的。在此方面中所 希望的核酸充当了穿梭载体， 可以在真核及原核宿主两者中复制和 / 或表达 ( 例如， 包括在 真核及原核生物两者中识别的复制序列起点的载体 )。
     本发明包括一种裸 DNA 或 RNA 载体， 包括， 例如， 一个线性表达元件 ( 如说明于 例如， Sykes and Johnston(1997)Nat Biotech 17 ： 355-59)、 一种压缩的核酸载体 ( 如 说明于例如， 美国专利号 6,077,835 和 / 或国际专利申请公开号 WO 00/70087)、 一种质 粒载体 ( 如， pCDNA3.1、 pBR322、 pUC19/18 或 pUC 118/119)、 一种 “侏儒”最小尺寸的核 酸载体 ( 如说明于例如， Schakowski et al.(2001)Mol.Ther.3 ： 793-800)， 或作为一个 经沉淀的核酸载体构建体， 如， 一个 CaPO4 沉淀构建体 ( 如说明于例如， 国际专利申请 WO 00/46147， Benvenisty and Reshef(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83 ： 9551-55， Wigler et al.(1978)， Cell 14 ： 725， 及 Coraro and Pearson(1981)Somatic Cell Genetics 7 ： 603)， 它包括本发明的核酸。例如， 本发明提供了一种包括 SEQ ID NO ： 80 的裸 DNA 质粒， 该质粒 可操作地连接到一个 CMV 启动子或 CMV 启动子变体以及一个适当的聚腺苷酸序列上。裸核 苷酸载体及其使用是本领域中所已知的 ( 见， 如， 美国专利号 5,589,466 及 5,973,972)。
     本发明的一种载体典型地是一种表达载体， 该表达载体适用于细菌系统、 真核系 统、 哺乳动物系统、 或其他系统的表达 ( 相对于设计成用于复制该核酸序列而不进行表达 的载体， 它可被称为一种克隆载体 )。例如， 在一个方面， 本发明提供了一种细菌表达载体， 该载体包括本发明的一个核酸序列 ( 例如， 编码了重组突变 CTLA-4-Ig 的核酸序列 )。适 当的载体包括， 例如， 可指导容易纯化的融合蛋白的高水平表达的载体 ( 例如， 多功能性大 肠杆菌克隆及表达载体， 如， BLUESCRIPT(Stratagene) ； pIN 载体 (Van Heeke&Schuster， J.Biol.Chem.264 ： 5503-5509(1989) ； pET 载体 (Novagen， Madison WI) ； 及类似载体 )。尽 管此类细菌表达载体可用于表达本发明的特定多肽， 本发明的糖蛋白优选是在真核细胞中 表达， 并且这样本发明还提供了真核表达载体。
     该表达载体可以是一种适合于在酵母细胞中表达本发明核酸的载体。 可使用任何 适用于在酵母系统中进行表达的载体。 可用于例如， 酿酒酵母中的适当载体包括例如， 包括 组成性或诱导性启动子 ( 如， α 因子、 醇氧化酶以及 PGH) 的载体 ( 综述于 Ausubel， 以上 说明文献， Berger， 以上说明文献， 及 Grant et al.， Meth.Enzymol.153 ： 516-544(1987))。 通常， 该表达载体将是适用于在一种哺乳动物细胞中表达本发明核酸的载体， 该哺乳动物 细胞例如， 一种昆虫细胞 ( 例如， SF-9 细胞 ) 或一种哺乳动物细胞 ( 例如， 一种 CHO 细胞、 293 细胞、 HeLa 细胞、 人类纤维母细胞、 或已经详细表征的类似细胞 )。适当的哺乳动物表 达载体是本领域中所已知的 ( 见， 如， Kaufman， Mol.Biotechnol.16(2) ： 151-160(2000)， Van Craenenbroeck， Eur.J.Biochem.267(18) ： 5665-5678(2000)， Makrides， Protein Expr.Purif.17(2) ： 183-202(1999) ， 及 Yarranton ， Curr.Opin.Biotechnol.3(5) ： 506-511(1992))。 适当的昆虫细胞质粒表达载体也是已知的 (Braun， Biotechniques26(6) ： 1038-1040 ： 1042(1999))。
     一种表达载体典型地可以在一种宿主细胞中增殖， 该宿主细胞可以是一种真核细 胞 ( 如， 一种哺乳动物细胞、 酵母细胞、 或植物细胞 ) 或一种原核细胞 ( 如， 一种细菌细胞 )。 核酸载体或表达载体进入宿主细胞的引入 ( 例如， 转染 ) 可通过磷酸钙转染 ( 见， 如， Graham et al.， Virology 52 ： 456-457(1973) 的磷酸钙共沉淀法 )、 DEAE- 右旋糖酐介导的转染、 电穿孔、 基因或疫苗枪、 注射、 脂质体转染 (lipofection)、 以及生物弹道 (biolistics)， 或其 他常用技术来发挥作用 ( 见， 如， Kriegler， Gene Transfer and Expression ： A Laboratory Manual， Stockton Press(1990) ； 对 于 体 内、 离 体、 以 及 体 外 方 法 的 说 明， 见 Davis， L.， Dibner， M.， and Battey， I.， Basic Methods inMolecular Biology(1986))。包括本发明 的这些以及其他载体的细胞形成了本发明的一个重要部分。
     在一个方面， 本发明提供了一种表达载体， 该表达载体包括 ： (i) 一个第一多核苷 酸序列， 该第一多核苷酸序列编码了包括一个多肽序列的第一多肽， 该多肽序列具有与选 自下组的至少一个多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的序列一致性， 该 组的构成为 ： SEQ ID NOS ： l 至 73， 其中所述第一多肽结合人类 CD86 和 / 或人类 CD80、 和/ 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域， 和 / 或阻抑一种免疫反应， 以及 (ii) 一个第二 多核苷酸序列， 该第二多核苷酸序列编码一个第二多肽， 该第二多肽包括一个免疫球蛋白 (Ig) 多肽的一个铰链区、 一个 CH2 结构域、 以及一个 CH3 结构域。该 Ig 多肽可任选地是一 种人类 Ig Fc 多肽 ( 例如， IgG1、 IgG2、 IgG4、 等 )， 或一种突变 Ig Fc 多肽 ( 例如， 一种 Ig Fc 多肽 )， 其中一个或多个半胱氨酸残基已经由另一个氨基酸 ( 例如， 一个丝氨酸残基 ) 取代， 由此消除了在两个 Ig 链之间形成的一个或多个二硫键， 或其中一个或多个脯氨酸残 基已经由另一个氨基酸 ( 例如， 脯氨酸 ) 取代， 以降低效应子功能 ( 减少的 Fc 受体结合 )。 在另一个方面， 本发明提供了一种表达载体， 该表达载体包括编码了一种融合蛋白的一个 核苷酸序列， 该融合蛋白具有与选自下组的至少一种多肽序列至少 95％、 96％、 97％、 98％、 99％或 100％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 74 至 79、 197 至 200、 205 至 214、 以及 219 至 222。
     本发明所提供的额外的核酸包括黏粒 (cosmid)。 可使用任何适当的黏粒载体来复 制、 转移、 并且表达本发明的核酸序列。 典型地， 一个黏粒包括一个细菌 oriV、 一个抗生素选 择标记、 一个克隆位点、 以及一个或两个衍生自噬菌体 λ 的 cos 位点。该黏粒可以是一个 穿梭黏粒或哺乳动物黏粒 ( 包括 SV40 oriV) 并且如希望的， 一个或多个适当的哺乳动物选 择标记。黏粒载体进一步说明于例如， Hohn et al.(1988)Biotechnology 10 ： 113-27。
     本发明的核酸能够以一种适当递送运载体 ( 即， 一种载体 ) 的形式而包括在宿主 或宿主细胞中和 / 或对其进行给予。该载体可以是任何适当的载体， 包括染色体、 非染色 体、 以及合成的核酸载体， 或以上说明的其他载体， 并且可包括以上说明的表达元件以和 / 或其他转染协助性和 / 或表达促进性序列元件的任何组合。此类载体的实例包括病毒、 细 菌质粒、 噬菌体、 黏粒、 噬菌质粒 (phagemid)、 SV40 的衍生物、 杆状病毒、 酵母质粒、 衍生自 质粒与噬菌体 DNA 的组合的载体、 以及病毒核酸 (RNA 或 DNA) 载体、 聚赖氨酸、 以及细菌细 胞。
     本发明的一个重组 DNA 序列的递送能够用一种裸 DNA 质粒或结合到一种或多种转 染增强剂上的质粒而实现， 如本文进一步讨论。该质粒 DNA 载体可具有任何适当的特征组 合。质粒 DNA 载体可包括一个强启动子 / 增强子区域 ( 例如， 人类 CMV、 RSV、 SV40、 SL3-3、 MMTV 或 HIV LTR 启动子 )、 一个有效的聚 (A) 终止序列、 一个用于在大肠杆菌中产生质粒的 复制起点、 一个作为选择标记的抗生素抗性基因、 以及一个便利的克隆位点 ( 例如， 一个多 位点连接物 (polylinker))。在此方面中的一种用于递送本发明核酸的特定质粒载体示于 图1； 这种载体的建构及特征说明于以下的实例中。在另一个方面， 本发明提供了一种非核酸载体， 该载体包括本发明的至少一种核 酸或多肽。这种非核酸载体包括例如但不限于， 一种重组病毒、 一种病毒核酸 - 蛋白偶联物 ( 它与重组病毒颗粒有时可被称作病毒载体 )、 或一种细胞， 如重组 ( 且通常是经减毒 ) 的 沙门氏菌、 志贺氏杆菌、 利斯特菌属及卡介菌 (Bacillus Calmette-Guérin)(BCG) 细菌细 胞。 因此， 例如， 本发明提供了一种病毒载体、 昆虫载体、 细菌载体、 或植物载体， 该载体包括 本发明的序列的一种核酸。 在此方面中可以使用任何适当的病毒、 昆虫、 植物、 或细菌载体， 并且许多是本领域中所已知的。一种病毒载体可包括任何数目的病毒多核苷酸 ( 单独存在 ( 一种病毒核酸载体 )， 或更常见地是与一种或多种 ( 典型地是二、 三种或更多 ) 病毒蛋白 相结合 )， 它们协助了本发明的核酸在一种所希望的宿主细胞中的递送、 复制和 / 或表达。
     在一个方面， 可使用胞内细菌 ( 例如， 单核细胞增生性李斯特菌 ) 来递送本发明的 一种核酸。用于本发明的一种或多种核酸的质粒 DNA 递送的一种示例性细菌载体是单核细 胞增生性李斯特菌 (Lieberman et al.， Vaccine20 ： 2007-2010(2002))。
     本发明包括重组或分离的病毒载体， 它们已经被修饰为包括本发明的一种或多种 核酸或多肽。一种病毒载体可包含包括以下各项中的所有或部分的一个多核苷酸 ： 一种病 毒基因组， 一种病毒蛋白 / 核酸偶联物、 一种病毒样颗粒 (VLP)、 一种类似于说明于美国专 利号 5,849,586 号及国际专利申请公开号 WO 97/04748 的那些的载体、 或包括一种或多种 病毒核酸的完整病毒颗粒， 并且该病毒载体典型地是经工程处理的以便包括本发明的至少 一种核酸和 / 或多肽。 一种病毒载体 ( 即， 一种重组病毒 ) 可包括一种野生型的病毒颗粒或 经修饰的病毒颗粒， 其特定实例于以下讨论。许多病毒典型地可用作用于递送外源核酸的 一种载体， 包括本发明的至少一种核酸， 如编码了在本文中所说明的一种突变 CTLA-4 ECD 或突变 CTLA-4-Ig 的核酸。此类载体包括经重组修饰的具外膜或不具外膜的 DNA 及 RNA 病 毒， 典型地是选自杆状病毒科、 细小病毒科、 小 RNA 病毒科 (picomoviridiae)、 疱疹病毒科、 痘病毒科、 腺病毒科、 或小 RNA 病毒科 (picornnaviridiae)。 病毒载体可以是野生型或可通 过重组核酸技术而被修饰成复制缺陷型、 复制型、 或条件复制型。
     该病毒载体可以是要求另一种载体或野生型病毒的存在用于复制和 / 或表达的 载体 ( 即， 一种辅助病毒依赖的载体 )， 如， 一种腺病毒载体复制子。典型地， 此类病毒载体 包括一种野生型的病毒颗粒， 或在其蛋白和 / 或核酸内含物中经修饰来增加转基因能力或 辅助核酸转染和 / 或表达的病毒颗粒 ( 此类载体的实例包括疱疹病毒 /AAV 复制子 )。该病 毒基因组可经修饰以便包括诱导性启动子， 它们仅在特定条件下达到复制或表达。
     该病毒载体可衍生自或包括通常感染了动物 ( 优选是脊椎动物， 如， 哺乳动物， 包括， 例如， 人类 ) 的病毒。在此方面中的适当病毒载体颗粒包括， 例如， 腺病毒载体颗 粒 ( 包括腺病毒科中病毒的任何病毒或衍生自该病毒 )、 腺相关病毒载体颗粒 (AAV 载体 颗粒 )、 或其他细小病毒及细小病毒载体颗粒、 乳头瘤状病毒载体颗粒、 Semliki-Forest 病毒载体、 黄病毒载体、 微小核糖核酸病毒载体、 α 病毒载体、 疱疹病毒载体、 痘病毒载 体、 逆转录病毒载体 ( 包括慢病毒载体 )。此类病毒及病毒载体的实例提供于， 例如， Fields Virology， 以上说明文献， Fields et al.， eds.， Virology， RavenPress， Ltd.， New York(3rd ed.， 1996 及 4th ed.， 2001)， Encyclopedia ofVirology， R.G.Webster et al.， eds.， Academic Press(2nd ed.， 1999)， Fundamental Virology， Fields et al.， eds.， Lippincott-Raven(3rd ed.， 1995)， Levine， “Viruses” ， Scientific AmericanLibrary No.37(1992)， MedicalVirology， D.O.White et al.， eds.， Academic Press(2nd ed.1994)， 及 Introduction to Modern Virology， Dimock， N.J.et al.， eds.， Blackwell ScientificPublications， Ltd.(1994)。
     可与本发明的核酸以及在本文中所说明的方法共同使用的病毒载体包括腺相关 病毒载体， 这些载体综述于， 例如， Carter(1992)Curr.OpinionBiotech.3 ： 533-539(1992) 及 Muzcyzka(1992)Curr.Top.Microbiol.Immunol.158 ： 97-129(1992) 中 进 行 综 述。 AAV 载 体 的 其 他 类 型 及 方 面 说 明 于， 如， Buschacher et al.， Blood 5(8) ： 2499-504， Carter， Contrib.Microbiol.4 ： 85-86(2000)， Smith-Arica， Curr.Cardiol.Rep.3(1) ： 41-49(2001)， Taj， J.Biomed.Sci.7(4) ： 279-91(2000)， Vigna et al.， J.Gene Med.2(5) ： 308-16(2000)， Klimatcheva et al.， Front.Biosci.4 ： D481-96(1999)， Lever et al.， Biochem.Soc.Trans.27(6) ： 841-47(1999)， Snyder， J.Gene Med.1(3) ： 166-75(1999)， Gerich et al.， Knee Surg.Sports Traumatol.Arthrosc.5(2) ： 118-23(1998)， 及 During， Adv.Drug Deliv.Review 27(1) ： 83-94(1997)，及 美 国 专 利 号 4,797,368、 5,139,941、 5,173,414、 5,614,404、 5,658,785、 5,858,775 及 5,994,136， 以及本文其他地方所论及的 其他参考文献。 腺相关病毒载体可使用， 例如， 美国专利号 4,797,368 及 Laughlin et al.， Gene 23 ： 65-73(1983) 给出的方法而建构和 / 或纯化。
     α 病毒载体可以是其他内容中的基因递送载体。α 病毒载体是本领域中所已知 的， 并说明于， 如， Carter(1992)Curr Opinion Biotech 3 ： 533-539， Schlesinger Expert Opin.Biol.Ther.(2001)1(2) ： 177-91， Polo et al.， Dev.Biol.(Basel).2000 ； 104 ： 181-5， Wahlfors et al.， Gene Ther.(2000)7(6) ： 472-80， 国际专利申请公开号 WO 01/81609、 WO 00/39318、 WO 01/81553、 WO95/07994、 WO 92/10578。
     另一个有利的病毒载体组是疱疹病毒载体。 实例说明于， 例如， Lachmann et al.， Curr.Opin.Mol.Ther.(1999)1(5) ： 622-32， Fraefel et al.， Adv.Virus Res.(2000)55 ： 425-51， Huard et al.， Neuromuscul.Disord.(1997)7(5) ： 299-313， Frenkel et al.， Gene Ther.(1994)Suppl 1 ： S40-6， 美国专利号 6,261,552 及 5,599,691。
     逆转录病毒 ( 包括慢病毒载体 ) 也可以是在特定内容中的有利的基因递送运 载体。本领域中存在着多种已知的逆转录病毒载体。逆转录病毒载体的实例说明于， 例 如， Miller， Curr Top Microbiol.Immunol.(1992)158 ： 1-24， Weber et al.， Curr.Opin. Mol.Ther.(2001)3(5) ： 439-53， Hu et al.， Pharmacol.Rev.(2000)52(4) ： 493-511， Kim et al.， Adv.Virus Res.(2000)55 ： 545-63， Palu et al.， Rev.Med.Virol.(2000)10(3) ： 185-202， Takeuchi etal.， Adv.Exp.Med.Biol.(2000)465 ： 23-35， 美国专利号 6,326,195、 5,888,502、 5,580,766 及 5,672,510。
     杆状病毒载体是另一个有利的病毒载体组， 特别是就本发明多肽的产生而言。 杆 状 病 毒 载 体 的 产 生 及 使 用 是 已 知 的 ( 见， 如， Kost， Curr.Opin.Biotechnol.10(5) ： 428-433(1999) ； Jones， Curr.Opin.Biotechnol.7(5) ： 512-516(1996))。当该载体用于治 疗用途的情形下， 对该载体进行选择这样使得它可以适当地感染 ( 或就核酸载体的情形而 言为转染或转化 ) 靶细胞， 在这些细胞中所希望的治疗作用是希望的。
     腺 病 毒 载 体 也 可 以 是 用 于 基 因 转 移 的 适 当 病 毒 载 体。 腺 病 毒 载 体 是 本 领 域 中 所 熟 知 的，并 且 说 明 于，例 如， Graham et al.(1995)Mol.Biotechnol.33(3) ：207-220， Stephenson(1998)Clin.Diagn.Virol.10(2-3) ： 187-94 ， Jacobs(1993)Clin Sci(Lond).85(2) ： 117-22， 美国专利号 5,922,576、 5,965,358 及 6,168,941， 及国际专利申 请 WO 98/22588、 WO 98/56937、 WO 99/15686、 WO 99/54441 及 WO 00/32754。可用于本发明 的实施并适用于生物体内转导及表达本发明核酸的腺病毒载体、 疱疹病毒载体、 以及辛得 毕斯 (Sindbis) 病毒载体总体上说明于例如， Jolly(1994)Cancer Gene Therapy 1 ： 51-64， Latchman(1994)Molec.Biotechnol.2 ： 179-195，及 Johanning et al.(1995)Nucl.Acids Res.23 ： 1495-1501。
     该病毒载体可以是在宿主细胞中有复制缺陷的。包括了腺相关病毒 (AAV) 载体， 这些载体在互补的腺病毒或至少为腺病毒基因产物 ( 由例如， 一种辅助病毒、 质粒、 或补助 细胞 (complementing cell) 提供 ) 的缺失下是有天然复制缺陷性的。提及 “复制缺陷” 意 思指该病毒载体包括缺乏至少一种复制必要性基因功能的基因组。如在本文中所使用的， 一种基因、 基因功能、 或基因或基因组区域的缺陷被定义为删除了改病毒基因组的足够的 基因物质， 以损害或删除其核酸序列的全部或部分经删除的基因功能。复制必要性基因功 能是复制缺陷型病毒载体的复制 ( 即， 增殖 ) 所要求的那些基因功能。该病毒载体颗粒的 必要基因功能随所讨论的病毒载体颗粒的类型而变化。 复制缺陷型病毒载体颗粒的实例说 11319-20(1996)， Johnson 明于， 例如， Marconi etal.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(21) ： andFriedmann， Methods Cell Biol.43(pt.A) ： 211-30(1994)， Timiryasova et al.， J.Gene Med.3(5) ： 468-77(2001)， Burton et al.， Stem Cells 19(5) ： 358-77(2001)， Kim et al.， Virology 282(1) ： 154-67(2001)， Jones et al.， Virology278(1) ： 137-50(2000)， Gill et al.， J.Med.Virol.62(2) ： 127-39(2000)。其他复制缺陷型载体是基于单纯 MLV 载体 (Miller et al.(1990)Mol.CellBiol.10 ： 4239 ； Kolberg(1992)J.NIH Res.4 ： 43， 及 Cornetta et al.(1991)Hum.Gene.Ther.2 ： 215)。金丝雀痘病毒载体在感染人类细胞方面 是有利的， 但无法自然地在其中进行复制 ( 即， 无基因修饰 )。
     重组病毒载体的基础建构是本领域中所充分理解的， 并且涉及使用标准的分 子生物学技术， 如， 说明于以下的那些， 例如， Sambrook et al.， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press 1989) 及其第三版 (2001)， Ausubel et al.， Current Protocols in Molecular Biology(WileyInterscience Publishers 1995)， 及 Watson， 以上说明文献， 以以及本文所提及的数种其他参考文献。例如， 腺病毒载体可使 用， 例如， Graham et al.， Mol.Biotechnol.33(3) ： 207-220(1995)， 美国专利号 5,965,358， Donthine etal.， Gene Ther.7(20) ： 1707-14(2000)， 及在本文中所说明的其他参考文献列 出的方法而建构和 / 或纯化。 Adeno-associated viral vectors can beconstructed and/ or purified using the methods set forth， for example， in U.S.Patent No.4,797,368 and Laughlin et al.， Gene 23 ： 65-73(1983). 腺相关病毒载体载体可以使用例如在美国 专利号 4,797,368 以及 Laughlin et al.， Gene23 ： 65-73(1983) 中所给出的方法进行构建 和 / 或纯化。有关其他病毒载体的类似技术是本领域中所已知的， 特别是有关疱疹病毒载 体 ( 见， 如， Lachmanet al.， Curr.Opin.Mol.Ther.1(5) ： 622-32(1999))、 慢病毒载体、 以及 其他逆转录病毒载体。总体上， 该病毒载体包括该核酸的插入 ( 例如， 一种野生型腺病毒载 体可包括达到 3KB 的插入而无缺失 )， 或者， 更典型地， 包括一个或多个病毒基因组的缺失， 以容纳该核酸及额外核酸 ( 当希望是 ) 的插入， 并防止在宿主细胞中的复制。非病毒载体 ( 例如， DNA 质粒、 裸核酸、 以及络合着一个递送运载体 ( 如， 脂质体 ) 的核酸 ) 也可结合到可使该载体靶向该宿主中的一个特定区域 ( 例如， 一种特定的器官、 组织和 / 或细胞类型 ) 的分子上。例如， 一种核苷酸可以偶联到一种靶向蛋白 ( 如， 一种 结合受体的病毒蛋白， 或结合特定靶的受体的蛋白 ) 上 ( 例如， 通过 Wu et al.， J.Biol. Chem.263(29) ： 14621-24(1988) 中的技术的修饰 )。靶向阳离子脂质的组合物是已知的 ( 见， 如， U.S.6,120,799)。用于靶向遗传构建体的其他技术提供于国际专利申请公开号 WO 99/41402。
     表达宿主
     本发明还提供了经工程处理的宿主细胞， 这些宿主细胞用本发明的一种载体 ( 例 如， 一种克隆载体或表达载体 ) 或本发明的一种核酸进行转导、 转染或转化。这些经工程 处理的宿主细胞适当是可以培养于常规的营养培养基中用于激活启动子、 选择转化株、 或 扩增感兴趣的核酸。这些培养条件 ( 如， 温度、 pH 及类似条件 ) 是先前用于表达的经选择 的宿主细胞一起使用的， 并且对于本领域中的普通技术人员而言应当是清楚的， 并且在本 文所引述的参考文献中是清楚的， 包括例如， Freshney(1994)Culture ofAnimal Cells， a Manual of Basic Technique， 3rd ed.， Wiley-Liss， New York 以及其中所引述的参考文献。 通过此类本发明的载体或核酸所编码的本发明多肽是在此类宿主细胞中表达的， 并可通过 标准技术进行分离。例如， 可通过超离心或类似的技术将释放至细胞培养物中的多肽从培 养物中分离。
     本发明的多肽可以产生于不同的表达宿主， 包括但不限于， 动物细胞， 如， 哺乳动 物细胞 ( 例如， CHO 细胞 )， 包括人类及非人类灵长类细胞， 以及在非动物细胞中， 如， 植物、 酵母、 真菌、 细菌、 以及类似物。适当表达宿主的实例包括细菌细胞， 如， 大肠杆菌、 链霉菌、 以及伤寒沙门氏菌 ； 真菌细胞， 如， 酿酒酵母、 毕赤酵母、 以及粉色面包霉菌 ； 昆虫细胞， 如， 果蝇及秋行军虫 ； 哺乳动物细胞， 如， CHO( 例如， CHO-K1)、 COS( 例如， COS-1， COS-7)、 BHK、 以 及 HEK( 例如， HEK 293) 细胞、 Bowes 黑色素瘤细胞， 以及植物细胞。如以上所指出， 本发明 并不受到所才用的宿主细胞抑制。除外 Sambrook， Berger 和 Ausubel， 皆为以上说明文献， 有关细胞培养的细节尚可见于， 如， Payne et al.(1992)Plant Cell and TissueCulture in Liquid Systems John Wiley&Sons， Inc.New York， NY ； Gamborgand Phillips(eds.) (1995)Plant Cell， Tissue and Organ Culture ； FundamentalMethods Springer Lab Manual， Springer-Verlag(Berlin Heidelberg NY) ； Atlas&Parks(eds.)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press， Boca Raton， FL。使用本领域中所知的操作， 可 将此类宿主细胞改变以便在无血清、 无蛋白培养基、 无动物组分培养基中生长， 例如， 一种 TM 化学限定 (CD) 培养基 ( 例如， CD OptiCHO (Invitrogen， #12681))。
     本发明提供了一种细胞， 它包括在本文中所说明的本发明的核酸、 载体、 或其他构 建体 ( 例如， 一种表达突变 CTLA-4 ECD 或突变 CTLA-4-Ig 的构建体 ) 中的任何一种或多种， 或它们的任何组合。 还包括一种细胞， 它包括在本文中所说明的本发明的多肽、 抗体或融合 蛋白或其他构建体中的任何一种或多种， 或这些中一种或多种的任何组合。本发明的一种 细胞典型地是一种分离或重组的细胞， 并且可包括一种宿主细胞。这种细胞 ( 例如， 一种重 组细胞 ) 可通过用本发明的至少一种核酸、 载体、 或其他构建体的转化、 转染和 / 或感染而 修饰。这种细胞可以是一种真核细胞 ( 例如， 哺乳动物、 酵母、 或植物细胞 ) 或一种原核细胞 ( 例如， 细菌细胞 )， 并且可以使用不同的已知方法、 用本发明的任何这种构建体进行转 化， 这些方法包括例如， 磷酸钙转染 ( 见， 如， 磷酸钙共沉淀法 )、 DEAE- 右旋糖酐介导性转 染、 电穿孔 (Irving et al.， Cell 64 ： 891-901(1991))、 基因或疫苗枪、 注射、 脂质体转染、 以及生物弹道， 或如以上所指出的其他常用技术。还见万维网网站 inovio.com 的 Inovio Biomedical Corp. 电穿孔方法及技术。
     一个宿主细胞株可任选地因其调整这些插入序列表达的能力或以所希望的方式 加工这种经表达蛋白的能力而选择。此类蛋白修饰包括但不限于 ： 乙酰化作用、 羧化作用、 糖基化用、 磷酸化用、 脂化用、 以及酰化用。不同的宿主细胞 ( 如， 大肠杆菌、 杆菌属、 酵母、 或哺乳动物细胞， 如， CHO、 HeLa、 BHK、 MDCK、 HEK 293、 WI38、 等 ) 具有特定的细胞机械及特征 机制用于此类翻译后活动， 并且可经选择以确保该引入的外源蛋白的正确修饰及加工。
     本发明的一种核酸可插入一种适当的宿主细胞中 ( 在培养物中或在宿主生物体 中 )， 以容许该宿主表达感兴趣的蛋白 ( 例如， 突变 CTLA-4 ECD 或突变 CTLA-4-Ig)。可通 过本发明的核酸来转化 / 转导任何适当的宿主细胞。 适当表达宿主的实例包括 ： 细菌细胞， 如， 大肠杆菌、 链霉菌、 杆菌属、 以及伤寒沙门氏菌 ； 真菌细胞， 如， 酿酒酵母、 毕赤酵母、 以及 粉色面包霉菌 ； 昆虫细胞， 如， 果蝇及秋行军虫 ； 哺乳动物细胞， 如， Vero 细胞、 HeLa 细胞、 CHO 细胞 ( 例如， CHO-K1)、 COS 细胞、 WI38 细胞、 NIH-3T3 细胞 ( 以及其他纤维母细胞， 诸如， MRC-5 细胞 )、 MDCK 细胞、 KB 细胞、 SW-13 细胞、 MCF7 细胞、 BHK 细胞、 HEK-293 细胞、 Bowes 黑色素瘤细胞， 以及植物细胞、 等。
     本发明还提供了宿主细胞， 这些宿主细胞被本发明的至少一种核酸或载体转导、 转化或转染。如上所讨论， 本发明的一种载体典型地包括本发明的一种核酸。宿主细胞是 被本发明的载体进行遗传学上的工程处理 ( 例如， 转导、 转化、 感染、 或转染 )， 这些载体可 以是例如， 一种克隆载体或表达载体。该载体可以是处于一种质粒、 一种病毒颗粒、 一种噬 菌体、 减毒细菌、 或任何其他适当类型的载体形式。适用于经本发明的病毒载体转导和 / 或 感染以产生本发明重组多肽和 / 或复制本发明病毒载体的宿主细胞包括以上说明的细胞。 已经证实为适于包装病毒载体颗粒的细胞实例说明于， 如， Polo et al.， Proc.Natl.Acad. Sci.96(8) ： 4598-603(1999)， Farsonet al.， J.Gene Med.1(3) ： 195-209(1999)， Sheridan et al.， Mol.Ther.2(3) ： 262-75(2000)， Chen et al.， Gene Ther.8(9) ： 697-703(2001)， 及 Pizzaroet al.， Gene Ther.8(10) ： 737-745(2001)。就复制缺陷型病毒载体 ( 如， AAV 载 体 ) 而言， 需要互补细胞系 (complementing cell line)、 经辅助病毒转化的细胞系、 或经编 码了必要基因的质粒转化的细胞系， 用于该病毒载体的复制。
     这些经工程处理的宿主细胞可培养于常规的营养培养基中 ( 在适当时进行修 饰 ) 用于激活启动子、 选择转化株、 或扩增感兴趣的核酸。宿主细胞可培养于含血清培养 基或无血清培养基中。宿主细胞可培养于一种无血清、 无蛋白、 无动物组分培养基中， 包 TM 括例如， 一种化学限定培养基 ( 例如， CD OptiCHO (Invitrogen， #12681))。若希望， 该 细胞培养基可补充有本领域中的普通技术人员所知的添加剂， 例如， 一种或多种氨基酸， 如， L- 谷氨酰胺 ( 例如， 2 ％体积 / 体积的 200mM L- 谷氨酰胺 (Invitrogen， #25031))。 这些培养条件 ( 如， 温度、 pH、 以及类似条件 ) 是与先前用于表达的经选择宿主细胞一起 使用的， 并且对于本领域的普通技术人员而言应当是清楚的， 并且在本文所引述的参考 文献中是清楚的， 包括， 例如， Animal Cell Technology， Rhiel et al.， eds.， (KluwerAcademic Publishers1999)， Chaubard et al.， Genetic Eng.News 20(18)(2000)， Hu et al.， ASMNews 59 ： 65-68(1993)， Hu et al.， Biotechnol.Prog.1 ： 209-215(1985)， Martin et al.， Biotechnol.(1987)， Freshney， Culture of Animal Cells ： A Manualof Basic Technique， 4th ed.， (Wiley， 2000)， Mather， Introduction to Celland Tissue Culture ： Theory and Technique， (Plenum Press， 1998)， Freshney， Culture of Immortalized Cells， 3rd ed.， (John Wiley&Sons， 1996)， Cell Culture ： Essential Techniques， Doyle et al.， eds.(John Wiley&Sons 1998)， 以 及 General Techniques of Cell Culture， Harrison et al.， eds.， (Cambridge Univ.Press 1997)。
     该核酸也可在植物细胞中包含、 复制、 和 / 或表达。有关植物细胞培养的技术 说明于， 如， Payne et al.(1992)Plant Cell and Tissue Culture in LiquidSystems John Wiley&Sons ， Inc.New York ， NY ； Gamborg and Phillips(eds.)(1995)Plant Cell ， Tissue and Organ Culture ： Fundamental MethodsSpringer Lab Manual. Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York) ；及 PlantMolecular Biology(1993) R.R.D.Croy(ed.)Bios Scientific Publishers， Oxford， U.K.ISBN 0 12 198370 6。细胞 培养基总体上由 Atlas and Parks(eds.)The Handbook of Microbiological Media(1993) CRC Press， Boca Raton， FL 列出。
     就重组蛋白的长期、 高产率产生而言， 可使用稳定的表达系统。例如， 可以用包括 病毒复制起点和 / 或内源表达元件以及一个选择标记基因的表达载体来转导稳定地表达 本发明多肽的细胞系。在引入该载体之后， 可允许该细胞系中的细胞在一种富集培养基中 生长 1-2 天， 之后将其转换至选择培养基中。该选择标记的目的是产生对于选择的抗性， 而 其存在可容许成功地表达这些引入序列的细胞的生长及回收。例如， 可以使用适用于该细 胞类型的组织培养技术， 使经稳定转化细胞的抗性细胞丛增殖。无血清培养基是容易获得 的 ( 例如， JRH Biosciences、 SAFC Biosciences、 Sigma-AldrichCorporation， 全球信息网 于 sigmaaldrich.com)。在一些情形下， 无血清培养基或条件培养基 ( 例如， 先前收获自未 经转染或天然细胞培养物的生长培养基 ) 对于蛋白产生或细胞贮存 (cell-banking) 是优 选的。
     本发明包括永生的细胞或细胞系， 它们包括本发明的一种或多种多肽 ( 包括， 例 如， 二聚体或单体融合蛋白或多聚体多肽 )、 偶联物、 核酸、 或载体、 或载体。
     经由表达载体和 / 或多核苷酸转化的宿主细胞可任选地在适于表达并且从细胞 培养物中回收该经编码蛋白的条件下进行培养。 由这种重组细胞所产生的多肽或其片段可 以是分泌的、 膜连接的、 或包含于胞内的， 这取决于所使用的序列和 / 或载体。包括编码了 本发明成熟多肽的多核苷酸的表达载体可以经设计成具有信号序列， 这些序列指导这些成 熟多肽通过原核或真核细胞膜的分泌。此类信号序列典型地被纳入该载体中， 这样使得该 信号序列表达于本发明多肽的 N- 端。有关此类信号序列的原例在本文的其他地方讨论。
     多肽产生及回收
     在转导一种适当的宿主株并使该宿主株生长至适当的细胞密度之后， 可以通过适 当的手段 ( 例如， 温度偏移或化学诱导 ) 诱导该所选的启动子， 并且将细胞再培养一段时 间。 细胞典型地是通过离心而收集的， 通过物理或化学方法被破坏， 并且保留了得到的粗萃 取物进行进一步纯化。在蛋白表达中所采用的微生物细胞可通过任何常规的方法被破坏，包括冷冻 - 解冻循环、 超音处理、 机械破坏、 或使用细胞裂解剂， 或其他方法， 这些方法是本 领域中的普通技术人员所熟知。
     如所指出， 可获得诸多关于多种细胞的培养及产生的参考文献， 这些细胞包括细 菌、 植物、 动物 ( 优选为哺乳动物 )、 以及古细菌起源的细胞。见， 如， Sambrook、 Ausubel 及 Berger( 皆为以上说明文献 )， 以及 Freshney(1994)Culture of Animal Cells， a Manual of Basic Technique， 第三版， Wiley-Liss， New York 以及其中所引述的参考文献 ； Doyle and Griffiths(1997)Mammalian Cell Culture ： Essential Techniques， John Wiley and Sons， NY ； Humason(1979)Animal Tissue Techniques， 第四版， W.H.Freeman andCompany ； 及 Ricciardelli， et al.， (1989)In vitro Cell Dev.Biol.25 ： 1016 1024。 针 对 植 物 细 胞 的 培 养 及 再 生， Payne et al.(1992)Plant Cell and Tissue Culturein Liquid Systems， John Wiley&Sons， Inc.New York， N.Y. ； Gamborg andPhillips(eds.)(1995) Plant Cen， Tissue and Organ Culture ； FundamentalMethods Springer Lab Manual， Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York) ； 及 Plant Molecular Biology[1993) R.R.D.Croy， Ed.Bios ScientificPublishers， Oxford， U.K.ISBN 0 12 198370 6。细胞 培养基大体上如 Atlas andParks(eds.)The Handbook of Microbiological Media(1993) CRC Press， Boca Raton， Fla 所示。有关细胞培养的其他信息可见于可获得的商业文献， 如， 取自 Sigma-Aldrich， Inc.(St.Louis， Mo.) 的 Life Science Research CellCulture Catalogue(1998)(″ Sigma-LSRCCC″ )， 以及例如， 还取自 Sigma-Aldrich， Inc(St.Louis， Mo.) 的 Plant Culture Catalogue and supplement(1997)(″ Sigma-PCCS″ )。
     本发明的多肽可通过本领域内所熟知的诸多方法中的任何一个而从重组细胞培 养物中回收并纯化， 这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、 酸萃取、 阴离子或阳离子交换色谱 法、 磷酸纤维素层析、 疏水性相互作用层析、 亲和层析 ( 例如， 使用任何本文所提及的标记 系统 )、 羟基磷灰石层析、 以及凝集素层析。如希望， 可使用蛋白再折叠步骤， 以完成该成 熟蛋白的构型。最后， 可以在最终的纯化步骤中使用高效液相色谱法 (HPLC)。除以上所 提及的参考文献之外， 不同纯化方法皆为本领域中所熟知， 包括， 例如， 在以下中所列出的 那些 ： Sandana(1997)Bioseparation of Proteins， Academic Press， Inc. ； 及 Bollag et al.(1996)Protein Methods， 2.sup.nd EditionWiley-Liss， NY ； Walker(1996)The Protein Protocols Handbook HumanaPress， NJ ； Harris and Angal(1990)Protein Purification Applications ： APractical Approach IRL Press at Oxford， Oxford， England ； Harris and AngalProtein Purification Methods ： A Practical Approach IRL Press at Oxford， Oxford， England ； Scopes(1993)Protein Purification ： Principles and Practice3. sup.rd Edition Springer Verlag， NY ； Janson and Ryden(1998)ProteinPurification ： Principles， High Resolution Methods and Applications SecondEdition Wiley-VCH， NY ； and Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROMHumana Press， NJ.
     本领域中的普通技术人员应当理解， 本发明的融合蛋白 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) 可通过在本文中所说明的不同方法制备， 包括， 例如， 在实例 1 中给出用于制备 LEA29Y-Ig 的那些。例如， 可通过编码了本发明突变 CTLA-4 ECD 多肽 ( 例如， D3-54 多肽 ) 的核酸序列取代 LEA29Y- 编码核酸而克隆进入该 IgG2 Fc 融合载体中， 以产生编码了该突 变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 例如， D3-54-IgG2) 的载体， 表达这种突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的稳定 CHO-K1 细胞可通过用该突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白编码载体转染的此类细胞而制备， 而 得到的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 例如， D3-54-IgG2) 可如实例 1 所述进行表达 ( 典型地 是为二聚体形式 ) 及纯化。
     活体外的表达系统
     使用本发明的 DNA 和 / 或 RNA， 可采用无细胞的转录 / 翻译系统来产生本发明的重 组多肽或其片段。数种此类系统是可商购的。有关活体外的转录及翻译操作操作的广泛指 导可见于 Tymms(1995)In vitro Transcriptionand Translation Protocols ： Methods in Molecular Biology， Volume 37， GarlandPublishing， New York。
     本发明的方法
     本发明的多肽类 ( 包括， 如， 二聚体或单体融合蛋白类以及多聚体多肽类 )、 偶联 物类、 组合物类、 核酸类、 载体类、 以及细胞显示了不同特性和特征， 并且据信它们可用于不 同应用中， 这些应用包括， 但不限于， 如， 用于治疗不同免疫系统疾病、 紊乱和病况的预防性 或治疗性方法， 其中对免疫系统和免疫系统反应的调整或调节可以是有益的。例如， 据信 具有结合 CD80 和 / 或 CD86 或其任一或两者 ECD 的能力、 和 / 或抑制一种免疫应答的能力 的本发明多肽、 偶联物、 组合物、 核酸、 载体、 以及细胞可用于用以阻抑或抑制一位受试者体 内一种免疫应答的预防和 / 或治疗方法、 用以抑制受体对于来自供方的组织、 细胞、 或器官 移植的排斥的方法、 以及其他本文其他地方所述的方法。一些此类本发明的多肽、 偶联物、 组合物、 核酸、 载体、 以及细胞预期可用于调整或抑制表达 CD28 和 / 或 CTLA-4 的 T 细胞与 B7- 阳性细胞间相互作用的方法。
     在一个方面， 本发明的治疗或预防方法涉及对一位受试者给予有效量的至少一种 这种多肽 ( 包括， 如， 融合蛋白、 多聚体等 )、 偶联物、 组合物、 核酸、 载体、 和 / 或细胞， 以阻 抑或抑制一种免疫应答。在治疗性的背景下， 该受试者典型地是罹患免疫系统疾病、 紊乱、 或病况的一位受试者， 并且进行给予以预防该疾病、 紊乱或病况的进一步进展。例如， 对于 罹患一种免疫系统疾病 ( 例如， 自身免疫疾病 ) 的一位受试者给予一种本发明的分子可造 成阻抑或抑制这种免疫系统攻击或是与其相关的生物反应。 通过阻抑这种对健康体组织的 免疫系统攻击， 所述由这种对于健康组织的攻击所造成或是与其相关的得到身体症状 ( 例 如， 疼痛、 关节炎、 关节肿胀或压痛 ) 可获得减少或缓解， 并且由该免疫系统攻击所造成或 是与其相关的生物及身体损伤可获得减少、 延缓或中止。
     在预防性的背景下， 受试者可为罹患、 易罹患或是据信具有一种免疫系统疾病、 紊 乱或病况的， 并且典型地是进行给予以预防该疾病、 紊乱或病况的进展、 抑制或缓解与其相 关的症状、 征兆、 或生物反应、 预防潜在地由它产生的身体损伤、 和 / 或维持或提高受试者 的身体机能。
     在一个方面， 本发明提供一种调整表达 CD28 和 / 或 CTLA-4 的 T 细胞与 B7- 阳性细 胞间相互作用的方法， 该方法包括将 B7- 阳性细胞与有效量的下列至少一个接触， 以调节 B7- 阳性细胞与 CD28- 阳性 T 细胞和 / 或 CTLA-4- 阳性 T 细胞间的相互作用 ： (1) 一种本发 明的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4-ECD 多肽或是二聚体或单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) ； (2) 包括一个或多个本发明多肽的一种多聚体 ( 例如， 包括任何两个此类多肽的一种二聚体， 或是包括任何四个此类多肽的一种四聚体 ) ； (3) 包括至少一种本发明多肽的一种偶联物 ； (4) 一种本发明的核酸 ( 例如， 一种编码本发明多肽的核酸 ) ； (5) 包括一种本发明核酸或是编码一种本发明多肽的一种载体 ； (6) 包括一种本发明的多肽、 核酸、 偶联物、 和 / 或载体 的细胞或多个细胞的一个群体 ； 和 / 或 (7) 本发明的组合物， 其中 B7- 阳性细胞与 CD28- 阳 性 T 细胞和 / 或 CTLA-4- 阳性 T 细胞间的相互作用受到了调节。典型地， 该调整作用是一 种抑制性作用， 这样使得 B7- 阳性细胞与 CD28- 阳性 T 细胞和 / 或 CTLA-4- 阳性 T 细胞间 的相互作用受到抑制。在一些情形下， 所述 B7- 阳性细胞是抗原呈递细胞 (APC)。在一些 此类方法中， 抑制 B7-2- 阳性细胞 ( 例如， 表达 B7-2(CD86) 的 APC) 与 CD28- 阳性 T 细胞间 的相互作用。在一些此类方法中， 抑制 B7-1- 阳性细胞 ( 例如， 表达 B7-1(CD80) 的 APC) 与 CD28- 阳性 T 细胞间的相互作用。
     在另一个方面， 本发明提供一种抑制 CD28- 阳性 T 细胞和 / 或 CTLA-4- 阳性 T 细胞 与 B7- 阳性细胞间相互作用的方法， 该方法包括将 B7- 阳性细胞 ( 例如， B7-1- 阳性细胞和 / 或 B7-2- 阳性细胞 ) 与有效量的至少一种下列的本发明分子或组分接触， 以抑制 CD28- 阳 性 T 细胞和 / 或 CTLA-4- 阳性 T 细胞与 B7- 阳性细胞间的相互作用 ： (1) 一种本发明的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4-ECD 多肽或是二聚体或单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) ； (2) 包括一个 或多个本发明多肽的一种多聚体 ( 例如， 包括任何两个此类多肽的一种二聚体， 或是包括 任何四个此类多肽的一种四聚体 ) ； (3) 包括至少一种本发明多肽的一种偶联物 ； (4) 一种 本发明的核酸 ( 例如， 编码本发明多肽的核酸 ) ； (5) 包括一种本发明核酸或是编码一种本 发明多肽的一种载体 ； (6) 包括一种本发明的多肽、 核酸、 偶联物、 和 / 或载体的细胞或多个 细胞的一个群体 ； 和 / 或 (7) 本发明的组合物， 其中 CD28- 阳性 T 细胞和 / 或 CTLA-4- 阳性 所述 B7- 阳性细胞是 APC。 T 细胞与 B7- 阳性细胞间的相互作用受到抑制。在一些情形下， 在一些此类情形下， 抑制 CD28- 阳性 T 细胞与 hB7-1- 阳性细胞和 / 或 hB7-2- 阳性细胞间 的相互作用。在一些此类方法中， CD28- 阳性 T 细胞与 hB7-1- 阳性细胞和 / 或 hB7-2- 阳 性细胞间相互作用的抑制造成以下的一项或多项的阻抑或抑制 ： T 细胞的活化或增殖、 细 胞因子的合成或生成 ( 例如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2 的生成 )、 不同活化标记 ( 例如， CD25、 IL-2 受体 ) 的诱发、 炎症、 关节肿胀或压痛、 C- 反应性蛋白的血清含量、 抗胶原抗体生成、 和 / 或一种或多种 T 细胞相依赖的抗体反应。
     在一些此类方法中， 是对一位受试者给予有效量的至少一种这种本发明的分子或 组分， 以在该受试者体内抑制内源性 CD28- 阳性 T 细胞与内源性 B7-1- 阳性细胞和 / 或 B7-2- 阳性细胞间的相互作用。在一些此类方法中， 抑制内源性 CD28- 阳性 T 细胞与表达 B7-2(CD86) 或 B7-1(CD80) 的 B7- 阳性细胞。在一些情形下， 该 B7- 阳性细胞是表达 B7-2 或 B7-1 的 APC， 并且抑制 B7-2 或 B7-1 与 CD28- 阳性 T 细胞间的相互作用。在一些情形下， 还抑制表达于 APC 上的 B7-2 和 B7-1 两者与 CD28- 阳性 T 细胞间的相互作用。
     在另一个方面， 本发明提供一种在活体外或活体内阻抑一种免疫应答的方法。该 方法包括将 B7- 阳性细胞与有效量的至少一种下列的本发明分子或组分接触， 以阻抑一 种免疫应答 ： (1) 一种本发明的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4-ECD 多肽或是二聚体或单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) ； (2) 包括一个或多个本发明多肽的一种多聚体 ( 例如， 包括任何两 个此类多肽的一种二聚体， 或是包括任何四个此类多肽的一种四聚体 ) ； (3) 包括至少一种 本发明多肽的一种偶联物 ； (4) 一种本发明的核酸 ( 例如， 一种编码本发明多肽的核酸 ) ； (5) 包括一种本发明核酸或是编码一种本发明多肽的一种载体 ； (6) 包括一种本发明的多 肽、 核酸、 偶联物、 和 / 或载体的细胞或多个细胞的一个群体 ； 和 / 或 (7) 本发明的组合物，其中一种免疫应答由此受到阻抑。它可阻抑一种或多种免疫应答， 包括， 如， T 细胞应答、 T 细胞的增殖或活化、 细胞因子的合成或生成、 炎症、 关节肿胀或压痛、 C- 反应性蛋白的血清 水平、 抗胶原抗体生成、 和 / 或一种或多种 T 细胞相依赖的抗体反应。在所述包括将 B7- 阳 性细胞与本发明多肽接触的方法中， 该多肽结合表达于 B7- 阳性细胞上的 B7-1( 例如， 人类 B7-1)， 和 / 或结合表达于 B7- 阳性细胞上的 B7-2( 例如， 人类 B7-2)。在一些情形下， 所述 B7- 阳性细胞是 APC。在一些情形下， 一种免疫应答是在试管中受到阻抑， 诸如， 如， 在活体 外的分析中， 包括所说明于本文其他地方详细说明的 ( 见， 如， 以下的实例 )。在一些情形 下， 一种免疫应答是在对其给予有效量以阻抑一种免疫应答的一位受试者体内于活体中受 到阻抑， 诸如， 如， 在治疗性或预防性的治疗方法中 ( 例如， 治疗关节疾病， 诸如， 类风湿性 关节炎， 或是其他免疫疾病的方法 )， 于本文其他地方详细说明。
     在另一个方面， 本发明提供一种在一位受试者体内 ( 例如， 哺乳动物， 诸如， 一个 人 ) 阻抑一种免疫应答的方法。该方法包括对需要阻抑的受试者给予可在该受试者体内阻 抑一种免疫应答的治疗或预防有效量 ( 例如， 治疗或预防有效剂量 ) 的至少一种下列的本 发明分子或组分 ： (1) 一种本发明的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4-ECD 多肽或是二聚体或单体 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) ； (2) 包括一个或多个本发明多肽的一种多聚体 ( 例如， 包括任 何两个此类多肽的一种二聚体， 或是包括任何四个此类多肽的一种四聚体 ) ； (3) 包括至少 一种本发明多肽的一种偶联物 ； (4) 一种本发明的核酸 ( 例如， 编码一种本发明多肽的一种 核酸 ) ； (5) 包括一种本发明核酸或是编码一种本发明多肽的一种载体 ； (6) 包括一种本发 明的多肽、 核酸、 偶联物、 和 / 或载体的一个细胞或多个细胞的一个群体 ； 和 / 或 (7) 本发明 的组合物， 其中该受试者体内的一种免疫应答由此受到阻抑。
     在另一个方面， 本发明提供一种治疗患有免疫系统疾病或紊乱的一位受试者的方 法， 该疾病或紊乱是由内源性 T 细胞与表达 CD80 和 / 或 CD86 的内源性细胞间的相互作用 而调整。该方法包括对需要这种治疗的受试者给予治疗有效量的 ： (1) 一种本发明的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4-ECD 多肽或是二聚体或单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) ； (2) 包括一个 或多个本发明多肽的一种多聚体 ( 例如， 包括任何两个此类多肽的一种二聚体， 或是包括 任何四个此类多肽的一种四聚体 ) ； (3) 包括至少一种本发明多肽的一种偶联物 ； (4) 一种 本发明的核酸 ( 例如， 编码一种本发明多肽的一种核酸 ) ； (5) 包括一种本发明核酸或是编 码一种本发明多肽的一种载体 ； (6) 包括一种本发明的多肽、 核酸、 偶联物、 和 / 或载体的一 个细胞或多个细胞的一个群体 ； 和 / 或 (7) 本发明的组合物， 由此治疗该受试者体内的免疫 系统疾病或紊乱。如受试者是一个人， CD80 是人类 CD80、 CD86 是人类 CD86、 并且 CD28 是人 类 CD28。在一些此类方法中， 抑制表达 CD28 的内源性 T 细胞与表达 CD86 的内源性细胞和 / 或表达 CD80 的内源性细胞间的相互作用。
     据信不同免疫系统疾病或紊乱， 包括关节或自身免疫系统的疾病或紊乱， 皆可使 用本文所披露的一种或多种本发明的分子而有效治疗， 诸如， 一种突变 CTLA-4ECD 多肽 ( 例如， SEQ ID NOS ： 1 至 73 中的任何一个， 诸如， 如， D3-54(SEQ ID NO ： 36)、 D3-69(SEQ ID NO ： 50) 或 D3-27(SEQID NO ： 24) 突变 CTLA-4 ECD)， 或是它的一个融合蛋白 ( 例如， D3-54-IgG2(SEQ ID NO ： 197 或 211)、 D3-69-IgG2(SEQ ID NO ： 199 或 213)、 D3-29-IgG2(SEQ ID NO ： 79 或 210))。该免疫系统的疾病或紊乱可为或是涉及， 如， 但不限于， 阿狄森氏病、 过敏、 斑秃、 阿耳兹海默氏病、 抗嗜中性细胞胞质抗体 (ANCA)- 相关性脉管炎、 强直性脊柱炎、 抗磷脂综合征 ( 休斯综合征 )、 关节炎、 哮喘、 动脉硬化、 动脉硬化斑块、 自身免疫疾病 ( 例如， 狼疮、 RA、 MS、 格雷夫斯氏病、 等等 )、 自身免疫性溶血性贫血、 自身免疫性肝炎、 自身 免疫性内耳病、 自身免疫性淋巴增生综合征、 自身免疫性心肌炎、 自身免疫性卵巢炎、 自身 免疫性睾丸炎、 无精子症、 贝切特氏病、 贝切特氏综合征、 贝格尔氏病、 大疱性类天疱疮、 心 肌症、 心血管疾病、 口炎性腹泻 / 乳糜泻、 慢性疲劳免疫功能障碍综合征 (CFIDS)、 慢性自发 性多发神经炎、 慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经疾病 (CIPD)、 慢性复发性多发性神经病变 ( 格 - 巴二氏综合征 )、 丘 - 施二氏血管炎 (CSS)、 瘢痕性类天疱疮、 冷凝集素病 (CAD)、 COPD、 CREST 综合征、 克罗恩病、 疱疹样皮炎、 皮肌炎、 糖尿病、 盘状狼疮、 湿疹、 后天性大疱性表皮 松解症、 原发性混合型冷凝球蛋白血症、 伊凡斯氏综合征、 眼球突出症、 纤维肌痛、 古德帕斯 彻氏综合征、 移植物相关性疾病或紊乱、 格雷夫斯氏病、 GVHD、 桥本甲状腺炎、 特发性肺纤维 化、 特发性血小板减少性紫癜 (ITP)、 IgA 肾病、 免疫增生性疾病或紊乱 ( 例如， 银屑病 )、 炎 症性肠病 (IBD)、 胰岛素依赖型糖尿病 (IDDM)、 间质性肺病、 幼年型糖尿病、 幼年型关节炎、 幼年型特发性关节炎 (JIA)、 川崎氏病、 朗 - 伊二氏肌无力综合征、 扁平苔藓、 狼疮、 狼疮肾 炎、 淋巴细胞性垂体炎、 美尼尔氏病、 米勒费雪综合征 / 急性播散性脑脊髓脊神经根病、 混 合性结缔组织病、 多发性硬化症症 (MS)、 肌风湿病、 肌痛性脑脊髓炎 (ME)、 重症肌无力、 眼 部炎症、 落叶型天疱疮、 寻常型天疱疮、 恶性贫血、 结节性多动脉炎、 多软骨炎、 多腺体综合 征 ( 怀塔克综合征 )、 风湿性多肌痛、 多发性肌炎、 原发性无丙种球蛋白血症、 原发性胆汁性 肝硬化 / 自身免疫性胆道疾病、 银屑病、 银屑病性关节炎、 雷诺氏现象、 莱特尔氏综合征 / 反 再狭窄、 风湿热、 风湿性疾病、 类风湿性关节炎、 肉样瘤病、 施密特氏综合征、 硬 应性关节炎、 皮病、 斯耶格伦氏综合症、 实体器官移植体排斥 ( 肾、 心脏、 肝、 肺、 等等 )、 僵人综合征、 系统 性红斑狼疮 (SLE)、 系统性硬皮病、 高安氏动脉炎、 颞动脉炎 / 巨细胞动脉炎、 甲状腺炎、 I型 糖尿病、 II 型糖尿病、 溃疡性结肠炎、 眼色素层炎、 脉管炎、 白癜风、 韦格纳氏肉芽肿病， 以及 预防或阻抑与由一位受方受试者对于一种供方的组织、 细胞、 移植物、 或器官移植体的排斥 相关联的一种免疫应答移植物相关性疾病或紊乱包括移植物对抗宿主疾病 (GVDH)， 诸如， 与骨髓移植相关的， 以及由与对于器官、 组织、 或细胞移植物的移植 ( 例如， 组织或细胞同 种移植物或异种移植物， 包括， 如， 皮肤、 肌肉、 神经元、 胰岛、 器官、 肝实质细胞等的移植物 ) 的排斥造成的或是与其相关的免疫紊乱。 关于一位受方受试者体内的供方的组织、 细胞、 移 植物或实体器官的移植而言， 据信本文所披露的此类本发明分子 ( 例如， 突变 CTLA-4-ECD 多肽或是突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) 可有效预防这种移植在受方体内的急性排斥， 和/或 就长期的维持治疗而言可预防这种移植在受方体内的排斥 ( 例如， 抑制来自供方的胰岛素 生产性胰岛细胞移植在罹患糖尿病的受方受试者体内的排斥 )。
     本发明包括任何此类本发明的突变 CTLA-4-ECD 多肽或是突变 CTLA-4-Ig 融合蛋 白， 其用于阻抑与至少一种以上说明的免疫系统疾病或紊乱相关的一种免疫应答。本发明 还提供任何此类本发明的突变 CTLA-4-ECD 多肽或是突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白在制造用于 阻抑与至少一种以上说明免疫系统疾病或紊乱相关的一种免疫应答的一种药物中的用途。
     在在本文中所说明的方法中， 本发明的分子， 诸如， 如， 一种突变 CTLA-4-ECD 多 肽 ( 例如， D3-54、 D3-69、 D3-29、 D3-56、 D3-75) 或是包括一种本发明突变 CTLA-4-ECD 多 肽的一种 Ig 融合蛋白 ( 对应地如， D3-54-IgG2、 D3-69-IgG2、 D3-29-IgG2、 D3-56-IgG2、 D3-75-IgG2)， 用以在受试者体内阻抑一种免疫应答或是治疗由该受试者体内内源性 T 细胞与表达 CD80 和 / 或 CD86 的内源性细胞间的相互作用调整的免疫系统疾病或紊乱的有效 量可包括从大约 0.0001 微克每千克 (mg/kg) 受试者体重至大约 200 微克每千克 (mg/kg) 受试者体重， 诸如， 如， 从大约 0.001 微克每千克 (mg/kg) 受试者体重至大约 100 微克每千 克 (mg/kg) 受试者体重， 或是， 如， 从大约 0.001mg/kg 受试者体重到至少大约 0.005、 0.01、 0.025、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 25、 50 或 75mg/kg 受试者体重。它可在该受试者体内阻抑一种或多种免疫应答， 包括， 如， T 细胞应 答、 T 细胞的活化或增殖、 细胞因子的合成或生成 ( 例如， TNF-α、 IFN-γ、 IL-2 等的生成 )、 不同活化标记 ( 例如， CD25、 IL-2 受体等 ) 的诱发、 炎性分子的合成或生成、 炎症、 关节肿胀、 关节压痛、 疼痛、 僵硬、 C- 反应性蛋白的血清含量、 抗胶原抗体生成、 和 / 或 T 细胞相依赖的 抗体反应。 用以阻抑一种免疫应答的本发明分子或组分的有效量可为可以可侦测的量测量 而阻抑一种免疫应答或其症状或征兆的量。该免疫应答可以被部份或完全阻抑。用以治疗 免疫系统疾病或紊乱的有效量可为可舒缓、 减少、 或缓解至少一种与该疾病或紊乱相关的 症状或生物反应或相互作用、 预防该疾病或紊乱的进展或改善该受试者身体机能的量。
     用以调整或抑制表达 CD28 和 / 或 CTLA-4 的 T 细胞与 B7- 阳性细胞间反应的本 发明分子或组分的有效量可为可对应地调整或抑制 B7- 阳性细胞与 CD28- 阳性和 / 或 CTLA-4- 阳性 T 细胞间结合的量。这种或这些结合相互作用可以被部份或完全的调整或抑 制。
     在一些此类方法中， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体是以足以阻抑一种 免疫应答、 治疗由 T 细胞与 B7- 表达性细胞间的相互作用调整的免疫系统疾病或紊乱或是 调整或抑制表达 CD28 和 / 或 CTLA-4 的 T 细胞与 B7- 阳性细胞间的反应的治疗或预防有效 量 ( 或剂量 ) 而对该受试者进行给予。 该经给予的融合蛋白二聚体典型地是一种可溶性 Ig 融合蛋白二聚体。在一些此类方法中， 本发明融合蛋白二聚体的有效量或剂量包括从大约 0.001 毫克每千克 (mg/kg) 受试者体重至大约 200 毫克每千克 (mg/kg) 受试者 ( 诸如， 如， 一 个人 ) 体重， 或是从大约 0.001mg/kg 至大约 300mg/kg 受试者体重。例如， 该融合蛋白二聚 体的有效量或剂量包括从大约 0.001mg/kg 受试者体重到至少大约 0.005、 0.01、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1、 2、 3、 4、 5、 10、 25、 30、 40、 50、 60、 75、 80、 90、 100、 125、 150、 175、 200、 225、 250 或 300mg/kg 受试者 ( 诸如， 如， 人类， 包括成人 ) 体重。在一些情形 下， 该有效量或剂量是从大约 0.001 毫克 (mg) 至大约 50 毫克每千克 (kg) 受试者体重， 它包 括， 但不限于， 对该受试者给予从大约 0.01mg/kg 至大约 100mg/kg 受试者 ( 例如， 人类 ) 体 重， 从大约 0.01mg/kg 至大约 50mg/kg 受试者体重， 或是从大约 0.01mg/kg 至大约 25mg/kg 受试者体重 ； 例如， 大约 0.05mg/kg、 0.075mg/kg、 0.1mg/kg、 0.15mg/kg、 0.2mg/kg、 0.25mg/ kg、 0.3mg/kg、 0.5mg/kg、 0.75mg/kg、 1mg/kg、 1.5mg/kg、 2mg/kg、 2.5mg/kg、 3mg/kg、 5mg/kg、 大约 10mg/kg、 20mg/kg、 25mg/kg、 50mg/kg、 75mg/kg 或 100mg/kg 受试者 ( 例如， 成人病患 ) 体重。在一些情形下， 该融合蛋白二聚体的有效量或剂量是从大约 2 至 10mg/kg、 大约 3 至 10mg/kg、 大约 3 至 5mg/kg、 大约 5 至 10mg/kg、 0.1 至 5mg/kg、 大约 0.05 至 1.0mg/kg、 大约 0.05 至 3mg/kg、 大约 0.05 至 2.0mg/kg、 大约 0.05 至 1.0mg/kg、 大约 0.1 至 2.0mg/kg、 大 约 0.1 至 3.0mg/kg、 大约 0.1 至 0.5mg/kg、 大约 0.1 至 0.8mg/kg、 大约 0.1 至 0.6mg/kg、 大 约 0.01mg/kg 至大约 0.05mg/kg、 大约 0.01mg/kg 至大约 0.1mg/kg、 大约 0.01mg/kg 至大约 0.05mg/kg、 大约 0.01mg/kg 至大约 1mg/kg、 大约 0.01 至大约 5mg/kg、 大约 0.01mg/kg 至大约 3mg/kg、 大约 0.05mg/kg 至大约 2.5mg/kg、 大约 0.1mg/kg 至大约 1mg/kg、 大约 0.1mg/kg 至大约 5mg/kg、 大约 0.2 至 1mg/kg、 大约 0.2 至 0.6mg/kg、 大约 0.2 至 0.5mg/kg 大约 0.3 至 1mg/kg、 大约 0.3 至 0.6mg/kg、 大约 0.3 至 0.5mg/kg 受试者体重。 在一些情形下， 该有效 量或剂量对于体重小于 60kg 的受试者而言是小于大约 500mg( 例如， 小于大约 100mg、 75mg、 50mg、 25mg、 12.5mg 或 10mg)， 对于体重介于 60-100kg 的受试者而言是小于大约 750mg( 例 如， 小于大约 150mg、 100mg、 75mg、 37.5mg 或 20mg)， 或是对于体重超过 100kg 的受试者而言 是小于大约 1000mg( 例如， 小于大约 500mg、 100mg、 50mg、 25mg、 或 10mg)。
     在另一个方面， 在一些此类本发明的方法中， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 是以， 如， 足以阻抑一种免疫应答、 治疗由 T 细胞与 B7- 表达性细胞间的相互作用调整的免 疫系统疾病或紊乱或是调整或抑制表达 CD28 和 / 或 CTLA-4 的 T 细胞与 B7- 阳性细胞间的 反应的治疗或预防有效量或剂量而对该受试者进行给予。该融合蛋白 ( 它通常是可溶性融 合蛋白 ) 的有效量或剂量可包括从大约 0.001mg/kg 至大约 300mg/kg、 大约 0.001mg/kg 至 大约 200mg/kg、 或大约 0.001mg/kg 至大约 300mg/kg 该受试者 ( 例如， 人类 ) 体重。在一个 方面， 该融合蛋白的有效量或剂量包括从大约 0.001mg/kg 到至少大约 0.005、 0.01、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1、 2、 3、 4、 5、 10、 25、 30、 40、 50、 60、 75、 80、 90、 100、 125、 150、 175、 200、 225、 250、 或 300mg/kg 受试者体重。在另一个方面， 该有效量或剂量是从 大约 0.01mg/kg 至大约 100mg/kg、 从大约 0.01mg/kg 至大约 50mg/kg 或从大约 0.01mg/kg 至大约 25mg/kg 受试者体重。示例性的剂量或量包括大约 0.05mg/kg、 0.075mg/kg、 0.1mg/ kg、 0.15mg/kg、 0.2mg/kg、 0.25mg/kg、 0.3mg/kg、 0.5mg/kg、 0.75mg/kg、 1mg/kg、 1.5mg/kg、 2mg/kg、 2.5mg/kg、 3mg/kg、 5mg/kg、 大 约 10mg/kg、 20mg/kg、 25mg/kg、 50mg/kg、 75mg/kg、 以 及 100mg/kg 受试者 ( 例如， 成人 ) 体重。 在另一个方面， 该融合蛋白的有效量或剂量是从大 大约 5 至 10mg/kg、 0.1 至 5mg/kg、 大 约 2 至 10mg/kg、 大约 3 至 10mg/kg、 大约 3 至 5mg/kg、 约 0.05 至 1.0mg/kg、 大约 0.05 至 3mg/kg、 大约 0.05 至 2.0mg/kg、 大约 0.05 至 1.0mg/kg、 大约 0.1 至 2.0mg/kg、 大约 0.1 至 3.0mg/kg、 大约 0.1 至 0.5mg/kg、 大约 0.1 至 0.8mg/kg、 大约 0.1 至 0.6mg/kg、 大约 0.01mg/kg 至大约 0.05mg/kg、 大约 0.01mg/kg 至大约 0.1mg/kg、 大约 0.01mg/kg 至大约 0.05mg/kg、 大约 0.01mg/kg 至大约 1mg/kg、 大约 0.01 至大约 5mg/ kg、 大约 0.01mg/kg 至大约 3mg/kg、 大约 0.05mg/kg 至大约 2.5mg/kg、 大约 0.1mg/kg 至大 约 1mg/kg、 大约 0.1mg/kg 至大约 5mg/kg、 大约 0.2 至 1mg/kg、 大约 0.2 至 0.6mg/kg、 大约 0.2 至 0.5mg/kg 大约 0.3 至 1mg/kg、 大约 0.3 至 0.6mg/kg、 大约 0.3 至 0.5mg/kg 受试者体 重。 在一些方面中， 该有效量或剂量对于体重小于 60kg 的受试者而言是小于大约 500mg( 例 如， 小于大约 100mg、 75mg、 50mg、 25mg、 12.5mg、 或 10mg)， 对于体重介于 60-100kg 的受试者 而言是小于大约 750mg( 例如， 小于大约 150mg、 100mg、 75mg、 37.5mg、 或 20mg)， 或是对于体 重超过 100kg 的受试者而言是小于大约 1000mg( 例如， 小于大约 500mg、 100mg、 50mg、 25mg 或 10mg)。
     足以类似阻抑一种免疫应答或是调整、 治疗由 T 细胞与 B7- 表达性细胞间的相 互作用调整的免疫系统疾病或紊乱或是调整或阻抑表达 CD28 和 / 或 CTLA-4 的 T 细胞与 B7- 阳性细胞间的反应的一种本发明核酸、 载体、 组合物、 和 / 或细胞的有效量可经确定。 例 如， 如欲将编码这种本发明融合蛋白二聚体的一种载体给予至该受试者， 本领域中的普通 技术人员可轻易确定有待给予的载体量， 这样使得希望的治疗或预防有效量的融合蛋白二聚体可能在该受试者体内产生。
     示例性的本发明融合蛋白二聚体包括任何所述说明于以上及本文中的， 它包括， 如， 包括两种相同融合蛋白单体的一种融合蛋白二聚体， 其中每种融合蛋白单体包括一种 本发明的突变 CTLA-4-ECD 多肽， 以其 C- 端融合 Ig Fc 多肽 ( 例如， IgG2Fc、 IgG1、 IgG4 或 是可降低效应功能的突变 Ig Fc 多肽 ) 的 N- 端。一种示例性的突变 CTLA-4 ECD 多肽包括 选自下组的一个多肽序列， 该组的构成为 SEQ ID NOS ： 1 至 73。一种示例性的融合蛋白二 聚体包括两种融合蛋白单体， 其中每中融合蛋白单体包括选自下组的一个多肽序列， 该组 的构成为 SEQ ID NOS ： 74-79、 197-200、 205-214 以及 219-222。典型地， 该二聚体融合蛋白 中的两个单体融合蛋白是经由至少一个二硫键而共价地连接在一起， 该二硫键在每个单体 中存在的一个或多个半胱氨酸残基之间形成。
     在任何以上说明的方法中， 本发明的分子或组分 ( 例如， 本发明的多肽 ( 包括， 如， 二聚体或单体融合蛋白或是多肽多聚体 )、 偶联物、 核酸、 载体、 组合物、 和 / 或细胞 ) 可以作 为一种组合物对该受试者进行给予。该组合物典型地包括至少一种这种分子或组分， 以及 一种赋形剂、 载体、 或稀释剂。该组合物可包括一种药物组合物， 该药物组合物包括至少一 种这种分子或组分， 以及一种药学上可接受的赋形剂、 载体、 或稀释剂 ( 例如， PBS)。本发明 组合物的 pH 典型地是在从大约 pH 6.0 至大约 pH 9.0 的范围内， 包括， 如， 从大约 pH 6.5 至大约 pH 8.5， 通常从大约 pH 7.0 至大约 pH8.0 之间。在一个方面， 本发明组合物的 pH 典 型地是在从大约 pH 3 至大约 pH 10、 从大约 pH 4 至大约 pH 10、 从大约 pH 5 至大约 pH 9、 从大约 pH 6.0 至大约 pH 6.7、 从 从大约 pH 6 至大约 pH 9、 从大约 pH 5.5 至大约 pH 8.5、 大约 pH 6.0 至大约 pH 6.5、 从大约 pH 6.2 至大约 pH 8.7、 从大约 pH 6.5 至大约 pH 7.5、 从大约 pH 6.2 至大约 pH 7.0、 从大约 pH 6.3 至大约 pH 6.8、 从大约 pH 6.4 至大约 pH 6.8 以及大约 pH 7.0 至大约 pH 7.4 的范围内。在一个方面， 包括至少一种这种本发明的分子 或组分 ( 诸如， 如， 一种突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) 的一种组合物具有 pH 5.5、 pH 6.0、 pH 6.1、 pH 6.2、 pH 6.3、 pH 6.4、 pH 6.5、 pH 6.6、 pH 6.7、 pH 6.8、 pH 6.9、 pH 7.0、 pH 7.1、 pH 7.2、 pH 7.3、 pH 7.4、 pH 7.5、 pH 7.6、 pH 7.7、 pH 7.8、 pH 7.9、 pH 8.0、 pH 8.1、 pH 8.2、 pH 8.3、 pH 8.4、 pH 8.5、 pH 8.6、 pH 8.7、 pH 8.8、 pH 8.9、 pH 9.0、 pH 9.1、 pH 9.2、 pH 9.3、 pH 9.4、 pH 9.5、 pH 9.6、 pH 9.7、 pH 9.8、 pH 9.9、 或 pH 10.0 的 pH 值。一些本发明的组合 物包括一种或多种盐 ( 例如， 氯化钠、 磷酸钠、 氯化钙、 及其类似物 )、 一种或多种缓冲剂 ( 例 如， HEPES、 柠檬酸钠、 磷酸钠 ( 例如， Na2HPO4/Na3PO4)、 琥珀酸盐、 酒石酸盐、 富马酸盐、 葡萄 糖酸盐、 草酸盐、 乳酸盐、 醋酸盐、 三 ( 羟甲基 ) 氨基甲烷 (Tris)、 及其类似物 )、 一、 二、 三、 四、 五个或以上的糖或糖类 ( 例如， 蔗糖、 甘露糖、 麦芽糖、 海藻糖、 葡萄糖、 及其类似物 )、 和 / 或一、 二、 三、 四个或以上的多元醇或糖醇 ( 例如， 甘露糖醇、 山梨糖醇、 乙二醇、 甘油、 阿拉 伯糖醇、 赤藓糖醇、 木糖醇、 核糖醇、 乳糖醇、 及其类似物 )。可将一、 二、 三、 四、 五个、 或以上 的单糖、 二糖和 / 或多糖包括于该组合物中。本发明的组合物可包括在对该受试者进行给 予时可有效阻抑一种免疫应答的任何浓度的这种分子或组合物。例如， 在一些此类方法中 ( 包括， 如， 其中需要免疫抑制的方法， 诸如， 但不限于， 如， 类风湿性关节炎或类似免疫紊乱 的治疗， 或是用以抑制受方受试者对于来自供方的组织、 细胞、 移植物、 或器官移植的排斥 的 )， 其是将包括一种药学上可接受的载体、 赋形剂、 或稀释剂以及本发明的融合蛋白二聚 体的一种药物组合物对该受试者进行给予 ( 例如， 经胃肠外、 皮下、 静脉内、 肌内等 )， 其中该药物组合物包括本发明的融合蛋白二聚体， 其浓度是从大约 0.001mg/ml 至大约 200mg/ ml、 大约 0.001mg/ml 至大约 300mg/ml、 大约 0.01mg/ml 至大约 200mg/ml、 大约 0.01mg/ml 至大约 250mg/ml、 大约 0.1mg/ml 至大约 200mg/ml、 大约 0.001mg/ml 至大约 100mg/ml、 大 约 0.001mg/ml 至大约 90mg/ml、 大约 0.01mg/ml 至大约 90mg/ml、 大约 0.01mg/ml 至大约 75mg/ml、 大约 0.1 至大约 80mg/ml、 大约 0.1 至大约 75mg/ml、 大约 0.1 至大约 60mg/ml、 大 约 0.1 至大约 50mg/ml、 大约 0.1 至大约 40mg/ml、 大约 0.1 至大约 30mg/ml、 大约 1 至大约 90mg/ml、 大约 1 至大约 80mg/ml、 大约 1 至大约 75mg/ml、 大约 1 至大约 60mg/ml、 大约 1 至 大约 50mg/ml、 大约 1 至大约 40mg/ml、 大约 1 至大约 30mg/ml、 大约 1 至大约 20mg/ml、 大约 1 至大约 10mg/ml、 大约 1 至大约 5mg/ml、 大约 5 至大约 90mg/ml、 大约 5 至大约 80mg/ml、 大 约 5 至大约 75mg/ml、 大约 5 至大约 60mg/ml、 大约 5 至大约 50mg/ml、 大约 5 至大约 40mg/ ml、 大约 5 至大约 30mg/ml、 大约 5 至大约 20mg/ml、 大约 5 至大约 10mg/ml、 大约 1 至大约 5mg/ml、 大约 10 至大约 75mg/ml、 大约 25mg/ml 至大约 75mg/ml、 大约 30mg/ml 至大约 60mg/ ml、 大约 25 至大约 50mg/ml、 大约 50mg/ml 至大约 100mg/ml， 它包括， 如， 大约 1mg/ml、 5mg/ ml、 10mg/ml、 大约 15mg/ml、 大约 25mg/ml、 大约 30mg/ml、 大约 40mg/ml、 大约 50mg/ml、 大约 60mg/ml、 大约 70mg/ml、 大约 80mg/ml、 大约 90mg/ml 或 100mg/ml。也可考虑其他浓度。在 部分在本文中所说明的本发明方法中， 包括部分的治疗或预防方法， 它可经由单一的 i.v.、 s.c.、 i.m. 或 i.p. 注射而将介于大约 0.01 毫升 (ml) 至大约 10ml、 大约 0.01ml 至大约 5ml、 大约 0.1ml 至大约 5ml、 大约 0.5ml 至大约 2ml、 大约 1ml 至大约 2ml 之间的体积， 它包 括， 如， 0.01ml、 0.025ml、 0.05ml、 0.1ml、 0.2ml、 0.3ml、 0.4ml、 0.5ml、 0.75ml、 1ml、 2ml、 3ml、 4ml、 5ml、 10ml、 20ml、 25ml、 50ml、 75ml、 100ml、 200ml、 250ml、 300ml、 500ml、 1000ml 等的体积 的任何这种包括本发明融合蛋白的组合物 ( 例如， 药物组合物 ) 对该受试者进行给予。关 于本发明示例性组合物的进一步细节于本文其他地方讨论
     对一特定受试者进行给予的本发明分子的有效量或剂量可根据， 如， 该待治疗的 疾病、 紊乱、 或病况、 该待给予特定本发明突变 CTLA-4 分子的强度 ( 即， 其功效 )( 例如， 本 发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 )、 该分子的给药模式、 以及该受试者耐受特定量 的特定分子的个别能力而各异。例如， 在一种用以在罹患类风湿性关节炎 (RA) 的受试者 体内阻抑一种免疫应答的方法中， 或是一种用以治疗 RA 的方法中， 待对该受试者给予的本 发明突变 CTLA-4-Ig 二聚体 ( 例如， D3-29-IGg2、 D3-54-IgG2、 D3-56-IgG2、 D3-69-IgG2、 D3-75-IgG2 等 ) 的有效量或剂量可根据不同因素而确定， 包括该突变 CTLA-4-Ig 二聚体的 强度、 该二聚体的给药模式、 和 / 或该受试者类风湿性关节炎症状或征兆的严重性。在一个 方面， 本发明特定突变 CTLA-4-Ig 二聚体的有效量或剂量可通过比较这种突变 CTLA-4-Ig 二聚体的强度与 二聚体的强度而确定。可有效治疗类风湿性关节炎和相关紊 乱的 二聚体剂量是为本领域中所已知的。例如， 二聚体典型地是以 大约 10mg 每千克 (kg) 人类体重的剂量， 经由静脉内而对罹患类风湿性关节炎 的一个人给予。相较 大约为 “X” 倍较强的一种本发明突变 CTLA-4-Ig 二聚体可 以相较该 二聚体剂量大约为 “X” 倍较小的剂量而对罹患类风湿性关节炎的一个 人给予 ( 例如， 经静脉内、 皮下、 或以其他在本文中所说明的方式 )， 以达成大约相当于该 二聚体的治疗相互作用 ( 例如， 阻抑一种免疫应答 )。如需要较大的治疗相互作 用， 可轻易确定比例增加的突变 CTLA-4-Ig 二聚体的量或剂量， 并对该人进行给予。在任何在本文中所说明的等方法中， 本发明的分子或组分 ( 例如， 本发明的多肽 ( 包括， 如， 二聚体或单体融合蛋白或多肽多聚体 )、 偶联物、 核酸、 载体、 组合物和 / 或细胞 ) 可经胃肠外、 皮下、 或静脉内， 或是如本文其他地方所述进行给予。本发明的分子或组分可 以治疗有效的量而每周、 每双周 ( 每两周 ) 或每双月 ( 每两个月 ) 各一、 二、 三或四次进行 给予。给予可持续 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 或 12 个月或更长 ( 例如， 一、 二、 三、 四年或 以上， 包括该受试者一生 ) 的周期。
     任何在本文中所说明的方法可进一步包括对该受试者给予有效量的至少一种其 他的治疗性或免疫抑制性试剂或化合物。 这样， 例如， 本发明提供一种阻抑一种免疫应答的 方法， 该方法包括对须要该方法的受试者给予 (1) 有效量的至少一种第一免疫抑制剂， 其 中每个这种第一免疫抑制剂是本发明的多肽、 核酸、 载体、 组合物、 和 / 或细胞， 以及 (2) 有 效量的至少一种第二免疫抑制剂， 其中该受试者体内的一种免疫应答受到阻抑。
     不同其他的治疗性或免疫抑制性试剂 ( 其并非本发明的分子 ) 皆结合本发明的分 子 ( 例如， 本发明的多肽、 核酸、 载体、 组合物、 和 / 或细胞 ) 而使用或给予。此类试剂包括， 如， 一种缓解疾病的抗风湿药 (DMARD)( 诸如， 如， 甲氨蝶呤 (MTX)、 细胞因子拮抗剂 ( 例如， IL-2 或 IL-6 拮抗剂 )、 甾体化合物 ( 例如， 皮质类固醇， 糖皮质类固醇， 如， 泼尼松或甲基 泼尼松 )、 非甾体化合物、 水杨酸钠或镁、 布洛芬、 乙酰水杨酸、 乙酰胺苯酚、 抗体、 可阻断抗 炎细胞因子生成的生物剂、 依法珠单抗、 抗炎剂或化合物、 以及非甾体抗炎药物 (NSAID)。这种其他的治疗性或免疫抑制性试剂可在包括一种其他试剂以及一种药学上可 接受的赋形剂或载体的药物组合物中对该受试者进行给予。 有待给予的试剂的有效量或剂 量将取决于该特定试剂。一些此类试剂是目前用于免疫抑制疗法中的， 并且适当的剂量可 基于有待治疗的疾病、 紊乱或病况以及该受试者耐受特定量或剂量的能力、 以及此类试剂 的免疫抑制效能而决定。以上说明并非本发明分子的免疫抑制剂的示例性剂量是已知的。 并非一种本发明分子的其他免疫抑制剂可与本发明分子 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) 同时给予或是在其之前或之后进行给予。
     治疗的疗程， 包括， 如， 剂量、 给药时程、 给药方法 ( 例如， 静脉注射、 皮下注射等 ) 以及包括至少一种这种本发明的分子或组分的药物组合物， 可根据有待治疗的疾病、 紊乱 或病况而各异。可对一位受试者给予一种或多种此类本发明的分子或组分 ； 每个此类分子 或组分并不需要在相同的药物的配制品中、 经由相同的给药方法、 以相同的量、 或是经由相 同的剂量频率时程而进行给予。
     在一些此类方法中， 例如， 可将大约 1ml 的包括一种药学上可接受的赋形剂、 载 体、 或稀释剂以及大约 50mg/ml 浓度的本发明融合蛋白二聚体的一种药物组合物， 经由皮 下对需要免疫抑制的受试者 ( 例如， 成人 )( 例如， 罹患类风湿性关节炎的受试者 ) 进行给 予。这种起始剂量是 50mg 的融合蛋白二聚体。对于具有 100kg 体重的受试者而言， 此起始 剂量相当于每千克受试者体重的 0.5mg 融合蛋白二聚体。在第一剂后一或两周， 经由皮下 给予第二相同的量。视需要而每周、 每双周或一个月一次或是以更高或更低频率经由皮下 给予额外剂量。 此类组合物以及给药形式据信可用于， 例如， 治疗罹患类风湿性关节炎或是 其中需要免疫抑制的另一免疫紊乱的一个人， 或是抑制一个人类受方对于来自一个人类供 方的组织、 细胞、 移植物或器官移植的排斥。
     治疗类风湿性关节炎的方法类风湿性关节炎是最常见的全身性炎性自身免疫疾病的一种， 并且估计它影 响 1 ％ -2 ％ 的 成 人 群 体。 见， 如， Dipiro， J.T.， Rheumatoid arthritis， inPHARMACOTHERAPY ： A PATHOPHYSIOLOGIC APPROACH， 1671-1682(Talbert， R.T.et al.eds.， McGraw-Hill， New York， th 6 ed.2005)。该疾病的特征为滑液膜的增生和炎性细胞的浸润， 包括活化的 T 细胞。 活化的 T 细胞在类风湿性关节炎的进程中， 经由刺激不同细胞类型产生促炎性细胞因 子 ( 诸如， IL-1、 IL-6、 以及 TNF-α)、 自体抗体、 以及基质金属蛋白酶而扮演关键角色 (Hoffman， R.W.， Front.Biosci.6 ： 1369-1378(2001) ； Choy， E.K.et al.， N.Engl.J.Med344 ： 907-916(2001))。T 细胞对于类风湿性关节炎的进程的强力贡献使得 T 细胞的活化成为治 疗干预的合理感兴趣的。此类炎性分子据信可造成与类风湿性关节炎相关的炎症应答、 组 织损伤 ( 例如， 关节损伤 ) 和疼痛。
     经 由 CD28 受 体 与 CD80 和 / 或 CD86 配 体 间 的 相 互 作 用 而 介 导 的 T 细 胞 共 刺 激相互作用对于大部分 T 细胞的活化而言具有必要性 (Riley， J.L.etal.， Blood 105 ： 13-21(2005))。 可 拮 抗 该 CD80/CD86-CD28 共 刺 激 途 径 的 治 疗 性 或 预 防 性 试 剂， 诸 如， ( 阿巴西普 (Abatacept)) 融合蛋白 ( 它是一种可溶性二聚体 hCTLA-4-Ig 融 合蛋白 ) 已经显示可临床有效治疗类风湿性关节炎 (Kremer， J.M.et al.， Ann.Intern. Med.144 ： 865-876(2006) ； Genovese， M.C.et al.， N.Engl.J.Med.353 ： 1114-1123(2005))。 据信阿巴西普在以治疗或预防有效量而对一位受试者 ( 例如， 成人 ) 进行活体内的给药时， 可经由结合抗原呈递细胞上的 CD80 和 / 或 CD86 配体而产生免疫抑制功能， 由此预防此类 配体的任一或两者与 T 细胞上的 CD28 受体相互作用。
     目前阿巴西普已经核准用于治疗患有中度至严重活性 RA 的成人病患， 所述病患 是对一种或多种 DMARD( 诸如， 甲氨蝶呤 ) 或 TNF 拮抗剂具有不适当的反应的。阿巴西普是 以静脉内的输液， 以 10mg/kg 受试者体重的剂量对一位成人 RA 病患进行给药。 在第一剂后， 对应地在第一剂后的二和四周时， 给予 10mg/kg 该融合蛋白的第二和第三剂。每四周 ( 即， 每个月一次 ) 给予后续的剂量。阿巴西普的静脉内输液据信为递送欲在类风湿性关节炎的 治疗中获得希望的功效所需的高剂量所必须的。
     其他类风湿性关节炎的当前疗法包括给药非特异性免疫抑制剂 ( 诸如， 甲氨蝶 呤 )， 以及甾体和非甾体抗炎药物。 此外， 亦已核准可靶向特定促炎细胞因子的生物试剂， 诸 如， TNF-α( 例如， 英利昔单抗、 益赛普 (entanercept)、 阿 达木单抗 ) 以及 IL-1( 例如， 阿那白滞素 )。 然而， 诸多此类法具有显著的相互作 用 - 其部分具毒性 - 特别是在长期给药时。
     尽管具有不同疗法， RA 的治疗仍有显著未满足的需求。例如， 60 ％具有失败的 先前 DMARD 治疗的人类 RA 病患和 80％具有失败的先前抗 -TNF 治疗的人类 RA 病患， 在以 Orencia 治疗 6 个月后， 仍未达成 ACR50 分值 (Kremer J.M.et al.， Ann.Intern.Med.144 ： 865-876(2006) ； Genovese， M.C.etal.， N.Engl.J.Med.353 ： 1114-11(2005))。使用阿巴西 普和贝拉西普 (LEA29Y-Ig) 融合蛋白于成人 RA 治疗中的剂量反应实验指出， 该功效是剂 量相关性的， 并且在最高试验剂量下仍未饱和 (Kremer， J.M.et al.， N.Engl.J.Med.349 ： 1907-1915(2003) ； Moreland， L.W.et al.， Arthrit.Rheum.46 ： 1470-1479(2002))。
     对 hCD80 和 / 或 hCD86 的结合亲合力高于阿巴西普的一种可溶性本发明二聚体突 变 CTLA-4-Ig 预期在对患有 RA 的一位病患给药时可产生大于阿巴西普的较强免疫抑制作用。这种突变 CTLA-4-Ig 可以低于阿巴西普的较低浓度结合类似数目的 CD80 和 / 或 CD86 配体。
     对应地具有较高的 CD80 或 CD86 结合亲合力以及较慢的 CD80 或 CD86 解离速率的 一种突变 CTLA-4-Ig 在这种配体上具有较长的停留时间。这种较长的停留时间预期可与活 体内的较高功效相关。据信这种突变 CTLA-4-Ig 可以低于阿巴西普的剂量而对患有 RA 的 受试者有效进行治疗性或预防性的治疗。即， 据信这种突变 CTLA-4-Ig 在以低于 10mg/kg 受试者体重阿巴西普剂量的剂量而对该 RA 受试者给药时， 它可达成相当于阿巴西普的功 效程度。本发明提供可溶性的二聚体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 它具有对于 hCD80 和 / 或 hCD86 的各异的结合亲合力。对于 hCD86 具有实质上高于阿巴西普的结合亲合力的可溶性 二聚体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白在以基本上小于阿巴西普的剂量而对该 RA 受试者给药时， 它可达成相当于阿巴西普的功效程度。较低剂量这种突变 CTLA-4-Ig 的给予可容许使用较 目前用以给药阿巴西普的 ( 静脉注射 ) 更为便利的给药方法 ( 例如， 皮下注射 )。
     还据信， 较阿巴西普或贝拉西普融合蛋白具有较高免疫抑制强度的一种本发明可 溶性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白将可在 RA 病患的治疗中获得较高程度的功效。更具免疫抑 制性的突变 CTLA-4-Ig 预期可较阿巴西普更为有效的缓解与 RA 相关的症状， 并抑制 RA 有 害身体相互作用的进展。这种突变 CTLA-4-Ig 可以介于大约 0.1-200mg/ml 的浓度而配制 在药学上可接受的稀释剂、 赋形剂、 或载体 ( 例如， PBS) 中。RA 受试者治疗可通过以适当确 定的剂量频率 ( 例如， 起始剂量接续每个月 2 至 4 次的一剂、 每个月一剂或每两个月一剂 )， 以皮下注射或静脉输液， 对该受试者给予治疗或预防有效量 ( 剂量 ) 的突变 CTLA-4-Ig 而 完成。该剂量将取决于该受试者疾病或症状的严重性。例如， 它可给予不超过大约 10mg/ kg( 包括， 如， 大约 1mg/kg、 0.5mg/kg、 0.25mg/kg、 1mg/kg、 2mg/kg、 3mg/kg、 4mg/kg、 5mg/kg、 6mg/kg、 7mg/kg、 8mg/kg、 或 9mg/kg) 受试者体重的突变 CTLA-4-Ig 量或剂量。更具免疫抑 制性的突变 CTLA-4-Ig 可容许使用较阿巴西普典型使用的剂量时程而言较不频繁的剂量 时程 ( 例如， 每两个月一次 )。可替代地， 可对患有 RA 的受试者给予大于大约 10mg/kg 受 试者体重的量或突变 CTLA-4-Ig 的剂量 ( 例如， 从大约 10mg/kg 至大约 100mg/kg、 从大约 10mg/kg 至大约 25mg/kg、 大约 10mg/kg 至大约 50mg/kg、 大约 10mg/kg 至大约 75mg/kg 等， 包 括， 如， 大 约 15mg/kg、 20mg/kg、 30mg/kg、 40mg/kg、 50mg/kg、 60g/kg、 70m/kkg、 75mg/kg、 80mg/kg、 90mg/kg、 100mg/kg)， 如该受试者疾病病况和 / 或症状可核准这种量或剂量。
     用以在罹患的一个人体内治疗 RA 的一种本发明突变 CTLA-4-Ig 二聚体的有效量 可根据不同因素确定， 诸如， 该突变 CTLA-4-Ig 二聚体的强度、 该二聚体的给药模式、 和/或 该受试者风湿性关节炎症状或征兆的严重性。例如， 本发明突变 CTLA-4-Ig 二聚体的有效 量或剂量可通过比较这种二聚体与 二聚体的强度， 并根据典型地会对具有类似 RA 症状或征兆的一个人类受试者给予的 量或剂量， 确定可产生可与 相当的希望的免疫抑制作用 ( 例如， 改进或约相当的相互作用 ) 的突变 CTLA-4-Ig 二聚体 的有效量或剂量而确认。
     在一个具体实例中， 例如， 本发明提供一种在需要这种治疗的病患体内治疗类风 湿性关节炎的方法， 该方法包括经由， 如， 静脉或皮下注射而对该受试者给予有效量的一种 本发明可溶性二聚体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白。该有效量或剂量可包括从大约 0.001 毫 克 (mg) 至大约 10 毫克每千克 (kg) 受试者体重， 它包括， 但不限于， 如， 对受试者给予从大约 0.01mg/kg 至大约 10mg/kg 受试者体重、 从大约 0.05mg/kg、 0.1mg/kg、 0.2mg/kg、 0.25mg/ kg、 0.3mg/kg、 0.5mg/kg、 1mg/kg、 2mg/kg、 5mg/kg、 6mg/kg、 7mg/kg、 8mg/kg、 9mg/kg、 或 10mg/ kg 成人病患体重。在一些情形下， 该有效量或剂量是从大约 2 至 10mg/kg、 大约 3 至 10mg/ kg、 大约 3 至 5mg/kg、 大约 5 至 10mg/kg， 0.1 至 5mg/kg 体重、 大约 0.05 至 1.0mg/kg、 大约 0.05 至 3mg/kg 体重、 大约 0.05 至 2.0mg/kg、 大约 0.05 至 1.0mg/kg、 大约 0.05 至 2.0mg/ kg、 大约 0.1 至 2.0mg/kg、 大约 0.1 至 3.0mg/kg、 大约 0.1 至 0.5mg/kg、 大约 0.1 至 0.8mg/ kg、 大约 0.1 至 0.6mg/kg、 大约 0.2 至 1mg/kg、 大约 0.2 至 0.6mg/kg、 大约 0.2 至 0.5mg/ kg、 大约 0.3 至 1mg/kg、 大约 0.3 至 0.6mg/kg、 大约 0.3 至 0.5mg/kg 受试者体重。在一些 情形下， 该有效量或剂量对于体重小于 60kg 的受试者而言是小于大约 500mg( 例如， 小于大 约 100mg、 75mg、 50mg、 25mg 或 12.5mg)， 对于体重介于 60-100kg 的受试者而言是小于大约 750mg( 例如， 小于大约 150mg、 100mg、 75mg、 37.5mg 或 20mg)， 或是对于体重超过 100kg 的受 试者而言是小于大约 1000mg( 例如， 小于大约 500mg、 100mg、 50mg、 25mg、 或 10mg)。在第一 剂后， 后续的相当剂量是以 1、 2、 4、 8、 10、 12、 14、 或 16 周之间期给予。后续剂量的频率可如 所需进行确定。
     这种突变 CTLA-4-Ig 融合物可与一种药学上可接受的赋形剂、 载体、 或稀释剂共 同配制， 以产生适于对一位受试者 ( 例如， 哺乳动物， 包括一个人 ) 进行给药的一种药物 组合物。该融合蛋白在该组合物中的浓度可在从大约 0.01mg/ml 至大约 300mg/ml 或从大 约 0.01mg/ml 至大约 200mg/ml 的范围内， 它包括， 但不限于， 如， 从大约 0.1mg/ml 至大约 300mg/ml、 从大约 0.1mg/ml 至大约 200mg/ml、 大约 0.1mg/ml 至大约 100mg/ml、 大约 0.5mg/ ml 至大约 100mg/ml、 大约 0.5mg/ml 至大约 50mg/ml、 大约 1 至大约 100mg/ml、 大约 1 至大 约 75mg/ml、 大约 5 至大约 75mg/ml、 大约 10 至大约 75mg/ml、 大约 10 至大约 60mg/ml、 大约 25 至大约 60mg/ml、 大约 30 至大约 60mg/ml、 大约 25 至大约 50mg/ml、 大约 40 至大约 50mg/ 包括所说明于以上及以下讨论 ml、 大约 25mg/m、 l 或大约 50mg/ml。也可考虑其他组合物， 的。
     这种治疗预期可在该受试者体内降低与类风湿性关节炎相关的一种或多种征兆 和 / 或症状， 诸如， 如， 炎症、 关节压痛、 关节肿胀、 疼痛、 和僵硬。这种治疗可在该受试者体 内减少该疾病的进一步进展。例如， 这种治疗可在该受试者体内减少结构损伤的进展。这 种治疗可改善该受试者的身体机能。
     抑制组织、 细胞、 移植物、 或器官移植排斥的方法
     在另一个方面， 本发明提供一种抑制受方受试者对于来自供方的组织、 细胞、 皮肤 移植物、 或器官移植的排斥， 或是阻抑与其相关的免疫应答的方法， 该方法包括对该受方受 试者给予治疗有效量的以下的一项或多项 ： (1) 一种本发明的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4-ECD 多肽或是二聚体或单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) ； (2) 包括一个或多个本发明多肽的一种 多聚体 ( 例如， 包括任何两个此类多肽的一种二聚体， 或是包括任何四个此类多肽的一种 四聚体 ) ； (3) 包括至少一种本发明多肽的一种偶联物 ； (4) 一种本发明的核酸 ( 例如， 编码 一种本发明多肽的核酸 ) ； (5) 包括一种本发明核酸或是编码一种本发明多肽的一种载体 ； (6) 包括一种本发明的多肽、 核酸、 偶联物、 和 / 或载体的一个细胞或多个细胞的一个群体 ； 和 / 或 (7) 本发明的组合物， 由此抑制该受方受试者对于组织、 细胞、 皮肤移植物、 或器官移 植的排斥。该供方和受方可以是相同的种或不同的种。该供方和受方可为一个哺乳动物，诸如， 一个人、 非人类灵长类 ( 例如， 猴、 猩猩 )、 羊、 猫、 狗、 猪、 牛、 马等。 在一些此类方法中， 该本发明的多肽、 偶联物、 载体、 和 / 或细胞是在组织、 细胞、 皮肤移植物、 或器官移植的前、 同时、 或的后而对该受方受试者给予。该有效量典型地包括从大约 0.001mg/kg 受试者体 重至大约 200mg/kg 受试者体重。在一些此类方法中， 例如， 该有效量包括从大约 0.001 毫 克每千克 (mg/kg) 受试者体重到至少大约 0.005、 0.01、 0.05、 0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1、 2、 3、 4、 5、 10、 25、 50、 75、 100、 125、 150、 175、 200、 225、 250、 或 300 毫 克 每 千 克 (mg/kg) 受试者体重。在一些此类方法中， 该有效量包括从大约 0.001 毫克每千克 (mg/ kg) 受试者体重到至少大约 0.005、 0.01、 0.05、 0.1、 0.2、 0.5、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 20、 25、 50、 或 75 毫克每千克 (mg/kg) 受试者体重。该本发明的多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 和/ 或细胞可在移植过程中、 在其之前、 或是在其之后立即对该受方受试者进行给予。 可替代地 或是此外， 这种本发明的分子可在移植后的一个或多个小时后、 在移植后一天和 / 或在其 后每日或在需要时在移植后至少每周一次、 至少每两周一次或是至少每个月一次， 当需要 时达到 12、 24、 或 36 个月或以上或是更长时间而进行给予。 该器官移植体可涉及任何器官， 诸如， 如， 一个肾脏、 肝脏、 心脏、 或肺。
     该待对器官、 组织、 或细胞移植的受方受试者给予以抑制移植排斥 ( 或是阻抑与 这种移植相关的免疫应答 ) 的本发明突变 CTLA-4 分子 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二 聚体 ) 的有效量或剂量典型地是根据这种分子的强度、 给药途径、 移植类型 ( 例如， 细胞、 组 器官 )、 该受试者病史、 和 / 或该移植受方受试者建议移植排斥的免疫应答症状或征兆 织、 的严重性而确定。例如， 该本发明突变 CTLA-4-Ig 二聚体 ( 例如， D3-29-IGg2、 D3-54-IgG2、 D3-56-IgG2、 D3-69-IgG2、 D3-75-IgG2 二聚体等 ) 的有效量或剂量可通过比较这种二聚体 与贝拉西普 (Belatacept) 二聚体的强度而确定。 可用于预防或阻抑与肾 / 肾脏移植相关的 一种免疫应答的贝拉西普有效剂量是已知的。例如， 贝拉西普是以每个月大约 5mg 或 10mg 每千克人体重的量或剂量， 在一人类自一肾脏供方的进行肾脏移植的后， 以静脉输液对该 人进行给予。相较贝拉西普大约为 “X” 倍较强的本发明突变 CTLA-4-Ig 二聚体可以相较该 贝拉西普剂量大约为 “X” 倍较小的量或剂量而对具有肾脏移植的一个人给予 ( 例如， 经静 脉内、 皮下、 或以其他在本文中所说明的方式 )， 以达成大约相当于贝拉西普的治疗相互作 用 ( 例如， 阻抑一种免疫应答 )。如需要较大的治疗相互作用， 可确定并给予比例增加的突 变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体的量或剂量。
     在另一个方面， 本发明提供一种用以在由供方的接受这种组织、 细胞、 或器官的受 试者体内治疗组织、 细胞、 或器官移植排斥 ( 如实体器官移植排斥 ( 例如肾、 肝、 肺、 心等器 官 )) 的方法， 该方法包括对该受方给予治疗有效量的至少一种本发明的多肽、 偶联物、 核 酸、 载体、 和 / 或细胞， 由此抑制该受方受试者对于该供方的组织、 细胞、 或器官移植的排 斥。该本发明的多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 和 / 或细胞可在细胞、 组织或器官移植的前、 同 时、 或的后对该受试者进行给予。
     在一个方面， 本发明提供一种在需要该方法的一个受方受试者体内抑制对于来自 一个供方的胰岛细胞移植排斥的方法， 该方法包括在将胰岛细胞自供方的胰脏移植进入该 受试者体内的前、 同时、 或的后， 对该受试者给予有效量或剂量的本发明突变 CTLA-4 分子 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )。该受试者 ( 例如， 人类 ) 典型地罹患糖尿病 ( 例如， IDDM)， 并且这种方法可用于治疗诊断具有或罹患糖尿病的受试者。 胰岛移植操作是为本领域中所已知的。典型地， 它是自一去世器官供方的胰脏取出胰岛， 纯化并加工， 接着移植进 入罹患糖尿病的受方受试者体内。在移植的后， 所述胰岛中的 β 细胞开始制造并释出胰岛 素， 由此降低该受方受试者对于胰岛素的需求。
     在 此 类 抑 制 移 植 排 斥 的 方 法 中， 本 发 明 的 突 变 CTLA-4 分 子 ( 例 如， 突变 CTLA-4-Ig) 可与一种药学上可接受的赋形剂、 载体、 或稀释剂共同配制， 以产生适于对一位 受试者 ( 例如， 哺乳动物， 包括一个人 ) 进行给药的一种药物组合物。一些此类方法包括给 予一种药物组合物， 该组合物包括一种药学上可接受的赋形剂、 载体、 或稀释剂， 以及具有 从大约 0.01mg/ml 至大约 300mg/ml 或大约 0.01mg/ml 至大约 200mg/ml， 它包括， 但不限于， 如， 从大约 0.1mg/ml 至大约 300mg/ml、 从大约 0.1mg/ml 至大约 200mg/ml、 大约 0.1mg/ml 至大约 100mg/ml、 大约 0.5mg/ml 至大约 100mg/ml、 大约 0.5mg/ml 至大约 50mg/ml、 大约 1 至大约 100mg/ml、 大约 1 至大约 75mg/ml、 大约 5 至大约 75mg/ml、 大约 10 至大约 75mg/ml、 大约 10 至大约 60mg/ml、 大约 25 至大约 60mg/ml、 大约 30 至大约 60mg/ml、 大约 25 至大约 50mg/ml、 大约 40 至大约 50mg/ml、 大约 25mg/ml、 或大约 50mg/ml 浓度的本发明 CTLA-4-Ig 二聚体。也可考虑其他组合物， 包括所说明于以上及以下讨论的。
     抑制一种免疫应答的方法
     在另一个方面， 本发明包括本发明的多肽 ( 包括， 如， 一种二聚体或单体融合蛋白 或多聚体多肽 )、 偶联物、 核酸、 载体、 或细胞在制造用以在一个哺乳动物体内 ( 例如， 人类 或非人类灵长类 ) 抑制或阻抑一种免疫应答的一种药物的用途。可受到阻抑的免疫应答包 括， 如， T 细胞的活化或增殖、 细胞因子的合成或生成、 活化标记的诱发、 炎症分子的合成或 生成、 炎症、 抗胶原 Ab 生成、 依赖于 T 细胞的 Ab 应答。
     本发明还包括一种本发明的多肽 ( 包括， 如， 一种二聚体或单体融合蛋白或多聚 体多肽 )、 偶联物、 核酸、 载体、 或细胞在制造用以治疗免疫系统疾病或紊乱的一种药物的用 途。该免疫系统疾病或紊乱可为由 T 细胞与 CD80- 阳性细胞和 / 或 CD86- 阳性细胞在一个 哺乳动物体内的相互作用介导的。该免疫系统疾病或紊乱可为免疫系统的疾病或紊乱， 诸 如， 风湿性的疾病或紊乱， 或是自身免疫疾病或自身免疫紊乱。 这种免疫系统疾病或紊乱可 为或是涉及， 如， 但不限于， 阿狄森氏病、 过敏、 斑秃、 阿耳兹海默氏病、 抗嗜中性细胞胞质抗 体 (ANCA)- 相关性脉管炎、 强直性脊柱炎、 抗磷脂综合征 ( 休斯综合征 )、 关节炎、 哮喘、 动 脉硬化、 动脉硬化斑块、 自身免疫疾病 ( 例如， 狼疮、 RA、 MS、 格雷夫斯氏病、 等等 )、 自身免 疫性溶血性贫血、 自身免疫性肝炎、 自身免疫性内耳病、 自身免疫性淋巴增生综合征、 自身 免疫性心肌炎、 自身免疫性卵巢炎、 自身免疫性睾丸炎、 无精子症、 贝切特氏病、 贝切特氏综 合征、 贝格尔氏病、 大疱性类天疱疮、 心肌症、 心血管疾病、 口炎性腹泻 / 乳糜泻、 慢性疲劳 免疫功能障碍综合征 (CFIDS)、 慢性自发性多发神经炎、 慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经疾 病 (CIPD)、 慢性复发性多发性神经病变 ( 格 - 巴二氏综合征 )、 丘 - 施二氏血管炎 (CSS)、 瘢痕性类天疱疮、 冷凝集素病 (CAD)、 COPD、 CREST 综合征、 克罗恩病、 疱疹样皮炎、 皮肌炎、 糖尿病、 盘状狼疮、 湿疹、 后天性大疱性表皮松解症、 原发性混合型冷凝球蛋白血症、 伊凡斯 氏综合征、 眼球突出症、 纤维肌痛、 古德帕斯彻氏综合征、 移植物相关性疾病或紊乱、 格雷夫 斯氏病、 GVHD、 桥本甲状腺炎、 特发性肺纤维化、 特发性血小板减少性紫癜 (ITP)、 IgA 肾病、 免疫增生性疾病或紊乱 ( 例如， 银屑病 )、 炎症性肠病 (IBD)、 胰岛素依赖型糖尿病 (IDDM)、 间质性肺病、 幼年型糖尿病、 幼年型关节炎、 幼年型特发性关节炎 (JIA)、 川崎氏病、 朗-伊二氏肌无力综合征、 扁平苔藓、 狼疮、 狼疮肾炎、 淋巴细胞性垂体炎、 美尼尔氏病、 米勒费雪 综合征 / 急性播散性脑脊髓脊神经根病、 混合性结缔组织病、 多发性硬化症症 (MS)、 肌风湿 病、 肌痛性脑脊髓炎 (ME)、 重症肌无力、 眼部炎症、 落叶型天疱疮、 寻常型天疱疮、 恶性贫血、 结节性多动脉炎、 多软骨炎、 多腺体综合征 ( 怀塔克综合征 )、 风湿性多肌痛、 多发性肌炎、 原发性无丙种球蛋白血症、 原发性胆汁性肝硬化 / 自身免疫性胆道疾病、 银屑病、 银屑病性 关节炎、 雷诺氏现象、 莱特尔氏综合征 / 反应性关节炎、 再狭窄、 风湿热、 风湿性疾病、 类风 湿性关节炎、 肉样瘤病、 施密特氏综合征、 硬皮病、 斯耶格伦氏综合症、 实体器官移植体排斥 ( 肾、 心脏、 肝、 肺、 等等 )、 僵人综合征、 系统性红斑狼疮 (SLE)、 系统性硬皮病、 高安氏动脉 炎、 颞动脉炎 / 巨细胞动脉炎、 甲状腺炎、 I 型糖尿病、 II 型糖尿病、 溃疡性结肠炎、 眼色素层 炎、 脉管炎、 白癜风、 韦格纳氏肉芽肿病， 以及预防或阻抑与由一位受方受试者对于一种供 方的组织、 细胞、 移植物、 或器官移植体的排斥相关联的一种免疫应答。
     本发明还提供一种本发明的多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 或细胞在制造用以抑制 CD80- 阳性细胞和 / 或 CD86- 阳性细胞与 CD28- 阳性和 / 或 CTLA-4- 阳性 T 细胞间相互作 用的一种药物的用途。在另一个方面， 本发明包括一种本发明的多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 或细胞在制造用以在一个哺乳动物体内治疗组织或器官移植排斥 ( 例如， 实体器官移植排 斥 ( 例如， 肾脏、 肺、 肝脏、 心脏等 )) 的一种药物的用途。
     评估免疫应答
     由一种本发明的多肽、 核酸、 载体、 病毒、 假病毒、 VLP、 或组合物所阻抑的免疫应 答可以任何适当的技术测量。可用以评估体液免疫应答的可用技术实例包括流式细胞计 数、 免疫印迹分析、 免疫组织化学分析、 免疫沉淀分析、 放射免疫分析 (RIA)、 以及酶免疫分 析。酶免疫分析包括酶连免疫流式分析 (ELIFA) 以及酶连免疫吸附分析 (ELISA)， 包括 夹层 ELISA 以及竞争性 ELISA 分析。也可将 HPLC 以及毛细电泳 (CE) 用于免疫分析中， 以侦测抗体与目标物质的偶联物。有关进行此类技术的广泛指导及相关原则说明于， 如， Harlow and Lane(1988)ANTIBODIES， ALABORATORY MANUAL， Cold Spring Harbor Publications， New York， HamptonR et al.(1990)SEROLOGICAL METHODS A LABORATORY MANUAL， APS Press， St.Paul Minn.， Stevens(1995)CLINICAL IMMUNOLOGY AND SEROLOGY ： ALABORATORY PERSPECTIVE， CRC press， Bjerrum(1988) HANDBOOK OFIMMUNOBLOTTING OF PROTEINS， Vol.2， Zoa(1995)DIAGNOSTICIMMUNOPATHOLOGY ： LABORATORY PRACTICE AND CLINICAL APPLICATION， Cambridge University Press， Folds(1998)CLINICAL DIAGNOSTIC IMMUNOLOGY ： PROTOCOLS IN QUALITY ASSURANCE AND STANDARDIZATION， Blackwell ScienceInc.， Bryant(1992)LABORATORY IMMUNOLOGY&SEROLOGY 3rd edition， W BSaunders Co.， 以及 Maddox D E et al.(1983)J.Exp.Med.158 ： 1211。 有关 ELISA 技术和相关原则的指导说明于， 如， Reen(1994)Methods Mol.Biol.32 ： 461-6， Goldberg et al.(1993)Curr.Opin.Immunol.5(2) ： 278-81， Voller et al.(1982)Lab.Res. Methods Biol.Med.5 ： 59-81， Yolken et al.(1983)Ann.NYAcad.Sci.420 ： 381-90， Vaughn et al.(1999)Am.J.Trop.Med.Hyg.60(4) ： 693-8， 以 及 Kuno et al.(1991)J.Virol. Methods 33(1-2) ： 101-13。有关流式细胞技术提供于， 如， Diamond(2000)IN LIVING COLOR ： PROTOCOLS INFLOW CYTOMETRY AND CELL SORTING， Springer Verlag， Jaroszeki(1998)FLOWCYTOMETRY PROTOCOLS， 1st Ed.， Shapiro(1995)PRACTICAL FLOW CYTOMETRY， 3rd edition， Rieseberg et al.(2001) Appl.Microbiol.Biotechnol.56(3-4) ： 350-60， Scheffold and Kern(2000)J.Clin. Immunol.20(6) ： 400-7， 以及 McSharry(1994)Clin.Microbiol.Rev.(4) ： 576-604。细胞毒性及其他 T 细胞免疫应答也可由任何适当的技术测量。此类技术的实例 包括 ELISpot 分析 ( 特别是 IFN-γELISpot)、 胞内细胞因子染色 (ICC)( 特别是结合 FACS 分析 )、 CD8+T 细胞四聚体染色 /FACS、 标准及经修饰的 T 细胞增殖分析、 铬释放 CTL 分析、 抑制性稀释分析 (LDA) 及 CTL 杀伤分析。有关 T 细胞增殖分析的指导及原则是说明于， 如， Plebanskiand Burtles(1994)J.Immunol.Meth.170 ： 15， Sprent et al.(2000)Philos. Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.355(1395) ： 317-22，以 及 Messele et al.(2000)Clin. Diagn.Lab.Immunol.7(4) ： 687-92。LDA 是说明于， 如， Sharrock et al.(1990)Immunol. Today 11 ： 281-286。ELISpot 分析及相关的原则是说明于， 如， Czerinsky et al.(1988) J.Immunol.Meth.110 ： 29-36 ，Olsson et al.(1990)J.Clin.Invest.86 ： 981-985 ， Schmittel et al.(2001)J.Immunol.Meth.247(1-2) ： 17-24， Ogg and McMichael(1999) Immunol.Lett.66(1-3) ： 77-80， Schmittel et al.(2001)J.Immunol.Meth.247(1-2) ： 17-24， Kurane et al.(1989)J.Exp.Med.170(3) ： 763-75， Chain et al.(1987)J.Immunol. Meth.99(2) ： 221-8， Czerkinskyet al.(1988)J.Immunol.Meth.110 ： 29-36，以 及 美 国 专 利 号 5,750,356 以 及 6,218,132。 四 聚 体 分 析 是 说 明 于， 如， Skinner et al.(2000) J.Immunol.165(2) ： 613-7。其他 T 细胞分析技术则说明于 Hartel et al.(1999)Scand. J.Immunol.49(6) ： 649-54 以及 Parish et al.(1983)J.Immunol.Meth.58(1-2) ： 225-37。
     T 细胞的活化也可经由测量 CTL 的活性或是活化抗原 ( 诸如， IL-2 受体、 CD69 或 HLA-DR 分子 ) 的表达而分析。纯化 T 细胞的增殖可在混合淋巴细胞反应 (MLR) 分析中测 量； 此类分析是本领域中所熟知的。
     ELISpot 分析是测量分泌特定细胞因子的 T 细胞数目， 所述细胞因子诸如 IFN-γ 或 TNF-α， 它可作为 T 细胞效应子的标记。细胞因子特异性的 ELISA 试剂盒是可由市售购 得的 ( 例如， IFN-γ 特异性 ELISpot 可由 R&D Systems， Minneapolis， MN) 获得。
     其他可用以评估并测量本发明分子 ( 例如， 本发明的多肽， 包括， 如， 本发明的可 溶性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) 阻抑或抑制 T 细胞活化和 / 或 T 细胞增殖的能力的方法说 明于以下实例段落中的实例 5-8。
     给药方法
     在任何在本文中所说明的方法中， 包括一种适当药学上可接受的赋形剂或载体 ( 例如， PBS) 以及一种有效量的本发明分子 ( 诸如本发明的多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4ECD 或 是单体、 二聚体、 或多聚体突变 CTLA-4-Ig) 或偶联物 ) 的一种可注射药物组合物可经由胃 肠外、 肌内、 腹膜内、 静脉内、 真皮下、 经皮、 皮下、 或皮内而对宿主进行给予。 可替代地， 可使 用生物弹道 (biolistic) 蛋白递送技术 ( 疫苗枪递送 )( 其实例如本文其他地方所讨论 )。 也可使用任何其他适当的技术。多肽的给予可由脂质体协助。任何这种递送技术皆结合在 本文中所说明的任何治疗或预防方法而用以递送本发明的多肽或偶联物。
     尽管下列的讨论主要是关于核酸， 成应当理解， 其同样可应用于本发明的核酸 载体。本发明的核酸或其组合物可以任何适当的给药途径而对宿主进行给予。在本 发明的部份方面中， 核酸的给予是经胃肠外 ( 例如， 皮下 (s.c.)、 肌内 (i.m.)、 或皮内 (i.d.))、 局部、 或经皮进行。该核酸可使用针或其他类似的装置， 经由注射而直接引入组 织中 ( 诸如， 肌肉 )。见， 如， Nabel et al.(1990)， 以上说明文献 ； Wolff et al.(1990) Science247 ： 1465-1468， Robbins(1996)Gene Therapy Protocols， Humana Press， NJ， 以及Joyner(1993)Gene Targeting ： A Practical Approach， IRL Press， Oxford， England， 以及 美国专利号 5,580,859 和 5,589,466。其他方法， 诸如， “生物弹道” 或颗粒介导性的转化相 互作用 ( 见， 如， 美国专利号 4,945,050 以及 5,036,006， Sanford et al.， J.Particulate Sci.Tech.5 ： 27-37(1987)， Yang et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87 ： 9568-72(1990)， 以 及 Williams et al..Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 ： 2726-30(1991))。此类方法不仅可用 于在活体内将 DNA 引入受试者体内， 诸如， 哺乳动物， 也可用于进行细胞的活体外修饰， 以 再次引入一个哺乳动物体内 ( 它在本文其他地方进一步讨论 )。
     就标准的基因枪给药而言， 是使该感兴趣的载体或核酸沉淀于显微金属珠的表 面。所述微粒经由冲击波或膨胀的氦气加速， 并穿透组织至数个细胞层的深度。例如， 由 TM Agacetus， Inc.Middleton WI 所制造的 Accel 基因递送装置可适用于此具体实例中。该 核酸或载体可以此类技术而经由， 如， 肌内、 经皮、 真皮下、 皮下、 和 / 或腹膜内进行给予。有 关生物弹道递送的其他装置和技术说明于国际专利申请公开号 WO 99/2796、 WO 99/08689、 WO 99/04009、 以及 WO 98/10750， 以及美国专利号 5,525,510、 5,630,796、 5,865,796 以及 6,010,478。
     该核酸结合转染协助剂而给予， 其实例于以上讨论。该核酸可局部和 / 或经由液 态颗粒递送 ( 相对于固态颗粒生物弹道递送 ) 而进行给予。可适用作为本发明核酸递送 运载体的此类核酸递送技术、 组合物以及其他构建体的实例提供于美国专利号 5,591,601、 5,593,972 、 5,679,647 、 5,697,901 、 5,698,436 、 5,739,118 、 5,770,580 、 5,792,751 、 5,804,566 、 5,811,406 、 5,817,637 、 5,830,876 、 5,830,877 、 5,846,949 、 5,849,719 、 5,880,103、 5,922,687、 5,981,505、 6,087,341、 6,107,095、 6,110,898， 以及国际专利申请 公开号 WO 98/06863、 WO 98/55495、 以及 WO 99/57275。
     可替代地， 该核酸可经由脂质体基础性基因递送的方式而对该宿主进行给予。 有关于脂质体基础性基因递送的示例性技术和原则提供于， 如， Debs and Zhu(1993) WO 93/24640 ； Mannino and Gould-Fogerite(1988)BioTechniques 6(7) ： 682-691 ； Rose 美 国 专 利 号 5,279,833 ； Brigham(1991)WO91/06309 ； Brigham et al.(1989)Am.J.Med. Sci.298 ： 278-281 ； Nabel et al.(1990)Science 249 ： 1285-1288 ； Hazinski et al.(1991) Am.J.Resp.Cell Molec.Biol.4 ： 206-209 ； 以 及 Wang and Huang(1987)Proc.Natl. Acad.Sci.USA84 ： 7851-7855)， 以 及 Felgner et al.(1987)Proc.Natl Acad.Sci.USA84 ： 7413-7414)。 可用于递送核酸的适当脂质体药学上可接受的组合物进一步说明于本文其他 地方。
     可将任何量的本发明核酸用于本发明的方法中。例如， 可使足够的核酸配制于 药学上可接受的赋形剂或载体中， 并对一位受试者进行给予， 这样使得该经编码的多肽或 偶联物可以据信可有效， 例如， 阻抑该受试者体内的一种免疫应答、 抑制内源性 B7- 阳性细 胞与 CD28- 阳性细胞在该受试者体内的相互作用或是阻抑组织、 细胞、 器官、 或移植物移 植排斥的量而在该受试者体内生成。在其中一种形式中， 当该核酸是以注射给予时， 其是 给予大约 50 微克 (μg) 至 100mg 的核酸。在一示例性的应用中， 为阻抑一种免疫应答， 其以注射或电穿孔或其他适当的递送方法 ( 例如， 基因枪、 经由皮肤压印、 以及脂质转染 (lipofection))， 将包括 PBS 以及编码有效量突变 CTLA-4 多肽的 DNA 载体量的药物组合 物， 对需要治疗的受试者 ( 例如， 罹患其中需要免疫抑制治疗的免疫系统疾病或紊乱的受试者 ) 进行给予。其中一种示例性的载体如图 1 所示。
     在经由基因枪而给予时， 用于本发明方法中的 DNA 质粒量是， 如， 从大约 100 至大 约 1000 倍低于直接注射 ( 例如， 经由标准的针注射 ) 所用的量。尽管具有这种灵敏性， 可 在这种生物弹道递送技术中使用至少大约 1μg 的核酸。
     RNA 或 DNA 病毒载体系统可用于递送编码本发明多肽的核酸。病毒载体可在活体 中直接对一位受试者进行给予， 可替代地它可在试管中用于治疗细胞， 并以活体外的形式 将所述经修饰的细胞对该受试者进行给予。可用的病毒载体包括所说明于以上讨论的， 诸 如， 腺相关病毒、 腺病毒、 逆转录病毒、 慢病毒、 以及单纯疱疹病毒载体。 使用此类病毒载体， 本发明的核酸可轻易转移进入该受试者感兴趣的细胞和组织中。 此外， 使用逆转录病毒、 慢 病毒、 以及腺相关病毒基因转移法， 它可能将本发明的核酸纳入该宿主的基因组中， 由此造 成该经插入核酸的持续表达。
     包括至少一种本发明核酸的本发明病毒载体的递送据信可在该载体所给予的受 试者体内阻抑一种免疫应答。可任选地的， 部份本发明的预防和 / 或治疗方法是以足以阻 抑可侦测性免疫应答的适当病毒载体剂量而实施。可使用任何适当浓度的包括本发明核 酸的任何适当病毒载体而阻抑该免疫应答。例如， 可对该受试者宿主给予一种群的逆转录 病毒载体 ( 实例说明于， 如， Buchscher et al.(1992)J.Virol.66(5)2731-2739， Johann et al.(1992)J.Virol.66(5) ： 1635-1640(1992)， Sommerfelt et al.， (1990)Virol.176 ： 58-59， Wilson et al.(1989)J.Virol.63 ： 2374-2378， Miller et al.， J.Virol.65 ： Wong-Staal et al.， PCT/US94/05700， Rosenburg and Fauci(1993) 2220-2224(1991)， inFUNDAMENTAL IMMUNOLOGY， THIRD EDITION Paul(ed.)Raven Press， Ltd.， NewYork 以及其中的参考文 献 )， 一种 AAV 载体 ( 说明于， 如， West et al.(1987)Virology 160 ： 38-47， Kotin(1994) Human Gene Therapy 5 ： 793-801， Muzyczka(1994)J.Clin.Invest.94 ： 1351， Tratschin et al.(1985)Mol.Cell.Biol.5(11) ： 3251-3260， 美国专利号 4,797,368 和 5,173,414， 以及国 际专利申请公开号 WO 93/24641)， 或一种腺病毒载体 ( 说明于， 如， Berns et al.(1995) Ann.NY Acad.Sci.772 ： 95-104 ； Ali et al.(1994)Gene Ther.1 ： 367-384 ； 以及 Haddada et al.(1995)Curr.Top.Microbiol.Immunol.199(Pt 3) ： 297-306)， 这样使得其产生该载体中 所包括核酸的免疫抑制含量表达， 由此造成希望的免疫抑制反应。其他适当类型的病毒载 体说明于本文其他地方 ( 包括适当逆转录病毒、 AAV、 以及腺病毒载体的替代实例 )。
     此类以及其他类型病毒载体颗粒的适当感染条件说明于， 如， Bachrachet al.， J.Virol.， 74(18)， 8480-6(2000)， Mackay et al.， J.Virol.， 19(2)， 620-36(1976)， 以 及 FIELDS VIROLOGY， 以上说明文献。可用于制备以及应用病毒载体的其他技术提供于， 如， “Practical Molecular Virology ： Viral Vectors forGene Expression” in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY， vol.8， Collins， M.Ed.， (Humana Press 1991)， VIRAL VECTORS ： BASIC SCIENCE l stEd.(Cid-Arregui et al.， Eds.)(Eaton Publishing 2000)， “Viral AND GENE THERAPY， ExpressionVectors， ” in CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY， Oldstone etal.， Eds. (Springer-Verlag， NY， 1992)，以 及 “Viral Vectors” in CURRENTCOMMUNICATIONS IN BIOTECHNOLOGY， Gluzman and Hughes， eds.(Cold SpringHarbor Laboratory Press， 1988)。 包括一种或多种本发明分子的载体或病毒的毒性和治疗功效是使用标准的药物 的操作而在细胞培养物或实验动物中进行测定。 你可使用本文所提出的操作以及所述其他
     在本领域中已知的， 测定 MLD50( 对于 50％的种群具致命性的最小剂量 ) 和 / 或 ED50( 对于 50％的种群具治疗有效性的剂量 )。关于已知病毒疫苗的建议剂量， 还见 S.Plotkin and W.Orenstein， VACCINES(W.B.Saunders Co.19993d ed.)。本发明的核酸、 多肽、 蛋白、 融合蛋 白、 经转导细胞以及其他配制品可以， 如， 由该配制品的 MLD50， 以及它在应用于该病患的质 量和整体健康情形下的不同浓度的副相互作用所确定的量而进行给药。 这样， 例如， 本发明 提供一种诱发免疫应答的方法， 其是经由给予等于或大于一药学上可接受的组合物的 ED50 的剂量而进行， 该组合物包括一种群的病毒样颗粒或病毒 ( 例如， 减毒或复制缺陷病毒 )， 它包括本发明的多肽或核酸。给药可经由单剂或分剂 ( 其是经由共给药、 是列给药、 或其组 合进行 ) 而完成。给药的技术和操作操作说明于， 如， Plotkin(VACCINES) 以上说明文献以及 其他本文所引述的参考文献。在相关的概念中， 用以评估可有效诱发免疫力的核酸、 多肽、 载体、 以及细胞组合物剂量的技术说明于， 如， 欧洲专利申请第 1156333 号以及其中所引述 的参考文献。
     该病毒载体可靶向一位受试者 ( 例如， 哺乳动物 ) 的特定组织、 细胞、 和 / 或器 官。此类载体的实例说明于以上。例如， 该病毒载体或核酸载体可用以将本发明的核 酸序列选择性地递送至单核细胞、 树状细胞、 与树状细胞相连的细胞 ( 例如， 与郎格罕 (Langerhans) 细胞相连的角质细胞 )、 T 细胞、 和 / 或 B 细胞。该病毒载体可为复制缺陷 型病毒载体。该病毒载体颗粒也可经修饰以减少对于该病毒载体的宿主免疫应答， 由此达 成持续的基因表达。此类 “隐蔽 (stealth)” 载体说明于 Martin， Exp.Mol.Pathol.66(1) ： J.Virol.75(10) ： 4792-801(2001)， Rollins et al.， Hum. 3-7(1999)， Croyle et al.， GeneTher.7(5) ： 619-26(1996) ， Ikeda et al. ， J.Virol.74(10) ： 4765-75(2000) ， Halbertet al.， J.Virol.74(3) ： 1524-32(2000)， 以及国际专利申请公开号 WO98/40509。 可 替代地或是此外， 该病毒载体颗粒可以经选择的策略进行给予以减少对于该病毒载体的宿 主免疫应答。 用以在对宿主进行给予时减少对于该病毒载体的免疫应答的策略提供于， 如， Maione et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98(11) ： 5986-91(2001)， Morral et al.， Proc. Natl.Acad.Sci.USA96(22) ： 2816-21(1999)， Pastore et al.， Hu m.Gene Ther.10(11) ： 1773-81(1999)， Morsy et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(14) ： 7866-71(1998)， Joos et al.， Hum.Gene Ther.7(13) ： 1555-66(1996)， Kass-Eisler et al.， Gene Ther.3(2) ： 154-62(1996)， 美 国 专 利 号 6,093,699、 6,211,160、 6,225,113， 美国专利申请公开号 2001-0066947A1。
     皮肤和肌肉总体上是本发明多肽、 偶联物、 核酸、 以及载体的优选给药感兴趣的， 以任何适当的技术进行。这样， 本发明多肽、 偶联物、 核酸、 以及载体进入或通过受试者 ( 例 如， 哺乳动物 ) 皮肤的递送是本发明的特征之一。此类本发明的分子可以药学上可接受的 可注射溶液形式而进入或通过皮肤给予， 如， 经由肌内或是腹膜内。 给药也可以经皮装置完 成， 可替代地， 更典型的， 以生物弹道递送完成， 将该多肽、 偶联物、 核酸、 和 / 或载体送至、 进入或通过该受试者皮肤， 或是进入该受试者暴露肌肉中。例如， 可使本发明所提供的经 皮装置 ( 其说明于本文其他地方 ) 应用于宿主的皮肤一段适当期间， 以产生多核苷酸和 / 或载体至该受试者足够递送， 由此阻抑该受试者体内的一种免疫应答， 或是抑制移植物、 细 胞、 或组织移植排斥。肌肉的给药更典型的是以包括本发明多肽、 多核苷酸、 或载体的液体 溶液的注射而协助进行。可经靶向的特定细胞包括树状细胞、 其他 APC、 B 细胞、 单核细胞、 T细胞 ( 包括 T 辅助细胞 ) 以及与此类免疫系统细胞相连的细胞 ( 例如， 与郎格罕细胞相连的 角质细胞或其他皮肤细胞 )。本发明载体以及核酸的靶向说明于本文其他地方。此类靶向 给药可以包括可操作地连接至细胞和 / 或组织特异性启动子的核酸的核酸或载体而进行， 所述启动子的实例是为本领域中所已知的。
     本发明的多核苷酸可以任何适当的递送系统给予， 这样使得该宿主中产生重组多 肽的表达， 由此造成免疫应答的阻抑、 B7- 阳性剂胞与 CD28- 阳性细胞间相互作用的抑制或 是组织、 细胞、 器官或移植物移植排斥的抑制。例如， 可对一位受试者给予有效量的包括本 发明核酸的多个细菌细胞的一个群体， 造成本发明重组突变 CTLA-4 多肽的表达， 以及该受 试者体内免疫应答的阻抑。 经研发以进行哺乳动物基因递送的细菌细胞是为本领域中所已 知的。
     本发明多核苷酸或载体对于受试者给予可通过对有效数目的细胞或有效的组织 感兴趣的进行电穿孔而协助， 这样使得该核酸和 / 或载体由所述细胞摄入， 并在其中表达， 由此造成本发明重组多肽在其中的制备， 并后续在该受试者体内阻抑一种免疫应答。
     制备和纯化方法
     本发明进一步提供制备和纯化本发明多肽、 核酸、 载体、 以及细胞的方法。在一个 方面， 本发明提供一种制备本发明重组多肽的方法， 该方法是通过将本发明的一种核酸引 入到培养基中的多个细胞的一个群体之中， 在该培养基中培养这些细胞 ( 其持续时间和所 用条件适用于所希望的基因表达量 ) 以生产该多肽， 再该多肽从所述细胞、 培养基或两者 中分离。 该核酸典型地被可操作地连接到可有效表达由该核酸所编码的多肽的一个调节序 列上。
     该多肽可从细胞裂解物、 细胞上清液、 和 / 或细胞培养基中， 以不同本领域中已 知的适当方法分离， 这些方法包括， 如， 细胞裂解物和 / 或细胞上清液的不同层析。例如， 该多肽可首先通过使用离心过滤器 (Amicon) 浓缩该培养基或可替代地通过以硫酸铵或 聚乙二醇沉淀该多肽， 再接着使该多肽重新悬浮于 PBS 或其他适当的缓冲液中， 而从细 胞裂解物和 / 或细胞培养基中分离。该多肽接着可在 Sephacryl S-400 柱子 (Amersham Biosciences) 上 进 行 大 小 排 阻 层 析 ( 如 说 明 于， 如， Hjorth， R.andJ.Moreno-Lopez， J.Virol.Methods 5 ： 151-158(1982)) 或是另一种亲和层析， 或是通过 20％ -60％的蔗糖梯 度进行离心 ( 例如说明于， 如， Konish et al.， Virology 188 ： 714-720(1992)) 而进行纯 化。含有所希望的多肽的部分可以由 ELISA 或 SDS-PAGE 随后进行蛋白质银染或免疫印迹 来鉴定。收集所希望的部分并进一步进行浓缩。梯度离心部分中的蔗糖可用 PD-10 柱子 (Amersham Biosciences) 凝胶过滤来去除。其他纯化技术包括那些所述于以下实例中的、 以及疏水相互作用层析 (Diogo， M.M， et al.， J.Gene Med.3 ： 577-584(2001))、 以及任何其 他本领域中已知的适当技术。
     也可使用本领域中已知的任何适当纯化技术。本领域中已知的多肽纯化方法包 括那些方法说明于， 如， Sandana(1997)BIOSEPARATION OF PROTEINS， Academic Press， Inc.， Bollag nd et al.(1996)PROTEIN METHODS， 2 EditionWiley-Liss， NY， Walker(1996)THE PROTEIN PROTOCOLS HANDBOOK HumanaPress， NJ， Harris and Angal(1990)PROTEIN PURIFICATION APPLICATIONS ： APRACTICAL APPROACH IRL Press at Oxford， Oxford， England， Scopes(1993)PROTEIN PURIFICATION ： PRINCIPLES AND PRACTICE rd 3 Edition Springer Verlag， NY， Janson and Ryden(1998)PROTEIN PURIFICATION ： PRINCIPLES，HIGHRESOLUTION METHODS AND APPLICATIONS， Second Edition Wiley-VCH， NY ； 以及 Walker(1998)PROTEIN PROTOCOLS ON CD-ROM Humana Press， NJ。适于进行蛋白制备的细胞在本领域中是已知的， 并且 在本文其他地方进行讨论 ( 例如， Vero 细胞、 293 细胞、 BHK、 CHO( 例如， CHO-K1) 以及 COS 细胞可以是适用的 )。可以通过任何适当的技术将细胞进行裂解， 包括， 如， 超声处理、 微射 流 (microfluidization)、 物理剪切、 法式细胞压碎 (French press) 裂解、 或洗涤剂基础性 (detergent-based) 裂解。
     在一个方面， 本发明提供一种纯化本发明多肽的方法， 该方法包括用本发明的核 酸 ( 例如， 编码包括 SEQ ID NO ： 1 多肽序列的重组多肽的重组核酸 ) 转化适当的宿主细胞， 在该宿主细胞 ( 例如， CHO 细胞或 293 细胞 ) 中， 以适当的裂解技术裂解该细胞 ( 例如， 超 声处理、 洗涤剂裂解、 或其他适当技术 )， 再对该裂解物进行亲和纯化 ( 使用一个包括一种 树脂的层析柱子， 该树脂包括至少一种本发明的新颖抗体 ( 通常是本发明的一种单克隆抗 体 ) 或其抗原结合片段 )， 这样使得该裂解物富含该所希望的多肽 ( 例如， 一种包括 SEQ ID NO ： 1 多肽序列的多肽 )。
     在另一个方面， 本发明提供一种纯化此类目标多肽的方法， 该方法与以上说明方 法的不同在于该方法使用一种核酸， 该核酸包括一个编码包括本发明多肽 ( 例如， SEQ ID NO ： 1) 的融合蛋白以及一个适当标记 ( 例如， e- 表位 /his 标记 ) 的核苷酸序列， 并且其是 以免疫亲和、 扁豆凝集素亲和柱层析 (immunoaffinity， lentil-lectin affinity column 固定化金属离子亲和层析 (IMAC)、 或金属螯合亲和层析 (MCAC) 富集技 chromatography)、 术纯化该多肽。另外的纯化方法在本文其他地方披露。
     在另一个方面， 本发明提供一种制备本发明多肽的方法， 该方法包括将包括本发 明一种核酸的一个重组表达载体引入到多个细胞的一个群体之中， 在足以从该载体表达该 核酸并制备由该核酸所编码多肽的适当条件下在培养基中培养所述细胞， 再从所述细胞、 培养基、 或两者中分离该多肽。 所选的细胞是基于该多肽的所希望的处理， 并且基于该适当 载体 ( 例如， 对于细菌质粒而言， 大肠杆菌细胞是优选的， 而对于哺乳动物穿梭质粒和 / 或 腺病毒 ( 特别是 E1- 缺失腺病毒 ) 而言， 293 细胞是优选的 )。
     在又另一个方面， 本发明包括一种制备多肽的方法， 该方法包括 ： (a) 将包括至少 一种编码本发明多肽的本发明一种核酸的一个重组表达载体引入到多个细胞的一个群体 之中 ； (b) 将该表达载体给予至一个哺乳动物体内 ； 并且 (c) 从该哺乳动物或从该哺乳动物 的副产品分离该多肽。
     本发明的多肽也可通过以下来制备 ： 在足以表达该多肽的条件下培养本发明的细 胞或多个细胞的一个群体 ( 该细胞或多个细胞的一个群体， 如， 已经由编码这种多肽的本 发明核酸转化 )， 再回收在该细胞中或是由该细胞表达的多肽， 使用本领域中已知的标准技 术进行。
     在另一个方面， 本发明提供一种制备本发明多肽的方法， 该方法包括 (a) 将本发 明的一种核酸引入到多个细胞的一个群体之中， 其中该核酸被可操作地连接到可有效生产 由该核酸所编码的多肽的一个调节序列上 ； (b) 在一种培养基中培养这些细胞以生产该多 肽； 并且 (c) 将该多肽从这些细胞或培养基中分离。 还包括一种经培养的细胞， 在该细胞中 已引入一个本发明的载体 ( 例如， 本发明的一个表达载体 )。
     还包括一种制备本发明多肽的方法， 该方法包括将编码所述多肽的一种核酸引入到培养基中的多个细胞的一个群体之中 ( 这些细胞可容许表达该核酸 )， 将这些细胞维持 在其中可表达该核酸的条件下， 此后从该培养基中分离该多肽。
     在另一个方面， 本发明提供一种制备融合蛋白的方法。该方法包括 ： (1) 在一种 培养基中培养用一种核酸转化的宿主细胞， 其中该核酸包括 ： (i) 一个第一核苷酸序列， 该 第一核苷酸序列编码了一种多肽， 该多肽具有与选自下组的一个多肽序列至少 95％的一致 性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该多肽结合 CD86 和 / 或 CD80、 和 / 或 CD86 或 CD80 之一的一个细胞外结构域 ； 以及 (ii) 一个第二核苷酸序列， 该第二核苷酸序列编码了 一种 Ig Fc 多肽， 该多肽包括一个铰链区、 CH2 结构域以及 CH3 结构域， 由此表达该核酸并产 生了一种融合蛋白 ； 以及 (2) 回收该融合蛋白。可使用任何 Ig Fc 多肽， 包括， 如， IgG1 Fc、 IgG2 Fc、 IgG4 Fc、 或是突变 Ig Fc 多肽。在一些此类方法中， 该核酸进一步包括一个第三 核苷酸序列， 该第三核苷酸序列编码了可操作地连接至该融合蛋白上的一种分泌肽或信号 肽， 并且该融合蛋白是作为包括相同第一以及第二融合蛋白的一种二硫键合的融合蛋白二 聚体形式而从该宿主细胞中分泌的， 并且该二硫键合的融合蛋白二聚体是从该培养基中回 收的。在一些此类方法中， 该二硫键合的融合蛋白二聚体是经由在该第一融合蛋白的一个 半胱氨酸残基与该第二融合蛋白的一个半胱氨酸残基之间的一个共价二硫键而形成的。 在 一些此类方法中， 该融合蛋白是从该培养基、 宿主细胞、 或宿主细胞周质中回收的。
     在另一个方面， 本发明提供一种分离或重组的核酸， 该核酸包括一个核苷酸序列， 该核苷酸序列编码了 (i) 一个第一多肽， 该多肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选 自下组的至少一个多肽序列至少 95％的序列一致性， 该组的构成为 ： SEQ ID NOS ： 1 至 73， 其中该第一多肽结合 CD86 和 / 或 CD80、 和 / 或两者之一或两者的一个细胞外结构域， 以及 (ii) 一个第二多肽， 该多肽包括一种 IgG 多肽的一个铰链区、 CH2 结构域以及 CH3 结构域。 该第二多肽可包括在本文其他地方所讨论的任何适当 Ig 多肽， 它包括， 如， 包括 SEQ ID NO ： 184 或 SEQ ID NO ： 218 的多肽序列。
     在另一个方面， 本发明提供一种制备可溶性融合蛋白二聚体的方法。该方法包括 培养由一种表达载体转化的宿主细胞， 该表达载体包括编码本发明一种可溶性融合蛋白二 聚体的一个核苷酸序列。示例性的融合蛋白包括所述的包括 SEQ ID NOS ： 74-79、 197-200、 205-214、 以及 219-222 中任何多肽序列的那些。该载体包括可协助该融合蛋白表达的一个 核苷酸序列 ( 例如， 编码一个信号肽的一个核苷酸序列 )。 该融合蛋白是作为包括两相同的 融合蛋白的一种二硫键合的融合蛋白二聚体而从该宿主细胞分泌的， 并且该二硫键合的融 合蛋白二聚体是从该培养基中回收的。在一些此类方法中， 该二硫键合的融合蛋白二聚体 是经由在每个融合蛋白上的一个半胱氨酸残基之间的一个共价二硫键而形成。 该融合蛋白 二聚体典型地是从该培养基、 宿主细胞、 或宿主细胞周质中回收的。实例 12 提供一种示例 性的操作， 该操作用于产生表达本发明一种突变 CTLA4-Ig 融合蛋白的一种稳定转染细胞 系， 产生该突变 CTLA4-Ig 融合蛋白， 并自培养物中纯化该突变融合蛋白。
     除重组制备的外， 本发明的多肽尚可使用固相技术而以直接的肽合成制备 ( 见， 如， Stewart et al.(1969)SOLID-PHASE PEPTIDE SYNTHESIS， W.H.Freeman Co， San Francisco 以及 Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85 ： 2149-2154)。. 肽合成可使用手动技术或是通 过自动化而进行。自动化合成可， 例如， 使用 Applied Biosystems 431A 肽合成仪 (Perkin Elmer， Foster City， Calif.)， 根据制造商所提供的指示而实现。例如， 亚序列可用化学方法来单独合成并使用化学方法来结合， 以产生本发明的一个多肽或其片段。 可替代地， 可从 任何专门生产多肽的公司订购合成的多肽。最常见的， 本发明的多肽是通过表达编码核酸 并回收多肽而制备的， 如， 如上所述。
     本发明包括一种制备本发明多肽的方法， 该方法包括将本发明的一种核酸、 本发 明的一种载体、 或它们的一个组合引入到一个动物体内， 诸如， 一个哺乳动物 ( 包括， 如， 大 鼠、 非人类灵长类、 蝙蝠、 狨猿、 猪、 或鸡 )， 这样使得本发明的一种多肽在该动物体内表达， 再该多肽从该动物或从该动物的副产物分离。 多肽从该动物或动物副产物的分离可以任何 适当技术进行， 取决于该动物和所希望的回收策略而定。 例如， 该多肽可从表达本发明多肽 的小鼠、 猴、 或猪的血清中而回收。本发明提供了包括至少一种本发明核酸的转基因动物 ( 包括以上说明哺乳动物 )。该转基因动物可具有整合入它的宿主基因组中的核酸 ( 例如， 经由 AAV 载体、 慢病毒载体、 以整合促进序列所进行的生物弹道技术等 )， 或是可具有维持 在染色体外的核酸 ( 例如， 在一个非整合性质粒载体中， 或是通过插入一个非整合性病毒 载体中 )。 可对染色体外的载体进行设计， 以进行比整合性载体更为瞬时的基因表达。 基于 RNA 的载体在这方面提供了特别的优势。
     组合物
     本发明进一步提供新颖并有用的组合物， 该组合物包括至少一种本发明的组分， 诸如， 如， 至少一种本发明的多肽 ( 包括， 如， 融合蛋白以及多聚体多肽 )、 偶联物、 核酸、 载 体、 病毒、 病毒样颗粒 (VLP)、 和 / 或细胞、 或它们的任何组合 ； 以及一种载体、 赋形剂、 或稀 释剂。该载体、 赋形剂或稀释剂可以是一种药学上可接受的载体、 赋形剂、 或稀释剂。这种 组合物可包括任何适当量的任何适当数目的本发明多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 病毒、 VLP、 和 / 或细胞。本发明还提供药物组合物， 该组合物包括至少一种该多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 病毒、 VLP、 和 / 或细胞、 或它们的任何组合， 以及一种药学上可接受的载体、 赋形剂、 或稀释 剂。此类组合物在此处所述的本发明方法中是有用的， 这些方法包括， 如， 阻抑免疫应答的 方法。
     例如， 在一个非限制性实施方案中， 本发明提供一种组合物， 该组合物包括一种 赋形剂、 稀释剂、 或载体， 以及至少一种本发明的此类多肽 ( 例如， 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 种或以上的多肽 )， 诸如， 一种突变 CTLA-4 ECD 多肽 ( 例如， SEQ ID NOS ： 1 至 73 中的任 何一个 ) 或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 例如， SEQ ID NOS ： 74-79、 197-200、 205-214、 以及 219-222 中的任何一个 )， 其中至少一种多肽是以有效阻抑在被给予该组合物的受试者体 内的一种免疫应答 ( 包括， 如， 涉及移植排斥和 / 或自身免疫的免疫应答 )、 阻抑对于一个供 方的组织、 细胞、 或器官移植的排斥或是抑制内源性 B7- 阳性细胞与 CD28- 阳性 T 细胞间相 互作用的量而存在于该组合物中。
     本发明还包括一种药物组合物， 该组合物包括一种药学上可接受的赋形剂、 稀释 剂、 或载体， 以及有效量的一种或多种此类本发明的组分。 该有效量可为用于本文其他地方 所述的一种治疗或预防方法中的治疗或预防有效量或剂量， 这种方法诸如， 治疗一种自身 免疫疾病的一种方法， 或是抑制一位受方受试者对于来自一个供方的组织、 细胞、 移植物、 或器官移植排斥的一种方法。
     该组合物 ( 或药物组合物 ) 可以是任何无毒性的组合物， 它不会干扰其中所包括 的本发明多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 病毒、 VLP、 和 / 或细胞的免疫抑制特性。该组合物可包括一种或多种赋形剂、 稀释剂、 或载体， 并且该药物组合物包括一种或多种药学上可接受的 赋形剂、 稀释剂、 或载体。本领域中已知宽泛种类的可接受的载体、 稀释剂、 以及赋形剂， 并 且它们可被包括在本发明的组合物以及药物组合物中。例如， 可使用不同水性载体， 如， 蒸 馏或纯化水， 无菌的盐水、 缓冲盐水 ( 诸如， 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)) 及其类似物， 它们在本 发明的多肽、 融合蛋白类、 偶联物、 核酸、 载体、 病毒、 VLP、 和 / 或细胞的可注射配制品中是 有利的。本领域中已知众多可用于治疗性蛋白给予的适当赋形剂、 载体、 以及稀释剂。此 类溶液优选是无菌的， 并且总体上不含不希望的物质。组合物可以通过常规的、 众所周知 的灭菌技术来灭菌。本发明的组合物可以包括所需的药学上可接受的辅助物质以接近生 理条件。此类物质包括， 如， pH 调节剂、 缓冲剂、 以及渗透压调节剂 (tonicity adjusting agent)， 包括， 如， 醋酸钠、 抗坏血酸钠、 氯化钠、 氯化钾、 氯化钙、 乳酸钠及其类似物。 本发明 的组合物， 包括药物组合物， 还可以包括一种或多种适用于夹杂在一种药物组合物中的组 分， 诸如， 稀释剂、 填充剂、 盐、 缓冲剂、 表面活性剂、 乳化剂、 洗涤剂 ( 例如， 非离子型洗涤剂 或乳化剂， 诸如， -20、 -40、 -60、 -80、 普流尼克 F-68 及其类似物 )、 稳定剂类 ( 如糖类或不含蛋白的氨基酸类 )、 防腐剂、 组织固定剂、 增溶剂、 和 / 或其他物质。
     可 用 于 药 物 组 合 物 中 的 适 当 组 分 实 例 说 明 于， 如， Berge et al.， J.Pharm. Sci.66(1) ： 1-19(1977)， Wang and Hanson， J.Parenteral.Sci.Tech.42 ： S4-S6(1988)， 美国专利号 6,165,779 和 6,225,289， 以及本文其他地方。药物组合物还可以包括防腐 剂 ( 诸如， 苯甲醇、 迭氮化钠、 间 - 甲酚等 )、 抗氧化剂、 金属螯合剂 ( 诸如， 甲硫氨酸、 EDTA 等 )、 和 / 或本领域中的普通技术人员所知的其他添加物。用于药物组合物的适当的药 物上可接受性载体实例说明于， 如， Urquhart et al.， Lancet 16 ： 367(1980)， Lieberman et al.， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS-DISPERSE SYSTEMS(2nd ed.， Vol.3， 1998)， Ansel et al.， PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS&DRUG DELIVERY SYSTEMS(7thed.2000)， Martindale， THE EXTRA PHARMACOPEIA(31st edition)， Remington’ sPHARMACEUTICAL SCIENCES(16th-20th editions)， THE PHARMACOLOGICAL BASISOF THERAPEUTICS， Goodman and Gilman， Eds.(9th ed.-1996)， W ILSON ANDGISVOLDS TEXTBOOK OF ORGANIC MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY， Delgado and Remers， Eds.(10th ed.-1998)， 以及美国专 利号 5,708,025 和 5,994,106。配制药物上可接受的组合物的原则说明于， 如， Platt， Clin.LabMed.7 ： 289-99(1987)， Aulton， PHARMACEUTICS ： THE SCIENCE OF DOSAGE FORMDESIGN， Churchill Livingstone(New York)(1988)， EXTEMPORANEOUS ORALLIQUID DOSAGE PREPARATIONS， CSHP(1998)， 以 及″ Drug Dosage， ″ J.Kans.Med.Soc.70(1) ： 30-32(1969)。特别适用于载体的给予的其 他药学上可接受的载体说明于， 如， 国际专利申请公开号 WO 98/32859。
     本发明的组合物 ( 包括药物组合物 ) 可以包括一种或多种水性载体或赋形剂 ( 包 括， 如， 药学上可接受的载体或赋形剂 ) 以及一种或多种组分 ( 诸如， 一种或多种缓冲剂、 一 种或多种盐、 一种或多种洗涤剂或乳化剂、 和 / 或一种或多种糖。缓冲系统典型地是适用于 使该组合物的 pH 维持在一范围内， 该范围有助于存在于该组合物中的本发明分子 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig) 的稳定性。用于该组合物中的示例性缓冲剂包括， 但不限于， 如， N-2- 羟 乙基哌嗪 -N′ -2- 氨基乙烷磺酸 (HEPES) 缓冲剂、 柠檬酸盐缓冲剂 ( 例如， 柠檬酸二钠 - 柠 檬酸三钠混合物、 柠檬酸钠 - 柠檬酸混合物、 柠檬酸 - 柠檬酸三钠混合物、 柠檬酸一钠 - 柠 檬酸二钠混合物、 柠檬酸 - 柠檬酸一钠混合物 )、 磷酸钠缓冲剂 ( 例如， 磷酸二钠 - 磷酸三钠混合物 (Na2HPO4/Na3PO4)、 磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠混合物 )、 乙酸盐缓冲剂 ( 例如， 醋 酸 - 醋酸钠混合物、 醋酸 - 氢氧化钠混合物 )、 组氨酸缓冲剂、 Tris 缓冲剂、 Tris- 马来酸盐 缓冲剂、 琥珀酸盐缓冲剂 ( 例如， 琥珀酸 - 氢氧化钠混合物、 琥珀酸 - 琥珀酸一钠混合物、 琥 珀酸 - 琥珀酸二钠混合物、 琥珀酸一钠混合物 - 琥珀酸二钠混合物 )、 马来酸盐缓冲剂、 咪 唑缓冲剂、 酒石酸盐缓冲剂、 富马酸盐缓冲剂、 葡萄糖酸盐缓冲剂、 草酸盐缓冲剂、 乳酸盐缓 冲剂、 乙酸盐缓冲剂、 及其类似物， 或是它们任何的组合 ( 例如， 柠檬酸盐和乙酸盐缓冲剂 的混合物等 )。缓冲剂在组合物中的浓度可以是任何的对包括于该组合物溶液中的这种或 这些本发明分子的 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig) 适用的浓度， 诸如， 但不限于， 在大约 1mM 至大 约 100mM、 大约 1mM 至大约 50mM、 大约 5mM 至大约 50mM、 或大约 5mM 至大约 25mM 的范围内， 包括， 如， 1mM、 5mM、 10mM、 15mM、 20mM、 25mM、 30mM、 40mM、 50mM( 诸如， 如， 20mM HEPES 缓冲剂、 20mM 柠檬酸二钠 - 柠檬酸三钠缓冲剂、 20mM 琥珀酸缓冲剂等 )。
     用于该组合物的示例性盐类包括， 但不限于， 如， 水溶性盐类， 包括一种有机盐或 无机盐 ( 例如， 水溶性无机盐 )， 诸如， 氯化钠、 氯化镁、 碳酸氢钠、 氯化钾、 氯化钙、 和氯化 铵、 及其类似物， 或是任何药学上可接受的或生理学上可相容的盐。盐在该组合物溶液中 的示例性浓度包括， 但不限于， 如， 在大约 1mM 至大约 150mM、 大约 10mM 至大约 125mM、 或大 约 75mM 至大约 125mM 的范围内， 包括， 如， 10mM、 50mM、 75mM、 100mM、 125mM、 150mM( 诸如， 如， 100mM NaCl)。
     用于该组合物的示例性糖类或碳水化合物包括， 但不限于， 如， 蔗糖、 麦芽糖、 海藻 糖、 葡萄糖、 甘露糖、 棉子糖、 乳糖、 麦芽糊精、 右旋糖酐、 蔗糖等， 其浓度范围包括， 但不限 于， 如， 基于该组合物， 按重量计从大约 0.1 ％至大约 10 ％的糖、 按重量计从大约 1 ％至大 约 5％的糖或按重量计从大约 1％至大约 3％的糖， 包括， 如， 按重量计 0.1％、 0.5％、 1％、 1.5％、 2％、 2.5％、 3％、 4％、 5％、 6％、 7％、 8％、 9％、 或 10％的糖 ( 例如， 按重量计 2％的蔗 糖、 按重量计 2％的海藻糖、 或按重量计 2％的甘露糖 )。用于该组合物的示例性糖醇包括， 但不限于， 如， 甘露糖醇、 山梨糖醇、 乙二醇、 甘油、 阿拉伯糖醇、 赤藓糖醇、 木糖醇、 核糖醇、 乳糖醇、 及其类似物， 其浓度范围包括， 但不限于， 如， 基于该组合物， 按重量计从大约 0.1％ 至大约 10％的糖醇、 大约 1-5％、 大约 1-3％， 包括， 如， 按重量计 0.1％、 0.5％、 1％、 1.5％、 2％、 2.5％、 3％、 4％、 5％、 6％、 7％、 8％、 9％、 或 10％的糖醇。
     本发明组合物 ( 包括药物组合物 ) 的渗摩尔浓度典型地类似血液的血清渗摩尔浓 度， 其范围是从大约 250 至大约 350 渗透压毫克分子每千克 (mOSm/kg) 水。盐在该组合物 中的浓度典型地是小于 125mM。 盐和糖的浓度可经调整或变化， 这样使得该组合物的渗摩尔 浓度为从大约 250-350mOSm/kg 水。
     用于该组合物的示例性洗涤剂或乳化剂包括， 但不限于， 如， 聚山梨醇酯， 诸如， -20、 -40、 -60、 -80 或 普 流 尼 克 F-68， 其范围包 括， 但不限于， 如， 基于该组合物， 按重量计从大约 0.001 ％至大约 0.2 ％的一种洗涤剂或 乳化剂， 包括， 如， 基于该组合物， 按重量计 0.001％、 0.002％、 0.003％、 0.004％、 0.005％、 0.006％、 0.007％、 0.008％、 0.009％、 0.01％、 0.02％、 0.03％、 0.04％、 0.05％、 0.075％、 以 及 0.1％的洗涤剂或乳化剂 ( 例如， -20、 -40、 -60、 -80、 或普流尼克 F-68)。
     本发明的组合物 ( 包括药物组合物 ) 可以包括一种聚合物， 诸如， 一种 PEG 分子，其浓度足以降低或抑制二个或多个本发明分子间 ( 诸如， 如， 二个或多个本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 ) 的不希望的结合。该组合物可包括二种或多种不同的聚合 物 ( 例如， PEG)。该聚合物 ( 例如， PEG 分子 ) 典型地具有从大约 200Da 至大约 8000Da 的 分子量 ( 例如， 大约 200Da、 300Da、 400Da、 600Da、 900Da、 1000Da、 1450Da、 3350Da、 4500Da 或 8000Da， 可自 Dow Chemical 获得 )。所相信的是， 在该组合物中添加聚合物 ( 例如， PEG 分 子 ) 可降低不希望的聚集体的形成， 特别是二个或多个本发明融合蛋白二聚体的不希望的 聚集体。
     本发明的组合物 ( 包括药物组合物 ) 可以包括一种环状寡糖， 诸如， 一种环糊精 ( 例如， (Cydex))。在一个方面， 该组合物包括两种或多种不同的环状寡糖。在 该组合物中添加一种或多种环状寡糖可改进一种或多种活性药物成分 ( 例如， 突变 CTLA-4 分子 ) 的溶解度、 稳定性、 生物利用率、 和 / 或剂量。
     本发明组合物 ( 包括药物组合物 ) 的 pH 可介于从大约 pH 3 至大约 pH10、 从大约 pH 4 至大约 pH 10、 从大约 pH 5 至大约 pH 9、 从大约 pH 6 至大约 pH 9、 从大约 pH 5.5 至大 约 pH 8.5、 从大约 pH 6.0 至大约 pH 6.7、 从大约 pH 6.0 至大约 pH 6.5、 从大约 pH 6.2 至 大约 pH 8.7、 从大约 pH 6.5 至大约 pH 8.5、 从大约 pH 6.5 至大约 pH 7.5、 从大约 pH 6.2 至大约 pH 7.0、 从大约 pH 6.3 至大约 pH 6.8、 从大约 pH 6.4 至大约 pH 6.8、 从大约 pH 7.0 包括本发明一种分子 ( 诸 至大约 pH 8.0、 以及大约 pH 7.0 至大约 pH 7.4。在一个方面， 如， 如， 一种突变 CTLA-4-IgG2) 的组合物具有 pH 5.0、 pH 5.1、 pH 5.2、 pH 5.3、 pH 5.4、 pH 5.5、 pH 5.6、 pH 5.7、 pH 5.8、 pH 5.9、 pH 6.0、 pH 6.1、 pH 6.2、 pH 6.3、 pH 6.4、 pH 6.5、 pH 6.6、 pH 6.7、 pH 6.8、 pH 6.9、 pH 7.0、 pH 7.1、 pH 7.2、 pH 7.3、 pH 7.4、 pH 7.5、 pH 7.6、 pH 7.7、 pH 7.8、 pH 7.9、 pH 8.0、 pH 8.1、 pH 8.2、 pH 8.3、 pH 8.4、 pH 8.5、 pH 8.6、 pH 8.7、 pH 8.8、 pH 8.9、 pH 9.0、 pH 9.1、 pH 9.2、 pH 9.3、 pH 9.4、 pH 9.5、 pH 9.6、 pH 9.7、 pH 9.8、 pH 9.9、 或 pH 10.0 的 pH 值。
     在一个方面， 本发明提供一种本发明的组合物， 该组合物包括一种赋形剂或载体 ( 包括， 如， 一种药物组合物， 该组合物包括一种药学上可接受的赋形剂或载体 ) 以及有效 量的任何说明于全文以及此处的本发明 CTLA-4 多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体， 并进一步包括一种可使该组合物的 pH 维持在介于大约 pH 3 至大约 pH 10 的缓冲剂、 水、 可任选地的非离子型洗涤剂、 可任选地的盐、 以及可任选地的一种糖醇、 单 糖、 二糖、 或多糖。一些此类组合物是在生理 pH 下。一些此类组合物具有从大约 4 至大约 7.5、 大约 5.0 至大约 7.5、 或从大约 6.4 至大约 6.6， 包括， 如， 大约 pH 6.5、 大约 pH 7.4、 或 pH 7.5 的 pH 值。一些此类组合物包括浓度从大约 1mM 至大约 100mM、 大约 1mM 至大约 50mM、 大约 5mM 至大约 35mM、 大约 10mM 至大约 25mM， 包括， 如， 大约 20mM、 25mM 或 30mM 的一 种缓冲剂。一些此类组合物包括一种选自下组的缓冲剂， 改组的构成为一种 HEPES 缓冲剂、 柠檬酸盐缓冲剂、 琥珀酸盐缓冲剂、 乙酸盐缓冲剂、 柠檬酸盐缓冲剂、 马来酸盐缓冲剂、 磷酸 盐缓冲剂、 以及 Tris 缓冲剂。一些此类组合物包括一种选自下组的缓冲剂， 该组的构成为 一种 HEPES 缓冲剂、 柠檬酸钠缓冲剂、 以及琥珀酸钠缓冲剂。就一些此类组合物而言， 其 pH 是从大约 6.0 至大约 6.7， 并且缓冲剂是琥珀酸钠或柠檬酸钠。就一些此类组合物而言， 其 pH 是从大约 7.0 至大约 7.7， 并且缓冲剂是 HEPES。 一些此类组合物进一步包括一种糖醇或 糖， 其中该糖是一种单糖、 二糖 ( 例如， 蔗糖或海藻糖 ) 或多糖。一些此类组合物包括以大约 1mM 至大约 50mM， 包括， 如， 大约 20mM、 25mM 或 30mM 的浓度存在的一种盐。一些此类组 合物包括一种非离子型洗涤剂， 诸如， 如， 选自下组的一种非离子型洗涤剂， 该组的构成为 ： -80、 -60、 -40、 -20 或普流尼克 F-68。
     在一些此类上段所述的组合物 ( 包括药物组合物 )， 该多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联 物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体是以介于大约 1mg/ml( 重量 / 体积或 w/v) 至大约 200mg/ ml(w/v)、 大约 25mg/ml(w/v) 至大约 100mg/ml(w/v)、 大约 50mg/ml 至大约 300mg/ml 的浓度 存在， 任选地大约在介于大约 50mg/ml(w/v) 至大约 100mg/ml(w/v) 的范围。一些此类组合 物包括从大约 0.1mg/kg 至大约 15mg/kg 的有效量的多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联物、 融合蛋 白、 或融合蛋白二聚体， 并且该组合物是给予一个哺乳动物 ( 例如， 人类 ) 的。 一些此类组合 物包括从大约 0.5mg/kg 至大约 10mg/kg 的有效量的多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联物、 融合蛋 白、 或融合蛋白二聚体， 并且该组合物是经由胃肠外进行给予。 一些此类组合物包括从大约 0.1mg/kg 至大约 5mg/kg( 并且任选地为大约 0.5mg/kg) 的有效量的多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体， 并且该组合物是经由皮下进行给予。一些此类组合 物包括从大约 5mg/kg 至大约 15mg/kg( 任选地为大约 10mg/kg) 的有效量的多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体， 并且该组合物是经由静脉内进行给予。 就一 些此类组合物而言， 该多肽、 多聚体、 二聚体、 偶联物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体包括一 个氨基酸序列， 该氨基酸序列具有与 SEQ IDNO ： 36 的氨基酸序列至少 95％、 至少 96％、 至 少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性。 就一些此类组合物而言， 该多肽、 多聚体、 二 聚体、 偶联物、 融合蛋白、 或融合蛋白二聚体包括一个氨基酸序列， 该氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 50 的氨基酸序列至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一 致性。一些此类组合物是无菌的和 / 或是对血液等渗的。一些此类组合物是液体组合物。 一些此类组合物处于一种液体或一种经干燥的形式， 其中该经干燥的形式选自下组， 其构 成为 ： 一种冻干形式、 一种风干形式、 以及一种经喷雾干燥的形式。
     在一示例性方面中， 本发明提供一种药物组合物， 该组合物包括 ： (i) 一种本发明 的 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 该融合蛋白具有从大约 1mg/ml 至大约 300mg/ml( 例如， 大约 1mg/ ml 至大约 100mg/ml、 大约 50mg/ml 或大约 100mg/ml 等 ) 的浓度 ( 任选地为一种二聚体融合 蛋白 ) ； (ii) 一种缓冲剂， 该缓冲剂具有介于大约 pH 5.0 与大约 pH 9.0 之间的缓冲能力， 浓度为大约 5mM 至大约 50mM ； (iii) 将该组合物达到一个指定体积的一种药学上可接受的 稀释剂 ； (iv) 一种糖， 其浓度为基于该组合物按重量计大约 0.5％至大约 10％的糖 ； (v) 一 种盐， 其浓度为大约 1mM 至大约 200mM ； (vi) 任选地一种非离子型洗涤剂 ( 例如， -20、 -40、 -60、 -80、 或普流尼克 F-68)， 其浓度为大约 0.01mg/ ml 至大约 0.5mg/ml， 如， 大约 0.01mg/ml 至大约 0.1mg/ml ； 以及 (vii) 任选地的一种环状寡 糖 ( 例如， 环糊精 )， 其中该组合物的 pH 是在大约 pH 5.0 至大约 pH 8.0 的 范围内。示例性的本发明 CTLA-4-Ig 融合蛋白包括那些 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 它们包括一 个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 91％、 92％、 93％、 94％、 95 ％、 96 ％、 97 ％、 98 ％、 99 ％、 或 100 ％的序列一致性， 该组的构成为 SEQ ID NOS ： 74-79、 197-200、 205-214、 以及 219-222( 任选地为， 如， 选自下组， 该组的构成为 SEQ IDNOS ： 197、 199、 211、 以及 213)， 其中该融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或它的一个细胞外结构域， 和 / 或可阻抑一种免疫应答。此类融合蛋白可处于单体或二聚体形式。在另一个方面， 本发明提供一种药物组合物， 该组合物包括 ： (i) 一种偶联物， 该 偶联物包括一种本发明的 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 任选地为二聚体融合蛋白 ) 以及一个共价 地附连至该融合蛋白的非多肽部分， 所述偶联物具有从大约 1mg/ml 至大约 300mg/ml( 例 如， 大约 1mg/ml 至大约 100mg/ml、 大约 50mg/ml 或大约 100mg/ml 等 ) 的浓度 ； (ii) 一种缓 冲剂， 该缓冲剂具有在大约 pH 5.0 与大约 pH 8.0 之间的缓冲能力， 浓度为大约 5mM 至大约 50mM ； (iii) 将该组合物达到一个指定体积的一种药学上可接受的稀释剂 ； (iv) 一种糖， 其 浓度为基于该组合物按重量计大约 0.5％至大约 10％的糖 ； (v) 一种盐， 其浓度为大约 1mM 至大约 200mM ； 以及 (vi) 任选地一种非离子型洗涤剂 ( 例如， -20、 -40、 -60、 -80、 或普流尼克 F-68)， 其浓度为大约 0.01mg/ml 至大约 0.5mg/ ml， 如， 大约 0.01mg/ml 至大约 0.1mg/ml ； 其中该组合物的 pH 是在大约 pH 5.0 至大约 pH 8.0 的范围内。该偶联物可以包括一、 二、 三、 四个或更多个非多肽部分。每个非多肽部分 可以包括一个聚合物 ( 例如， PEG 或 PAO) 或一个糖部分。在一些情形下， 非多肽部分是一 个聚合物分子， 诸如， 一个 PEG 分子。该聚合物分子可具有任何所希望的分子量， 取决于所 希望的功能效应 ( 例如， 增加的半衰期、 融合蛋白分子间减小的结合 )。在一些情形下， 如， 该聚合物是具有大约 1kDa 至大约 100kDa Da( 例如， 1kDa、 2kDa、 2.5kDa、 3kDa、 5kDa、 8kDa、 10kDa、 12kDa、 20kDa、 25kDa、 30kDa、 40kDa、 60kDa 等 ) 的分子量的一个 PEG。 使用如上所述的 标准操作， 非多肽部分 ( 例如， 糖部分或聚合物分子 ) 被共价地附连至该融合蛋白的一个氨 基酸残基的一个连附基团。示例性的 CTLA-4-Ig 融合蛋白包括那些 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 它们包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少 91％、 至少 92％、 至少 93％、 至少 94％、 至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％、 或 100％ 的序列一致性， 该组的构成为 SEQ ID NOS ： 74-79、 197-200、 205-214、 以及 219-222( 任选 地为， 如， 选自下组， 其构成为 SEQ ID NOS ： 197、 199、 211、 以及 213)， 其中该融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或它的一个细胞外结构域， 和 / 或可阻抑一种免疫应答。此类融合 蛋白可处于单体或二聚体形式。
     在另一个方面， 本发明提供一种药物组合物， 该组合物包括 ： (a) 一种多肽， 该多 肽包括一个多肽序列， 该多肽序列具有与选自 SEQ ID NOS ： 1 至 73 的组的一个多肽序列 ( 诸如， 如， SEQ ID NOS ： 36 和 50) 至少大约 94％、 95％、 96％、 97％、 98％、 99％、 或 100％的 一致性， 其中该多肽是以在大约 1mg/ml 至大约 200mg/ml(w/v) 范围内的浓度存在 ； (b) 一 种缓冲剂， 该缓冲剂具有在大约 pH 5.0 与大约 pH 8.0 之间的缓冲能力， 浓度在大约 5mM 至 大约 50mM 的范围内 ； (c) 将该组合物达到一个指定体积的一种药学上可接受的稀释剂 ； (d) 一种糖， 其浓度为按重量计大约 0.5％至大约 10％ ； (e) 一种盐， 其浓度为大约 1mM 至大约 200mM ； 以及 (f) 任选地一种洗涤剂 ； 其中 pH 是在大约 pH 5.0 至大约 pH 8.0 的范围内。在 一些此类药物组合物中， (a) 该多肽包括 SEQ ID NO ： 36 的多肽序列， 以在大约 50mg/ml 至 大约 100mg/ml 范围内的浓度存在 ； (b) 该缓冲剂是 HEPES 缓冲剂， 以大约 20mM 的浓度存 在； (c) 该药学上可接受的稀释剂是水 ； (d) 该糖是蔗糖或海藻糖， 浓度为按重量计 2％； (e) 该盐是氯化钠， 浓度为大约 100mM ； 并且 (f) 可任选地从下组选择一种洗涤剂， 该组的构成 为： -80、 -60、 -40、 -20、 或普流尼克 F-68， 洗涤剂的 浓度为小于或等于大约 0.1mg/ml， 其中该组合物的 pH 是大约 7.4。在另一此类药物组合物 中， (a) 该多肽包括 SEQ ID NO ： 50 的多肽序列， 以在大约 50mg/ml 至大约 100mg/ml 范围内的浓度存在 ； (b) 该缓冲剂是柠檬酸钠缓冲剂， 以大约 20mM 的浓度存在 ； (c) 该药学上可 接受的稀释剂是水 ； (d) 该糖是蔗糖或海藻糖， 浓度为按重量计 2％ ； (e) 该盐是氯化钠， 浓 度为大约 100mM ； 以及 (f) 可任选地从下组选择一种洗涤剂， 该组的构成为 ： -80、 -60、 -40、 -20、 或普流尼克 F-68， 洗涤剂的浓度为小于或等于 大约 0.1mg/ml， 其中 pH 是大约 pH 6.5。
     在另一个方面， 本发明提供一种药物组合物， 该组合物包括 ： (a) 一种多肽， 该多 肽包括一个氨基酸序列， 该氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 36 的氨基酸序列至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性 ； 以及 (b)HEPES 或柠檬酸钠缓冲剂 ( 例如， 柠檬 酸二钠 - 柠檬酸三钠混合物、 柠檬酸钠 - 柠檬酸混合物、 柠檬酸 - 柠檬酸三钠混合物、 柠檬 酸一钠 - 柠檬酸二钠混合物、 或柠檬酸 - 柠檬酸一钠混合物 )。
     本发明还提供一种药物组合物， 该组合物包括 ： (a) 一种多肽， 该多肽包括一个氨 基酸序列， 该氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 36 的氨基酸序列至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性 ； 以及 (b) 一种药学上可接受的赋形剂或一种药学上可接受的载体， 其 中该组合物具有从大约 7 至大约 8 的 pH 值。一些此类药物组合物具有大约 7.4 或 7.5 的 pH 值。一些此类药物组合物包括 HEPES 或柠檬酸钠缓冲剂。
     本发明还提供一种药物组合物， 该组合物包括 (a) 一个多肽， 该多肽包括一个氨 基酸序列， 该氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 50 的氨基酸序列至少 96 ％、 至少 97 ％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性 ； 以及 (b) 柠檬酸钠缓冲剂 ( 例如， 柠檬酸二钠 - 柠檬酸三 钠混合物、 柠檬酸钠 - 柠檬酸混合物、 柠檬酸 - 柠檬酸三钠混合物、 柠檬酸一钠 - 柠檬酸二 钠混合物、 或柠檬酸 - 柠檬酸一钠混合物 )。
     本发明还提供一种药物组合物， 该组合物包括 ： (a) 一种多肽， 该多肽包括一个氨 基酸序列， 该氨基酸序列具有与 SEQ ID NO ： 50 的氨基酸序列至少 97％、 至少 98％、 或至少 99％的序列一致性 ； 以及 (b) 一种药学上可接受的赋形剂或一种药学上可接受的载体， 其 中该组合物具有从大约 6 至大约 7 的 pH 值。一些此类药物组合物具有大约 6.5 的 pH 值。 一些此类药物组合物包括柠檬酸钠缓冲剂。
     在一个示例性的方面， 本发明提供一种药物组合物， 该组合物包括从大约 1mg/ml 至大约 300mg/ml 的一种本发明 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 例如， D3-54-IgG2)( 例如， 大约 1mg/ ml 至大约 100mg/ml， 如， 大约 50mg/ml 或大约 100mg/ml)， 典型地作为一种二聚体融合蛋白 表达， 包括在下列之中 ： 20mM HEPES 缓冲剂于水中， 100mM NaCl， 基于该组合物按重量计 2％ 的蔗糖， pH 7.4， 可任选地包括一种非离子型洗涤剂 ( 例如， -20、 -40、 -60、 -80 或普流尼克 F-68)， 其浓度为大约 0.01mg/ml 至大约 0.5mg/ ml， 如， 大约 0.01mg/ml 至大约 0.1mg/ml， 并可任选地包括一种聚乙二醇 (PEG)， 诸如， 一种 具有从大约 200 道耳顿 (Da) 至大约 8000Da( 例如， 大约 200、 300、 400、 600、 900、 1000、 1450、 3350、 4500、 或 8000Da， 可自 Dow Chemical 获得 ) 分子量的 PEG 分子。在另一个示例性的 方面， 本发明提供一种药物组合物， 该组合物包括从大约 1mg/ml 至大约 300mg/ml 的一种本 发明 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 例如， D3-69-IgG2)， 典型地作为二聚体融合蛋白表达， 包括在 下列之中 ： 20mM 柠檬酸钠缓冲剂于水中， 100mM NaCl， 根据该组合物按重量计 2％的蔗糖， pH 6.5， 可任选地包括一种非离子型洗涤剂 ( 例如， -20、 -40、 -60、 -80 或普流尼克 F-68)， 其浓度为大约 0.01mg/ml 至大约 0.5mg/ml， 如， 大约0.01mg/ml 至大约 0.1mg/ml， 并可任选地包括一种 PEG 分子， 诸如， 一种具有从大约 200Da 至大约 8000Da( 例如， 大约 200、 300、 400、 600、 900、 1000、 1450、 3350、 4500、 或 8000Da， 可自 Dow Chemical 获得 ) 分子量的 PEG 分子。
     本发明包括用以包含一种本发明组合物的容器， 该组合物包括本发明的一种分子 ( 例如， 突变 CTLA-4 分子， 诸如， 一种突变 CTLA-4-Ig) 以及一种赋形剂、 稀释剂、 或载体。 该 组合物可以是一种药物组合物， 该组合物包括一种本发明的分子以及一种药学上可接受的 赋形剂、 稀释剂、 或载体。容器包括， 但不限于， 如， 小瓶 ( 例如， 玻璃小瓶， 诸如， 一种 I 型玻 璃小瓶 )、 自动注射器、 笔形注射器 ( 固定剂量或可变剂量 ) 以及预装填针筒、 或是其他适当 的容器。如果希望的话， 容器可含有一或多份可如本文其他地方所述而有效阻抑一种免疫 应答或是治疗一种免疫系统疾病或紊乱的预定剂量的本发明分子。 一些此类容器可用于对 罹患一种免疫疾病或紊乱的一位受试者给予其中所含的组合物 ( 例如， 自动注射器、 笔形 注射器、 预装填针筒等 )。一些此类容器可容许该受试者自行给予该组合物 ( 例如， 笔形注 射器、 自动注射器、 预装填针筒等 )。
     还提供了一种本发明分子 ( 例如， 突变 CTLA-4ECD 或突变 CTLA-4-Ig) 的稳定组合 物或配制品， 包括一种本发明分子与一种药学上可接受的载体的药学上可接受的组合物。 在另一个方面， 本发明包括冷冻干燥或冻干的组合物或配制品。术语 “冷冻干燥” 或 “冻干” 总体上是指一种物质的状态， 该物质已经过一个诸如冷冻干燥或冻干的干燥操作处理， 其 中至少 50％的水分已去除。预冻干及冻干操作是本领域中所熟知的 ( 见， 如， LYOPHILIZATIONOF BIOPHARMACEUTICALS， Vol.2 of BIOTECHNOLOGY ： PHARMACEUTICALASPECTS(Henry R.Costantino et al.eds.， 2004)， U.S.6,436,897， WO06/104852)， 并且可为本领域中的技术行家容易理解。在制备 本发明的冻干组合物中， 本领域中的普通技术人员可使用或随需要改进任何适当的冻干操 作， 。冷冻干燥、 风干、 喷雾干燥、 或冻干的组合物通常是从一种液体制备， 诸如， 一个溶液、 一个悬浮液、 一个乳液等。有待进行冷冻干燥、 风干、 喷雾干燥或冻干的液体典型地包括有 待在终重构液体组合物中的所有组分 ( 除该液体外， 如， 水 )。以此方式， 在重构时， 该经 冷冻干燥、 风干、 喷雾干燥或冻干的组合物将会具有所希望的液体组合物 ( 例如， 药物组合 物 )。 在本申请的全文中所说明的包括一种本发明分子 ( 例如， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融 合蛋白， 诸如， 如， SEQ ID NO ： 197、 199、 211 或 213) 的本发明的示例性组合物 ( 包括药物组 合物 ) 可通过使用本领域中已知的标准操作而冷冻干燥、 风干、 喷雾干燥、 或冻干， 以对应 地产生一种稳定的冷冻干燥、 风干、 喷雾干燥、 或冻干组合物。见， 如， 说明于以上说明文献 LYOPHILIZATION OF BIOPHARMACEUTICALS 的示例性操作。
     例如， 包含一种本发明分子 ( 例如， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 诸如， 如， SEQ ID NO ： 197、 199、 211、 或 213) 的一种液体组合物的一个容器 ( 例如， 小瓶， 诸如， 玻璃小 瓶 ) 可使用一般本领域中的普通技术人员所知的标准操作而进行冻干。见， 如， 以上说明文 献 LYOPHILIZATIONOF BIOPHARMACEUTICALS。经冻干的本发明分子 ( 例如， 本发明的突变 CTLA-4-Ig) 接着 可以用一种液体进行重构， 以产生一种重构的液体组合物。冻干配制品典型地是通过加入 一种水溶液以溶解冻干配制品而进行重构。 可使用任何适当的水性液体或溶液来重构一种 冻干配制品。一种冻干配制品通常是使用无菌的或蒸馏水而重构， 但包括载体、 赋形剂、 稀 释剂、 缓冲剂、 和 / 或其他组分 ( 包括全文所述的那些 ) 的溶液也可用于进行重构。
     在一个方面， 本发明提供一种冻干形式的药物组合物， 其中该组合物包括从大约1mg/ml 至大约 300mg/ml 的一种本发明 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 通常作为一种二聚体融合蛋 白表达， 包括在下列之中 ： 水中的适当缓冲剂 ( 例如， HEPES、 柠檬酸二钠 - 柠檬酸三钠等 )， 其浓度可维持所希望的 pH 值 ( 例如， 大约 pH 6.0 至大约 pH 7.5)， 盐 ( 例如， 50mM NaCl)， 糖 ( 例如， 基于该组合物按重量计 4 ％ -6 ％的蔗糖 )， 并可任选地包括一种非离子型洗涤 剂 ( 例如， -20、 -40、 -60、 -80、 或普流尼克 F-68)， 其浓度为大约 0.01mg/ml 至大约 0.5mg/ml， 如， 大约 0.01mg/ml 至大约 0.1mg/ml( 例如， -20、 -60、 -80 或普流尼克 F-68)。与一种未冻干的液体组合 物相比， 一种冻干形式的药物的典型地包括更低的盐浓度和更高的糖浓度。
     在一个具体方面中， 本发明提供一种用于经以无菌的水重构进行治疗性给药的 稳定的冻干组合物， 该组合物包括治疗有效量的一种本发明分子以及可任选地的一种或 多种下列药学上可接受的组分 ： (a) 一种糖或糖类， 诸如一种蔗糖、 甘露糖、 葡萄糖、 或海 藻糖， 其量是从按重量计大约 1％至按重量计大约 10％ ； (b) 一种洗涤剂或乳化剂， 诸如， -20、 -40、 -60、 -80、 或普流尼克 F-68 ； (c) 一种等渗 剂或盐， 诸如， 一种无机盐 ( 例如， 氯化钠 )， 其浓度为从 0mM 至大约 50mM( 包括， 如， 说明于 以上的浓度 ) ； (d) 将该组合物的 pH 维持在有助于分子稳定的范围中一种适当的缓冲剂 ； (e) 分散剂 ( 例如， 其量足以进行本发明分子的长期分散， 诸如， 如， 自 0.001w/v％至大约 -20、 -40、 -60、 1.0w/v％ )( 例如， 聚山梨醇酯， 诸如， -80、 或普流尼克 F-68) ； 以及 (f) 一种稳定剂， 如， 糖类、 右旋糖酐、 低分子量 (MW)PEG 基团 ( 诸如， 具有从大约 200Da 至大约 8000Da( 例如， 大约 200Da、 300Da、 400Da、 600Da、 900Da、 1000Da、 1450Da、 3350Da、 4500Da 或 8000Da)MW 的 PEG) 或防腐剂。在一些此类稳定的冻干 组合物中， 本发明的分子是一种重组或分离的本发明融合蛋白， 诸如包括与选自下组至少 一种的多肽序列具有至少 95％、 至少 96％、 至少 97％、 至少 98％、 至少 99％、 或 100％序列 一致性的多肽序列的融合蛋白， 该组的构成为 SEQ ID NOS ： 74-79、 197-200、 205-214、 以及 219-222( 任选地为， 如， 选自下组， 其构成为 SEQ ID NOS ： 197、 199、 211、 以及 213)， 其中该 融合蛋白结合 CD80 和 / 或 CD86、 和 / 或它的一个细胞外结构域， 和 / 或可阻抑一种免疫应 答。此类融合蛋白可处于单体或二聚体形式。
     每种此类组分在冻干组合物中的示例性含量包括说明于以上及此处的那些。 在一 个方面， 选择缓冲剂使得组合物的 pH 维持在从大约 pH 3 至大约 pH 8、 从大约 pH 4 至大约 pH 7.5 的范围内。 包括一种本发明重组突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的一种本发明冻干组合物 典型地在 -80℃至 +40℃下是稳定的， 和 / 或在贮存于环境温度下 ( 例如， 大约 22℃至大约 30℃ ) 时可基本上维持其生物活性至少一周、 一个或多个月 ( 例如， 六个月 )、 一年、 两年、 三 年、 四年或以上。在用液体 ( 例如， 用于注射的无菌的水 (WFI)) 重构时， 冻干组合物即适于 对一位受试者 ( 例如， 人类 ) 进行给药 ( 例如， i.v.、 s.c.、 胃肠外、 i.m.、 i.d.、 i.p. 等 )。
     本发明还提供一种试剂盒， 它在第一容器 ( 例如， 小瓶， 诸如， 玻璃小瓶 ) 中包括一 种冻干或冷冻干燥的组合物， 该组合物包括一种冻干或冷冻干燥的本发明分子 ( 例如， 突 变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 诸如， 如， SEQ IDNO ： 197、 199、 211、 或 213)， 以及关于使用一种液体 ( 例如， 无菌的水、 WFI、 或缓冲液 ) 重构该冷冻干燥或冻干组合物的说明书。可任选地的， 该试剂盒包括第二容器 ( 例如， 小瓶， 诸如， 玻璃小瓶 )， 其含有用于将冻干或冷冻干燥组合 物重构成为一种液体组合物的足量液体 ( 例如， 无菌的水、 WFI 或缓冲液 )。在此情形下，重构是通过使用一个针筒从该第二容器取出所希望的体积的水， 并将水引入该第一容器中 来实现的。接着温和震荡该第一容器， 这样使得该本发明的分子 ( 例如， 融合蛋白 ) 进入溶 液。该试剂盒可包括用以重构冻干或冷冻干燥组合物和 / 或给予该重构液体组合物的一个 或多个装置。示例性的装置包括， 但不限于， 如， 双组分混合针筒、 双腔针筒、 以及双腔自动 注射器。其中一个组分或腔含有冻干组合物， 并且该第二组分或腔含有用以进行重构的液 体。 使用此类装置， 重构典型地是在给药前实时进行， 并且该重构组合物通常是经肠外给予 ( 例如， s.c.、 i.v.、 i.m.、 i.d. 注射 )。
     本发明的组合物或药物组合物可包括一种脂质体或可处于一种脂质体的形式。 用 于脂质体配制品的适当脂质包括， 但不限于， 单酸甘油脂、 双酸甘油脂、 硫脂、 溶血卵磷脂、 磷脂、 皂苷、 胆酸、 及其类似物。 此类脂质体配制品的制备说明于， 如， 美国专利号 4,837,028 以及 4,737,323。
     所述组合物或药物组合物的形式可 ( 至少部分 ) 由所感兴趣的多肽、 偶联物、 核 酸、 载体、 病毒、 VLP、 或细胞的给予途径指定。 由于诸多给予途径皆是可能， 该药物组合物的 形式及其组分可各有不同。 例如， 在穿黏膜或经皮给予中， 可将对有待渗透的屏障适合的渗 透剂包括在该组合物中。此类渗透剂总体上是本领域中广泛已知的， 它包括， 例如， 就穿粘 膜给药而言， 洗涤剂、 胆盐、 以及梭链孢酸衍生物。 相对地， 穿粘膜给药可经由使用鼻喷剂或 栓剂而协助。
     本发明组合物 ( 包括药物组合物 ) 的一种常用给予形式是经由注射进行。可注射 的药学上可接受的组合物典型地包括一种或多种适当的液体载体， 诸如， 水、 石油、 生理盐 水、 抑菌盐水、 Cremophor ELTM(BASF， Parsippany， NJ)、 PBS、 或油。液体药物组合物可进一 步包括生理盐水溶液、 葡萄糖 ( 或其他糖溶液 )、 醇 ( 例如， 乙醇 )、 多元醇 ( 多元醇， 诸如， 甘露糖醇、 山梨糖醇等 )、 或二醇 ( 诸如， 乙二醇、 丙二醇、 PEG 分子 )、 可促进适当流动性的 涂覆剂 ( 诸如， 卵磷脂 )、 等渗剂 ( 诸如， 甘露糖醇或山梨糖醇 )、 有机酯 ( 诸如， 油酸乙酯 )、 以及吸收延迟剂 ( 诸如， 单硬脂酸铝以及明胶 )。该可注射组合物可处于一种无热原稳定 水溶液的形式。一种可注射的水溶液可包括一种等渗运载体， 诸如， 氯化钠、 林格氏注射溶 液、 葡萄糖、 乳酸化林格氏注射溶液或是相当的递送运载体 ( 例如， 氯化钠 / 葡萄糖注射溶 液 )。适于以动脉内、 静脉内、 肌内、 皮内、 真皮下、 腹膜内、 以及皮下途径进行注射的配制 品包括水性和非水性的等渗无菌的注射溶液， 它可包括溶剂、 共溶剂、 抗氧化剂、 还原剂、 螯 合剂、 缓冲剂、 抑菌剂、 抗微生物防腐剂、 以及可使该配制品与预期的受体血液等渗的溶质 ( 例如， PBS 和 / 或盐水溶液， 诸如， 0.1M NaCl)， 以及水性和非水性的无菌的悬浮液， 它可包 括悬浮剂、 增溶剂、 增稠剂、 乳化剂、 稳定剂、 以及防腐剂。
     本发明多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 病毒、 假病毒、 VLP 或细胞 ( 或是包括任何此类组 分的组合物 ) 的给予可以由任何适当材料所形成的一个递送装置协助。用以制备非生物可 降解性给予装置的适当基质材料包括羟基磷灰石、 生物玻璃、 铝酸盐或其他陶瓷。在一些 应用中， 可使用一种钳合剂 ( 诸如， 羧甲基纤维素 (CMC)、 甲基纤维素或羟丙基甲基纤维素 (HPMC)) 这样使得该特定组分结合该装置而进行定位递送。
     一种本发明的核酸或载体可与一种或多种泊洛沙姆 (poloxamer)、 聚氧乙烯 / 聚氧丙烯嵌段共聚物或是其他表面活性剂或似皂亲脂性物质共同配制， 以用于将该核酸 或载体递送至受试者多个细胞的一个群体或组织或皮肤。如见美国专利号 6,149,922、6,086,899、 以及 5,990,241。
     本发明的核酸或载体结合一种或多种转染增进剂。在部分具体实施方案中， 本发 明的核酸和 / 或核酸载体典型地是结合一种或多种可协助转染的稳定促进性盐类、 载体 ( 例如， PEG) 和 / 或配制品 ( 例如， 磷酸钠盐、 右旋糖酐载体、 氧化铁载体、 或生物弹道递送 ( “基因枪” ) 载体， 诸如， 金珠或粉末载体 )。见， 如， 美国专利号 4,945,050。其他转染增进 剂包括可偶联该核酸或核酸载体的病毒颗粒、 一种磷酸钙沉淀剂、 一种蛋白酶、 一种脂酶、 一种 bipuvicaine 溶液、 一种皂苷、 一种脂质 ( 例如， 一种带电荷脂质 )、 一种脂质体 ( 例如， 一种阳离子脂质体 )、 一种转染协助肽或蛋白复合物 ( 例如， 聚 ( 乙烯亚胺 )、 聚赖氨酸或病 毒蛋白 - 核酸复合物 )、 一种病毒颗粒或一种经修饰的细胞或细胞样结构 ( 例如， 一种融合 细胞 )。
     本发明的核酸或载体也可以活体内或活体外的电穿孔法递送， 包括， 如， 说明 于 美 国 专 利 号 6,110,161 以 及 6,261,281 号 以 及 Widera et al.， J.ofImmunol.164 ： 4635-4640(2000) 的那些。
     本发明组分 ( 例如， 本发明的多肽、 偶联物、 核酸、 载体、 病毒、 VLP、 和 / 或细胞 ) 的 经皮给予可以经皮贴剂促进， 该贴剂包括任何适当形式的任何适当组合的此类组分。本发 明提供此类经皮贴剂装置。 例如， 这种组分可包含在药物贮存贴剂装置中的液态贮物中， 或 是， 替代言的， 该组分可分散在适于纳入简单单片经皮贴剂装置中的材料中。典型地， 该贴 剂包括免疫抑制量的至少一种这种组分 - 诸如可有效在接触该贴剂的受试者体内阻抑一 种免疫应答的量。此类贴剂装置的实例是为本领域中所已知的。该贴剂装置可为被动装置 或是可使至少一个这种组分以离子导入递送至该受试者皮肤或组织的装置。
     一种组合物 ( 特别是一种药物组合物 ) 可包括任何足以在给药的后在该受试者体 内达到所希望的免疫抑制反应的适当剂量的至少一种本发明的此类组分 ( 例如， 多肽、 偶 联物、 核酸、 载体、 病毒、 VLP、 和 / 或细胞 )。 适当的剂量可以任何适当技术确定， 并且用以确 定适当的考虑是为本领域中所已知的。在一简单的剂量试验疗程中， 其是将低剂量的组合 物给予至试验受试者或系统中 ( 例如， 动物模式、 无细胞系统、 或全细胞分析系统 )。 剂量常 以有待给予的特定组分的功效、 受试者病况、 受试者体重和 / 或有待治疗的受试者的目标 区域而确定。 该剂量的大小也可以由特定受试者体内伴随任何此类特定组分给予的任何有 害副作用的存在、 性质、 和程度而确定。 有关治疗和预防剂的剂量的原则提供于， 如， Platt， Clin.Lab Med.7 ： 289-99(1987)“ ，Drug Dosage， ” J.Kans.Med.Soc.70(1) ： 30-32(1969)， 以 及其他在本文中所说明的参考文献 ( 例如， Remington’ s， 以上说明文献 )。
     例如， 用于作为治疗一种自身免疫疾病起始剂量的一种本发明多肽的治疗有效量 可包括从大约 0.001mg/kg 受试者体重至大约 100mg/kg 受试者体重， 诸如， 如， 从大约 0.001 毫克每千克 (mg/kg) 受试者体重至大约 100 毫克每千克 (mg/kg) 受试者体重， 或是， 如， 从大约 0.001mg/kg 受试者体重到至少大约 0.005、 0.01、 0.025、 0.05、 0.1、 0.2、 0.25、 0.3、 0.4、 0.5、 0.6、 0.7、 0.8、 0.9、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 20、 25、 30、 40、 50、 60、 70、 75、 80、 90、 或 100mg/kg 受试者体重。此类剂量可以任何适当操作操作进行， 如， 诸如， 每日、 每周、 或每双 周给予， 或其任何组合 ( 例如， 间隔大约 0、 1、 2、 4、 5、 6 以及 7 天， 在其后每周， 或是间隔大 约 0、 1、 2、 4 以及 6 周 )， 接续 1-、 2-、 3- 个月之间期， 并且可以任何适当的递送方法进行， 诸 如， 如， 以电穿孔或是皮下 (s.c.)、 肌内 (i.m.)、 静脉内 (i.v.)、 或腹膜内 (i.p.)、 真皮下、经皮、 胃肠外、 或皮内 (i.d.) 注射进行。在一些情形下， 本发明的多肽典型地是以可溶性多 肽的形式给予， 诸如， 如， 包括共价地连接至一种 Ig Fc 多肽的一种本发明突变 CTLA-4ECD 多肽的融合蛋白。例如， 包括药学上可接受的载体、 稀释剂、 或赋形剂中的一种本发明突 变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的药物组合物可以任何适当的途径 ( 例如， 经由皮内、 静脉内、 或皮 下 )， 以根据该待治疗自身免疫疾病 ( 例如， 类风湿性关节炎 ) 或病况 ( 例如， 为抑制受方受 试者对于来自供方的组织、 细胞、 移植物、 或实体器官移植的排斥 ) 而决定的有效量进行给 予。
     在一示例性的方面中， 本发明提供一种在需要该方法的受试者体内阻抑一种免疫 应答的方法， 该方法包括对该受试者给予一种药物组合物， 该药物组合物包括， 如， 从大约 1mg/ml 至大约 300mg/ml， 包括从大约 25mg/ml 至大约 150mg/ml( 例如， 50 或 100mg/ml) 的 D3-54-IgG2 融合蛋白， 包括在下列之中 ： 20mM HEPES 缓冲剂于水中， 100mM NaCl， 按重量计 2％的蔗糖， pH 7.4， 其中该受试者罹患自身免疫疾病 ( 例如， 类风湿性关节炎 )。在另一示 例性的方面中， 本发明提供一种在受方受试者体内抑制对于来自供方的组织、 细胞、 移植物 或实体器官移植的排斥的方法， 该方法包括对该受方受试者给予一种药物组合物， 该药物 组合物包括， 如， 从大约 25mg/ml 至大约 100mg/ml( 例如， 50 或 100mg/ml) 的 D3-69-IgG2 融 合蛋白， 包括在下列之中 ： 20mM 柠檬酸钠缓冲剂于水中， 100mM NaCl， 按重量计 2％的蔗糖， pH 6.5。
     还提供一种病毒载体组合物， 该组合物包括一种载体或赋形剂， 以及一种本发明 的病毒载体。 还提供包括一种药学上可接受的载体或赋形剂以及一种病毒载体的药物组合 物。病毒载体颗粒或病毒载体颗粒编码性核酸的量或剂量取决于 ： (1) 就载体来源而言的 病毒载体颗粒类型， 它包括， 但不限于， 如， 是否该载体是 α 病毒载体、 Semliki-Forest 病 毒载体、 腺病毒载体、 腺相关 (AAV) 病毒载体、 黄病毒载体、 乳头状瘤病毒载体、 和 / 或单纯 疱疹病毒 (HSV) 载体， (2) 是否该载体是一种转基因表达性载体或重组肽展示性载体， (3) 该宿主， 以及 (4) 其他如上所论的考虑。总体上， 就基因转移载体而言， 该药学上可接受的 2 组合物在大约 1ml 的体积内包括至少大约 1x10 个病毒载体颗粒 ( 例如， 在大约 1ml 的内 2 8 至少大约 1x10 至 1x10 个颗粒 )。较高的剂量也适用 ( 例如， 至少大约 1x106、 大约 1x108、 大约 1x109、 大约 1x1010 个颗粒 /ml)。
     本发明还提供一种组合物 ( 包括药物组合物 )， 它包括二种或多种本发明的多肽 或偶联物的一种聚集体。同时， 本发明提供一种组合物 ( 包括药物组合物 )， 它包括一群的 一种或多种本发明的多聚体多肽或多聚体偶联物。如以上所指出， 此类药物组合物包括一 种药学上可接受的赋形剂、 稀释剂或载体。
     试剂盒
     本发明还提供试剂盒， 这些试剂盒包括一、 二、 三种或以上的本发明的多肽 ( 例 如， 突变 CTLA-4ECD 多肽、 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 包括二聚体融合蛋白 )、 偶联物、 核酸、 载体、 细胞、 和 / 或组合物。 本发明的试剂盒可任选地包括 ： (1) 本发明的至少一种多肽 ( 例 如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )、 偶联物、 核酸、 载体、 VLP、 细胞、 和 / 或组合物 ； (2) 可任选的 至少一种第二免疫抑制剂 ( 例如， 非甾体抗炎剂、 甲氨蝶呤、 类固醇、 TNFα 拮抗剂、 等) ； (3) 用于实施在本文中所说明的任何方法的指示， 包括一种治疗或预防方法， 以及用于在 (1) 或 (2) 中所识别的任何组分的指示 ； (4) 用于容纳在 (1) 或 (2) 中所识别的至少一种这种组分的容器 ； 和 / 或 (5) 包装材料。可将本发明的一种或多种多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )、 偶联物、 核酸、 载体、 VLPs、 细胞、 和 / 或组合物， 可任选地连同一种或多种第二 免疫抑制剂， 包装在包装组、 分配装置、 以及试剂盒中， 以对一个受试者 ( 例如， 一种哺乳动 物， 包括人类 ) 进行给药。其指明了用于该所指定治疗或预防方法的本发明的每个这种多 肽 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )、 偶联物、 核酸、 载体、 VLP、 细胞、 和 / 或组合物或可任 选的第二免疫抑制剂的有效量 ( 例如， 剂量 )， 并提供一个或多个此类剂量。该一种或多种 多肽 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 )、 偶联物、 核酸、 载体、 和 / 或细胞组合物、 以及 ( 若 希望 ) 该可任选的第二免疫抑制剂可按照粉末 ( 例如， 冻干 ) 或液体形式提供， 并且可结合 一种赋形剂或载体而进行调配 ( 包括例如， 一种药学上可接受的赋形剂或载体 )， 由此形成 一种组合物 ( 包括例如， 药物组合物 )。 提供了包括一个或多个单元剂型的包装组或分配装 置。典型地， 用于给予此类组分的指示是与该包装， 连同在标签上的一个适当的指示 ( 该化 合物是适合于一种指定的病况的治疗的 ) 一起提供的。
     实例
     以下实例进一步展示了本发明， 但不应以任何方式理解为限制其范围。
     实例 1
     此实例提供用于创造 LEA29Y-Ig 融合蛋白的方法的说明， 该多肽在 BiacoreTM 结合 以及基于细胞的活性测定中用作一种对照物以及用于比较目的。
     编码了 LEA29Y-Ig 融合蛋白的 DNA 质粒载体的创造
     此实例说明了编码 LEA29Y-Ig 融合蛋白的 DNA 质粒载体的制备。LEA29Y-Ig 包 括 一 种 特 异 的 已 知 突 变 CTLA-4ECD 多 肽， 称为 “LEA29Y” (或 “LEA”或 “L104EA29Y”或 “A29YL104E” )， 它在其 C- 端共价连接到一种特异的突变人类 IgG1 Fc 多肽的 N- 端上。该 LEA29Y 多肽是一种突变 CTLA-4ECD 多肽， 该多肽包括与人类 CTLA-4 细胞外结构域的多肽序 列具有两个突变的差异的多肽序列 -A29Y 取代及 L104E 取代 - 其中位置 29 及 104 是参照 该人类 CTLA-4 ECD 多肽的多肽序列而编号， 以人类 CTLA-4 的第一氨基酸残基指定为氨基 酸残基位置 1。见 U.S.7,094,874。创造该质粒载体 pCDNA3.1-LEA( 它包括编码 LEA29Y-Ig 的核苷酸序列 ) 以产生这种融合蛋白。
     使用基于与在 SEQ ID NO ： 167 中所示的编码 LEA29Y-Ig 的核苷酸序列的同源性而 设计的重迭寡核苷酸， 通过 PCR 组合创造了编码 LEA29Y-Ig 的 DNA。 这些寡核苷酸是使用本 领域中的普通技术人员所熟知的标准操作而设计、 制备、 并且组合的， 并且当必要时它可包 括终止及起始密码子以及限制位点。所采用的 PCR 扩增操作亦为本领域中所熟知的。见， 如， Berger、 Ausubel 及 Sambrook， 皆为上述文献。
     这 些 寡 核 苷 酸 是 在 100μl 的 PCR 反 应 中， 以 1μM 寡 核 苷 酸、 1x Taq 缓 冲 液 (Qiagen ； #201225) 及 200μM dNTPs， 进行 30 个扩增循环 (94℃， 30s ； 60℃， 30s ； 72℃， 60s) 而组合。将经扩增的 DNA 通过 QiaQuick PCR 离心柱子 (Qiagen， Cat.#28104) 纯化， 并用限 制酶 NheI 及 SacII 进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳分离这些片段， 使用 Qiaquick 凝胶提 取试剂盒 (Qiagen， #28704) 根据制造商的建议进行纯化， 并将其接合进入经类似消化的质 粒 pCDNA 3.1(+)(Invitrogen， Cat.#V790-20) 中。根据制造商的建议， 使连接物转化进入 TOP10E 大肠杆菌细胞 (Qiagen， Cat.#C4040-10) 中。使所得的细胞， 在含有 50μg/ml 羧苄 西林的 LB 培养基中， 于 37℃下并以 250rpm 震荡， 进行过夜孵育， 并接着用于制备质粒 DNA的 maxiprep(Qiagen ； #12362) 贮液 ( 它在后文中称为质粒载体 pCDNA3.1-LEA)。
     该质粒载体 pCDNA3.1-LEA 是与如图 1 所示的质粒载体 pCDNA 突变 CTLA-4-IgG2 载体相同， 除外该编码突变 CTLA-4-IgG2 多肽的核酸序列已经被编码该 LEA29Y-Ig 融合蛋 白的核酸序列置换。包括了编码该人类 CTLA-4 信号肽的一种核酸作为该信号肽编码性核 苷酸序列。
     编码该预测 LEA29Y-Ig 融合蛋白的核酸序列示于 SEQ ID NO ： 167。SEQID NO ： 167 包括编码了该信号肽的核苷酸序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 165 的氨基酸残基 1-37)。该预测 LEA29Y-Ig 及成熟 LEA29Y-Ig 融合蛋白 ( 无该信号肽 ) 的多肽序列对应地示于 SEQ ID NOS ： 165 及 166。如图 2C 所指出， LEA29Y-Ig 的预测氨基酸序列包括下列片段 ： 预测的信号肽 ( 氨基酸残基 1-37)、 LEA29YECD 多肽 ( 氨基酸残基 38-161)、 连接物 ( 氨基酸残基 162) 及 人类 IgG1 多肽的突变 ( 经修饰 )Fc 结构域 ( 氨基酸残基 163-394)。在这些不同片段之间 接合处的氨基酸残基也示于图 2C。具体言之， 显示了该信号肽的最后四个氨基酸残基、 该 LEA29Y ECD 的前五个及最后五个氨基酸残基、 该单一的连接物氨基酸残基 (Q)、 以及该突变 IgG1 Fc 多肽的前五个及最后五个氨基酸残基。
     该信号肽典型地在加工过程中被切割， 并且因此该 LEA29Y-Ig 的分泌融合蛋白 ( 即， 成熟融合蛋白 ) 通常并不含有该信号肽序列。该 LEA29Y-Ig 的成熟 / 分泌形式 ( 它具 有总共 357 个氨基酸 ) 包括在 SEQ ID NO ： 165 中所示的预测序列的氨基酸残基 38-394( 无 该信号肽的全长序列 )， 并且以以下氨基酸序列起始 ： 甲硫氨酸 - 组氨酸 - 缬氨酸 - 丙氨 残基 1 至 37) ； 该信号肽典型地被 酸。SEQ ID NO ： 165 在其 N- 端包括该信号肽 ( 例如， 切割来形成在 SEQ ID NO ： 166 中所示的成熟蛋白。若希望， 该成熟形式的氨基酸能够以 Met-His-Val-Ala 序列中的 Met 开始编号， 将 Met 指定为该第一残基 ( 例如， 该 ECD 包括编号 为 1 至 124 的氨基酸残基 )， 如在这种具有在 SEQ IDNO ： 166 中所示的序列的成熟 LEA29Y-Ig 融合蛋白中。在一个方面， SEQ IDNO ： 165 或 166 的序列并不包括该 C- 端赖氨酸残基 ； 此残 基可在加工过程或在分泌之前被切割。
     LEA29Y-Ig 融合蛋白的蛋白序列说明于 U.S.7,094,874。 具体言之， U.S.7,094,874 的 SEQ ID NO ： 4 显示了编码非成熟形式单体 LEA29Y-Ig 的蛋白序列。在 U.S.7,094,874 中， 该 LEA29Y-Ig 融合蛋白被称为 “L104EA29YIg” 。这种包括在本文中给出的 SEQ ID NO ： 166 中所示的序列的成熟 LEA29Y-Ig 融合蛋白是与在 U.S.7,094,874 的 SEQ ID NO ： 4 中所 示的融合蛋白序列不同的， 这是因为 U.S.7,094,874 的 SEQ ID NO ： 4 包括信号肽 ( 即， SEQ ID NO ： 4 的残基 1-26)。这个信号肽典型地在加工过程中被切割， 并且因此该成熟 ( 分泌 ) 形式的 LEA29Y-Ig 融合蛋白通常并不包括该信号肽序列。U.S.7,094,874 的 SEQ ID NO ： 3 给出了编码该 L104EA29YIg 融合蛋白 ( 即， LEA29Y-Ig) 的核酸序列。
     LEA29Y-Ig 典型地是在溶液中以包括两个相同单体融合蛋白的一种二聚体融合 蛋白的形式而存在的。在此情形下， 每个单体成熟 LEA29Y-Ig 融合蛋白包括一个 LEA29Y ECD(SEQ ID NO ： 168) 多肽， 该多肽在其 C- 端融合到一种突变 IgG1 Fc(SEQ ID NO ： 186) 的 N- 端上。这两个 LEA29Y-Ig 单体是通过二硫键共价连接在一起的， 这些二硫键是在每个单 体中的半胱氨酸残基之间形成， 由此形成了该 LEA29Y-Ig 融合蛋白二聚体。该 LEA29Y-Ig 二聚体是在这些实例所说明的测定中所使用的融合蛋白形式， 除非另有明示。
     表达 LEA29Y-Ig 融合蛋白的稳定 CHO-K1 细胞系的创造创造了一种稳定的细胞系， 以产生几毫克量的以上所讨论的 LEA29Y-Ig 融合蛋白。 CHO-K1 细胞的转染
     将 CHO-K1 细胞以 1x106 个细胞 /ml 的密度， 接种于含有 40ml 生长培养基 ( 补充有 10％胎牛血清 (FBS)(Hyclone， #SV30014.03)、 以及 1x PS( 青霉素 + 链霉素 )(Invitrogen， #15140-122) 的 DMEM/F12 培养基 (Invitrogen， #10565-018)) 的 T-175 烧瓶 (BD Falcon， #353112) 中。在 37℃下孵育细胞 24 小时 (hr)， 并接着用混合着 60μl Fugene 6(Roche， #11814443001) 的 10μg Maxiprep 质粒 DNA( 例如， 编码了如以上所说明的 LEA29Y-Ig 的质 粒载体 ) 根据制造商的建议条件进行转染。在 37℃下在生长培养基中孵育细胞 2 天 (d)， 并接着在选择培养基 ( 含有 300μg/ml 遗传霉素 (Geneticin)(Invitrogen， #10131-027) 的生长培养基 ) 中孵育 10d， 每 2d 更换培养基。除去培养基， 并通过加入 3ml 的 0.05％胰 蛋白酶 (Invitrogen， Cat.#25300-054) 来分散细胞， 并且在 37℃下孵育 3min。将经分散稀 释到 10ml 培养基中， 并且在室温 (RT) 下在 GH-3.8 转子 (Beckman Coulter， #360581) 中以 1000rpm 离心 5min 来进行收集。 在除去上清液之后， 将细胞悬浮于 1ml 的生长培养基中， 通 6 过 40μm 滤膜 (BDFalcon， #352340) 进行过滤， 并调整至 1x10 个细胞 /ml 的密度。
     独特克隆的分离
     使 用 细 胞 分 选 器 (Dako， MoFlo)， 将 活 细 胞 逐 个 地 分 散 到 96 孔 培 养 板 (Sigma-Aldrich， #CLS-3596) 中， 该板含有 200μl/ 孔的含有 25 ％条件培养基 ( 先前自 未经转染 ( 或天然 ) 的细胞培养物中收集的生长培养基 ) 的生长培养基。在 37℃下孵育 10-14d 之后， 通过胰蛋白酶水解来分散细胞， 并将其移至含有 200μl/ 孔的生长培养基的 新培养板中。在 37℃下在生长培养基中孵育细胞， 直到细胞密度达到 70％汇合为止 ( 达约 14d， 每 7d 更换培养基 )。
     希望的克隆的识别
     通过点迹法及蛋白质分析法来识别表达高水平的重组 LEA29Y-Ig 融合蛋白的克 隆。就点迹法而言， 从该 96 孔培养板的各孔中收集 100μl 的培养基， 并根据制造商的建议 将其转移至硝基纤维素膜 (Whatman， #10439388) 上。在室温 (RT) 下用 200ml PBST(PBST 是磷酸缓冲盐水 (PBS)+0.05％ -20) 洗涤该膜 10 分钟共两次， 并接着在 RT 下与 含有 5％脱脂奶粉 (EMD， #1.15363.0500) 的 PBST 孵育 1 小时 (hr)。如以上所说明洗涤这 些膜， 并在 RT 下在含有稀释至 1 ∶ 4000 的辣根过氧化酶 (HRP) 偶联的山羊抗人类 Ig 抗体 (Vector Labs， #BA-3000) 的 20ml PBST 中孵育 1hr。 如以上所说明洗涤这些膜， 并在 RT 下与 含有稀释至 1 ∶ 2000 的抗生蛋白链菌素 -HRP 试剂 (BD Biosciences， #554066) 的 PBST 孵 育 1hr。 如以上所说明洗涤膜， 并使用 ECL 蛋白质印迹检测试剂 (Amersham， Cat.#RPN2132)， 根据制造商的建议条件来检测信号。将由高信号强度 ( 即， 表达高水平的融合蛋白 ) 所识 别的阳性克隆通过胰蛋白酶水解来进行分散， 并将其移至含有 2ml/ 孔的生长培养基的 6 孔 培养板 (BD Falcon， Cat.#353046) 中。在 37℃下孵育 3-4d 之后， 通过胰蛋白酶水解来分 散细胞， 并将其移至含有 20ml 生长培养基的 T-75 烧瓶 (BD Falcon， Cat.#353136) 中。在 37℃下孵育 2d 之后， 收集 100μl 的培养基， 并通过蛋白质分析来分析蛋白表达水平。就蛋 白质分析而言， 根据制造商的建议条件， 将取自每个细胞培养物的等量 (15μl) 培养基， 通 过 MES(MES 是 2-(N- 吗啉基 ) 乙烷磺酸， pH7.3) 移动缓冲液 (Invitrogen， #NP0002) 中的
     4％ -12％ Bis-Tris NuPAGE 凝胶 (Invitrogen， #NP0322BOX) 进行移动。根据制造商的建 议条件， 通过电转移使蛋白从凝胶转移至硝基纤维素膜 (Invitrogen， Cat.#LC2001)。如以 上说明用点迹法处理这些膜， 并通过信号强度及表观分子量来识别阳性克隆 ( 表达感兴趣 的融合蛋白 )。如以上所说明通过胰蛋白酶水解来分散阳性克隆， 并使其在含有 40ml 生长 培养基的 T-175 烧瓶中进行繁殖。
     LEA29Y-Ig 融合蛋白的产生和纯化
     滚瓶培养物的繁殖
     如以上所说明用编码了感兴趣的融合蛋白的核酸所转染的一种稳定 CHO-K1 细胞 系在含有 40ml 生长培养基 ( 补充有 10 ％胎牛血清 (FBS)(Hyclone， #SV30014.03) 及 1x PS(Invitrogen， #15140-122) 的 DMEM/F-12 培养基 (Invitrogen， #10565-018)) 的 T-175 烧 瓶中生长至汇合。 通过在 37℃下在 3ml 的 0.05％胰蛋白酶 (Invitrogen， Cat.#25300-054) 中孵育 3min 来收集细胞， 将其稀释至 12ml 的生长培养基中， 并接着将其移至含有 250ml 生 长培养基的滚瓶 (Corning， Cat.#431191) 中。 在 37℃下在湿润的滚动式恒温孵育箱中孵育 所述滚瓶培养物 2d 之后， 除去培养基， 并用 250ml 的新鲜生长培养基进行替换。在 37℃下 孵育培养物 2d 之后， 用 250ml 的 UltraCHO 培养基 ( 补充有 1/1000 EX-CYTE(Serologicals Proteins， Cat.#81129N) 及 1x PS 的 UltraCHO 培 养 基 (BioWhittaker， Cat.#12-724)) 替换该培养基。在 37 ℃下孵育 2d 之后， 用 250ml 的新鲜 UltraCHO 培养基替换该培养 基。将细胞在 37℃下孵育 2d， 并接着用 250ml 的生产培养基 ( 补充有 1/100x ITSA(Life Technologies#51300-044)， 1/1000x EX-CYTE 及 1x PS 的 DMEM/F-12 培养基 ) 替换该培养 基。在生产过程中， 收集培养基， 并每隔一天用新鲜的生产培养基替换。
     蛋白纯化
     通 过 在 RT 下 以 2500x g 离 心 30min、之 后 跟 随 通 过 0.2μM 滤 膜 (VWR， Cat.#73520-986) 的过滤， 使来自滚瓶培养物的生产培养基变为澄清。使用 10kDa MWCO 滤 膜 (Millipore， Cat.#P3C010C00)， 通过切向流过滤将培养基浓缩 10 倍， 并接着使用 BioCad vision HPLC 系统将其用于蛋白 -A 亲和层析。 将 Ig- 融合蛋白连结到 PBS 缓冲液中的 Poros 20 蛋白 -A 树脂 (AppliedBiosystems， Cat.#1-5029-01) 上， 用相同的缓冲液洗涤， 用含有 160mM 氯化钠的 80mM 柠檬酸缓冲液 (pH 4.0) 洗脱， 并接着通过加入 2M Tris 碱来进行中 和。 最后使用 10kDa MWCO 滤膜 (Pierce， Cat.#PI66810)， 将该蛋白溶液相对 6 升 (1) 的 PBS 进行透析。
     实例 2
     此实例说明了通过噬菌体展示针对改变的人类 CD80 和 / 或人类 CD86 结合活性而 创造并筛选了 CTLA-4 突变分子库的示例性方法。
     人类 CD80-Ig 融合蛋白
     在噬菌体淘选及噬菌体 ELISA 实验中， 使用人类 CD80-Ig(“hCD80-Ig” ) 及人类 CD86-Ig(“hCD86-Ig” ) 融合蛋白作为配体， 以识别结合人类 CD80(“hCD80” ) 和 / 或人类 CD86(“hCD86” )、 和 / 或二者之一的或两者的一个细胞外结构域的突变 CTLA-4 分子。人 类 CD80-Ig( 也称为 “hB7.1-Ig”或 “hB7-1-Ig” ) 及人类 CD86-Ig( 也称为 “hB2.1-Ig”或 “hB2-1-Ig” ) 融合蛋白可获自 R&D Systems(Minneapolis， MN)。
     编 码 该 预 测 WT 人 类 CD80-IgG1 融 合 蛋 白 ( 它 包 括 该 人 类 CD80 信 号 肽、 人类CD80ECD、 以及人类 IgG1 Fc) 的代表性核酸序列示于 SEQ IDNO ： 172。 该 hCD80-IgG1 融合蛋 白的预测且成熟的多肽序列对应地示于 SEQID NO ： 170 及 SEQ ID NO ： 171。在 SEQ ID NO ： 170 中所示的预测融合蛋白包括 WT 人类 CD80 ECD， 该 ECG 在以其 C- 端共价融合到一种人 类 IgG1 Fc 多肽的 N- 端上， 并且在其 N- 端包括一种信号肽。该信号肽典型地被切割以形 成在 SEQ ID NO ： 171 中所示的成熟 CD80-Ig 融合蛋白切割。
     人类 CD80-IgG1 在本文中典型地缩写为 hCD80-Ig。如图 2A 所示， 该 hCD80-Ig 融 合蛋白 ( 亦指名为 “CD80-IgG1” ) 的预测氨基酸序列包括下列片段 ： 该预测的信号肽 ( 氨 基酸残基 1-34)、 人类 CD80ECD( 氨基酸残基 35-242)、 连接物 ( 氨基酸残基 243-245)、 以及 人类 IgG1 Fc 多肽 ( 氨基酸残基 246-476)。在这些不同的片段之间的接合处上的氨基酸 残基示于图 2A。具体言之， 显示了该信号肽的最后四个氨基酸残基、 该人 CD80 ECD 的前五 个及最后五个氨基酸残基、 该连接物的氨基酸残基 (GVT)、 以及该人类 IgG1 Fc 多肽的前五 个及最后五个氨基酸残基。在该 CD80-Ig 融合蛋白中， 三个残基 GVT 作为一个克隆人造物 ( 或连接物 ) 存在于该 CD80 ECD 的 C- 端 ( 它以氨基酸残基 FPDN 结束 ) 与该 IgG1 Fc 多肽 的 N- 端 ( 它以氨基酸残基 PKSC 起始 ) 之间。这个 GVT 克隆人造物或连接物对应地显示在 SEQID NO ： 170 及 171 所示的预测且成熟的 CD80-Ig 多肽序列中。
     该信号肽典型地在加工过程中被切割， 并且因此该 hCD80-Ig 的分泌融合蛋白 ( 即， 成熟融合蛋白 ) 通常并不含有该信号肽。hCD80-Ig 的成熟 / 分泌形式 ( 它具有总共 442 个氨基酸 ) 包括 SEQ ID NO ： 170 的氨基酸残基 35-476( 没有该信号肽的全长序列 )， 并 且以氨基酸残基序列 ： 缬氨酸 - 异亮氨酸 - 组氨酸 - 缬氨酸起始。若希望， 该成熟形式的 氨基酸能够以 Val-Ile-His-Val 序列的缬氨酸 (Val) 开始编号， 将 Val 指定为该第一残基 ( 例如， 该 ECD 包括编号为 1-208 的氨基酸残基 )， 如同在这种包括在 SEQ ID NO ： 171 中所 示的多肽序列的成熟形式 hCD80-Ig 中。
     该 hCD80-Ig 融合蛋白典型地是在溶液中以包括两个相同单体成熟 hCD80-Ig 融合 蛋白的一种二聚体融合蛋白的形式而存在。在此情形下， 每个单体成熟 hCD80-Ig 融合蛋白 (SEQ ID NO ： 171) 包括一个人类 CD80 ECD(SEQ ID NO ： 174)， 该 ECD 在其 C- 端融合到人类 IgG1 Fc(SEQ ID NO ： 185) 的 N- 端上。这两个 hCD80-Ig 单体是通过二硫键共价连接在一 起的， 这些二硫键是在每个单体中的半胱氨酸残基之间形成， 由此形成了该 hCD80-Ig 融合 蛋白二聚体。该 hCD80-Ig 融合蛋白二聚体是在这些实例中所说明的测定中使用的融合蛋 白分子形式， 除非另有明示。
     编码该预测全长人类 CD80 多肽的代表性核酸示于 SEQ ID NO ： 196。 在 SEQ ID NO ： 196 中所示的核酸序列编码了该人类 CD80 的信号肽、 ECD、 跨膜结构域、 以及胞质域， 并且在 其 C- 端包括 TAA 终止密码子。
     人类 CD86-Ig 融合蛋白
     编码该预测人类 CD86- 人类 IgG1( 在本文中典型地缩写为 “hCD86-Ig” ) 融合蛋白 的代表性核酸序列示于 SEQ ID NO ： 179。这个核酸序列包括编码了一种成熟人类 CD86- 人 类 IgG1 融合蛋白信号肽的核苷酸序列。该 hCD86-Ig 融合蛋白的预测氨基酸序列示于 SEQ ID NO ： 177， 并且编码该预测 hCD86-Ig 融合蛋白的示例性核酸示于 SEQ ID NO ： 179。
     如图 2B 所示， 该 hCD86-Ig 融合蛋白的预测氨基酸序列包括下列片段 ： 该预测的信 号肽 ( 氨基酸残基 1-23)、 人类 CD86 细胞外结构域 ( 氨基酸残基 24-243)、 连接物序列 ( 氨基酸残基 244-246)、 及人类 IgG1 Fc 多肽 ( 氨基酸残基 247-477)。在这些不同片段之间的 接合处上的氨基酸残基亦如图 2B 所示。具体言之， 显示了该信号肽的最后四个氨基酸残 基、 该人类 CD86ECD 的前五个及最后七个氨基酸残基、 该连接物的氨基酸残基 (GVT)、 以及 该人类 IgG1 Fc 多肽的前五个及最后五个氨基酸残基。
     该 CD86 信号肽典型地在加工过程中从该预测 hCD86-Ig 多肽中切割， 并且因此该 分泌的人类 CD86-Ig 融合蛋白 ( 即， 成熟融合蛋白 ) 通常并不包括该信号肽。 该成熟 / 分泌 形式的 hCD86-Ig( 它具有总共 454 个氨基酸 ) 包括 SEQ ID NO ： 177 的氨基酸残基 24-477( 没 有该信号肽的全长序列 )， 并且以氨基酸残基序列 ： 丙氨酸 - 脯氨酸 - 亮氨酸起始。 若希望， 该成熟融合蛋白的氨基酸能够以 Ala-Pro-Leu 序列中的丙氨酸 (Ala) 开始编号， 将 Ala 指 定为该第一残基 ( 例如， 该 ECD 包括编号为 1-218 的氨基酸残基 )， 如同在这种包括在 SEQ ID NO ： 178 中所示的多肽序列的成熟形式 hCD86-Ig 中。该成熟蛋白 (SEQ ID NO ： 178) 包 括一种 WT hCD86 ECD 蛋白， 该蛋白在其 C- 端共价融合到 hIgG1 Fc 多肽的 N- 端上。
     该 hCD86-Ig 融合蛋白典型地是在溶液中以包括两个相同单体成熟 hCD86-Ig 融合 蛋白的一种二聚体融合蛋白的形式而存在。在此情形下， 每个单体成熟 CD86-Ig 融合蛋白 (SEQ ID NO ： 178) 包括一个人类 CD86 ECD(SEQ ID NO ： 180)， 该 ECD 在其 C- 端融合到一种 人类 IgG1 Fc(SEQ IDNO ： 185) 的 N- 端上。这两个 hCD86-Ig 单体是通过二硫键共价连接在 一起的， 这些二硫键是在每个单体中的半胱氨酸残基之间形成， 由此形成了该 hCD86-Ig 融 合蛋白二聚体。该 hCD86-Ig 融合蛋白二聚体是在这些实例中说明的测定中所使用的融合 蛋白分子形式， 除非另有明示。
     在该 CD86-Ig 融合蛋白中 ( 例如， 预测及成熟形式 )， 三个残基 GVT 作为一种克隆 人造物 ( 或连接物 ) 存在于该 CD86 ECD 的 C- 端与该 IgG1Fc 多肽的 N- 端之间。在另一方 面， 该 WT 人类 CD86 ECD 蛋白包括一个多肽序列， 该多肽序列包括 SEQ ID NO ： 180 的氨基酸 残基 1-218( 即， 排除最后两个 C- 端氨基酸残基 (PP))。
     融合蛋白
     作为一个额外的对照并且出于比较目的， 购买了被称为 融合蛋白 (Bristol-Myers Squibb Co.， Princeton， NJ) 的可商购的融合蛋白。 融合蛋白 是由在其 C- 端融合到一种特定突变 IgG1 Fc 多肽的 N- 端上的 WT 人类 CTLA-4 细胞外结构 域构成。 蛋白是包括两个相同单体融合蛋白的一种二聚体融合蛋白， 这些单体 融合蛋白是通过二硫键共价连接在一起， 这些二硫键是在每个单体融合蛋白中所存在的半 胱氨酸残基之间形成。每个成熟 融合蛋白单体的多肽序列示于 SEQ IDNO ： 164， 并且它是由下列片段构成 ： WT 人类 CTLA-4 细胞外结构域 ( 氨基酸残基 1-124)、 连接物序列 ( 氨基酸残基 125)、 以及突变 IgG1 Fc 多肽 ( 氨基酸残基 126-357)。 每个 融合蛋 白单体具有与在图 2C 中示意性显示的 LEA29Y-Ig 融合蛋白单体的结构相类似的结构， 除外 该 LEA29Y ECD 经 WT 人类 CTLA-4ECD 置换， 并且在任一个 融合蛋白单体中皆不存 在信号肽， 这是因为每个单体皆是分泌或成熟的融合蛋白。 非成熟形式 单体 ( 它 包括信号肽 ) 的多肽序列以及编码了该非成熟形式 融合蛋白单体的核酸序列对 融合 应地示于 U.S.7,094,874 的 SEQ IDNO ： 8 及 SEQ ID NO ： 7。用于制备及使用 蛋白的方法还披露于 U.S.7,094,874。
     编码突变 CTLA-4 多肽的 DNA 序列的创造使用直接发展法来产生编码了重组突变 CTLA-4 细胞外结构域多肽的重组非自 然发生的多核苷酸库。诸多自然发生的哺乳动物 CTLA-4 同源物的蛋白以及核苷酸序列 是已知的。见， 如， 国家生技信息中心 (NCBI)。将在不同的自然发生的哺乳动物 CTLA-4 细胞外结构域同源物中所识别的序列多样性用于直接发展法来产生编码了突变 CTLA-4 ECD 结构域多肽的重组多核苷酸库。直接发展操作包括例如， 体外重组及诱变操作， 如实 质上说明于 ； Stemmer， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91 ： 10747-10751(1994) ； Chang etal.， Nature Biotech 17 ： 793-797(1999) ； 国际专利申请公开号 WO 98/27230 ； 以及美国专利号 6,117,679 及 6,537,776。
     编码突变 CTLA-4 多肽的 DNA 序列库的创造
     使用基于序列同源性所设计的正向及反向引物， 通过 PCR， 从组合反应中扩增编码 了重组突变 CTLA-4 ECD 多肽的突变 DNA 序列。这些引物是通过本领域的普通技术人员所 熟知的标准操作来设计、 制备、 并组合的， 并且在需要时包括终止及起始密码子以及限制位 点。所采用的 PCR 扩增操作亦为本领域中所熟知。见， 如， Berger、 Ausubel 及 Sambrook， 皆为上述文献。示例性的正向及反向引物包括但不限于以下这些 ： 正向引物 (5’ -CTATTGC TACGGCCGCTATGGCCMTKCACGTCGCTCAACCAGCCGTCGTACTCGCGTCC-3’ )(SEQ ID NO ： 191) 及反向 引物 (5’ -GTGATGGTGATGGTGTGCGGCCGCATCAGA-3’ )(SEQ ID NO ： 192)。使用 5μl 的组合反 Taq 缓冲液 (Qiagen ； 应物作为模板， 在 100μl 的 PCR 反应中， 以 1μM 的正向及反向引物、 #201225)、 以及 200μM dNTP， 进行 15 个扩增循环 (94℃ 30s ； 50℃ 30s ； 72℃ 40s)。将编码 突变 CTLA-4 ECD 多肽的经扩增 DNA 用限制酶 (SfiI 及 NotI) 进行消化， 并通过琼脂糖凝胶 电泳分离这些片段， 使用 Qiaquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， #28704) 根据制造商的建议 进行纯化， 并将其接合进入经类似消化的噬菌体展示载体 pSB0124 中 ( 操作类似于说明于 Chang et al.， Nature Biotech 17 ： 793-797(1999) 中的那些 )。根据制造商的建议条件， 通过电穿孔来使该所得的库转化进入 TOP10 大肠杆菌细胞 (Invitrogen， Inc ； #C4040-50) 中。将经转化的细胞在含有 50μg/ml 羧苄青霉素的 LB(Luria 液态培养基 ) 中， 在 37 ℃ 下并以 250rpm 震荡， 进行过夜孵育， 并接着根据制造商的建议条件将其用于制备库 DNA 的 maxiprep(Qiagen ； #12362) 贮液。
     具有改进人类 CD80 和 / 或人类 CD86 结合亲合力的展示突变 CTLA-4 多肽的噬菌 体库的筛选
     突变 CTLA-4 多肽的噬菌体展示库的产生
     根据制造商的建议条件， 通过电穿孔将该所得的库 DNA( 例如， 编码了 CTLA-4 ECD 突变体的 DNA 序列库 ) 转化进入 TG-1 大肠杆菌细胞 (Stratagene ； #200123) 中。 在噬菌质粒 选择条件下 ( 含有 50μg/ml 羧苄青霉素的 LB 培养基 )， 使该培养物生长 1-2 代， 用 M13KO7 辅助噬菌体 ( 以多重的 5-10 的感染水平 ) 进行感染， 并且在噬菌质粒 (50μg/ml 羧苄青霉 素 ) 及辅助噬菌体 (70μg/ml 卡那霉素 ) 的双重选择下在 37℃下以 250rpm 震荡进行过夜 孵育。通过离心来澄清这些培养物 (6000rpm， 15min， 4℃， 于 Sorvall 600TC 转子中 )， 并且 通过将 32ml 的培养物上清液与 8ml 的 PEG/NaCl 溶液 (20％ PEG-8000 ； 2.5M NaCl) 在冰上 孵育 30min、 之后跟随离心 (9500rpm， 40min， 4℃， 在 Sorvall 600TC 转子中 ) 来沉淀噬菌体 颗粒。将该噬菌体沉淀物悬浮于含有 1％ BSA( 牛血清白蛋白， Sigma ； #A7906) 的 1ml PBS 中， 移至微离心管中， 并通过离心进行澄清 ( 最大转速， 5min， RT， 在 Eppendorf 桌上型离心器中 )。 CTLA-4 突变体噬菌体库的淘选
     使用标准条件， 对噬菌体库进行对抗 hCD80-Ig 或 hCD86-Ig 融合蛋白的共五轮 的淘选。见， 如， Lowman， et al.， Biochemistry 12 ； 30(45) ： 10832-10838(1991) ； Smith， G.P.et al.， Chem.Rev.97 ： 391-410(1997)。各轮的淘选包括 ： (a) 将该噬菌体展示性突变 CTLA-4ECD 多肽与 hCD80-Ig 或 hCD86-Ig 配体结合 ； (b) 除去未连结的噬菌体 ； (c) 洗脱连 结的噬菌体， 并且 (d) 扩增该经洗脱的噬菌体用于下一轮的淘选。将来自各轮的一个等分 部分的噬菌体转导进入大肠杆菌细胞中， 以获得单个的转导株的克隆。
     通过噬菌体 ELISA 对具有改进人类 CD80 和 / 或人类 CD86 结合亲合力的 CTLA-4 突变体的识别
     将来自各轮淘选的单个克隆接种到含有 150μl/ 孔的含有 50μg/ml 羧苄青霉素 的 2x YT( 酵母菌 - 胰蛋白胨 ) 培养基的 96 孔培养板 (NUNC ； #243656) 中， 并在 37℃下以 250rpm 震荡进行过夜孵育。 使用这些过夜培养物来接种含有 600μl/ 孔的相同培养基的深 孔块 (Scienceware ； #378600001)。在 37℃下以 250rpm 震荡孵育该培养物 2hr， 用 M13K07 辅助噬菌体 ( 多重感染 (moi)5-10) 进行感染， 并接着在噬菌质粒及辅助噬菌体标记的双重 选择下 (50μg/ml 羧苄青霉素及 70μg/ml 卡那霉素 ) 在 37℃下以 250rpm 震荡进行过夜 孵育。在 Beckman GH 3.8 转子中在 4℃下以 4000rpm 离心 20min 来澄清培养物。通过加 入 50μl/ 孔的含有 10μg/ml hCD80-Ig 或 hCD86-Ig 的 PBS， 并在 4℃下过夜孵育， 来涂覆 #449824)。以 200μl/ 孔的 PBST 洗涤试验板三次、 并通过加入 200μl/ 孔 ELISA 板 (NUNC ； 的含有 3％脱脂奶粉的 PBS、 并在 RT 下孵育 1 小时 (hr) 来进行阻断。将 25μl/ 孔的来自 该深孔块的噬菌体上清液移至含有 25μl/ 孔的 6％脱脂奶粉的 ELISA 板中， 并在室温 (RT) 下孵育试验板 1hr。用 200μl/ 孔的 PBST 洗涤所述试验板三次、 并与 50μl/ 孔的以含有 3％脱脂奶粉的 PBST 稀释 1 ∶ 5000 的 HRP- 偶联性抗 -M13 单克隆抗体 (GE Healthcare， #27-9421-01) 在 RT 下孵育 1hr。用 200μl/ 孔的 PBST 洗涤所述试验板三次、 并使用 TMB 底物试剂盒 (Pierce ； #34021)， 根据制造商的建议条件来检测信号。与人类 CTLA-4 对于 人类 CD80 和 / 或人类 CD86 的结合亲合力 ( 如通过人类 CTLA-4ECD 对于 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig 的结合亲合力所测量 ) 相比， 选择了展示出对于人类 CD80 和 / 或人类 CD86 的 增加的亲合力 ( 如通过对于 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig 的增加的亲合力而测量 ) 的突变 CTLA-4ECD 多肽， 用于进一步分析。
     实例 3
     IgG2 Fc 融合蛋白载体的创造
     创造了一种质粒 IgG2-Fc 融合蛋白表达载体以制备包括本发明的突变 CTLA-4 ECD 多 肽 及 人 类 IgG2 Fc 多 肽 的 融 合 蛋 白。 通 过 人 类 白 细 胞 cDNA(BD Biosciences， Cat.#HL4050AH) 的 PCR 扩增而产生了编码人类 IgG2 Fc 多肽的 DNA， 这是通过使用正向引 物 (5’ -AAGCTGTCACCGGTGGATCGATCCCGAACCCTGCCCTGATTCTGATGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCC CACCGT-3’ )(SEQ ID NO ： 189) 及反向引物 (5’ -CAGAATTCATTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC TTCTG-3’ )(SEQ ID NO ： 190) 来进行的。通过本领域的普通技术人员所熟知的标准操作对 这些引物进行设计、 制备、 并组合， 并且在需要时包括终止及起始密码子以及限制位点。所 采用的 PCR 扩增操作亦为本领域中所熟知。见， 如， Berger、 Ausubel 及 Sambrook， 皆为上
     述文献。使用 50-100ng 的 cDNA 作为模板， 在 100μl 的 PCR 反应中以 1μM 的正向及反向 引物、 Taq 缓冲液 (Stratagene ； #200435) 及 200μM dNTP， 进行 25 个扩增循环 (94℃， 30s ； 55℃， 30s ； 72℃， 60s)。根据制造商的建议条件， 将该 PCR 产物通过 QiaQuick PCR 离心柱子 (Qiagen#28106) 进行纯化， 并且用限制酶 AgeI 及 EcoRI 进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳 来分离所述 PCR 消化片段， 并且使用 Qiaquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， #28704) 根据制造 商的建议条件进行纯化。可以用 AgeI 及 EcoRI 对经修饰形式的 pCDNA3.1-LEA 载体 ( 以上 说明 )( 它在该 CTLA-4 信号序列中含有一个 AgeI 限制位点 ( 作为一种沉默突变而引入 )) 进行消化， 并且与以上提及的片段进行接合。 根据制造商的建议条件， 使该连接物转化进入 One-shot TOP10 大肠杆菌细胞 (Invitrogen Cat.#C4040-03) 中。将经转化的细胞在含有 50μg/ml 羧苄青霉素的 LB(Luria 液态培养基 ) 中在 37℃下以 250rpm 震荡， 进行过夜孵育， 并接着根据制造商的建议条件， 将其用来制备质粒 DNA 的 maxiprep(Qiagen ； #12362) 贮液。
     该所得的质粒表达载体称为 pCDNA IgG2 Fc 融合蛋白表达载体。这个载体是与 在图 1 中所示的 pCDNA 突变 CTLA-4-IgG2 质粒载体相同的， 除外去除了这种编码了突变 CTLA-4 ECD 多肽的核酸序列。在 pCDNA IgG2 Fc 融合载体中编码了该信号肽的核酸序列 ( 它在图 1 中可以是任何适当的信号肽编码性核苷酸序列 ) 是编码了该人类 CTLA-4 信号肽 的核酸 (SEQ IDNO ： 181 或 SEQ ID NO ： 215)。这种 IgG2 Fc 融合载体并不包括编码了本发 明的一种突变 CTLA-4 ECD 多肽或任何其他 CTLA-4 ECD 多肽的任何核酸序列。
     将编码了突变 CTLA-4 多肽的核酸序列克隆进入该 IgG2 Fc 融合载体
     为了产生作为可溶性 Fc 融合蛋白的突变 CTLA-4 多肽， 将编码了来自该噬菌体库 筛选的、 识别为具有对于人类 CD80 和 / 或人类 CD86 的改进的结合亲合力 ( 当与人类 CTLA-4 ECD 对于人类 CD80 和 / 或人类 CD86 的结合亲合力相比 ) 的突变 CTLA-4 ECD 多肽的 DNA 序 列各自克隆进入以上说明的 IgG2 Fc 融合蛋白载体中， 这是使用例如下列操作进行的。
     首先， 从该噬菌体展示载体中、 通过 PCR 扩增、 使用基于与在该突变 CTLA-4 ECD 多肽的 N- 及 C- 端上的多个核苷酸残基 ( 例如， 30-60 个核苷酸 ) 的序列同源性而设计的 正向及反向引物以及本领域中已知的标准操作， 回收了编码展示出对于 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig 的较高结合亲合力的突变 CTLA-4 ECD 多肽的 DNA 序列。见， 如， 说明于例如， Berger、 Ausubel 及 Sambrook， 皆为以上说明文献的操作。例如， 在一个方面， 编码了突变 CTLA-4 ECD 多肽的 DNA 序列是通过 PCR 扩增而从该噬菌体展示载体中回收的， 这是使用正 向 引 物 (5’ -GGAATACCGGTTTTTTGTAAAGCCATGCACGTCGCTCAACCAGCCGTCGTACTC-3’ )(SEQ ID NO ： 191) 及 反 向 引 物 (5’ -GGCACTCAGATCTACGTCATCGATCCCGAA-3’ )(SEQ ID NO ： 192) 进 行的。使用 10 纳克 (ng) 的质粒 DNA( 含有一个突变 CTLA-4 ECD 编码核苷酸序列的噬菌 体展示载体 ) 作为模板， 在 100μl 的 PCR 反应中， 用 1μM 的正向及反向引物、 Taq 缓冲液 (Stratagene ； #200435) 及 200μM dNTPs， 进行 25 个扩增循环 (94℃， 30s ； 55℃， 30s ； 72℃， 60s)。 根据制造商的建议条件， 将该 PCR 产物通过 QiaQuick PCR 离心柱子 (Qiagen#28106) 进行纯化， 并用限制酶 AgeI 及 ClaI 进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳来分离所述片段， 使用 Qiaquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， #28704) 根据制造商的建议条件进行纯化， 并将其接合 进入经类似消化的质粒 IgG2 Fc 融合载体中。根据制造商的建议条件， 将该连接物转化进 入 One-shot TOP10 大肠杆菌细胞 (Invitrogen Cat.#C4040-03) 中。将经转化的细胞在含 有 50μg/ml 羧苄青霉素的 LB(Luria 液态培养基 ) 中在 37℃下以 250rpm 震荡， 进行过夜孵育， 并接着根据制造商的建议条件， 将其用于制备质粒 DNA 的 maxiprep(Qiagen ； #12362) 贮液。
     该所得的质粒表达载体 ( 该载体包括编码了本发明突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白 的核酸 ) 称为 pCDNA 突变 CTLA-4 ECD IgG2 Fc 质粒表达载体。这种载体的示意图示于图 1。这种载体包括一个 Bla 启动子 ； 氨苄青霉素抗性基因 ； pUC 起点 ； SV40 聚腺苷酸 ( 聚 A) 信号序列 ； f1 起点 ； SV40 启动子 ； 新霉素抗性基因 ； CMV 启动子， 以协助表达本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 包括例如， 人类 CTLA-4 信号肽、 突变 CTLA-4 ECD 多肽、 以及人类 IgG2 Fc 多肽 ) ； 编码了一种人类 CTLA-4 信号肽的核酸序列 (SEQID NO ： 181 或 SEQ ID NO ： 215) ； 编码了本发明的一种突变 CTLA-4 ECD 多肽的核酸序列 ( 包括但不限于， 例如编码了 SEQ ID NOS ： 80-152 中任何一个的核苷酸序列 ) ； 编码了在 SEQ ID NO ： 183 或 SEQ ID NO ： 217 所示 的一种人类 IgG2 Fc 多肽的示例性核酸序列 ； 以及一个牛生长激素 (bGH) 聚 A 终止信号序 列。SEQ ID NO ： 183 的核酸序列编码了具有 C- 端赖氨酸 (K) 残基的 hIgG2 Fc 多肽 (SEQ ID NO ： 184) ； 而 SEQ ID NO ： 217 的核酸序列编码了不具有 C- 端赖氨酸残基的 hIgG2 Fc 多 肽 (SEQ ID NO ： 218)。
     该质粒 IgG2 Fc 融合蛋白载体也可用于产生人类 CTLA-4-IgG2( “hCTLA-4-Ig” )融 合蛋白。 在此情形下， 使用类似以上说明的那些的标准克隆操作， 将编码了人类 CTLA-4 ECD 的核酸序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 193) 取代编码了突变 CTLA-4 ECD 的核苷酸序列而克隆进入 该质粒 IgG2Fc 融合蛋白载体中。该 hCTLA-4-Ig 融合蛋白典型地是在溶液中以包括两个相 同单体成熟 hCTLA-4-Ig 融合蛋白的一种二聚体融合蛋白的形式而存在。在此情形下， 每个 单体成熟 hCTLA-4-Ig 融合蛋白包括一个人类 CTLA-4ECD(SEQID NO ： 159)， 该 ECD 在其 C- 端 融合到人类 IgG2 Fc(SEQ ID NO ： 218 或 SEQID NO ： 184) 的 N- 端上。这两个 hCTLA-4-Ig 单 体是以二硫键共价连接在一起， 这些二硫键是在每个单体中的半胱氨酸残基之间形成， 由 此形成了该 hCTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体。该成熟 hCTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体是在这些实 例中说明的测定中所使用的融合蛋白分子形式， 除非另有明示。
     现已通过实验发现， 通过转染包括了编码该 hCTLA-4-Ig 或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋 白以及在 SEQ ID NO ： 184 中所示的 hIgG2 Fc 多肽的核苷酸序列的表达载体而在 CHO 细胞中 制备的人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白典型地并不包括该预测 C- 端 赖氨酸 (K) 残基， 如通过 LCMS 分析所测定 ； 因此， 一种 hCTLA-4-IgG2 或突变 CTLA-4-IgG2 的 hIgG2Fc 多肽序列是如 SEQ ID NO ： 218 所示的那种， 这种 hIgG2Fc 多肽序列与在 SEQ ID NO ： 184 中所示的多肽序列相比典型地并不包括该 C- 端赖氨酸残基。
     COS 细胞的瞬时转染
     在 含 有 40ml 生 长 培 养 基 ( 补 充 有 10 ％ 胎 牛 血 清 (FBS)(Hyclone Cat.#SV30014.03) 及 1x PSG( 青霉素、 链霉素及谷氨酰胺 )(Invitrogen， Cat.#10378-016) 的 DMEM/F12 培养基 (Invitrogen， Cat.#10565-018)) 的 T-175 烧瓶中， 使 COS-7 细胞生长 至 80％ -90％汇合。在用一种质粒表达载体转染细胞之前立即除去该培养基， 并用 35ml 的 表达培养基 ( 含有 1x PSG 的 OptiMem 培养基 (Gibco#51985)) 替换。将质粒 DNA(10μg) ( 例如， 编码了本发明突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白的 pCDNA 突变 CTLA-4 ECDIgG2 Fc 表达载 体 ) 与 FuGENE6 转染试剂 (Roche#11815075001) 以 1 ∶ 3 的体积比混合， 并加入 1ml 的生 长培养基中。接着， 将该混合物缓慢加入该 T-175 烧瓶中， 并温和搅拌混合。在 37℃下孵育3 天后， 收集该培养基， 加入新鲜的表达培养基， 并将这些培养物再孵育 3d。
     可使用一种类似的操作来制备用编码了人类 CTLA-4-IgG2 的类似质粒载体或编 码了 LEA29Y-Ig 的 pCDNA3.1-LEA 质粒载体进行转染的 COS-7 细胞。
     蛋白的纯化
     在 RT 下 以 1000xg 离 心 10min， 并 过 滤 通 过 0.2μm 滤 膜 (Nalgene， VWR#73520-982)， 来澄清来自转染培养物 ( 例如， 包括用编码了突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的 pCDNA 突变 CTLA-4ECD IgG2 Fc 载体进行转染的细胞 ) 的上清液。 使用 AKTA Explorer HPLC 系统 (GE Healthcare)， 通过蛋白 -A 亲和层析来纯化蛋白。将一种突变融合蛋白在 PBS 缓 冲液中连结到 Hitrap Protein A FF 柱子 (GE Healthcare， #17-5079-01) 上， 用相同的缓 冲液洗涤， 用 100mM 柠檬酸缓冲液 (pH 4.0) 洗脱， 并接着加入 1/10 体积的 2M Tris 碱来进 行中和。最后， 使用 10kDa MWCO 滤膜 (Pierce， Cat.#PI66810)， 通过透将该蛋白溶液中的 缓冲液析交换为 PBS。
     可使用一种类似的操作来纯化人类 CTLA-4-IgG2 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白。
     蛋白质量的评估
     SDS/PAGE 分析
     在非还原条件下， 通过 SDS/PAGE 分析， 测量了本发明的经纯化的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的表观分子量 (MW)。在非还原条件下， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白典型地 是以包括两个单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的一种二聚体融合蛋白的形式而存在。在一个 方面， 该二聚体是一个同型二聚体， 该二聚体包括两个相同的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白单 体。在一个方面， 每个 CTLA-4-Ig 融合蛋白单体包括一个成熟 / 分泌的突变 CTLA-4ECD， 该 ECD 在其 C- 端融合到人类 IgG2 Fc 多肽的 N- 端上。这两个突变 CTLA-4-Ig 单体是以二硫 键共价连接在一起， 这些二硫键是在每个单体中的半胱氨酸残基之间形成。该同型二聚体 是典型地说明于这些实例中的本发明的突变融合蛋白分子形式， 除非另有明示。在这些实 例中所示的数据涉及到突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白同型二聚体， 除非另有明示。
     以 下 进 行 SDS/PAGE 分 析。 将 2μg 的 纯 化 蛋 白 加 至 20μl 的 LDS 样 本 缓 冲 液 (Invitrogen#NP0007) 中， 并 根 据 制 造 商 的 建 议 条 件， 使 其 通 过 1xMES 十 二 烷 基 硫 酸 钠 (SDS)/PAGE 移 动 缓 冲 液 (Invitrogen#NP0002) 中 的 NuPAGE 4 ％ -12 ％ Bis-Tris 凝 胶 (Invitrogen#NP0321BOX) 进 行 移 动。 在 RT 下，在 50ml SimplyBlue SafeStain(Invitrogen#LC6060) 中并温和震荡处理 1hr， 来对凝胶进行染色。在 RT 下， 通 过用 200ml 水并温和震荡处理 1hr 两次， 并根据制造商的建议条件在染色缓冲液 (Bio RAD 161-0752) 中加工， 来对凝胶进行脱染。
     两种示例性的本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白同型二聚体 ( 称为克隆 D3 及 D4) 以及 融合蛋白 ( 它充当一种比较对照 ) 的代表性 SDS/PAGE 凝胶示于图 3。该 D3-Ig 融合蛋白二聚体包括两个相同的 D3-Ig 融合蛋白单体， 这些单体通过在每个 D3-Ig 单体中的半胱氨酸残基间之所形成的二硫键来共价连接。每个 D3-Ig 单体包括一种突变 CTLA-4ECD 多肽 ( 称为 “D3” )， 包括在 SEQ ID NO ： 61 中所示的一个多肽序列， 该多肽序列在 其 C- 端直接 ( 即， 无 “连接物” 氨基酸残基 ) 融合到在 SEQ ID NO ： 218 中所示的 hIgG2 Fc 多肽的 N- 端上。该 D4-Ig 融合蛋白二聚体包括两个相同的 D4-Ig 单体， 这些单体通过在每 个 D3-Ig 单体中的半胱氨酸残基之间所形成的二硫键来共价连接。每个单体 D4-IgG2 融合蛋白包括一种突变 CTLA-4ECD 多肽 ( 称为 “D4” )， 该多肽包括在 SEQ ID NO ： 62 中所示的多 肽序列， 该多肽序列在其 C- 端直接 ( 即， 无 “连接物” 氨基酸残基 ) 融合到在 SEQ IDNO ： 218 中所示的 hIgG2 Fc 多肽的 N- 端上。
     如以上所解释， 现已实验发现， 经由使用包括编码 SEQ ID NO ： 184 中所示预测 hIgG2 Fc 多肽的核苷酸序列的载体而在 CHO 细胞中制备的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白典型地 并不包括该预测 C- 端赖氨酸 (K) 残基， 如以 LCMS 测定所测定 ； 因此， 突变 CTLA-4-IgG2 的 hIgG2 Fc 多肽序列是如 SEQID NO ： 218 所示的的， 该 hIgG2 Fc 多肽序列与 SEQ ID NO ： 184 中所示的多肽序列相比典型地并不包括该 C- 端赖氨酸残基。
     对所有的蛋白制备物进行 SDS/PAGE 测定， 以确认就表观分子量、 蛋白浓度、 及纯 度而言的蛋白品质。所述 SDS/PAGE 测定的结果就所有的蛋白制备物而言皆为相似。由 如图 3 所示的示例性凝胶结果可见， 经纯化的 D3-IgG2 及 D4-IgG2 融合蛋白二聚体具有约 为 80kDa 的表观 MW， 其与图 10 所示示例性同型二聚体突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白结构的 预测 MW 相符 ( 预测 MW ＝ 78-79kDa)。( 经纯化的突变 CTLA-4-IgG2 蛋白单体典型地具有 39-40kDa 的表观 MW。) 所述如图 3 所示凝胶中的蛋白条带已经相等的强度染色 ； 这可确认 测量不同样本蛋白浓度的精确性。至于蛋白纯度， 图 3 中可观察到一较低 MW 条带位于约 44kDa 的表观 MW， 其与单体 IgG2 融合蛋白的预测 MW 相符。这个较低 MW 条带的相对强度亦 相符为较低， 并且其估计为小于总蛋白量的 5％。
     可使用类似的 SDS/PAGE 测定， 评估使用类似所述以上说明的方法所制备的人类 CTLA-4-IgG2 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白的纯度。
     内毒素测定
     使用 QCL-1000 鲎变形细胞裂解物测定试剂盒 (Cambrex#50-648U)， 根据制造商的 建议条件， 测量突变 CTLA-4 融合蛋白的内毒素含量。用于细胞基础性测定中的蛋白最大内 毒素含量设定为 10 内毒素单位 (EU)/mg 蛋白。
     可使用类似的测定， 测量人类 CTLA-4-IgG2 或 LEA29Y-Ig 蛋白制备物的内毒素含 量。
     大小排阻层析 (SEC) 测定
     使用 Dionex BioLC system(Dionex)， 以大小排阻层析， 测量蛋白凝聚量 ( 包括突 变 CTLA-4 多肽及对照组多肽的凝聚量 )。使用 20min 的等强度移动， 使蛋白 (5μg) 在 PBS 移动缓冲液中通过 Tosoh G3000Wxl 柱子 (Tosoh Bioscience) 移动， 并以 214 奈米 (nm) 的 吸收值 (A) 进行检测。将用于后续测定的蛋白最大凝聚量设定为 10％。
     对所有的蛋白制备物进行 SEC 测定， 以确认就蛋白凝聚量而言的蛋白品质。所述 结果就所有的蛋白制备物而言皆为相似， 并且突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 (D3-Ig) 的 代表性 SEC 测定洗脱曲线容如图 4 所示。其 y 轴显示毫吸收单位 (mAU) ； x 轴显示以分钟计 的洗脱时间。该 D3-Ig 二聚体的结构解释于上文的 “SDS/PAGE 测定” 章节中。这个经纯化 的突变 CTLA-4-Ig 二聚体在尺寸上大多匀质， 并且并不含有高量的凝聚分子种。其他本发 明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白亦进行类似测定并显示类似结果 ( 数据未示 )。本发明的纯 化突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白经发现是在尺寸上匀质且并不含有高量 ( ＞ 10％ ) 的凝聚蛋 白。确认本发明纯化突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的凝聚状态是重要的， 因为经高度凝聚的突 变 CTLA-4-Ig 融合蛋白可以较高的亲合力结合人类 CD80 和 / 或人类 CD86 分子， 并因此可能具有较高的生物活性。
     实例 4
     使用表面电浆子共振 (SPR)(BiacoreTM 测定 ) 测量突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白对于 人类 CD80- 小鼠 Ig(hCD80-mIg) 及人类 CD86- 小鼠 Ig(hCD86-mIg) 融合蛋白的结合亲合力
     此实例说明用因此使得用 Biacore 相互作用测定而筛选突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 的改进 hCD80-mIg 和 / 或 hCD86-mIg 配体结合亲合力的操作。在用于说明这种类型测定 的术语的中， 经固定的结合配对物称为 “配体” ， 而在该移动相中的结合配对物则称为 “测定 物” 。含有 Ig 结构域的融合蛋白典型地会经由两 Ig 结构域间的强连结力而在溶液中形成 二聚体结构。除非另有明示， 此类二聚体的构型预期为此实例中所述融合蛋白 ( 即， 突变 CTLA-4-Ig、 融合蛋白、 LEA29Y-Ig、 hCD80-mIg 及 hCD86-mIg) 所存在的。术语 “亲 合力” 典型地是关于二聚体测定物 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) 与二聚体配体 ( 例 如， hCD80-mIg 或 hCD86-mIg 融合蛋白 ) 间的结合强度。突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白所述的 结合亲合力增加是由每个 CTLA-4 ECD 结构域与其对应配体间的亲和力增加所造成。结合 亲合力的强度典型地是以平衡解离常数 (KD) 说明， 它说明平衡连结 50％可用配体的测定物 摩尔浓度。
     在此筛选法中， 其以 hCD80-mIg 或 hCD86-mIg 配体衍化 Biacore 感应芯片， 并使 缓冲液中的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白流过所述经配体涂覆的感应芯片。突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白结合特定结合配对物 ( 即， hCD80-mIg 或 hCD86-mIg) 的能力获得评估。亦使对 照组融合蛋白 ( 即， 人类 CTLA-4-IgG2 融合蛋白、 融合蛋白及突变 LEA29Y-Ig 融合蛋白 ) 流过所述经配体涂覆的感应芯片， 并以类似方式评估此类分子结合 hCD80-mIg 或 hCD86-mIg 的能力以进行比较。使用该 Biacore 系统， 它可评估感兴趣的蛋白结合 hCD80-mIg 或 hCD86-mIg 配体的结合 (kon) 及解离 (koff) 常数， 并以其计算平衡解离常数 KD。该人 CTLA-4-IgG2 融合蛋白 ( 它包括融合人类 IgG2 多肽的 WT 人类 CTLA-4 ECD 多肽 ) 可作为野生型人类 CTLA-4-Ig“对照组” 。此外或可替代地， 由于该 融合蛋白是 由融合经修饰 IgG1 Fc 多肽的 WT 人类 CTLA-4 ECD 多肽组成， 它还可有效作为野生型人 类 CTLA-4-Ig 对照组以进行比较。其识别出与人类 CTLA-4-IgG2、 融合蛋白和 / 或 LEA29Y-Ig 相比而具有增加 hCD80-mIg 和 / 或 hCD86-mIg 结合亲合力的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白。如下文详细讨论的， 本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白对于 hCD80-mIg 和 / 或 hCD86-mIg 的增加的结合亲合力 ( 例如与 融合蛋白 ( 即， hCTLA-4-IgG1) 和 / 或 LEA29Y-Ig 对于 hCD80-mIg 和 / 或 hCD86-mIg 的结合亲合力相比 ) 并非是因存在于该突变 CTLA-4-Ig 分子中的 IgG2 与存在于该 或 LEA29Y-Ig 分子中的突变 IgG1 的差异 而造成。
     该 CD86 信号肽典型地在加工过程中从该预测 hCD86-Ig 多肽中切割， 并且因此该 分泌的人类 CD86-Ig 融合蛋白 ( 即， 成熟融合蛋白 ) 通常并不包括该信号肽。 该成熟 / 分泌 形式的 hCD86-Ig( 它具有总共 454 个氨基酸 ) 包括 SEQ ID NO ： 177 的氨基酸残基 24-477( 没 有该信号肽的全长序列 )， 并且以氨基酸残基序列 ： 丙氨酸 - 脯氨酸 - 亮氨酸起始。 若希望， 该成熟融合蛋白的氨基酸能够以 Ala-Pro-Leu 序列中的丙氨酸 (Ala) 开始编号， 将 Ala 指 定为该第一残基 ( 例如， 该 ECD 包括编号为 1-218 的氨基酸残基 )， 如同在这种包括在 SEQ ID NO ： 178 中所示的多肽序列的成熟形式 hCD86-Ig 中。该成熟蛋白 (SEQ ID NO ： 178) 包 括一种 WT hCD86 ECD 蛋白， 该蛋白在其 C- 端共价融合到 hIgG1 Fc 多肽的 N- 端上。
     该 hCD86-Ig 融合蛋白典型地是在溶液中以包括两个相同单体成熟 hCD86-Ig 融合 蛋白的一种二聚体融合蛋白的形式而存在。在此情形下， 每个单体成熟 CD86-Ig 融合蛋白 (SEQ ID NO ： 178) 包括一个人类 CD86 ECD(SEQ ID NO ： 180)， 该 ECD 在其 C- 端融合到一种 人类 IgG1 Fc(SEQ IDNO ： 185) 的 N- 端上。这两个 hCD86-Ig 单体是通过二硫键共价连接在 一起的， 这些二硫键是在每个单体中的半胱氨酸残基之间形成， 由此形成了该 hCD86-Ig 融 合蛋白二聚体。该 hCD86-Ig 融合蛋白二聚体是在这些实例中说明的测定中所使用的融合 蛋白分子形式， 除非另有明示。
     在该 CD86-Ig 融合蛋白中 ( 例如， 预测及成熟形式 )， 三个残基 GVT 作为一种克隆 人造物 ( 或连接物 ) 存在于该 CD86 ECD 的 C- 端与该 IgG1Fc 多肽的 N- 端之间。在另一方 面， 该 WT 人类 CD86 ECD 蛋白包括一个多肽序列， 该多肽序列包括 SEQ ID NO ： 180 的氨基酸 残基 1-218( 即， 排除最后两个 C- 端氨基酸残基 (PP))。
     融合蛋白
     作为一个额外的对照并且出于比较目的， 购买了被称为 融合蛋白 (Bristol-Myers Squibb Co.， Princeton， NJ) 的可商购的融合蛋白。 融合蛋白 是由在其 C- 端融合到一种特定突变 IgG1 Fc 多肽的 N- 端上的 WT 人类 CTLA-4 细胞外结构 域构成。 蛋白是包括两个相同单体融合蛋白的一种二聚体融合蛋白， 这些单体 融合蛋白是通过二硫键共价连接在一起， 这些二硫键是在每个单体融合蛋白中所存在的半 胱氨酸残基之间形成。每个成熟 融合蛋白单体的多肽序列示于 SEQ IDNO ： 164， 并且它是由下列片段构成 ： WT 人类 CTLA-4 细胞外结构域 ( 氨基酸残基 1-124)、 连接物序列 ( 氨基酸残基 125)、 以及突变 IgG1 Fc 多肽 ( 氨基酸残基 126-357)。 每个 融合蛋 白单体具有与在图 2C 中示意性显示的 LEA29Y-Ig 融合蛋白单体的结构相类似的结构， 除外 该 LEA29Y ECD 经 WT 人类 CTLA-4ECD 置换， 并且在任一个 融合蛋白单体中皆不存 在信号肽， 这是因为每个单体皆是分泌或成熟的融合蛋白。 非成熟形式 单体 ( 它 包括信号肽 ) 的多肽序列以及编码了该非成熟形式 融合蛋白单体的核酸序列对 融合 应地示于 U.S.7,094,874 的 SEQ IDNO ： 8 及 SEQ ID NO ： 7。用于制备及使用 蛋白的方法还披露于 U.S.7,094,874。
     编码突变 CTLA-4 多肽的 DNA 序列的创造使用直接发展法来产生编码了重组突变 CTLA-4 细胞外结构域多肽的重组非自 然发生的多核苷酸库。诸多自然发生的哺乳动物 CTLA-4 同源物的蛋白以及核苷酸序列 是已知的。见， 如， 国家生技信息中心 (NCBI)。将在不同的自然发生的哺乳动物 CTLA-4 细胞外结构域同源物中所识别的序列多样性用于直接发展法来产生编码了突变 CTLA-4 ECD 结构域多肽的重组多核苷酸库。直接发展操作包括例如， 体外重组及诱变操作， 如实 质上说明于 ； Stemmer， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91 ： 10747-10751(1994) ； Chang etal.， Nature Biotech 17 ： 793-797(1999) ； 国际专利申请公开号 WO 98/27230 ； 以及美国专利号 6,117,679 及 6,537,776。
     编码突变 CTLA-4 多肽的 DNA 序列库的创造
     使用基于序列同源性所设计的正向及反向引物， 通过 PCR， 从组合反应中扩增编码 了重组突变 CTLA-4 ECD 多肽的突变 DNA 序列。这些引物是通过本领域的普通技术人员所 熟知的标准操作来设计、 制备、 并组合的， 并且在需要时包括终止及起始密码子以及限制位 点。所采用的 PCR 扩增操作亦为本领域中所熟知。见， 如， Berger、 Ausubel 及 Sambrook， 皆为上述文献。示例性的正向及反向引物包括但不限于以下这些 ： 正向引物 (5’ -CTATTGC TACGGCCGCTATGGCCMTKCACGTCGCTCAACCAGCCGTCGTACTCGCGTCC-3’ )(SEQ ID NO ： 191) 及反向 引物 (5’ -GTGATGGTGATGGTGTGCGGCCGCATCAGA-3’ )(SEQ ID NO ： 192)。使用 5μl 的组合反 Taq 缓冲液 (Qiagen ； 应物作为模板， 在 100μl 的 PCR 反应中， 以 1μM 的正向及反向引物、 #201225)、 以及 200μM dNTP， 进行 15 个扩增循环 (94℃ 30s ； 50℃ 30s ； 72℃ 40s)。将编码 突变 CTLA-4 ECD 多肽的经扩增 DNA 用限制酶 (SfiI 及 NotI) 进行消化， 并通过琼脂糖凝胶 电泳分离这些片段， 使用 Qiaquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， #28704) 根据制造商的建议 进行纯化， 并将其接合进入经类似消化的噬菌体展示载体 pSB0124 中 ( 操作类似于说明于 Chang et al.， Nature Biotech 17 ： 793-797(1999) 中的那些 )。根据制造商的建议条件， 通过电穿孔来使该所得的库转化进入 TOP10 大肠杆菌细胞 (Invitrogen， Inc ； #C4040-50) 中。将经转化的细胞在含有 50μg/ml 羧苄青霉素的 LB(Luria 液态培养基 ) 中， 在 37 ℃ 下并以 250rpm 震荡， 进行过夜孵育， 并接着根据制造商的建议条件将其用于制备库 DNA 的 maxiprep(Qiagen ； #12362) 贮液。
     具有改进人类 CD80 和 / 或人类 CD86 结合亲合力的展示突变 CTLA-4 多肽的噬菌 体库的筛选
     突变 CTLA-4 多肽的噬菌体展示库的产生
     根据制造商的建议条件， 通过电穿孔将该所得的库 DNA( 例如， 编码了 CTLA-4 ECD 突变体的 DNA 序列库 ) 转化进入 TG-1 大肠杆菌细胞 (Stratagene ； #200123) 中。 在噬菌质粒 选择条件下 ( 含有 50μg/ml 羧苄青霉素的 LB 培养基 )， 使该培养物生长 1-2 代， 用 M13KO7 辅助噬菌体 ( 以多重的 5-10 的感染水平 ) 进行感染， 并且在噬菌质粒 (50μg/ml 羧苄青霉 素 ) 及辅助噬菌体 (70μg/ml 卡那霉素 ) 的双重选择下在 37℃下以 250rpm 震荡进行过夜 孵育。通过离心来澄清这些培养物 (6000rpm， 15min， 4℃， 于 Sorvall 600TC 转子中 )， 并且 通过将 32ml 的培养物上清液与 8ml 的 PEG/NaCl 溶液 (20％ PEG-8000 ； 2.5M NaCl) 在冰上 孵育 30min、 之后跟随离心 (9500rpm， 40min， 4℃， 在 Sorvall 600TC 转子中 ) 来沉淀噬菌体 颗粒。将该噬菌体沉淀物悬浮于含有 1％ BSA( 牛血清白蛋白， Sigma ； #A7906) 的 1ml PBS 中， 移至微离心管中， 并通过离心进行澄清 ( 最大转速， 5min， RT， 在 Eppendorf 桌上型离心器中 )。 CTLA-4 突变体噬菌体库的淘选
     使用标准条件， 对噬菌体库进行对抗 hCD80-Ig 或 hCD86-Ig 融合蛋白的共五轮 的淘选。见， 如， Lowman， et al.， Biochemistry 12 ； 30(45) ： 10832-10838(1991) ； Smith， G.P.et al.， Chem.Rev.97 ： 391-410(1997)。各轮的淘选包括 ： (a) 将该噬菌体展示性突变 CTLA-4ECD 多肽与 hCD80-Ig 或 hCD86-Ig 配体结合 ； (b) 除去未连结的噬菌体 ； (c) 洗脱连 结的噬菌体， 并且 (d) 扩增该经洗脱的噬菌体用于下一轮的淘选。将来自各轮的一个等分 部分的噬菌体转导进入大肠杆菌细胞中， 以获得单个的转导株的克隆。
     通过噬菌体 ELISA 对具有改进人类 CD80 和 / 或人类 CD86 结合亲合力的 CTLA-4 突变体的识别
     将来自各轮淘选的单个克隆接种到含有 150μl/ 孔的含有 50μg/ml 羧苄青霉素 的 2x YT( 酵母菌 - 胰蛋白胨 ) 培养基的 96 孔培养板 (NUNC ； #243656) 中， 并在 37℃下以 250rpm 震荡进行过夜孵育。 使用这些过夜培养物来接种含有 600μl/ 孔的相同培养基的深 孔块 (Scienceware ； #378600001)。在 37℃下以 250rpm 震荡孵育该培养物 2hr， 用 M13K07 辅助噬菌体 ( 多重感染 (moi)5-10) 进行感染， 并接着在噬菌质粒及辅助噬菌体标记的双重 选择下 (50μg/ml 羧苄青霉素及 70μg/ml 卡那霉素 ) 在 37℃下以 250rpm 震荡进行过夜 孵育。在 Beckman GH 3.8 转子中在 4℃下以 4000rpm 离心 20min 来澄清培养物。通过加 入 50μl/ 孔的含有 10μg/ml hCD80-Ig 或 hCD86-Ig 的 PBS， 并在 4℃下过夜孵育， 来涂覆 #449824)。以 200μl/ 孔的 PBST 洗涤试验板三次、 并通过加入 200μl/ 孔 ELISA 板 (NUNC ； 的含有 3％脱脂奶粉的 PBS、 并在 RT 下孵育 1 小时 (hr) 来进行阻断。将 25μl/ 孔的来自 该深孔块的噬菌体上清液移至含有 25μl/ 孔的 6％脱脂奶粉的 ELISA 板中， 并在室温 (RT) 下孵育试验板 1hr。用 200μl/ 孔的 PBST 洗涤所述试验板三次、 并与 50μl/ 孔的以含有 3％脱脂奶粉的 PBST 稀释 1 ∶ 5000 的 HRP- 偶联性抗 -M13 单克隆抗体 (GE Healthcare， #27-9421-01) 在 RT 下孵育 1hr。用 200μl/ 孔的 PBST 洗涤所述试验板三次、 并使用 TMB 底物试剂盒 (Pierce ； #34021)， 根据制造商的建议条件来检测信号。与人类 CTLA-4 对于 人类 CD80 和 / 或人类 CD86 的结合亲合力 ( 如通过人类 CTLA-4ECD 对于 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig 的结合亲合力所测量 ) 相比， 选择了展示出对于人类 CD80 和 / 或人类 CD86 的 增加的亲合力 ( 如通过对于 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig 的增加的亲合力而测量 ) 的突变 CTLA-4ECD 多肽， 用于进一步分析。
     实例 3
     IgG2 Fc 融合蛋白载体的创造
     创造了一种质粒 IgG2-Fc 融合蛋白表达载体以制备包括本发明的突变 CTLA-4 ECD 多 肽 及 人 类 IgG2 Fc 多 肽 的 融 合 蛋 白。 通 过 人 类 白 细 胞 cDNA(BD Biosciences， Cat.#HL4050AH) 的 PCR 扩增而产生了编码人类 IgG2 Fc 多肽的 DNA， 这是通过使用正向引 物 (5’ -AAGCTGTCACCGGTGGATCGATCCCGAACCCTGCCCTGATTCTGATGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCC CACCGT-3’ )(SEQ ID NO ： 189) 及反向引物 (5’ -CAGAATTCATTATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC TTCTG-3’ )(SEQ ID NO ： 190) 来进行的。通过本领域的普通技术人员所熟知的标准操作对 这些引物进行设计、 制备、 并组合， 并且在需要时包括终止及起始密码子以及限制位点。所 采用的 PCR 扩增操作亦为本领域中所熟知。见， 如， Berger、 Ausubel 及 Sambrook， 皆为上
     述文献。使用 50-100ng 的 cDNA 作为模板， 在 100μl 的 PCR 反应中以 1μM 的正向及反向 引物、 Taq 缓冲液 (Stratagene ； #200435) 及 200μM dNTP， 进行 25 个扩增循环 (94℃， 30s ； 55℃， 30s ； 72℃， 60s)。根据制造商的建议条件， 将该 PCR 产物通过 QiaQuick PCR 离心柱子 (Qiagen#28106) 进行纯化， 并且用限制酶 AgeI 及 EcoRI 进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳 来分离所述 PCR 消化片段， 并且使用 Qiaquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， #28704) 根据制造 商的建议条件进行纯化。可以用 AgeI 及 EcoRI 对经修饰形式的 pCDNA3.1-LEA 载体 ( 以上 说明 )( 它在该 CTLA-4 信号序列中含有一个 AgeI 限制位点 ( 作为一种沉默突变而引入 )) 进行消化， 并且与以上提及的片段进行接合。 根据制造商的建议条件， 使该连接物转化进入 One-shot TOP10 大肠杆菌细胞 (Invitrogen Cat.#C4040-03) 中。将经转化的细胞在含有 50μg/ml 羧苄青霉素的 LB(Luria 液态培养基 ) 中在 37℃下以 250rpm 震荡， 进行过夜孵育， 并接着根据制造商的建议条件， 将其用来制备质粒 DNA 的 maxiprep(Qiagen ； #12362) 贮液。
     该所得的质粒表达载体称为 pCDNA IgG2 Fc 融合蛋白表达载体。这个载体是与 在图 1 中所示的 pCDNA 突变 CTLA-4-IgG2 质粒载体相同的， 除外去除了这种编码了突变 CTLA-4 ECD 多肽的核酸序列。在 pCDNA IgG2 Fc 融合载体中编码了该信号肽的核酸序列 ( 它在图 1 中可以是任何适当的信号肽编码性核苷酸序列 ) 是编码了该人类 CTLA-4 信号肽 的核酸 (SEQ IDNO ： 181 或 SEQ ID NO ： 215)。这种 IgG2 Fc 融合载体并不包括编码了本发 明的一种突变 CTLA-4 ECD 多肽或任何其他 CTLA-4 ECD 多肽的任何核酸序列。
     将编码了突变 CTLA-4 多肽的核酸序列克隆进入该 IgG2 Fc 融合载体
     为了产生作为可溶性 Fc 融合蛋白的突变 CTLA-4 多肽， 将编码了来自该噬菌体库 筛选的、 识别为具有对于人类 CD80 和 / 或人类 CD86 的改进的结合亲合力 ( 当与人类 CTLA-4 ECD 对于人类 CD80 和 / 或人类 CD86 的结合亲合力相比 ) 的突变 CTLA-4 ECD 多肽的 DNA 序 列各自克隆进入以上说明的 IgG2 Fc 融合蛋白载体中， 这是使用例如下列操作进行的。
     首先， 从该噬菌体展示载体中、 通过 PCR 扩增、 使用基于与在该突变 CTLA-4 ECD 多肽的 N- 及 C- 端上的多个核苷酸残基 ( 例如， 30-60 个核苷酸 ) 的序列同源性而设计的 正向及反向引物以及本领域中已知的标准操作， 回收了编码展示出对于 hCD80-Ig 和 / 或 hCD86-Ig 的较高结合亲合力的突变 CTLA-4 ECD 多肽的 DNA 序列。见， 如， 说明于例如， Berger、 Ausubel 及 Sambrook， 皆为以上说明文献的操作。例如， 在一个方面， 编码了突变 CTLA-4 ECD 多肽的 DNA 序列是通过 PCR 扩增而从该噬菌体展示载体中回收的， 这是使用正 向 引 物 (5’ -GGAATACCGGTTTTTTGTAAAGCCATGCACGTCGCTCAACCAGCCGTCGTACTC-3’ )(SEQ ID NO ： 191) 及 反 向 引 物 (5’ -GGCACTCAGATCTACGTCATCGATCCCGAA-3’ )(SEQ ID NO ： 192) 进 行的。使用 10 纳克 (ng) 的质粒 DNA( 含有一个突变 CTLA-4 ECD 编码核苷酸序列的噬菌 体展示载体 ) 作为模板， 在 100μl 的 PCR 反应中， 用 1μM 的正向及反向引物、 Taq 缓冲液 (Stratagene ； #200435) 及 200μM dNTPs， 进行 25 个扩增循环 (94℃， 30s ； 55℃， 30s ； 72℃， 60s)。 根据制造商的建议条件， 将该 PCR 产物通过 QiaQuick PCR 离心柱子 (Qiagen#28106) 进行纯化， 并用限制酶 AgeI 及 ClaI 进行消化。通过琼脂糖凝胶电泳来分离所述片段， 使用 Qiaquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， #28704) 根据制造商的建议条件进行纯化， 并将其接合 进入经类似消化的质粒 IgG2 Fc 融合载体中。根据制造商的建议条件， 将该连接物转化进 入 One-shot TOP10 大肠杆菌细胞 (Invitrogen Cat.#C4040-03) 中。将经转化的细胞在含 有 50μg/ml 羧苄青霉素的 LB(Luria 液态培养基 ) 中在 37℃下以 250rpm 震荡， 进行过夜孵育， 并接着根据制造商的建议条件， 将其用于制备质粒 DNA 的 maxiprep(Qiagen ； #12362) 贮液。
     该所得的质粒表达载体 ( 该载体包括编码了本发明突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白 的核酸 ) 称为 pCDNA 突变 CTLA-4 ECD IgG2 Fc 质粒表达载体。这种载体的示意图示于图 1。这种载体包括一个 Bla 启动子 ； 氨苄青霉素抗性基因 ； pUC 起点 ； SV40 聚腺苷酸 ( 聚 A) 信号序列 ； f1 起点 ； SV40 启动子 ； 新霉素抗性基因 ； CMV 启动子， 以协助表达本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 包括例如， 人类 CTLA-4 信号肽、 突变 CTLA-4 ECD 多肽、 以及人类 IgG2 Fc 多肽 ) ； 编码了一种人类 CTLA-4 信号肽的核酸序列 (SEQID NO ： 181 或 SEQ ID NO ： 215) ； 编码了本发明的一种突变 CTLA-4 ECD 多肽的核酸序列 ( 包括但不限于， 例如编码了 SEQ ID NOS ： 80-152 中任何一个的核苷酸序列 ) ； 编码了在 SEQ ID NO ： 183 或 SEQ ID NO ： 217 所示 的一种人类 IgG2 Fc 多肽的示例性核酸序列 ； 以及一个牛生长激素 (bGH) 聚 A 终止信号序 列。SEQ ID NO ： 183 的核酸序列编码了具有 C- 端赖氨酸 (K) 残基的 hIgG2 Fc 多肽 (SEQ ID NO ： 184) ； 而 SEQ ID NO ： 217 的核酸序列编码了不具有 C- 端赖氨酸残基的 hIgG2 Fc 多 肽 (SEQ ID NO ： 218)。
     该质粒 IgG2 Fc 融合蛋白载体也可用于产生人类 CTLA-4-IgG2( “hCTLA-4-Ig” )融 合蛋白。 在此情形下， 使用类似以上说明的那些的标准克隆操作， 将编码了人类 CTLA-4 ECD 的核酸序列 ( 例如， SEQ ID NO ： 193) 取代编码了突变 CTLA-4 ECD 的核苷酸序列而克隆进入 该质粒 IgG2Fc 融合蛋白载体中。该 hCTLA-4-Ig 融合蛋白典型地是在溶液中以包括两个相 同单体成熟 hCTLA-4-Ig 融合蛋白的一种二聚体融合蛋白的形式而存在。在此情形下， 每个 单体成熟 hCTLA-4-Ig 融合蛋白包括一个人类 CTLA-4ECD(SEQID NO ： 159)， 该 ECD 在其 C- 端 融合到人类 IgG2 Fc(SEQ ID NO ： 218 或 SEQID NO ： 184) 的 N- 端上。这两个 hCTLA-4-Ig 单 体是以二硫键共价连接在一起， 这些二硫键是在每个单体中的半胱氨酸残基之间形成， 由 此形成了该 hCTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体。该成熟 hCTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体是在这些实 例中说明的测定中所使用的融合蛋白分子形式， 除非另有明示。
     现已通过实验发现， 通过转染包括了编码该 hCTLA-4-Ig 或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋 白以及在 SEQ ID NO ： 184 中所示的 hIgG2 Fc 多肽的核苷酸序列的表达载体而在 CHO 细胞中 制备的人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白或突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白典型地并不包括该预测 C- 端 赖氨酸 (K) 残基， 如通过 LCMS 分析所测定 ； 因此， 一种 hCTLA-4-IgG2 或突变 CTLA-4-IgG2 的 hIgG2Fc 多肽序列是如 SEQ ID NO ： 218 所示的那种， 这种 hIgG2Fc 多肽序列与在 SEQ ID NO ： 184 中所示的多肽序列相比典型地并不包括该 C- 端赖氨酸残基。
     COS 细胞的瞬时转染
     在 含 有 40ml 生 长 培 养 基 ( 补 充 有 10 ％ 胎 牛 血 清 (FBS)(Hyclone Cat.#SV30014.03) 及 1x PSG( 青霉素、 链霉素及谷氨酰胺 )(Invitrogen， Cat.#10378-016) 的 DMEM/F12 培养基 (Invitrogen， Cat.#10565-018)) 的 T-175 烧瓶中， 使 COS-7 细胞生长 至 80％ -90％汇合。在用一种质粒表达载体转染细胞之前立即除去该培养基， 并用 35ml 的 表达培养基 ( 含有 1x PSG 的 OptiMem 培养基 (Gibco#51985)) 替换。将质粒 DNA(10μg) ( 例如， 编码了本发明突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白的 pCDNA 突变 CTLA-4 ECDIgG2 Fc 表达载 体 ) 与 FuGENE6 转染试剂 (Roche#11815075001) 以 1 ∶ 3 的体积比混合， 并加入 1ml 的生 长培养基中。接着， 将该混合物缓慢加入该 T-175 烧瓶中， 并温和搅拌混合。在 37℃下孵育3 天后， 收集该培养基， 加入新鲜的表达培养基， 并将这些培养物再孵育 3d。
     可使用一种类似的操作来制备用编码了人类 CTLA-4-IgG2 的类似质粒载体或编 码了 LEA29Y-Ig 的 pCDNA3.1-LEA 质粒载体进行转染的 COS-7 细胞。
     蛋白的纯化
     在 RT 下 以 1000xg 离 心 10min， 并 过 滤 通 过 0.2μm 滤 膜 (Nalgene， VWR#73520-982)， 来澄清来自转染培养物 ( 例如， 包括用编码了突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的 pCDNA 突变 CTLA-4ECD IgG2 Fc 载体进行转染的细胞 ) 的上清液。 使用 AKTA Explorer HPLC 系统 (GE Healthcare)， 通过蛋白 -A 亲和层析来纯化蛋白。将一种突变融合蛋白在 PBS 缓 冲液中连结到 Hitrap Protein A FF 柱子 (GE Healthcare， #17-5079-01) 上， 用相同的缓 冲液洗涤， 用 100mM 柠檬酸缓冲液 (pH 4.0) 洗脱， 并接着加入 1/10 体积的 2M Tris 碱来进 行中和。最后， 使用 10kDa MWCO 滤膜 (Pierce， Cat.#PI66810)， 通过透将该蛋白溶液中的 缓冲液析交换为 PBS。
     可使用一种类似的操作来纯化人类 CTLA-4-IgG2 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白。
     蛋白质量的评估
     SDS/PAGE 分析
     在非还原条件下， 通过 SDS/PAGE 分析， 测量了本发明的经纯化的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的表观分子量 (MW)。在非还原条件下， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白典型地 是以包括两个单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的一种二聚体融合蛋白的形式而存在。在一个 方面， 该二聚体是一个同型二聚体， 该二聚体包括两个相同的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白单 体。在一个方面， 每个 CTLA-4-Ig 融合蛋白单体包括一个成熟 / 分泌的突变 CTLA-4ECD， 该 ECD 在其 C- 端融合到人类 IgG2 Fc 多肽的 N- 端上。这两个突变 CTLA-4-Ig 单体是以二硫 键共价连接在一起， 这些二硫键是在每个单体中的半胱氨酸残基之间形成。该同型二聚体 是典型地说明于这些实例中的本发明的突变融合蛋白分子形式， 除非另有明示。在这些实 例中所示的数据涉及到突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白同型二聚体， 除非另有明示。
     以 下 进 行 SDS/PAGE 分 析。 将 2μg 的 纯 化 蛋 白 加 至 20μl 的 LDS 样 本 缓 冲 液 (Invitrogen#NP0007) 中， 并 根 据 制 造 商 的 建 议 条 件， 使 其 通 过 1xMES 十 二 烷 基 硫 酸 钠 (SDS)/PAGE 移 动 缓 冲 液 (Invitrogen#NP0002) 中 的 NuPAGE 4 ％ -12 ％ Bis-Tris 凝 胶 (Invitrogen#NP0321BOX) 进 行 移 动。 在 RT 下，在 50ml SimplyBlue SafeStain(Invitrogen#LC6060) 中并温和震荡处理 1hr， 来对凝胶进行染色。在 RT 下， 通 过用 200ml 水并温和震荡处理 1hr 两次， 并根据制造商的建议条件在染色缓冲液 (Bio RAD 161-0752) 中加工， 来对凝胶进行脱染。
     两种示例性的本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白同型二聚体 ( 称为克隆 D3 及 D4) 以及 融合蛋白 ( 它充当一种比较对照 ) 的代表性 SDS/PAGE 凝胶示于图 3。该 D3-Ig 融合蛋白二聚体包括两个相同的 D3-Ig 融合蛋白单体， 这些单体通过在每个 D3-Ig 单体中的半胱氨酸残基间之所形成的二硫键来共价连接。每个 D3-Ig 单体包括一种突变 CTLA-4ECD 多肽 ( 称为 “D3” )， 包括在 SEQ ID NO ： 61 中所示的一个多肽序列， 该多肽序列在 其 C- 端直接 ( 即， 无 “连接物” 氨基酸残基 ) 融合到在 SEQ ID NO ： 218 中所示的 hIgG2 Fc 多肽的 N- 端上。该 D4-Ig 融合蛋白二聚体包括两个相同的 D4-Ig 单体， 这些单体通过在每 个 D3-Ig 单体中的半胱氨酸残基之间所形成的二硫键来共价连接。每个单体 D4-IgG2 融合蛋白包括一种突变 CTLA-4ECD 多肽 ( 称为 “D4” )， 该多肽包括在 SEQ ID NO ： 62 中所示的多 肽序列， 该多肽序列在其 C- 端直接 ( 即， 无 “连接物” 氨基酸残基 ) 融合到在 SEQ IDNO ： 218 中所示的 hIgG2 Fc 多肽的 N- 端上。
     如以上所解释， 现已实验发现， 经由使用包括编码 SEQ ID NO ： 184 中所示预测 hIgG2 Fc 多肽的核苷酸序列的载体而在 CHO 细胞中制备的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白典型地 并不包括该预测 C- 端赖氨酸 (K) 残基， 如以 LCMS 测定所测定 ； 因此， 突变 CTLA-4-IgG2 的 hIgG2 Fc 多肽序列是如 SEQID NO ： 218 所示的的， 该 hIgG2 Fc 多肽序列与 SEQ ID NO ： 184 中所示的多肽序列相比典型地并不包括该 C- 端赖氨酸残基。
     对所有的蛋白制备物进行 SDS/PAGE 测定， 以确认就表观分子量、 蛋白浓度、 及纯 度而言的蛋白品质。所述 SDS/PAGE 测定的结果就所有的蛋白制备物而言皆为相似。由 如图 3 所示的示例性凝胶结果可见， 经纯化的 D3-IgG2 及 D4-IgG2 融合蛋白二聚体具有约 为 80kDa 的表观 MW， 其与图 10 所示示例性同型二聚体突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白结构的 预测 MW 相符 ( 预测 MW ＝ 78-79kDa)。( 经纯化的突变 CTLA-4-IgG2 蛋白单体典型地具有 39-40kDa 的表观 MW。) 所述如图 3 所示凝胶中的蛋白条带已经相等的强度染色 ； 这可确认 测量不同样本蛋白浓度的精确性。至于蛋白纯度， 图 3 中可观察到一较低 MW 条带位于约 44kDa 的表观 MW， 其与单体 IgG2 融合蛋白的预测 MW 相符。这个较低 MW 条带的相对强度亦 相符为较低， 并且其估计为小于总蛋白量的 5％。
     可使用类似的 SDS/PAGE 测定， 评估使用类似所述以上说明的方法所制备的人类 CTLA-4-IgG2 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白的纯度。
     内毒素测定
     使用 QCL-1000 鲎变形细胞裂解物测定试剂盒 (Cambrex#50-648U)， 根据制造商的 建议条件， 测量突变 CTLA-4 融合蛋白的内毒素含量。用于细胞基础性测定中的蛋白最大内 毒素含量设定为 10 内毒素单位 (EU)/mg 蛋白。
     可使用类似的测定， 测量人类 CTLA-4-IgG2 或 LEA29Y-Ig 蛋白制备物的内毒素含 量。
     大小排阻层析 (SEC) 测定
     使用 Dionex BioLC system(Dionex)， 以大小排阻层析， 测量蛋白凝聚量 ( 包括突 变 CTLA-4 多肽及对照组多肽的凝聚量 )。使用 20min 的等强度移动， 使蛋白 (5μg) 在 PBS 移动缓冲液中通过 Tosoh G3000Wxl 柱子 (Tosoh Bioscience) 移动， 并以 214 奈米 (nm) 的 吸收值 (A) 进行检测。将用于后续测定的蛋白最大凝聚量设定为 10％。
     对所有的蛋白制备物进行 SEC 测定， 以确认就蛋白凝聚量而言的蛋白品质。所述 结果就所有的蛋白制备物而言皆为相似， 并且突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 (D3-Ig) 的 代表性 SEC 测定洗脱曲线容如图 4 所示。其 y 轴显示毫吸收单位 (mAU) ； x 轴显示以分钟计 的洗脱时间。该 D3-Ig 二聚体的结构解释于上文的 “SDS/PAGE 测定” 章节中。这个经纯化 的突变 CTLA-4-Ig 二聚体在尺寸上大多匀质， 并且并不含有高量的凝聚分子种。其他本发 明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白亦进行类似测定并显示类似结果 ( 数据未示 )。本发明的纯 化突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白经发现是在尺寸上匀质且并不含有高量 ( ＞ 10％ ) 的凝聚蛋 白。确认本发明纯化突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的凝聚状态是重要的， 因为经高度凝聚的突 变 CTLA-4-Ig 融合蛋白可以较高的亲合力结合人类 CD80 和 / 或人类 CD86 分子， 并因此可能具有较高的生物活性。
     实例 4
     使用表面电浆子共振 (SPR)(BiacoreTM 测定 ) 测量突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白对于 人类 CD80- 小鼠 Ig(hCD80-mIg) 及人类 CD86- 小鼠 Ig(hCD86-mIg) 融合蛋白的结合亲合力
     此实例说明用因此使得用 Biacore 相互作用测定而筛选突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 的改进 hCD80-mIg 和 / 或 hCD86-mIg 配体结合亲合力的操作。在用于说明这种类型测定 的术语的中， 经固定的结合配对物称为 “配体” ， 而在该移动相中的结合配对物则称为 “测定 物” 。含有 Ig 结构域的融合蛋白典型地会经由两 Ig 结构域间的强连结力而在溶液中形成 二聚体结构。除非另有明示， 此类二聚体的构型预期为此实例中所述融合蛋白 ( 即， 突变 CTLA-4-Ig、 融合蛋白、 LEA29Y-Ig、 hCD80-mIg 及 hCD86-mIg) 所存在的。术语 “亲 合力” 典型地是关于二聚体测定物 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) 与二聚体配体 ( 例 如， hCD80-mIg 或 hCD86-mIg 融合蛋白 ) 间的结合强度。突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白所述的 结合亲合力增加是由每个 CTLA-4 ECD 结构域与其对应配体间的亲和力增加所造成。结合 亲合力的强度典型地是以平衡解离常数 (KD) 说明， 它说明平衡连结 50％可用配体的测定物 摩尔浓度。
     在此筛选法中， 其以 hCD80-mIg 或 hCD86-mIg 配体衍化 Biacore 感应芯片， 并使 缓冲液中的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白流过所述经配体涂覆的感应芯片。突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白结合特定结合配对物 ( 即， hCD80-mIg 或 hCD86-mIg) 的能力获得评估。亦使对 照组融合蛋白 ( 即， 人类 CTLA-4-IgG2 融合蛋白、 融合蛋白及突变 LEA29Y-Ig 融合蛋白 ) 流过所述经配体涂覆的感应芯片， 并以类似方式评估此类分子结合 hCD80-mIg 或 hCD86-mIg 的能力以进行比较。使用该 Biacore 系统， 它可评估感兴趣的蛋白结合 hCD80-mIg 或 hCD86-mIg 配体的结合 (kon) 及解离 (koff) 常数， 并以其计算平衡解离常数 KD。该人 CTLA-4-IgG2 融合蛋白 ( 它包括融合人类 IgG2 多肽的 WT 人类 CTLA-4 ECD 多肽 ) 可作为野生型人类 CTLA-4-Ig“对照组” 。此外或可替代地， 由于该 融合蛋白是 由融合经修饰 IgG1 Fc 多肽的 WT 人类 CTLA-4 ECD 多肽组成， 它还可有效作为野生型人 类 CTLA-4-Ig 对照组以进行比较。其识别出与人类 CTLA-4-IgG2、 融合蛋白和 / 或 LEA29Y-Ig 相比而具有增加 hCD80-mIg 和 / 或 hCD86-mIg 结合亲合力的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白。如下文详细讨论的， 本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白对于 hCD80-mIg 和 / 或 hCD86-mIg 的增加的结合亲合力 ( 例如与 融合蛋白 ( 即， hCTLA-4-IgG1) 和 / 或 LEA29Y-Ig 对于 hCD80-mIg 和 / 或 hCD86-mIg 的结合亲合力相比 ) 并非是因存在于该突变 CTLA-4-Ig 分子中的 IgG2 与存在于该 或 LEA29Y-Ig 分子中的突变 IgG1 的差异 而造成。
    
     所有的 BiacoreTM 测定皆是在 BiacoreTM 2000 系统 (GE Healthcare) 上于 室温 (RT， 25 ℃ ) 下进行。在所有实验中使用 HBS-EP 缓冲液 (10mMHEPES(pH 7.4)， 150mM NaCl， 3mM EDTA， 0.005％界面活性剂 P20) 作为该流动缓冲液。
     标准动力测定 标准动力测定是测量涂覆于感应芯片上的二聚体配体 ( 例如， hCD80-mIg 融合蛋 白或 hCD86-mIg 融合蛋白 ) 与移动相中的二聚体测定物 ( 例如， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融 合蛋白 ) 间的结合动力学。 根据制造商的操作操作， 将兔抗小鼠 IgG 抗体 (GE Healthcare，
     #BR-1005-14) 固定在 CM5 感应芯片 (GE Healthcare， #BR-1000-14) 上。将抗体以固定缓 冲液 (10mM 醋酸钠， pH 5.0(BR-1003-51)) 稀释至 30μg/ml。使用 5μl/ 分钟的流速， 注射 35μl 的 1- 乙基 -3-[3- 二甲氨基丙基 ] 碳化二亚胺盐酸化物 (EDC) 及 N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 混合物 ( 以混合等体积的 11.5mg/ml EDC 及 75mg/ml NHS 而制备 )(GE Healthcare， #BR-1000-50)， 并接着注射 35μl 的未经稀释抗体， 以活化感应芯片 CM5。将未经反应的位 点以 35μl 的 1M 乙醇胺 -HCL， pH 8.5(GE Healthcare， #BR-1000-50) 淬灭。这个操作典型 地可产生 15， 000 反应单位 (RU) 的偶合抗体。以 10μl/min 的流速， 经由对应地注射 10μl 或 16μl 的配体溶液 (2μg/ml 蛋白于 HBS-EP 缓冲液中 [10mM HEPES pH 7.4， 150mM NaCl， 3mM EDTA， 0.005％ (v/v) 界面活性剂 P-20， GE Healthcare， #BR-1001-88])， 使 CTLA-4 配 体人类 CD80- 小鼠 Ig(hCD80-mIg)(Ancell， #510-820) 或人类 CD86- 小鼠 Ig(hCD86-mIg) (Ancell， #509-820) 连结经抗体涂覆的感应芯片。配体捕捉量典型地是 135-170RU。使突 变 CTLA-4-Ig 蛋白 ( 或以 HBS-EP 缓冲液稀释 ) 以 30μl/min 流过经配体涂覆的感应芯片 2min， 再使不含蛋白的 HBS-EP 缓冲液以相同流速进行 5min 的孵育。对于自 hCD86-mIg 具 有极缓慢解离速率的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 亦使用较长的解离时间 ( 例如， 20min) 进 行动力测定。突变 CTLA-4-Ig 蛋白的 Rmax 信号量是介于约 70-100RU。各循环间的再生是 通过使 10mM 甘氨酸缓冲液 (pH 1.7) 以 50μl/min 进行 3min 的孵育而进行。在用于实际 实验之前， 对新芯片进行 4-5 循环的捕捉 / 结合 / 再生。由自含有经捕捉的 hCD80-mIg 或 hCD86-mIg 的流细胞所获得的数据中减去自仅含有兔抗小鼠 IgG 捕捉抗体的参照细胞所获 得的数据。典型地， 其是使介于自 500nM 至 0.2nM 的 8 种突变 CTLA-4-Ig 蛋白稀释物相对 空白参照组 ( 仅含 HBS-EP 缓冲液 ) 进行测定。
     取自一典型 Biacore 测定的感应谱踪迹图如图 5 所示。此图显示随时间 ( 以秒 (s) 为单位 ) 而获得的反应 (RU)， 以下列三种融合蛋白与 hCD86-mIg 融合蛋白的结合产生 ： (1) 融合蛋白 ( 作为对照组并用于进行比较 )(Bristol-Myers Squibb Co. ； 见， 如， Larson C.P.et al.， Am.J.Trans.5 ： 443-453(2005)) ； (2)LEA29Y-Ig 融合蛋白 ( 用于 进行比较 ) ； 及 (3) 称为 “克隆 D3” ( 也称为 D3-IgG2) 的本发明示例性突变 CTLA-4-Ig 融 合蛋白。该 D3-IgG2 融合蛋白包括两个相同的单体融合蛋白， 其以在每个单体中的半胱氨 酸残基间所形成的一个或多个二硫键彼此共价连接。见上文 “SDS/PAGE 测定” 章节中的讨 论。每个单体融合蛋白包括如 SEQ ID NO ： 159 所示的成熟突变 CTLA-4 ECD 多肽， 其以其 C- 端融合如 EQ ID NO ： 184 或 218 所示的人类 IgG2 多肽的 N- 端。其他本发明的二聚体融 合蛋白可包括类似该二聚体 D3-IgG2 融合蛋白的结构 - 除外每个单体融合蛋白的 D3 突变 CTLA-4 ECD 多肽经不同的突变 CTLA-4 ECD 多肽取代。
     该结合期反映该感兴趣的测定物与该感兴趣的配体间的结合。在图 5 中， 每 个测定物的结合期是以该由箭头所标记的时间前的时间曲线表示， 并且其是以测定物 (D3-IgG2、 融合蛋白或 LEA29Y-Ig) 与该 hCD86-mIg 配体的结合而特征标记的。 测定物离开该 hCD86-mIg 配体的解离速率亦反应在该曲线中 - 见， 如， 从约 510 秒起始的急 遽反应单位增加率。
     该测定的解离期是自图 5 中的由箭头所标记的时间起始。在该解离期中， 该测定 物与该配体自其结合的构型中解离。在图 5 中， 测定物离开该配体的解离速率是由反应单 位的降低表示 ( 随时间所测得的反应单位降低率 )。 根据此类数据， 可测定相对解离速率常数 (“off” 速率， koff 或 kd) 及结合速率常数 (“on” 速率， kon 或 ka)。该相互作用的总亲合 力可以 KD， (koff)/(kon) 说明。 较高的结合亲合力通常会以较低的解离速率展现。 如该较低的 解离速率伴随相等、 较高、 或临界较慢的结合速率， 因此使得该计算的平衡解离常数 KD 为较 低， 该亲合力将是较高。在此情形下， 对于 hCD86-mIg 配体的结合亲合力大于 融 合蛋白对于该相同配体的结合亲合力的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白亦将具有低于 蛋白的离开该配体的较慢解离速率。对于 hCD86-mIg 配体的结合亲合力大于 LEA29Y-Ig 对 于该相同配体的结合亲合力的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白亦将具有低于 LEA29Y-Ig 的离开该 配体的较慢解离速率。
     图 5 显示 LEA29Y-Ig 离开该 hCD86-mIg 配体的解离速率显著较慢于 蛋 白从该相同配体的解离速率。LEA29Y-Ig 结合 hCD86-mIg 的结合速率亦类似于 融合蛋白所观察到的。因此， LEA29Y-Ig 具有大于 蛋白的较高 hCD86-mIg 结合 亲合力。这个发现与说明 LEA29Y-Ig 具有大于 融合蛋白的较高 hCD86-mIg 配 体 结 合 亲 合 力 的 先 前 研 究 相 符 (Larson C.P.et al.， Am.J.Trans.5 ： 443-453(2005))。 5： 443-453(2005)). 图 5 亦显示本发明的突变 D3-IgG2 融合蛋白具有小于 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白的离开 hCD86-mIg 配体的较慢解离速率。该 D3-IgG2 融合蛋白亦具 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白对于 hCD86-mIg 配体的结合速率的类似 ( 但稍微 有相较 较快 ) 结合速率结合 hCD86-mIg 配体。因此， 该 D3-IgG2 融合蛋白具有大于 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白的较高 hCD86-mIg 配体结合亲合力。 因此， 该 D3-IgG2 融合蛋白预期可 以较高的结合亲合力结合天然 CD86， 包括， 如， 在哺乳动物 ( 诸如， 人类 ) 中于活体内表达于 APCs 上的 CD86。这个观点可由下文实例中所讨论的功能性细胞基础性测定进一步支持。
     使用其他本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白进行 Biacore 测定。此外， 使用经 hCD80-mIg 涂覆的感应芯片以及本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白进行 Biacore 测定。判 定此类突变分子的解离速率及结合亲合力， 并与 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白的解离 速率及亲和力进行比较。代表性的结果如表 3 及表 4 所示， 并在下文详细讨论。
     标准 Biacore 数据测定
     在除去所述感应谱的再生及补充部分后， 将曲线归零至样本注射前约 10s 的所有 曲线的 5s 平均值。自各试验曲线减去空白曲线。以 BIAevaluation 软件 (v4.1， 可自 GE Healthcare 获得 )， 使用 “Fit kinetics， Simultaneous ka/kd” 功能而测定数据。注射起 始时间定义为所有曲线皆接近零点的结合期前时间。 针对该结合期的数据选择起始于注射 起始时间后约 10s， 并结束于注射终止时间前约 10s。注射终止时间定义为任何与解离期 相关的信号峰值出现前的时间。解离期是选择为起始于注射终止时间后约 10s， 并包括该 5min 解离期的 280-295s。该 1 ∶ 1 Langmuir 模式说明反应 A+B< ＝ >AB。这个模式代表 单一配体对单一感兴趣的蛋白 ( 例如， 受体 ) 的结合。使用取从该 BIAevaluation 软件的 1 ∶ 1 Langmuir 模式以判定结合速率常数 (ka) 及解离速率常数 (kd)， 并计算平衡解离常数 KD。KD ＝ kd/ka。KD ＝ ([A]·[B])/[AB]. 平衡解离常数 KD 是等于平衡结合常数 KA 的倒数。 KD ＝ 1/KA。该反应 ( 测定物 A 加配体 B 产生偶联物 AB) 的速率方程式 ( 其中 A ＝经注射 测定物， B ＝自由配体， 并且 t ＝时间 ) 为 ： d[B]/dt ＝ -(ka[A][B]-kd[AB]) 及 d[AB]/dt ＝ ka[A][B]-kd[AB]。以 R( 特定时间的 Biacore 反应单位 (RU)) 取代 [AB]， Rmax-R 取代 [B]， 及 C( 测定物浓度 ) 取代 [A]， 以 Biacore 单位表达的净速率为 dR/dt ＝ kaC(Rmax-R)-kdR， 其中 R 在 t0 ＝ 0， B[0] ＝ Rmax， 并且 AB[0] ＝ 0RU， 其总反应＝ [AB]+RI。将实体偏移 (bulk shift)(RI) 设为 0， 并且对所有曲线整体拟合 Rmax、 ka 以及 kd。
     对于本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白制备物以及 LEA29Y-Ig 及 融合 蛋白进行以上说明的标准动力测定及数据测定。 表 3 及 4 摘述代表性本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的结合数据。
     表 3 提出代表性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白对于 hCD86-mIg 的结合亲合力， 如以以 上说明的标准 Biacore 测定测量。具体言之， 表 3 显示每个突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的名 称； 对应该单体突变 CTLA-4 ECD 融合蛋白多肽序列的序列识别号 (SEQ ID NO) ； 基于该突 变蛋白对于 hCD86-mIg 的结合亲合力所测定的平衡解离常数 (KD( 摩尔浓度 (M)) ； 以及相对 融合蛋白对于该 hCD86-mIg 结合亲合力的各突变 CTLA-4-Ig 对于该 hCD86-mIg 结合亲合力。这个相对结合亲合力 ( 例如最右栏所示 ) 是以突变融合蛋白的 hCD86-mIg 结 合亲合力与 融合蛋白的 hCD86-mIg 结合亲合力相比的倍数提高而表示。表 3 中 的每个本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白典型地在溶液中是以包括两个相同单体融合蛋 白的二聚体融合蛋白形式存在， 其中每个单体蛋白包括突变 CTLA-4 ECD 多肽 ( 例如， 称为 D1、 D1T、 D2、 D3、 D4 等 )， 它在其 C- 端直接融合包括 SEQ ID NO ： 184 或 218 序列的 IgG2 Fc 多肽的 N- 端。每个此类二聚体突变 CTLA-4-Ig 可以本领域中已知的标准技术制备。可替 代地， 每个此类二聚体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体可使用如上文实例 3 所示的方法制 备。简言之， 它可将编码表 3 所识别的特定突变 CTLA-4 ECD 的核酸序列 ( 例如， 编码表 3 中所识别突变 CTLA-4 ECD 多肽序列的核酸序列 ) 克隆进入该 IgG2 Fc 融合载体中， 以该载 体转染哺乳动物细胞， 在进行该所得融合蛋白的表达、 纯化及评估， 如实例 3 所述。每个突 融合蛋白 ( 它 变 CTLA-4 ECD 的示例性核酸序列如本文所包括的序列表中所示。 包括两个单体融合蛋白， 每个单体融合蛋白包括融合经修饰 IgG1 Fc 的野生型人类 CTLA-4 ECD) 是作为对照组， 即， 其对于 hCD86-mIg 的结合亲合力是设定为 1。它还显示 LEA29Y-Ig 融合蛋白以及人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白的 KD 值。此外， 它还显示 LEA29Y-Ig 的 hCD86-mIg 结合亲合力与 蛋白的 hCD86-mIg 结合亲合力相比的倍数提高。CTLA-4-IgG2 及 融合蛋白对于 hCD86-mIg 的结合亲合力约为相等， 因此确认， 人类 CTLA-4-IgG2 中所存在的人类 IgG2 与 蛋白中所存在的经修饰 IgG1 间的差异， 对于此类分子个 别的 hCD86-mIg 结合亲合力仅有极小的贡献 ( 例如其有任何贡献 )。如下文实例 5 中所详 细讨论， 兹以确认， 本发明突变 CTLA-4-Ig 多肽与 蛋白 ( 或 LEA29Y-Ig) 间的免疫 抑制功能活性差异并非由它包括不同 IgG 同种型的个别 Ig Fc 区结构域造成。
     如表 3 所示， 本发明的代表性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有如下的 hCD86-mIg 结 合亲合力 ： (1) 至少约等于大于人类 CTLA-4-IgG2( “hCTLA-4-IgG2” )( 它包括两个共价连接 的单体融合蛋白， 每个这种单体蛋白包括融合 IgG2 Fc 多肽的人类 CTLA-4 ECD 多肽 ) 的结 合亲合力 ； (2) 至少约等于大于 蛋白对于 hCD86-mIg 配体的结合亲合力 ； 和/或 (3) 至少约等于大于 LEA29Y-Ig 对于 hCD86-mIg 配体的结合亲合力。 其指出每个 CTLA-4-Ig 突变体相对于 蛋白的 hCD86-mIg 结合亲合力的 hCD86-mIg 结合亲合力倍数改进 ( 表 3 第 4 栏 )。
     兹发现大一些突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白离开 hCD86-mIg 融合蛋白的解离速率是较 融合蛋白离开 hCD86-mIg 融合蛋白的解离速率缓慢 ( 数据未显示 )。兹发现诸多的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白对于 hCD86-mIg 的结合速率是大于 融合蛋白对于 该相同配体的结合速率 ( 数据未显示 )。
     所有如表 3 所示的全部突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有 hCD86-mIg 平衡解离常数 (KD)， 该平衡解离常数小于人类 CTLA-4-IgG2 或 融合蛋白的 hCD86-mIg 平衡解离 常数。同时， 大部分如表 3 所示的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有 hCD86-mIg 平衡解离常数， 该平衡解离常数低于 LEA29Y-Ig 的 hCD86-mIg 平衡常数
     所有如表 3 所示的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白皆具有大于人类 CTLA-4-IgG2 或 融合蛋白的 hCD86-mIg 结合亲合力的 hCD86-mIg 结合亲合力 ( 相对于 融合蛋白的 hCD86-mIg 亲和力的经计算倍数改进如表 3 所示第 4 栏 )。同时， 诸多如表 3 所 示的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有大于 LEA29Y-Ig 的 hCD86-mIg 结合亲合力的 hCD86-mIg 结合亲合力 ( 表 3 第 4 栏 )。
     具有大于 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白的较高 hCD86-mIg 配体结合亲合力的 本发明突变 CTLA-4-Ig 将可能具有较高的活体内免疫抑制强度 ( 对应地与 hCTLA-4-IgG2、 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白相比 )， 诸如， 在， 如， 用于在受试者体内阻抑一种免疫反 应的治疗和 / 或预防方法 ( 例如， 在其中需要免疫抑制或免疫抑制的哺乳动物 ( 诸如， 如， 人类 ) 体内的免疫系统疾病或病症的活体内治疗中 )、 用于阻抑受方 ( 例如， 哺乳动物， 诸 如， 如， 人类 ) 对于来自供方的组织或器官移植排斥的方法或本文他处所述的其他方法。
     表3
     * 注记 ： 表 3 中针对人类 CTLA-4-IgG2、 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白的序列 识别号 (SEQ ID NOS) 对应地是此类 Ig 融合蛋白的多肽序列的。在表 3 中针对每个突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白所显示的 SEQ ID NO 识别了该经识别的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的突 变 CTLA-4ECD 的多肽序列。所述数据是有关于突变 CTLA-4-Ig， 它包括突变 CTLA-4ECD( 例 如， SEQ IDNOS ： 1-48 及 58-73 中的任何一个 )， 它在其 N- 端直接融合如 SEQ ID NO ： 184 或 218 所示的 IgG2 Fc 多肽的 C- 端。 用于制备此类融合蛋白的方法是为本领域中所已知的且 说明于本文的中。然而， 如上所注记， 现已实验发现， 经由使用包括编码 SEQ ID NO ： 184 中 所示预测 hIgG2 Fc 多肽的核苷酸序列的载体而在 CHO 细胞中所制备的突变 CTLA-4-Ig 典 型地并不包括该预测 C- 端赖氨酸 (K) 残基 ； 因此， 突变 CTLA-4-IgG2 的 hIgG2 Fc 多肽序列 是如 SEQ ID NO ： 218 所示的， 该 hIgG2 Fc 多肽序列与 SEQ ID NO ： 184 中所示的序列相比并 不包括该 C- 端赖氨酸残基。不包括该 C- 端赖氨酸残基的示例性融合蛋白序列如 SEQ ID NOS ： 205-214、 219 及 221 所示。
     表 4 提 出 突 变 CTLA-4-Ig 融 合 蛋 白 对 于 hCD80-mIg 的 结 合 亲 合 力， 如以标准 Biacore 测定测量。具体言之， 表 4 显示突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的克隆名称 ； 对应该单 体突变 CTLA-4 ECD 融合蛋白多肽序列的序列识别号 (SEQ ID NO) ； hCD80-mIg 配体结合亲 以及相对 融合蛋白对于该相同配 合力测定的平衡解离常数 (KD( 摩尔浓度 (M)) ； 体的结合亲合力的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的 hCD80-mIg 配体结合亲合力。针对每个突 变蛋白， 其显示该 hCD80-mIg 配体结合亲合力与 融合蛋白的 hCD80-mIg 配体结 合亲合力相比的倍数提高 ( 表 4 第 4 栏 )。 融合蛋白是作为对照组， 即， 其对于 hCD80-mIg 的结合亲合力是设定为 1。所述突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白典型地在溶液中是以 二聚体融合蛋白的形式存在。如表 4 所示， 本发明的二聚体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有 如下的 hCD80-mIg 结合亲合力 ： (1) 至少约等于大于人类 CTLA-4-IgG2 的结合亲合力 ； (2) 至少约等于大于 融合蛋白对于 hCD80-mIg 配体的结合亲合力 ； 和 / 或 (3) 至少 约等于大于 LEA29Y-Ig 对于 hCD80-mIg 配体的结合亲合力。如上所讨论， 每个二聚体突变 CTLA-4-Ig 二聚体可使用上文实例 3 所示的方法制备。
     兹发现诸多的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白离开 hCD80-mIg 融合蛋白的解离速率是约 等于或大于 融合蛋白离开该相同配体的解离速率 ( 数据未显示 )。兹发现一些 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白对于 hCD80-mIg 的结合速率是约等于或大于 融合蛋白 对于该相同配体的结合速率 ( 数据未显示 )。
     诸多如表 4 所示的许多突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有 hCD80-mIg 平衡解离常数 (KD)， 该平衡解离常数低于人类 CTLA-4-IgG2 或 融合蛋白的 hCD80-mIg 平衡解离 常数。同时， 数种如表 4 所示的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有 hCD80-mIg 平衡解离常数， 该 hCD80-mIg 平衡解离常数至少约等于 LEA29Y-Ig 的 hCD80-mIg 平衡常数。
     诸多如表 4 所示的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白皆具有大于人类 CTLA-4-IgG2 或 融合蛋白对于该相同配体的结合亲合力的 hCD80-mIg 结合亲合力 ( 相对于 融合蛋白的 hCD80-mIg 结合亲合力倍数改进如第 4 栏所示 )。同时， 数种如表 4 所示的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有至少约等于或大于 LEA29Y-Ig 对于该相同配体的结合 亲合力的 hCD80-mIg 结合亲合力。
     具有大于 hCTLA-4-IgG1、 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白的较高 hCD80-mIg 结合亲合力的本发明突变 CTLA-4-Ig 将可能具有较高的活体内免疫抑制强度 ( 对应地与 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白相比 )， 诸如， 在， 如， 用于在受试者体内 hCTLA-4-IgG2、 阻抑一种免疫反应的治疗和 / 或预防方法 ( 例如， 在其中需要免疫抑制或免疫抑制的哺乳 动物 ( 诸如， 如， 人类 ) 体内的免疫系统疾病或病症的活体内治疗中 )、 用于阻抑受方 ( 例 如， 哺乳动物， 诸如， 如， 人类 ) 对于来自供方的组织或器官移植排斥的方法或本文他处所 述的其他方法。
     表4
     * 注记 ： 表 4 中针对人类 CTLA-4-IgG2、 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白所示的 SEQ ID NOS 对应地是此类融合蛋白的多肽序列的。如表 4 中所示的人类 CTLA-4-IgG2、 以及 LEA29Y-Ig 融合蛋白的 SEQ ID NOS 对应地是这些融合蛋白的多肽序列。 在表 4 中针对每个突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白所显示的 SEQ ID NO 识别了该经识别的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的突变 CTLA-4 ECD 的多肽序列。然而， 兹已经由 LCMS 测定而实验发 现， 经由使用包括编码 SEQ ID NO ： 184 中所示预测 hIgG2 Fc 多肽的核苷酸序列的载体而在 CHO 细胞中所制备的突变 CTLA-4-Ig 典型地并不包括该预测 C- 端赖氨酸 (K) 残基 ； 因此， 突变 CTLA-4-IgG2 的 hIgG2 Fc 多肽序列是如 SEQ ID NO ： 218 所示的的， 该 hIgG2 Fc 多肽 序列与 SEQ ID NO ： 184 中所示的序列相比并不包括该 C- 端赖氨酸残基。不包括该 C- 端赖 氨酸残基的示例性融合蛋白序列如 SEQ ID NOS ： 205-214、 219 及 221 所示。
     单体动力测定
     对于突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白结合特性的进一步确认可由单价动力结合测定获 得。此类测定是测量涂覆于感应芯片上的二价试验蛋白 ( 例如， 二聚体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ) 与移动相中的单价配体 ( 例如， 经木瓜蛋白酶酶切消化的 hCD86-mIg) 间的结 合动力学。根据制造商的操作操作， 将山羊抗人类 IgG 抗体 (Jackson ImmunoResearch， #109-005-098) 偶合在 CM5 感应芯片上， 典型地可产生 15,000 反应单位 (RU)。 以 10μl/min 的流速， 通过使经抗体涂覆的芯片与 10μl 的二聚体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白于 HBS-EP 缓冲液中的 2μg/ml 溶液进行孵育而捕捉配体。配体捕捉量典型地是 25-80RU。将单
     体 hCD86-mIg 配体 ( 由 hCD86-mIg 的木瓜蛋白酶酶切消化及蛋白 -A 琼脂糖吸收而产生， 如 Hermanson， G.T.BIOCONJUGATETECHNIQUES( 生物偶联技术 )， Academic Press， 1996 中所述 ) 以 HBS-EP 缓冲液稀释， 并使其以 30μl/min 流过经试验蛋白涂覆的感应芯片 2min， 再使不含 蛋白的 HBS-EP 缓冲液以相同流速进行 2min 的孵育。各循环间的再生是通过使 10mM 甘氨 酸缓冲液 (pH 1.7) 以 30μl/min 进行 3min 的孵育而进行。典型地， 其是使介于自 3000nM 至 0.2nM 的 8 种单体测定物蛋白稀释物相对空白参照组 ( 仅含 HBS-EP 缓冲液 ) 而以双重 试验进行测定。与突变 CTLA-4-Ig 蛋白结合的 Rmax 信号量是介于约 10-60RU。
     针对动力测定， 如上选择进行单体结合测定的数据， 除外该结合数据选择是起始 及结束于距注射起始及终止时间 5s， 并且解离数据选择是起始于注射终止时间后 5s， 并典 型地包括该解离期的 1-60s。 还使用 BIAevaluation 软件测定此类数据的稳态平衡亲和力。 使用 BIAevaluation 的 “General fit ： average” 功能， 在接近样本注射结束的 5-20s 范围 内， 平均每个浓度的稳态结合量 (Responseeq(“Req” ) 值 )。使用 BIAevaluation 软件， 根 据方程式 Req ＝ KA x C x Rmax/(KA x C x n+1)( 其中 C 是测定物浓度， 并且立体干扰因 子 n 是 1， 并且 KD ＝ 1/KA)， 自 Req 对浓度作图而判定稳态亲和力。在一些情形下， 它可观查 到实质性的非专一性结合， 如以解离后的残余平坦 R- 值踪迹表示。此类数据可通过从所述 Inc.) Req 值中减去该残余 R 值而校正。接着在 GraphPad Prism 软件 (GraphPad Software， 中， 使用 “onesite-specific binding” 模式而计算值 KD。
     对于代表性突变 CTLA-4-Ig 蛋白的亚群进行这个单体结合测定， 并且所述结果摘 说明于表 5。总之， 在该单体结合测定中相对于 LEA29Y-Ig 所观察到的对于突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的 hCD86 ECD 结合改进程度， 与标准动力测定中相对于 LEA29Y-Ig 所观察到的对 于突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的 hCD86-mIg 结合改进程度相似。此类结果支持突变蛋白在 结合动力学中所观察到的改进是由所述突变蛋白在结合亲和力方面的真正改进 ( 例如， 与 和 / 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白相比 ) 所造成， 并且并不是由因凝聚蛋白制备物的高 价性而造成的潜在人造物所造成。
     表5
     融合蛋白 ( 二聚体 )SEQ ID NO* ( 例如， 突变 CTLA-4ECD 的 ) 166 61 4 10单体 hCD86 ECD KD(M)单体 hCD86 ECD 的结合 亲和力 ( 相对 于 LEA29Y-Ig) 1 ＞ 5x ＞ 5x ＞ 5xLEA29Y-Ig D3-IgG2 D3-4-IgG2 D3-11-IgG21.68x10-6 ＜ 3.36x10-7 ＜ 3.36x10-7 ＜ 3.36x10-7201101998965 A CN 101998971说11 12 15 17 24 26 28 35明书＞ 5x ＞ 5x ＞ 5x 2x-5x 2x-5x ＞ 5x ＞ 5x ＞ 5x169/188 页D3-12-IgG2 D3-14-IgG2 D3-17-IgG2 D3-20-IgG2 D3-27-IgG2 D3-29-IgG2 D3-31-IgG2 D3-53-IgG2
     ＜ 3.36x10-7 ＜ 3.36x10-7 ＜ 3.36x10-7 8.4x10-7-3.36x10-7 8.4x 10-7-3.36x10-7 ＜ 3.36x10-7 ＜ 3.36x10-7 ＜ 3.36x10-7* 注记 ： 表 5 中针对 LEA29Y-Ig 所示的 SEQ ID NO 是 LEA29Y-Ig 融合蛋白的多肽 序列的。表 5 中为每个突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白所示的 SEQ IDNO 是识别该经识别突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的突变 CTLA-4ECD 的多肽序列。所述数据是有关于突变 CTLA-4-Ig， 它 包括突变 CTLA-4ECD( 例如， SEQ ID NOS ： 4、 10-12、 15、 17、 24、 26、 28、 35 及 61 中的任何一 个 )， 它在其 N- 端融合如 SEQ ID NO ： 184 或 218 所示的 IgG2 Fc 多肽的 C- 端。然而， 兹已 经由 LCMS 测定而实验发现， 经由使用包括编码 SEQ ID NO ： 184 中所示预测 hIgG2 Fc 多肽的 核苷酸序列的载体而在 CHO 细胞中所制备的突变 CTLA-4-Ig 典型地并不包括该预测 C- 端 赖氨酸 (K) 残基 ； 因此， 突变 CTLA-4-IgG2 的 hIgG2 Fc 多肽序列是如 SEQ ID NO ： 218 所示 的的， 该 hIgG2Fc 多肽序列与 SEQ ID NO ： 184 中所示的序列相比并不包括该 C- 端赖氨酸残 基。不包括该 C- 端赖氨酸残基的示例性融合蛋白序列如 SEQ IDNOS ： 205-214、 219 及 221 所示。包括该 C- 端赖氨酸残基的示例性融合蛋白序列如 SEQ ID NOS ： 74-79、 197-200、 220 及 222 所示。
     实例 5
     使用人类 PBMC 增殖测定 ( 抗 -CD3 抗体刺激 ) 而测量 CTLA-4 突变体的生物活性
     CTLA-4-Ig 及其特定变体已经显示为活体外 T 细胞增殖的强阻抑剂 ( 见， 如， Larson et al.， Am.J.Transplant.5， 443)。为在此类测定中测量突变 CTLA-4-Ig 蛋白的改 进活性， 兹发展出周边血液单核细胞 (PBMC) 增殖测定。
     以等体积的 PBS 稀释人血 ( 由供方的计划新鲜收集 )， 再使用 Histopaque(Sigma， #10771)Ficoll 梯度， 根据制造商的建议条件进行分级分离以分离 PBMCs。以生长培养基 ( 补 充 有 10 ％ FBS(Hyclone#SV30014.03) 及 1xPSG(Invitrogen， #10378-016) 的 DMEM/ 5 F12 培养基 (Invitrogen， #10565-018)) 稀释 PBMCs， 再以 1x10 细胞 / 孔的密度， 加入 96 孔培养板 (BD Biosciences， #353077) 中。以生长培养基是列稀释试验化合物， 并以三重 试验形式加入所述孔中。添加小鼠抗 - 人类 CD3 抗体 (BDPharmingen ： 555329) 至 5μg/ ml 的终浓度以起始细胞增殖。在 37℃下孵育 2 天 (d) 后， 以 1μCi/ 孔的浓度加入 3H 胸苷(GE Healthcare， #TRK758-5MCI)， 再使所述试验板在 37℃下孵育额外 16hr。在细胞收集器 (FilterMate Omnifilter-96Harvester) 中， 使用制造商的建议条件而收集细胞， 并使用闪 3 3 烁计数器 (Wallac Trilux， #1450-421) 测量 H 胸苷的纳入。 H 胸腺嘧啶核苷掺入的程度 3 ( H 胸苷摄入 ) 是 T 细胞增殖程度的指标。3H 胸苷的纳入是以标准技术测量。T 细胞的增 殖是以三重试验孔的平均每分钟计数 (cpm) 表示。
     使用非线性回归曲线拟合模式 (S 型剂量反应， 可变斜率 ) 及最小平方拟合法， 以 GraphPad Prism 5 软件测定细胞增殖数据。报告了取从所述结果的 IC50( 亦显示为 IC50) 参数及其相关的 95％信赖区间 ( 表 6)。图 6 显示取自涉及一组本发明例示突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 即， D3-04-IgG2、 D3-11-IgG2、 D3-12-IgG2 及 D3-14-IgG2 融合蛋白 ) 的代表性 PBMC 增殖测定 ( 使用抗 -CD3 抗体刺激 ) 的细胞增殖曲线。该图是 3H 胸腺嘧啶核苷掺入 ( 每分钟计数 (cpm)) 对蛋白浓度 ( 纳摩尔浓度 (nM)) 的作图。3H 胸腺嘧啶核苷掺入 (3H 胸 苷摄入 )( 其是细胞增殖程度的指标 ) 是以标准技术测量。
     包括了 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白作为对照组以进行比较。 此类结果说明， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有显著大于 和 / 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白的 较高强度或更大的能力， 以在活体外阻抑或抑制多克隆 T 细胞的活化或 T 细胞的增殖。
     兹使用其他本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白进行 PBMC 增殖测定。表 6 提供代 表性本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白组的数据摘要。表 6 提出示例性突变 CTLA-4-Ig 融合 蛋白相对对照组 ( hCTLA-4-IgG2 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白 ) 在该 PBMC 增殖测 定 ( 使用抗 -CD3 抗体刺激 ) 中的平均 IC50 值 ( 纳摩尔浓度 (nM)) 的比较。IC50 值表示在 活体外产生 T 细胞增殖的 50％阻抑所需的化合物 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig、 hCTLA-4-IgG2、 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白 ) 浓度。将取自个别实验的 IC50 值进行平均以提供平均 IC50 值， 其再用于进行统计测定。使用单因子 ANOVA 及事后比较 Dunnett 或 Bonferroni 试 验， 对应地使突变 CLTA-4-Ig 融合蛋白及 hCTLA-4-IgG2 与 或 LEA29Y-Ig 融合蛋 白进行比较 (C.W.Dunnett， New Tables for Multiple Comparisons with a Control( 用 于与对照组进行多重比对的新颖表格 )， Biometrics 20(3) ： 482-491(Sept.1964) ； Abdi， Herve， “The Bonferroni and Sidak corrections for multiple comparisons( 多重比对 的 Bonferroni 及 Sidak 校正 )” ， 于 ENCYCLOPEDIA OF MEASUREMENT ANDSTATISTICS( 测量及统计百科全书 ) (N.J.Salkind ed.， Thousand Oaks， CA2007) ； 也可在全球信息网于网址 utdallas.edu/ ～ herve/Abdi-Bonferroni2007-pretty.pdf 获得 )。Ig 融合蛋白的统计测定是使下列突变 CTLA-4ECD 多肽 ( 克隆 D24、 D3-07、 D3-15 及 D3-16) 中的一种作为 n ＝ 1 不进行测定而构 成。术语 “SD( 平均 log IC50)” 表示平均 log IC50 值的标准偏差。
     表 6. 使用抗 -CD3 抗体刺激的示例性 PBMC 增殖测定的数据摘要
     1 表 6 中的上标注记如下 ： 与 Orencia 的统计差异为 p ＜ 0.05， 如以单因子 ANOVA 2 及事后比较 Dunnett 试验测定。 与 LEA 的统计差异为 p ＜ 0.05， 如以单因子 ANOVA 事后 比较 Bonferroni 试验测定。包括 D3-7、 D3-15、 D3-71 及 D24 突变 CTLA-4 ECDs 的融合蛋白 仅试验一次， 并因此无法进行统计比较。注记 ： 表 6 中的术语 “NA” 意谓 “未获得” 。
     统计测定显示， 在至少两次不同测定中试验并以上标注记 (1) 指明 ( 见表 6) 的所 有突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白皆在强度上统计优于 及 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白 (p ＜ 0.05)( 即， 具有大于 及 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白的更大的能力， 以在活体外的 PBMC 测定中阻抑或抑制 T 细胞的增殖 )。 所述以上标注记 (2) 指明的 ( 见表 6) 亦在强度上
     统计优于 LEA29Y-Ig 融合蛋白 (p ＜ 0.05)( 即， 具有大于 LEA29Y-Ig 融合蛋白的更大的能 力， 以在活体外的 PBMC 测定中阻抑或抑制 T 细胞的增殖 )， 如以上文所讨论的单因子 ANOVA 及事后比较 Dunnett 及 Bonferroni 试验测定。 在包括经修饰的 IgG1 Fc( 例如于 中 ) 或野生型 IgG2 Fc( 例如于 hCTLA4-IgG2 中 ) 的人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白间并无统计 差异。此类发现说明， 表 6 所示本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 它包括人类 IgG2 Fc) 与 或 hCTLA4-IgG2 间的功能活性差异是 CTLA-4 ECD 区结构域中所为氨基酸变化 ( 即， 氨基酸取代 ) 的直接结果。此类本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白与， 例如， ( 它包括经修饰的 IgG1 Fc) 间的功能活性差异并不是其个别 Ig Fc 多肽序列中差异的结 果。
     据信， 根据本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白与 LEA29Y-Ig 和 / 或 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白在活体外测定中阻抑或抑制 T 细胞增殖的较高能力相比， 此类 突变蛋白应亦在活体内的治疗和 / 或预防方法中具有与 LEA29Y-Ig、 和/或 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白相比的较高免疫抑制强度。每个此类本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白据信在活体内的预防或应用中具有相对于 LEA29Y-Ig、 和/或 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白的较高能力而阻抑或抑制 T 细胞增殖， 诸如， 在， 如， 用于在受试者 体内阻抑或抑制一种免疫反应的治疗和 / 或预防方法 ( 例如， 在哺乳动物 ( 诸如， 如， 人类 ) 体内的免疫系统疾病或病症的活体内治疗中 )、 用于阻抑或抑制受试者 ( 例如， 哺乳动物， 诸如， 如， 人类 ) 对于来自供方的组织或器官移植排斥的方法和 / 或本文他处所述的其他治 疗或诊断方法。
     应用相同的统计测定， 兹发现， 在 融合蛋白 ( 它包括人类 CTLA-4ECD- 突 变 IgG1) 及人类 CTLA-4-IgG2 间并无统计差异。因此， 据信此类分子 Ig 结构域间的差异 ( 即， 融合蛋白的突变 IgG1 与 hCTLA-4-IgG2 的人类 IgG2) 并不会影响此类分 子的功能性。见图 11。随着渐增剂量的 融合蛋白所观察到的增殖阻抑并未显著 不同于以 CTLA-4-IgG2 所观察到的， 此指出它们对应的免疫抑制活性并不会根据其不同的 IgG 同种型而有所偏移， 而是由其 hCTLA-4 ECD 多肽所造成。因此， 本发明突变 CTLA-4-Ig 多肽与 融合蛋白 ( 或 LEA29Y-Ig， 因其与 蛋白含有相同的 Ig) 间的不 同免疫抑制活性并不可归因于它包括不同 IgG 同种型的个别 Fc 区结构域。
     本发明包括单体突变 CTLA-4 ECD 蛋白， 其具有能力， 并且在一些情形下， 具有大于 单体人类 CTLA-4 蛋白或其细胞外结构域的更大的能力， 以阻抑或抑制 T 细胞的活化或增 殖。它还提供单体突变 CTLA-4 ECD 融合蛋白， 其具有能力， 并且在一些情形下， 具有大于单 体 hCTLA-4 Ig 蛋白或其细胞外结构域的更大的能力， 以阻抑或抑制 T 细胞的活化或增殖。 它还包括突变 CTLA-4 ECD 蛋白， 其具有能力， 并且在一些情形下， 具有大于包括两个人类 CTLA-4 细胞外结构域的二聚体的更大的能力， 以阻抑或抑制 T 细胞的活化或增殖。一些本 发明突变 CTLA-4 ECD 融合蛋白二聚体 ( 例如， 突变 CTLA-4-ECD-Ig 融合蛋白二聚体 ) 具有 能力， 并且在一些情形下， 具有大于 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白二聚体、 融合蛋白二 聚体、 和 / 或 LEA29YIg 融合蛋白二聚体的更大的能力， 以阻抑或抑制 T 细胞的活化或增殖。
     实例 6 使用人类 CD4+T 细胞增殖测定而测量突变 CTLA-4-Ig 分子的生物活性 人类 CTLA-4-Ig 以及其特定变体已经显示可通过阻断 CD80 及 CD86 经由 CD28的 信 号 传 导 而 阻 抑 T 细 胞 的 增 殖 (Linsley P.S.， Immunity1 ： 793-801(1994) ； Larson C.P.et al.， Am.J.Transplant.5 ： 443-453(2005))。5 ： 443-453(2005)). 由于本发明的突 变 CTLA-4-Ig 蛋白具有改进的 CD86-Ig 配体结合亲合力， 兹发展出 CD4+T 细胞增殖测定以 测量所述突变 CTLA-4-Ig 蛋白阻断经由 CD86 的信号传导的能力。
     创造编码全长人类 CD86 蛋白的 DNA 序列
     创造质粒 pCDNA3.1 hB7.2FL， 以编码全长人类 CD86 蛋白， 而在经转染的细胞的表 面表达。通过衍生于人类白细胞 (BD Biosciences， Cat#HL4050AH) 的 cDNA 的 PCR 扩增， 使用根据其与如 SEQ ID NO ： 176 所示的 CD86- 编码核苷酸序列的序列同源性而设计的正 向及反向寡核苷酸引物产生了编码 DNA 的人类 CD86。所述引物是以一般本领域中的普通 技术人员所熟知的标准操作而设计、 制备、 及组合， 并且在需要时包括终止及起始密码予以 及限制位点。所用的 PCR 扩增操作亦为本领域中所熟知。此类技术说明于， 如， Berger、 Ausubel 及 Sambrook， 皆为以上说明文献。使用 50 纳克 (ng) 的 cDNA 作为模板， 在 100μl 的 PCR 反应中， 以 1μM 正向及反向引物、 Herculase 聚合酶缓冲液 (Stratagene ； #600260) 及 200μMdNTPs， 进 行 30 个 扩 增 循 环 (94 ℃， 30s ； 50 ℃， 30s ； 72 ℃， 60s)。 将 该 PCR 产 物 以 QiaQuick PCR 离心柱子 (Qiagen#28106) 纯化， 并以限制酶 KpnI 及 NotI 进行酶切消 化。以琼脂糖凝胶电泳分离所述片段， 使用 Qiaquick 凝胶提取试剂盒 (Qiagen， #28704) 而根据制造商的建议条件进行纯化， 再使其接合进入经类似酶切消化的质粒 pCDNA 3.1(+) (Invitrogen， Cat.#V790-20) 中。根据制造商的建议条件， 使连接物类转化进入 TOP10 大 肠杆菌细胞 (Qiagen， Cat.#C4040-10) 中。使所述经转化的细胞， 在含有 50μg/ml 羧苄青 霉素的 LB(Luria 液态培养基 ) 中， 于 37℃下并以 250rpm 震荡， 进行过夜孵育， 并接着根据 制造商的建议条件， 以其制备质粒 DNA 的 maxiprep(Qiagen ； #12362) 贮液。
     该全长人类 CD86 蛋白的预测氨基酸序列如 SEQ ID NO ： 175 所示。在此序列中， 氨 基酸残基 1-23 是预测的信号序列， 氨基酸残基 24-241 包括人类 CD86 细胞外结构域， 氨基 酸残基 242-270 包括跨膜结构域， 并且氨基酸残基 271-329 包括胞质域。
     创造在细胞表面表达人类 CD86 的稳定细胞系
     在含有 20ml 生长培养基 ( 补充有 10 ％ FBS(Hyclone Cat.#SV30014.03) 及 1x PSG(Invitrogen， Cat.#10378-016) 的 DMEM/F12 培养基 (Invitrogen， Cat.#10565-018)) 的 T-75 烧瓶中， 使 HEK293 细胞生长至 80-90 ％汇合。以混合 60μl Fugene 6(ROCHE， #11814443001) 的 10μg 质粒 DNA(pCDNA3.1 hB7.2FL)， 根据制造商的建议条件而转染细 胞。在 37℃下于生长培养基中孵育细胞 2 天 (d)， 并接着于选择培养基 ( 含有 300μg/ml 遗传霉素 (Invitrogen， #10131-027) 的生长培养基 ) 中在 37℃下孵育 10d， 每 2d 更换培养 基。为容许进行 FACS 分选， 以 FITC- 标记性抗 -CD86 抗体 (BD Biosciences， #555)， 根据 制造商的建议条件， 染色经转染的细胞。使用门控 FITC 信号的细胞分选器 (Dako， MoFlo)， 将 CD86- 阳性细胞对应地分选进入 96 孔细胞培养板 (Sigma-Aldrich， #CLS-3596) 中， 该板 含有 200μl/ 孔的含有 25％条件培养基 ( 先前自未经转染 ( 或天然 ) 细胞培养物所收集的 生长培养基 ) 的生长培养基。在 37C 下孵育 13-19d 后， 以胰蛋白酶水解而分散细胞， 并将 其移至含有 0.5ml/ 孔的生长培养基的 24 孔培养板中。在 37℃下孵育 7d 后， 以胰蛋白酶水 解而分散细胞， 并将其移至含有 20ml 生长培养基的 T-75 烧瓶中。根据高水平的细胞表面 CD86 表达而选择终细胞系， 如使用 FACS Caliber(BD Biosciences)， 根据制造商的建议条件， 以经 FITC- 标记性抗 -CD86 抗体染色的细胞的 FACS 测定所测量。
     CD4+T 细胞增殖测定
     自人类 Buffy 蛋白壳制备物 coat preps(Stanford University Blood Center， Stanford， CA)， 使用 EasySep 人类 CD4 阳性选择试剂盒 (StemCellTechnologies， #18052R)， 以磁性细胞分离器 (RoboSep， StemCellTechnologies， #20000)， 根据制造商的建议， 使 + CD4 T 细胞富集至＞ 96 ％。以补充有 10 ％ FBS(Hyclone SV30014.03) 的 Yssel 氏培养基 (GeminiBio-Products， #400-102)， 将经富集的 CD4+T 细胞调整至 1x106 个细胞 /ml 的密 度， 并以 50μl/ 孔加入 96 孔组织培养板中。对于表达膜连人类 CD86 的 HEK293 细胞以 6000rads(Stanford Research Institute， Menlo Park， CA) 进行辐射照射， 以该相同培养 6 基调整至 1x10 个细胞 /ml， 再以 50μl/ 孔加入培养板中。以该相同培养基是列稀释试验 化合物， 并以三重试验形式加入所述孔中。添加小鼠抗 - 人类 CD3 抗体 (BD Pharmingen ： 555329) 至 5μg/ml 的终浓度以起始细胞增殖。在 37℃下孵育 3d 后， 以 1/ 孔的浓度加入 3 H 胸苷 (GE Healthcare， #TRK758-5MCI)， 再使所述试验板在 37℃下孵育额外 18hr。使用 细胞收集器 (Perkin Elmer Filter Harvester D961962) 收集细胞， 并根据制造商的建议 3 条件， 使用液体闪烁计数器 (Wallac Trilux 1450) 测量 H 胸苷。使用可变斜率方程式
     (Y ＝底值 +( 顶值 - 底值 )/(1+10^((LogIC50-X)( 斜率 )))， 以 GraphPadPrism 5 软件测定细胞增殖数据， 以产生各试验化合物的 IC50。术语 “(LogIC50-X)( 斜率 )” 是该方 程式中的一指数。
     图 7 显示取自涉及示例性本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白组 ( 即， D3-04-IgG2、 + D3-11-IgG2、 D3-12-IgG2、 及 D3-14-IgG2 融合蛋白 ) 的代表性 CD4 T 细胞增殖测定的细胞 增殖曲线。它包括 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白作为对照组以进行比较。该图是 3H 胸 腺嘧啶核苷掺入 (cpm) 对蛋白浓度 (nM) 的作图。3H 胸腺嘧啶核苷掺入是细胞增殖程度的 指标， 并且是以标准技术测量。此类结果说明， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有显著 大于 和 / 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白的较高强度或更大的能力， 以在活体外阻抑或抑 制 CD86 共刺激。
     兹对诸多其他本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白进行此 CD4+T 细胞增殖测定。 表7 提供代表性本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白组的数据摘要。 表 7 提出示例性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白相对对照组 ( LEA29Y-Ig、 及人类 CTLA-4-IgG2 融合蛋白 ) 使用该 + CD4 T 细胞增殖测定的平均 IC50 值 ( 纳摩尔浓度 (nM)) 的比较。将取自个别实验的 IC50 值进行平均以提供平均 IC50 值， 其再用于进行统计测定。术语 “SD( 平均 logIC50)” 表示 平均 log IC50 值的标准偏差。
     表 7 示例性 CD4+T 细胞增殖测定的数据摘要
     1 表 7 中的上标注记如下 ： 与 Orencia 的统计差异为 p ＜ 0.05， 如以单因子 ANOVA 2 及事后比较 Dunnett 试验测定。 与 LEA 的统计差异为 p ＜ 0.05， 如以单因子 ANOVA 事后 比较 Bonferroni 试验测定。包括 D3-02 突变 CTLA-4ECD 的融合蛋白仅试验一次， 并因此无 法进行统计比较。
     统计测定显示， 在至少两次不同测定中试验并以上标注记 (1) 指明 ( 见表 7) 的所 有突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白皆在强度上统计优于 及 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白 (p ＜ 0.05)( 即， 具有大于 及 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白的更大的能力， 以在活体外的
     CD4+T 细胞测定中阻抑或抑制 T 细胞的增殖 )。所述以上标注记 (2) 指明的 ( 见表 7) 亦在 强度上统计优于 LEA29Y-Ig 融合蛋白 (p ＜ 0.05)( 即， 具有大于 LEA29Y-Ig 融合蛋白的更 + 大的能力， 以在活体外的 CD4 T 细胞测定中阻抑或抑制 T 细胞的增殖 )， 如以上文所讨论的 单因子 ANOVA 及事后比较 Dunnett 及 Bonferroni 试验测定。在包括经修饰的 IgG1 Fc( 例 如于 中 ) 或野生型 IgG2 Fc( 例如于 hCTLA4-IgG2 中 ) 的人类 CTLA-4 融合蛋白 间并无统计差异。此类发现说明， 表 7 所示本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 它包括人类 IgG2 Fc) 与 或 hCTLA4-IgG2 间的功能活性差异是 CTLA-4ECD 区结构域中所为氨 基酸变化 ( 即， 氨基酸取代 ) 的直接结果。此类本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白与， 例如， ( 它包括经修饰的 IgG1 Fc) 间的功能活性差异并不是其个别 Ig Fc 多肽序列中 差异的结果。
     据 信， 根 据 本 发 明 的 突 变 CTLA-4-Ig 融 合 蛋 白 与 LEA29Y-Ig、 和/ 或 hCTLA-4-IgG2 融合蛋白相比在活体外测定中阻抑或抑制 CD86-mediated 共刺激 of T cells(e.g.， human T cells) 的较高能力， 此类突变蛋白应亦在活体内的治疗和 / 或预防方 法或应用中具有对应地与 LEA29Y-Ig、 和 / 或人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白 ( 例如， 人类 CTLA-4-IgG2 融合蛋白 ( “hCTLA-4-IgG2” )) 相比的较高免疫抑制强度。 在一个方面， 本 发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白据信在活体内的方法或应用中具有对应地与 LEA29Y-Ig、 和 / 或人类 CTLA-4-Ig( 例如， hCTLA-4-IgG2) 融合蛋白相比的较高能力而阻抑 或抑制 T 细胞 ( 例如， 人类 T 细胞 ) 的 CD86- 介导性共刺激， 诸如， 在， 如， 用于在受试者体 内阻抑或抑制一种免疫反应的治疗和 / 或预防方法 ( 例如， 在哺乳动物 ( 诸如， 如， 人类 ) 体内的免疫系统疾病或病症的活体内治疗中 )、 用于阻抑或抑制受试者 ( 例如， 哺乳动物， 诸如， 如， 人类 ) 对于来自供方的组织或器官移植排斥的方法、 和 / 或本文他处所述的其他 治疗或诊断方法。
     实例 7
     使用人类 PBMC 增殖测定 ( 回忆抗原刺激 ) 而测量突变 CTLA-4-Ig 分子的生物活 性
     记 忆 T 细 胞 的 活 化 是 自 体 免 疫 力 的 一 重 要 方 面 (Rogers N.J， ， et al.Eur. J.Immunol 35 ： 2909-2919(2005))。为测量突变 CTLA-4-Ig 蛋白在此方面中的免疫抑制活 性， 兹使用 PPD 抗原刺激而发展周边血液单核细胞 (PBMC) 增殖测定。
     以等体积的 PBS 稀释人血 ( 由供方的计划新鲜收集 )， 再使用 Histopaque(Sigma， #10771)Ficoll 梯 度， 根 据 制 造 商 的 建 议 条 件 进 行 分 级 分 离 以 分 离 PBMCs。 以 补 充 有 10 ％ FBS(Hyclone#SV30014.03) 及 1x PSG( 青 霉 素、 链 霉 素 及 谷 氨 酰 胺 )(Invitrogen， #10378-016) 的 RPMI 培养基 (Sigma， #R8758) 稀释 PBMCs， 再以 1x105 细胞 / 孔的密度， 加入 96 孔培养板 (BDBiosciences， #353077) 中。以该相同培养基是列稀释试验化合物， 并以四 重试验形式加入所述孔中。添加 PPD 抗原 ( 取自结核杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis， Mycos， #P-1000-001) 的纯化蛋白衍生物 ) 至 5μg/ml 的终浓度以起始细胞增殖。在 37℃ 下孵育 5d 后， 以 1μCi/ 孔的浓度加入 3H 胸苷 (GE Healthcare， #TRK758-5MCI)， 再使所述 试验板在 37℃下孵育额外 18hr。以细胞收集器 (FilterMate Omnifilter-96Harvester， Perkin Elmer)， 使用制造商的建议条件而收集细胞， 并使用闪烁计数器 (Wallac Trilux， 3 #1450-421) 测量 H 胸苷的纳入。 使用非线性回归曲线拟合模式 (S 型剂量反应， 可变斜率 )及最小平方拟合法， 以 GraphPad Prism 5 软件测定细胞增殖数据。 报告了 IC50( 或 “IC50” ) 参数及其相关的 95％信赖区间。
     图 8 显 示 取 自 涉 及 示 例 性 本 发 明 突 变 CTLA-4-Ig 融 合 蛋 白 组 ( 即， D3-IgG2、 D3-12-IgG2、 D3-17-IgG2 及 D3-29-IgG2 融合蛋白 ) 的代表性 PBMC 增殖测定的细胞增殖曲 线。它包括 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白作为对照组以进行比较。该图是 3H 胸腺嘧啶 核苷掺入 (cpm) 对蛋白浓度 (nM) 的作图。3H 胸腺嘧啶核苷掺入 ( 其是细胞增殖程度的指 标 ) 是以标准技术测量。此类结果说明， 在一个方面， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具 有显著大于 和 / 或 LEA29Y-Ig 蛋白的较高强度， 以在活体外阻抑或抑制记忆 T 细 胞的增殖 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有大于 和 / 或 LEA29Y-Ig 蛋白的更 大的能力， 以在人类 PBMC 增殖测定 ( 回忆抗原刺激 ) 中， 在活体外阻抑或抑制记忆 T 细胞 的增殖 )。
     兹使用其他本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白进行此使用 PPD 抗原刺激的 PBMC 增殖测定。表 8 提供代表性本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白组的数据摘要。表 8 提出示例 性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白相对对照组 ( 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白 ) 使用该以回忆 抗原刺激的 PBMC 增殖测定的平均 IC50 值 ( 纳摩尔浓度 (nM)) 的比较。将取自个别实验的 IC50 值进行平均以提供平均 IC50 值， 其再用于进行统计测定。术语 “SD( 平均 log IC50)” 表示平均 log IC50 值的标准偏差。
     表 8. 使用 PPD 抗原刺激的示例性 PBMC 增殖测定的数据摘要
     注记 ： 表 8 中的术语 “NA” 意思指 “未获得” 。
     统计测定显示， 在所有试验的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白皆在强度上统计优于 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白两者， 其 p ＜ 0.05， 如对应地以上文所讨论的单因子 ANOVA 及事后比较 Dunnett 及 Bonferroni 试验测定 ( 即， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有大 于 和 / 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白的更大的能力， 以在人类 PBMC 增殖测定 ( 回忆抗 原刺激 ) 中， 在活体外阻抑或抑制记忆 T 细胞的增殖 )。
     据信， 根据本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白与 和 / 或 LEA29Y-Ig 融 合蛋白相比在活体外测定中阻抑或抑制记忆 T 细胞 ( 例如， 人类记忆 T 细胞 ) 增殖的较 高能力， 此类突变蛋白应亦在活体内的治疗和 / 或预防方法或应用中具有与 LEA29Y-Ig 和 / 或人类 CTLA-4-Ig( 例如， 人类 CTLA-4-IgG2) 融合蛋白相比的较高免疫抑制 强度。在一个方面， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白据信在活体内的方法或应用中具有 与 LEA29Y-Ig 和 / 或人类 CTLA-4-Ig( 例如， CTLA-4-IgG2) 融合蛋白相比的较高 能力而阻抑或抑制记忆 T 细胞 ( 例如， 人类记忆 T 细胞 ) 的增殖， 诸如， 在， 如， 用于在受试 者体内阻抑或抑制一种免疫反应的治疗和 / 或预防方法 ( 例如， 在哺乳动物 ( 诸如， 如， 人 类 ) 体内的免疫系统疾病或病症的活体内治疗中 )、 用于阻抑受方 ( 例如， 哺乳动物， 诸如， 如， 人类 ) 对于来自供方的组织或器官移植排斥的方法、 和 / 或本文他处所述的其他治疗或 诊断方法。
     实例 8
     使用人类 MLR( 混合淋巴细胞反应 ) 测定而测量突变 CTLA-4-Ig 分子的生物活性
     CTLA-4-Ig 以及其特定变体是试管中初级同种异体反应的强阻抑剂 (Vaughan， A.N.et al.， J.Immunol.165 ： 3175-3181(2000) ； Wallace P.M.， et al.， Transplantation 58 ： 602-610(1994))。 为在此类测定中测量突变 CTLA-4-Ig 蛋白的改进活性， 兹发展出人类 混合淋巴细胞反应 (MLR) 测定。
     以等体积的 PBS 稀释人血 ( 由供方的计划新鲜收集 )， 再使用 Histopaque(Sigma， #10771)Ficoll 梯度， 根据制造商的建议条件进行分级分离以分离 PBMCs。以补充有 10％ FBS(Hyclone#SV30014.03) 及 1x PSG(Invitrogen， #10378-016) 的 RPMI 培养基 (Sigma， 5 #R8758) 稀 释 取 自 一 供 方 的 PBMC， 再 以 1x10 细 胞 / 孔 的 密 度， 加 入 96 孔 培 养 板 (BD Biosciences， #353077) 中。对于取自取自一不同供方的 PBMC 以 2500rads 进行辐射照射， 以该相同培养基稀释， 再以 1x105 细胞 / 孔的密度， 加入该相同培养板中。以该相同培养基 是列稀释试验化合物， 并以四重试验形式加入所述孔中。在 37℃下孵育 5d 后， 以 1μCi/ 3 孔的浓度加入 H 胸苷 (GE Healthcare， #TRK758-5MCI)， 再使所述试验板在 37℃下孵育额 外 18hr。以细胞收集器 (FilterMate Omnifilter-96Harvester， Perkin Elmer)， 使用制 造商的建议条件而收集细胞， 并使用闪烁计数器 (Wallac Trilux， #1450-421) 测量 3H 胸苷 的纳入。使用非线性回归曲线拟合模式 (S 型剂量反应， 可变斜率 ) 及最小平方拟合法， 以 GraphPad Prism 5 软件测定细胞增殖数据。报告了 IC50 参数及其相关的 95％信赖区间。
     图 9 显示取自涉及示例性本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 D3-IgG2 的代表性 MLR 增殖测定的细胞增殖曲线。它包括 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白作为对照组以进行比 3 较。该图是 H 胸腺嘧啶核苷掺入 (cpm) 对蛋白浓度 (nM) 的作图。3H 胸腺嘧啶核苷掺入 ( 其是细胞增殖程度的指标 ) 是以标准技术测量。此类结果说明， D3-IgG2 具有显著大于和 / 或 LEA29Y-Ig 蛋白的较高强度， 以在活体外测定中阻抑或抑制 T 细胞的初级 同种异体刺激 ( 例如， D3-IgG2 具有大于 或 LEA29Y-Ig 蛋白的更大的能力， 以在 活体外的 MLR 测定中阻抑或抑制 T 细胞增殖的初级同种异体刺激 )。
     兹对诸多其他本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白进行此 MLR 测定。表 9 提供代表 性本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白组的数据摘要。表 9 提出示例性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋 白相对引用对照组 ( 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白 ) 在该 MLR 测定中的平均 IC50 值 ( 纳摩尔浓度 (nM)) 的比较。将取自个别实验的 IC50 值进行平均以提供平均 IC50 值， 其再 用于进行统计测定。术语 “SD( 平均 log IC50)” 表示平均 log IC50 值的标准偏差。如表 9 所示的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白的平均 IC50 值低于 及 LEA29Y-Ig 融合蛋白个 别的平均 IC50 值。
     在 一 个 方 面， 本 发 明 提 供 突 变 CTLA-4-Ig 融 合 蛋 白， 其据信在强度上优于 和 / 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白的强度的 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 其据信 具有大于 和 / 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白的更大的能力， 以在活体外的 MLR 测定中阻 抑或抑制 T 细胞增殖的初级同种异体刺激 )。
     据信， 根据本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白与 和 / 或 LEA29Y-Ig 融 合蛋白相比在活体外测定中阻抑或抑制 T 细胞 ( 例如， 人类记忆 T 细胞 ) 初级同种异体刺 激的预期增强能力， 此类突变蛋白应亦在活体内的治疗和 / 或预防方法或应用中具有与 和 / 或 LEA29Y-Ig 融合蛋白相比的较高免疫抑制强度。
     在 一 个 方 面， 本 发 明 的 突 变 CTLA-4-Ig 融 合 蛋 白 具 有 显 著 大 于 LEA29Y-Ig、 和 / 或 人 类 CTLA-4-Ig( 例 如， 人 类 CTLA-4-IgG2) 融 合 蛋 白 的 较 高 强 度， 以 在活体外阻抑或抑制 T 细胞的初级同种异体刺激 ( 例如， 突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白具有 大于 LEA29Y-Ig、 和 / 或人类 CTLA-4-Ig 融合蛋白的更大的能力， 以在活体外 的 MLR 测定中阻抑或抑制 T 细胞增殖的初级同种异体刺激 )。在一个方面， 本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白据信在活体内的方法或应用中具有与 LEA29Y-Ig 和 / 或人 类 CTLA-4-Ig 融合蛋白相比的更大的能力而阻抑或抑制 T 细胞 ( 例如， 人类 T 细胞 ) 的初 级同种异体刺激， 诸如， 在， 如， 用于在受试者体内阻抑或抑制一种免疫反应的治疗和 / 或 预防方法 ( 例如， 在哺乳动物 ( 诸如， 如， 人类 ) 体内的免疫系统疾病或病症的活体内治疗 中 )、 用于阻抑或抑制受试者 ( 例如， 哺乳动物， 诸如， 如， 人类 ) 对于来自供方的组织或器官 移植排斥的方法、 和 / 或本文他处所述的其他治疗或诊断方法。
     表 9 示例性 NLR 测定的数据摘要
     注记 ： 表 9 中的术语 “NA” 意思指 “未获得” 。
     实例 9
     可如下而以可溶性的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白治疗罹患类风湿性关节炎的成人 病患。制备一种药物组合物， 该组合物包括可溶性的本发明突变 CTLA-4-Ig 融合以及药学 上可接受的赋形剂或载体 ( 例如， PBS)。 示例性的可溶性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白包括以一 个或多个二硫键彼此连结的两个相同单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 其中每个这种单体融 合蛋白包括本发明的突变 CTLA-4ECD 多肽， 该多肽包括选自 SEQ ID NOS ： 1-73 中任何一个 多肽序列， 在其 C- 端融合人类 IgG2Fc 多肽的 N- 端。 示例性的融合蛋白包括所述包括如 SEQ ID NOS ： 74-79、 197-200、 205-214 及 219-222 中任何一个多肽序列所示的。此类融合蛋白 典型地是以二聚体形式表达。该融合蛋白于该药物组合物中的浓度可为介于从约 0.05mg/ ml 至约 200mg/ml、 从约 1mg/ml 至约 150mg/ml、 从约 25mg/ml 至约 120mg/ml、 从约 1mg/ml 至约 100mg/ml、 从约 25mg/ml 至约 100mg/ml、 从约 50mg/ml 至约 100mg/ml、 从约 50mg/ml 至 约 75mg/ml、 从约 100mg/ml 至约 150mg/ml 及其类似的。例如， 该融合蛋白于该药物组合物 中的浓度可为约 1mg/ml、 5mg/ml、 10mg/ml、 15mg/ml、 25mg/ml、 30mg/ml、 40mg/ml、 50mg/ml、 60mg/ml、 70mg/ml、 80mg/ml、 90mg/ml、 100mg/ml、 150mg/ml、 或 200mg/ml。 这种药物组合物的 pH 是约 pH 4 至约 pH 10， 包括， 约 pH 5 至约 pH 9、 约 pH 6.5 至约 pH 8.5， 优选地为约 pH 6.0 至 pH 8.0、 约 6.5 至 pH 7.5、 或约 pH 7.0 至约 pH 8.0。
     该病患类风湿性关节炎的治疗是通过以静脉或皮下注射而对该病患给予治疗 有 效 量 的 突 变 CTLA-4-Ig( 例 如， 有 效 剂 量 ) 而 进 行。 该 注 射 位 点 可 为， 如， 该病患的 手 臂、 躯 干、 或 腿。 该 给 药 的 突 变 CTLA-4-Ig 融 合 蛋 白 有 效 剂 量 典 型 地 是， 但 不 限 于， 如， 从 约 0.01mg/kg 至 约 100mg/kg 该 成 人 病 患 体 重， 诸 如， 如， 从 约 0.01-5.0mg/kg、 约 0.01-3.0mg/kg、 约 0.05-2.5mg/kg、 约 0.1-2.0mg/kg、 约 0.1-1.0mg/kg、 约 0.01-0.05mg/
     kg、 约 0.5-1.5mg/kg、 约 1.0-4.0mg/kg、 约 1.0-3.0mg/kg、 约 1.0-2.0mg/kg， 它包括， 但不限 于， 对该病患给予约 0.01mg/kg、 0.05mg/kg、 0.075mg/kg、 0.1mg/kg、 0.15mg/kg、 0.2mg/kg、 0.25mg/kg、 0.3mg/kg、 0.5mg/kg、 0.75mg/kg、 1mg/kg、 1.25mg/ml、 1.5mg/kg、 2mg/kg、 2.5mg/ kg、 3mg/kg、 4mg/kg、 5mg/kg、 10mg/kg、 20mg/kg、 25mg/kg、 50mg/kg、 75mg/kg、 或 100mg/kg 该 病患体重。 可替代地， 可使用说明于上文 “本发明的方法” 章节的有效量或剂量或剂量范围。 该待给予的融合蛋白剂量是根据该融合蛋白的强度和 / 或该病患类风湿性关节炎的症状 或征兆的严重性而判定。对于该病患所给予的总突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白量可为， 如， 从约 0.01mg 至约 100mg， 典型地是从约 1mg 至 100mg、 从约 10mg 至 100mg、 从约 10mg 至约 75mg、 或从约 10 至约 50mg。对该病患所给予的药物组合物体积是根据该融合蛋白在该组合物中 的浓度以及待给予的融合蛋白剂量而判定。就皮下注射而言， 典型地可以注射给予 1 至 2 毫升包括该融合蛋白的药物组合物。就静脉注射而言， 它可给予适当体积的包括该融合蛋 白的药物组合物。
     在起始剂量的注射后， 可在， 如， 该起始剂量的 1、 2、 3、 或 4 周后， 经由皮下 ( 例如， s.c. 注射 ) 或静脉内 ( 例如， i.v. 注射 ) 而对该病患给予第二相同剂量的融合蛋白。该剂 量时程可为每两周一剂、 一剂 / 月、 每两个月一剂等， 根据， 如， 该病患的病况而定。后续的 剂量可随需要而每四周或以较高或较低的频率进行给药。 剂量的频率可取决于该病患的病 况而各异， 并可取决于该病患类风湿性关节炎症状或征兆的严重性。
     在一示例性的方面中， 其是根据该病患的条件以及对该药物的反应， 随需要而每 周一次或每月一次， 对罹患类风湿性关节炎的人类， 以皮下注射， 给药足以提供约 0.5mg/ kg 体重的融合蛋白二聚体剂量的包括本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 ( 诸如， D3-29-IgG2、 D3-54-IgG2、 D3-56-IgG2、 D3-69-IgG2 等 ) 以及药物的可接受性赋形剂的药物 组合物量。
     在另一示例性的方面中， 其是根据该病患的条件以及对该药物的反应， 随需要而 每周一次或每月一次， 对罹患类风湿性关节炎的人类， 经由静脉内而给药足以提供约 10mg/ kg 体重的融合蛋白二聚体剂量的包括本发明突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白二聚体 ( 诸如， D3-29-IgG2、 D3-54-IgG2、 D3-56-IgG2、 D3-69-IgG2 等 ) 以及药物的可接受性赋形剂的药物 组合物量。可使用标准的 i.v. 操作而进行这种给药。例如， 可使该药物组合物结合另一液 体而输液进入该人体内， 诸如， 无菌的盐水溶液、 葡萄糖溶液或其他等渗溶液， 经由标准的 静脉进入装置而使用标准的连续静脉滴液进行。
     每个以上说明以 s.c. 或 i.v. 注射所进行的治疗方法预期可减少或减轻该病患体 内一种或多种与类风湿性关节炎相关的征兆、 症状、 或生物反应， 诸如， 如， 炎症、 关节压痛、 关节肿胀、 疼痛、 组织萎缩、 及僵硬。 这种治疗可降低该疾病在该病患体内的进一步进展， 特 别是在结缔、 肌肉、 及骨骼组织中。 例如， 这种治疗可降低该病患体内结缔组织、 萎缩肌肉组 织、 骨骼、 关节、 软骨、 和 / 或脊柱及其类似的损伤或恶化的进展。其他该疾病的临床症状， 包括对于皮肤、 中枢神经系统或器官所造成的损伤， 也可获得减少或减轻。 这种治疗也可改 善该病患的身体机能。 实例 10
     可如下而以可溶性的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白治疗正在进行用于预防器官移植 排斥的维持治疗的成人病患。制备一种药物组合物， 该组合物包括可溶性的本发明突变
     CTLA-4-Ig 融合以及药学上可接受的赋形剂或载体 ( 例如， PBS 或其类似的 )。示例性的 可溶性突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白包括以一个或多个二硫键彼此连结的两个相同单体突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白， 其中每个这种单体融合蛋白包括本发明的突变 CTLA-4ECD 多肽， 该 多肽包括选自 SEQ ID NOS ： 1-73 中任何一个多肽序列， 在其 C- 端融合人类 IgG2Fc 多肽的 N- 端。 示例性的融合蛋白包括所述包括如 SEQ ID NOS ： 74-79、 197-200、 205-214 及 219-222 中任何一个多肽序列所示的。该融合蛋白于该药物组合物中的浓度可为介于从约 0.05mg/ ml 至约 200mg/ml、 从约 1mg/ml 至约 150mg/ml、 从约 25mg/ml 至约 120mg/ml、 从约 1mg/ml 至约 100mg/ml、 从约 25mg/ml 至约 100mg/ml、 从约 50mg/ml 至约 100mg/ml、 从约 50mg/ml 至 约 75mg/ml、 从约 100mg/ml 至约 150mg/ml 及其类似的。例如， 该融合蛋白于该药物组合物 中的浓度可为约 1mg/ml、 5mg/ml、 10mg/ml、 15mg/ml、 25mg/ml、 30mg/ml、 40mg/ml、 50mg/ml、 60mg/ml、 70mg/ml、 80mg/ml、 90mg/ml、 100mg/ml、 150mg/ml、 或 200mg/ml。这种药物组合物 的 pH 是约 pH 4 至约 pH 10， 包括， 约 pH 5 至约 pH 9、 约 pH6.5 至约 pH 8.5， 优选地为约 pH 6.0 至 pH 8.0、 约 6.5 至 pH 7.5 或约 pH 7.0 至约 pH 8.0。
     用于预防或阻抑器官移植排斥的维持治疗是通过以静脉或皮下注射而对已接受 器官移植 ( 例如， 肾脏移植 ) 的病患给予治疗有效量的突变 CTLA-4-Ig( 例如， 有效剂量 ) 如， 该病患的手臂、 躯干、 或腿。该给药的突变 CTLA-4-Ig 融合 而进行。该注射位点可为， 蛋白有效剂量典型地是， 但不限于， 如， 从约 0.01mg/kg 至约 100mg/kg 该成人病患体重， 诸 如， 如， 从 约 0.01-5.0mg/kg、 约 0.01-3.0mg/kg、 约 0.05-2.5mg/kg、 约 0.1-2.0mg/kg、 约 0.1-1.0mg/kg、 约 0.01-0.05mg/kg、 约 0.5-1.5mg/kg、 约 1.0-4.0mg/kg、 约 1.0-3.0mg/ kg、 约 1.0-2.0mg/kg， 它包括， 但不限于， 对该病患给予约 0.01mg/kg、 0.05mg/kg、 0.075mg/ kg、 0.1mg/kg、 0.15mg/kg、 0.2mg/kg、 0.25mg/kg、 0.3mg/kg、 0.5mg/kg、 0.75mg/kg、 1mg/kg、 1.25mg/ml、 1.5mg/kg、 2mg/kg、 2.5mg/kg、 3mg/kg、 4mg/kg、 5mg/kg、 10mg/kg、 20mg/kg、 25mg/ kg、 50mg/kg、 75mg/kg、 或 100mg/kg 该病患体重。可替代地， 可使用说明于上文 “本发明的 方法” 章节的有效量或剂量或剂量范围。该待给予的融合蛋白剂量是根据该融合蛋白的强 度和 / 或该病患器官移植排斥的症状或征兆的严重性而判定。对于该病患所给予的总突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白量可为， 如， 从约 0.01mg 至约 100mg， 典型地是从约 1mg 至 100mg、 从约 10mg 至 100mg、 从约 10mg 至约 75mg 或从约 10 至约 50mg。对该病患所给予的药物组合物体 积是根据该融合蛋白在该组合物中的浓度以及待给予的融合蛋白剂量而判定。 该融合蛋白 可在移植后的任何天数给予， 如， 移植后的第 1、 4、 7、 14、 28、 56、 84 天等。就皮下注射而言， 典型地可给予 1 至 2 毫升的药物组合物。就静脉注射而言， 它可给予适当体积的包括该融 合蛋白的药物组合物。
     在起始剂量的注射后， 可在， 如， 该起始剂量的 1、 2、 3、 或 4 周后， 经由皮下或静脉 内而对该病患给予第二相同剂量的融合蛋白。该剂量时程可为每两周一剂、 一剂 / 月、 每两 个月一剂等， 根据， 如， 该病患的病况而定。后续的剂量可随需要而每四周或以较高或较低 的频率进行给药， 并且若希望可以每月的基础而继续进行。剂量的频率可取决于该病患的 病况而各异， 并可取决于该病患器官移植排斥症状或征兆的严重性。
     这种治疗预期可减少或减轻该病患体内一种或多种与器官移植排斥相关的征兆、 症状、 或生物反应， 诸如， 如， 移植器官的急性排斥、 移植器官的慢性排斥、 移植器官的功能 降低、 该病患体内血清肌酸酐含量的增加、 和 / 或 T 细胞进入该移植器官的较高浸润情形。这种治疗可降低该移植器官由该病患的免疫系统排斥的可能性。
     实例 11
     突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白在大鼠体内的药物代谢动力评估
     药剂在对一活生物体进行外来给予的后的血清浓度会大量影响其治疗功效， 并且 它可由药物代谢动力学 (PK) 评估判定。在下列操作中， 它在大鼠体内， 与 hCTLA-4-IgG2 及 融合蛋白试验物两者相比， 评估代表性突变 CTLA-4-IgG2 试验物 D3-29-IgG2、 D3-54-IgG2、 D3-56-IgG2、 D3-69-IgG2 及 D3-75-IgG2 的 PK 曲线。该实验设计、 数据产生及 释意说明于后文。
     活体内研究设计
     在至少 5 天的适应期后， 使用重量相符的雄性 Hans Wistar 大鼠。 根据其体重而计 算个别动物的试验物剂量体积， 因此使得其皆接受 1mg/kg 的试验物。因此， 典型的 150 克 (g) 大鼠即接受 150μl 的剂量体积， 因每个试验物皆是在 PBS 中以 1mg/ml 制备。以静脉内 (i.v. 或 IV) 的团剂， 或试剂经由皮下 ( 缩写为 “s.c.” 或 “SC” ) 途径， 递送以上说明突变 CTLA-4-IgG2 试验物、 hCTLA-4IgG2 或 融合蛋白的单一给药。该试验的大小足以 进行每个时间点最少四次的 300μl 血液取样， 同时抑制自任何特定大鼠所取出的血液体 积不超过其 10％总血液体积。血液取样的时程就 i.v. 及 s.c. 给药而言对应地为取样前、 取样后 5 分钟 (min)、 30min、 2 小时 (h)、 4h、 8h、 1 天 (d)、 2d、 3d、 4d、 6d、 8d、 10d、 12d 及 14d， 或取样后 5min、 30min、 2h、 4h、 8h、 1d、 2d、 3d、 4d、 6d、 8d、 10d、 11d、 12d、 13d、 14d 及 15d。自每 个血液样本中制备血清， 并以 ELISA 试验以定量经给药试验物的存在。
     PK ELISA 法
     使存在于所述血清样本中的突变 CTLA-4-IgG2、 hCTLA-4IgG2、 或 融合 蛋白与预先涂覆于微滴定板上的人类 CD80- 小鼠 IgG( 例如以上所说明 ) 进行连结。经由 添加辣根过氧化酶 (HRP) 偶联性山羊抗人类 IgG(Jackson ImmunoResearch#109-035-098) 而达成检测。经由使用显色性的 HRP 底物 3， 3’ ， 5， 5’ - 四甲基联苯胺 (TMB) 添加过氧化 氢 (Kem-En-Tec#4390A) 进行定量， 添加 0.2N 硫酸 (H2SO4) 终止反应， 再以分光亮度计而在 450nm 测量光学吸收。在添加至 ELISA 板中前， 将血清样本预稀释为 1/20， 因此使得该基质 标准化至 5％大鼠血清， 并在 5％大鼠血清中进一步稀释， 以产生总共八个稀释物。对抗使 用添加至 5％大鼠血清中的相同试验物的滴定而制备的标准曲线， 定量每个经稀释血清样 本的浓度。该标准曲线是介于自 10 至 0.078ng/ml， 并且其精确范围是判定为自 5％大鼠血 清中背景值的两倍至 5ng/ml。使用在 5％大鼠血清中以该标准曲线精确范围的高、 中、 低浓 度所制备的相同试验物的品管 (QC)， 评估该标准曲线的质量。QC 接受标准是使该观察 QC 浓度为在该预期 QC 浓度的 20％的内。经由平均所述以该标准曲线精确范围内的光学密度 (ODs) 而指定予稀释物的浓度， 产生个别未知血清样本的浓度。 使用至少 4 份个别血清样本 以计算各所列时间点的平均血清浓度。
     PK 参数
     图 15A 及 15B 显示在大鼠体内， 使用单一 (A) 静脉 (IV) 团药或 (B) 皮下 (SC) 注射 形式， 以 1mg/kg 给予的 融合蛋白、 hCTLA-4-IgG2 及突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白 的 PK 曲线。误差条代表平均值的标准偏差 (SD)。虚线代表该 ELISA 的定量下限 ( 在 100％ 血清中～ 3ng/ml 的试验物 )。在试验物于时间 0h 的给予后的每个所列时间点的平均血清浓度包括图 15 中的半 -log 浓度 - 时间曲线内容的数据点。
     使用 WinNonLin 模式 201(i.v.- 团药输入 ) 或模式 200( 血管外的输入 )， 对应地 针对该 i.v.(IV) 或 s.c.(SC) 途径， 使用平均血清浓度而产生 PK 参数。表 10 对应地摘述 s.c. 及 i.v. 给药途径的重要 PK 参数。
     表 10 使用单一 I.V. 或 S.C. 团药形式而以 1mg/kg 对大鼠给药的 融合 蛋白、 hCTLA-4-IgG2 及突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白的 PK 参数摘要
     Cmax 是指试验物的最大血清浓度。终期半寿期值 (T1/2) 是在该浓度 - 时间曲线 的终期中， 该试验物在血清中的浓度减少一半所需的以小时计的时间。血清浓度 - 时间曲 线下的面积 (AUC) 是使用梯形规则而从时间零点至无限定量。清除值 (Cl) 是使用方程式 剂量 /AUC 计算， 而终期的分布体积 (Vz) 则是使用方程式 Cl/k 计算。
     各化合物的生物可利用性因子 (F) 如表 11 所示， 并且是经由计算皮下途径的 AUC/ 静脉内途径的 AUC 而判定。
     表 11 融合蛋白、 hCTLA-4-IgG2、 D3-29-IgG2、 D3-54-IgG2、 D3-56-IgG2、 D3-69-IgG2 及 D3-75-IgG2 融合蛋白的生物可利用性比较
     化合物 Orencia CTLA-4IgG2 D3-29 D3-54 D3-56 D3-69 D3-75
     生物利用率 0.54 0.34 0.71 0.51 0.58 0.45 0.52尽管具有不同的 IgG 架构， 人类 CTLA-4IgG2 及 融合蛋白展示类似的 PK 曲线， 其说明， 当功能结构域是恒定时， 此类个别试验物中的人类 IgG2 及突变人类 IgG1 Fc 部分具有相当的 PK 活性。经由推论， 突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白与 融合蛋白相比在 PK 曲线上的任何变化因此应可归因于功能结构域中的差异而非 Fc 部分。
     就每个突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白而言， 其移除是缓慢的， 如以该长半寿期值及 曲线下的大面积而建议。 与 融合蛋白相比 ( 它在以 SC 或 IV 途径给予时对应地具 有 70.0 或 42.3 小时的半寿期 )， 其以 SC 剂量的半寿期是介于自 11.2 至 56.4hr， 并且以 IV 剂量是自 15.3 至 83.0 小时 (h)。 突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白的 AUC 值平均优于 融合蛋白。在 SC 剂量后， 其平均值是 879.5+/-281.6h*kg*ng/L/mg( 与 SC 融合 蛋白的 391h*kg*ng/L/mg 相比 )， 而 IV 给药则产生 1645.5+/-641.1h*kg*ng/L/mg 的平均 AUC 值 ( 与 IV 融合蛋白的 728h*kg*ng/L/mg 相比 )。
     两种给药途径的分布体积皆为相似， 其中突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白是分布至血 清的外但在血管外液体中， 如以 44.8ml/kg 的平均值所建议， 其是高于 30ml/kg 的血浆参照 体积， 并且是在标准大鼠的 300ml/kg 胞外液体参照抑制的内 (Davies， B.et al.， Pharm. Res.10(7) ： 1093-95(1993))。
     大 部 分 突 变 CTLA-4-IgG2 融 合 蛋 白 的 生 物 可 利 用 性 亦 为 相 似， 其平均值为 0.6+/-0.1( 相较有利于 融合蛋白的 0.53 生物可利用性 )。
     最后， 与 融合蛋白相比， 突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白的 Cmax 总体上是较 融合蛋白相比 ( 它在以 SC 或 IV 途径给予时对应地具有 3.3 或 22.3ug/L 高。与 的 Cmax 值 )， 其以 SC 剂量的 Cmax 值是介于自 4.5 至 9.3ug/L， 并且以 IV 剂量是自 20.6 至 81.9ug/L。
     整体言的， 该 PK 数据显示， 在经由 SC 或 IV 途径而以 1mg/kg 对大鼠给予时， 所有经 评估的突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白典型地具有相对 融合蛋白的非较差 PK 曲线， 并且当功能结构域是恒定时， IgG1 或 IgG2Fc 部分是为相当。
     实例 12
     此实例说明创造稳定转染细胞系以表达本发明的突变 CTLA4-Ig 融合蛋白， 使用 可用于进行该突变 CTLA4-Ig 融合蛋白的惯常实验室规模制备的细胞系进行， 并从该细胞 表达培养基中纯化该突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白。尽管此实例特定说明一种用于创造稳定转 染的 CHO-K1 细胞系以表达 D3-54-IgG2 融合蛋白的方法， 使用这种细胞以进行实验室规模 制备并自培养基中纯化该蛋白， 本文所述的方法可以任何本发明的突变 CTLA-4-Ig 融合蛋 白和 / 或上文所揭示的任何适当细胞系而使用。
     创造稳定转染细胞系
     材料
     CHO-K1 天然 ( 未转染 ) 细胞 ： 将可适应化学限定培养基中的无血清悬浮生长的 CHO-K1 细胞 ( 细胞 ID ： M4-PeM-0436-112-01) 贮存在液态氮蒸汽相中 (Dewar MVE1536P)。 解 冻 一 小 瓶 的 M4-PeM-0436-112-01， 并 在 摇 瓶 中 以 CD OptiCHOTM 培 养 基 (Invitrogen， #12681) 进行培养。所述培养物可提供用于进行转染的细胞以及用于进行生长及克隆的条 件培养基。所有的培养物皆是在 37℃、 5％ CO2 下生长。
     质粒 ： 将编码融合人类 IgG2a Fc 区结构域的 D3-54 突变 CTLA-4 ECD 的 DNA 插入 CET1019AS UCOE 载体 (Millipore) 中， 并使用该所得的质粒 CET1019AS-D3-54-IgG2 进行所 有的转染。
     细胞培养基： 在 所 有 培 养 物 中 使 用 补 充 有 2 ％ v/v 200mM L- 谷 氨 酰 胺(Invitrogen#25031) 的 CD Opti-CHO(Invitrogen#12681) 化学限定无动物组份培养基。
     条件培养基 ： 条件培养基是通过在 CD Opti-CHO 培养基中培养母 CHO-K1 细胞系而 获得。在细胞计数≥ 5x105 个细胞 /ml 时， 离心该细胞培养物， 并对该条件培养基上清液进 行无菌的过滤。每天新鲜制备条件培养基以进行使用或贮存在 2℃ -8℃下最多 7 天。
     50％条件培养基 ： 使条件培养基 ( 以上说明 ) 结合等体积的新鲜细胞培养基 ； 在 其使用的每天新鲜制备。
     测定方法
     细胞计数及存活性是以 Cedex 或 Cedex HiRes 细胞计数器 (Innovatis) 进行。
     对于表达该突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 (D3-54-IgG2) 的克隆的初始筛选是以 ELISA 进行。以 hCD80- 小鼠 Ig 融合蛋白过夜涂覆 ELISA 板。第二天， 以二重测定的方式， 使用 50- 及 200- 倍的稀释物， 将待测定的样本转移至所述 ELISA 板中。 在两小时的孵育后， 加入 抗 - 人类 IgG-HRP 抗体， 并进行孵育 30 分钟。以 TMB 对所述试验板进行显影， 并在 450nm 下视读。报导粗光学密度 (OD)。
     D3-54-IgG2 融合蛋白的定量测定是使用 Poros A/20 柱子 (ABI#1-5024-12) 而以 蛋白 A HPLC 法进行。使用两种缓冲液 ： 缓冲液 A ： 50mM 磷酸， 150mM 氯化钾， pH 7.6±0.1， 以及缓冲液 B ： 50mM 磷酸， 150mM 氯化钾， pH 2.5±0.1。两种缓冲液皆额外添加 5％异丙醇。 平衡及样本注射后的洗涤是以 42％缓冲液 A 及 58％缓冲液 B(pH 6.5) 进行。洗脱是使用 1 分钟内的 12％缓冲液 A 及 88％缓冲液 B 进行。
     操作
     使用于创造用于进行 D3-54-IgG2 融合蛋白 GMP 制备的稳定细胞系的天然黏附 CHO-K1 细胞适应进行化学限定 CD OptiCHOTM 培养基中的悬浮生长。解冻一小瓶的此类 天然 CHO-K1 细胞， 并使它在含有 CD OptiCHOTM 培养基的 125ml 摇瓶中生长至 5x105 个活 个细胞 /ml 的密度。使 2x106 个活细胞再悬浮于 400μl 的 50％条件培养基中， 并在小管 中 使 其 与 20μg 的 质 粒 DNA(D3-54-IgG2 于 CET1019AS UCEO 载 体 中 ) 结 合。 使 用 Gene XcellPulser(BioRad)， 以 320 伏特 (V) 及 15 毫秒 (ms) 的方波脉冲长度进行电穿孔。进行 二重实验的转染， 并接着集合所述细胞。将所述集合的细胞移至含有 5ml 的 50％条件培养 基的 T-25 烧瓶中， 并进行孵育两天。
     将经转染的细胞直接分配至 96 孔试验板中进行克隆， 或以抗生素选择进行培养， 直到获得稳定的集合物为止， 并接着分配至 96 孔试验板中。 在电穿孔后两天， 以含有 8μg/ ml 嘌呤霉素以产生选择压力的条件培养基将该培养物稀释至 1250 个细胞 /ml。以每孔 200μl(250 细胞 / 孔 ) 将所述细胞分配至 96 孔试验板中。孵育所述试验板约 10 天以杀死 未转染及瞬时转染的细胞。在 10-12 天后， 目视检验每一试验板中的每一孔， 以识别具有单 一克隆的孔。其后再次检验此类孔， 以确认其含有适于在 24 孔试验板中进行扩增的单一、 健康克隆。
     在电穿孔后两天， 离心该培养物， 再使其再悬浮于含有 7μg/ml 嘌呤霉素以产生 选择压力的 50％条件培养基中。 亦以相同培养基中的未转染细胞接种对照组烧瓶。 根据进 行中的最适化研究， 在 3 天后将嘌呤霉素的浓度增加至 8μg/ml。 在对照组烧瓶中的所有细 胞死亡时， 于选择 10-12 天后产生稳定的集合物。以蛋白 A HPLC 确认该稳定集合物中的产 物表达， 而该培养物的存活率经确认为＞ 95％。以不含嘌呤霉素的条件培养基是列稀释所述细胞直到 3.8 个细胞 /ml 的终密度。以每孔 200μl(75 细胞 / 板或 0.8 细胞 / 孔 ) 将所 述细胞接种于 96 孔试验板中。
     在一天后， 目视检验每一试验板中的每一孔， 以识别具有单一细胞或克隆的孔。 第 二天， 选择具有 2-4 个细胞的单一克隆的孔。排除任何具有超过两个克隆的孔。由第二操 作员确认所述选择。其后再次检验所述孔， 以确认其含有适于在 24 孔试验板中进行扩增的 单一、 健康克隆。
     将取自 96 孔试验板的细胞在含有每孔 1ml 条件培养基 ( 含 8μg/ml 嘌呤霉素 ) 的 24 孔试验板中进行扩增。将取从所述 96 孔试验板的具有单一克隆的所选孔的全部内含 物移至 24 孔试验板的个别孔中。从该 24 孔试验板的每个新孔中取出 200μl 以洗涤该 96 孔试验板的对应孔， 接着再移回。为进行备用， 将 200μl 含有 8μg/ml 嘌呤霉素的条件培 养基加回该 96 孔试验板的各孔中。
     1-3 天后， 从所述 24 孔试验板的各孔中取样， 并以 ELISA 试验 D3-54-IgG2 的表达。 根据所述粗 ELISA OD 值以及适当生长的表达， 选择克隆进行进一步的扩增。
     使根据 ELISA 及所观察到的生长结果的首选 35-40 个克隆在含有 5ml 条件培养基 ( 含 8μg/ml 嘌呤霉素 ) 的 T-25 烧瓶中进行扩增。将取从所述 24 孔试验板的每个所选孔 的全部内含物移至个别的 T-25 烧瓶中。以该相同培养基洗涤所述孔中的残余细胞， 并加至 对应的 T-25 烧瓶中。为进行备用， 将 1ml 含有 8μg/ml 嘌呤霉素的条件培养基加回该 24 孔试验板的各孔中。
     通过选择具有最高产率的克隆而进一步减少克隆数目。以 1-2x105 个活个细胞 / ml 的密度使细胞再悬浮于新鲜培养基中， 并播种至 T25 烧瓶 (5ml 培养物 ) 或 125ml 摇瓶 (12ml 培养物 ) 中。使所述培养物进行孵育 22-24 小时， 并接着进行终细胞密度及存活性 测定， 接着取样而以蛋白 A HPLC 进行产物浓度测定。产率是通过使该所生产蛋白的总量除 以该烧瓶中活细胞的总数， 再除以培养持续时间而计算。将所述单位转化为每天每细胞的 皮克 (picograms) 数或 “pcd” 。根据其 pcd 值而排序克隆， 但略去并未显示显著生长的克 隆。使所述首选克隆在 125ml 摇瓶中进行扩增， 以进行冷冻保存以及生长及生产的进一步 评估。
     将待进行进一步评估的克隆以 1x105 个活个细胞 /ml 的密度接种于 250ml 摇瓶中 的 50ml 新鲜培养基中。当细胞密度到达 1x106 个活个细胞 /ml 时， 使该培养物传代至新摇 5 瓶中， 同样是以 1x10 个活个细胞 /ml 的密度加至 50ml 新鲜培养基中。再次重复该传代一 次。在此第三传代的过程中， 每日对该培养物取样以进行细胞计数、 存活性、 及产物浓度测 定 ( 以蛋白 AHPLC 进行 )。
     根据生长及特定生产率而选择表达 D3-54-IgG2 融合蛋白的首选克隆进行次克 隆。如上节针对稳定集合物所述的进行抑制稀释而进行次克隆， 除外在任何时间皆不使用 嘌呤霉素。克隆的扩增、 筛选、 及评估还如以上所说明进行。
     使所选的次克隆在摇瓶中重复传代约 90 天以评估生产稳特征标记的。在各传代 时， 使细胞以 1x105 个活个细胞 /ml 的密度接种于 125ml 摇瓶中的 25ml 新鲜培养基中。每 3-4 天传代所述培养物。在各次传代之前， 测量细胞的密度及存活性， 接着取样而以蛋白 A HPLC 进行产物浓度测定。
     自以 pcd 值排序的时至稳定性评估中的不同时点， 将所选的克隆及次克隆以冷冻保存。 冷冻培养基是以 90％生长培养基及 10％ DMSO(Sigma) 新鲜制备。 使取自摇瓶培养物 6 的细胞进行离心， 再以介于 2-10x10 个个细胞 /ml 的密度再悬浮于冷冻培养基中。将该细 胞悬浮液以 1ml 的小份分配至冻存管中。 将所述冻存管至于异丙醇冷冻容器中， 并在 -80℃ 下过夜贮存。在第二天将所述经冷冻的小瓶移至液态氮蒸汽相贮槽中。
     突变 CTLA4-IgG2 融合蛋白的制备
     解冻含有 1ml 体积表达 D3-54-IgG2 融合蛋白的 CHO-K1 细胞的冻存管， 并使它在 TM 5 37℃及 5％ CO2 下， 在含有 CD OptiCHO 培养基的 125ml 摇瓶中， 生长至 5x10 个活个细胞 5 /ml 的密度。结合数个烧瓶而以 1-2x10 个个细胞 /ml 的密度接种波浪袋 (wave bag) 中 的 5 或 10L 体积 CDOptiCHOTM 培养基 ( 含 4mM 谷氨酰胺 )。使该波浪袋培养物维持在添加 5％ CO2 的 37℃恒温孵育箱中， 购自 Sartorius Stedim Biotech 的装置的震荡平台设定为 18-22rpm 及 8 度的角度。每日对该培养物取样以测定细胞计数、 存活性、 营养素含量、 代谢 物曲线及突变 CTLA-4-IgG2( 即， D3-54-IgG2) 的表达量 ( 以蛋白 A HPLC 测定进行 )。当 存活率降至～ 50％时 ( 典型地是接种后 9-11 天 ) 收集细胞。使用深层过滤及无菌的过滤 的组合进行过滤而澄清该细胞培养物质， 并直接使用进行进一步的处理或贮存在 2℃ -8℃ 下。
     突变 CTLA-4-IgG2 融合蛋白的纯化
     使用 AKTA Explorer HPLC 系统 (GE Healthcare)， 以蛋白 -A 亲和层析纯化突变 CTLA4-IgG2 融合蛋白 (D3-54-IgG2)。使突变 CTLA-4-Ig 融合蛋白 (D3-54-IgG2) 在 PBS 缓 冲液 (Invitrogen) 中连结 MabSelect Protein A FF 柱子 (GE Healthcare， #17-5079-01) ( 以～ 10mg/ml 层析培养基加样 )， 以该相同缓冲液洗涤， 以 100 mM 柠檬酸缓冲液 (pH 4.0) 洗脱， 并接着加入 1/10 体积的 2M Tris 碱而进行中和。使用切向流过滤 (TFF) 系统， 以渗 滤 (diafiltration) 进一步处理该经蛋白 A 纯化的样本， 使缓冲液交换为 20mMTris-Cl， pH 7.5。
     在 Q-Sepharose 柱子上， 以～ 10mg/ml 的加样密度加样， 使用阴离子交换层析而进 一步纯化该经缓冲液交换的蛋白样本。使用 20 柱子体积 (CV) 的 20mM Tris-Cl， pH 7.5 中 自 0-500mM NaCl 的线性 NaCl 梯度洗脱连结的蛋白。收集主要峰值馏份， 并测量 280nm 的 吸收值而测定浓度。
     以 SDS-PAGE 测定确认蛋白纯度， 并使用尺寸排除 -HPLC 法测定单体含量。将样本 以小份贮存在 2℃ -8℃下或在 -20℃下于使用前长期贮存。
     在前述的发明已为明确及理解而以部分细节说明的同时， 本领域中的普通技术人 员应当理解， 由此揭示内容的阅读， 可在不偏离本发明真正范围的情形下， 进行不同的形式 及细节的变化。应当理解， 本文所述的材料、 实例、 及具体实例仅是为说明目的且并不欲进 行抑制， 并且根据其的不同的修饰或变化将可对本领域中的普通技术人员建议， 并包括于 本申请的精神及范围以及附呈申请专利范围的范围中。本文所提及的所有出版品、 专利申 请、 专利、 或其他文件皆就所有目的而以其全文并入作为参考， 其范围如同每个此类个别的 出版品、 专利、 专利申请或其他文件皆个别具体指明为就所有目的而以其全文并入作为参 考并以其全文说明于本文的中。在冲突的情形下， 本申请 ( 包括定义 ) 将具有支配力。221101998965 A CN 101998971序列 序列表表1/171 页<110>Maxygen， Inc. Karrer， Erik E. Paidhungat， Madan M. Bass， Steven H. Neighbors， Margaret Punnonen， Juha Chapin， Steven J. Viswanathan， Sridhar Larsen， Brent R. <120> 免疫抑制性多肽与核酸 <130>0364.210WO <150>US 60/984,631 <151>2007-11-01 <150>US 61/051,215 <151>2008-05-07 <160>228 <170>FastSEQ for Windows 4.0 版 <210>1 <211>124 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223>CTLA-4ECD 突变体 D3-1 <400>1 Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile 1 5 10 15 Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Asn Glu Ile222101998965 A CN 101998971序列表30 Thr Glu Val Cys 45 Leu Asp Asp Pro Leu Thr Ile Gln 80 Lys Val Glu Leu 95 Gly Thr Gln Ile 1102/171 页20 Arg Val Thr Val Leu Arg Gln 35 Ala Met Thr Tyr Met Lys Gly 50 55 Ser Cys Thr Gly Thr Phe Ser 65 70 Gly Leu Arg Ala Ala Asp Thr 85 Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr 100 Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro 115 <210>2 <211>124 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223>CTLA-4ECD 突变体 D3-2 <400>2 Met His Val Ala Gln 1 5 Ala Ser Phe Val Cys 20 Arg Val Thr Val Leu 35 Ala Met Thr Tyr Met 50 Ser Cys Thr Gly Thr 65 Gly Leu Arg Ala Ala 85 Met Tyr Pro Pro Pro 10025 Ala Gly Ser Gln Val 40 Asp Glu Leu Thr Phe 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120243101998965 A CN 101998971序列表23/171 页<210>32 <211>124 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223>CTLA-4ECD 突变体 D3-39 <400>32 Met His Val Ala Gln 1 5 Ala Ser Phe Val Cys 20 Arg Val Thr Val Leu 35 Ala Met Thr Tyr Met 50 Ile Cys Thr Gly Thr 65 Gly Leu Arg Ala Met 85 Met Tyr Pro Pro Pro 100 Tyr Val Ile Asp Pro 115 <210>33 <211>124 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223>CTLA-4ECD 突变体 D3-50 <400>33 Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile244Pro Ala Val Val Leu 10 Glu Tyr Glu Ser Pro 25 Arg Gln Ala Asp Ser 40 Lys Gly Asn Glu Leu 55 Phe Ser Gly Asn Gln 70 Asp Thr Gly Leu Tyr 90 Tyr Tyr Leu Gly Ile 105 Glu Pro Cys Pro Asp 120Ala Ser Ser Arg Gly 15 Gly Lys Ala Asn Glu 30 Gln Val Thr Glu Val 45 Thr Phe Leu Asp Asp 60 Val Asn Leu Thr Ile 75 Ile Cys Lys Val Glu 95 Gly Asn Gly Thr Gln 110 Ser AspIle Val Cys Pro Gln 80 Leu Ile101998965 A CN 101998971序列表10 Pro Gly Lys Ala Asn 30 Ser Gln Val Thr Glu 45 Leu Thr Phe Leu Asp 60 Gln Val Asn Leu Thr 75 Tyr Ile Cys Lys Val 90 Ile Gly Asn Gly Thr 110 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tcacagtgct tgggagatga aagttaatct tcgaactcat tcatcgatcc ttccttcgtg ccgccaagcc actaaccttc tactattcaa gtaccccccc cgaaccctgc63/171 页atgcacgtcg tgtgaatatg ggaagtcaag cttgacgatc ggacttcgag ccttactact cctgattctggcgtcctcta gaaattagag acatacatga tccggaaatc atttgtaaag cagatctacg60 120 180 240 300 360 372<210>86 <211>372 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223>CTLA-4ECD 突变体 D3-7 编码序列 <400>86 atgcacgtcg tgtgaatatg ggaagtcaag cttgacgatc ggacttcgag ccttactact cctgattctg ctcaaccagc agtcacccgg ttacagaagt ccagctgcac ccgcggatac tgggttttgg at cgtcgtactc caaagccaac ctgcgctatg aggtaccttt cggactctat taatggcact gcgtcctcta gaaattagag acatacatga tccggaaatc atttgtaaag cagatctacg gaggtatcgc tcacagtgct agggaaatga aagttaatct tcgaactcat tcatcgatcc ttccttcgtg ccgccaagcc actaaccttc tactattcaa gtaccccccc cgaaccctgc 60 120 180 240 300 360 372<210>87 <211>372 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223>CTLA-4ECD 突变体 D3-8 编码序列 <400>87 atgcacgtcg ctcaaccagc cgtcgtactc gcgtcctcta gaggtatcgc ttccttcgtg 60 tgtgaatatg agtcacccgg caaagccaac 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tccggaaatc atttgtaaag cagatctacggaggtatcgc tcacagtcct tcgaggacga aagttaatct tcgaactcat tcattgacccttccttcgtt ccgccaagct actcaccttc tactattcaa gtaccccccc cgaaccctgc60 120 180 240 300 360 372101998965 A CN 101998971序列表94/171 页<212>DNA <213> 人工序列 <220> <223>D3-12-IgG2 融合蛋白编码序列 <400>153 atggcttgtc ccttgtactc gctcaaccag gagtcacccg gttacagaag cccagctgca gccgcggata ttgggtattg gatgagcgca tcagtcttcc gtcacgtgcg gtggacggcg acgttccgtg tacaagtgca accaaagggc accaagaacc gtggagtggg gactccgacg caggggaacg aagagcctct ttggatttca ttctcttttt ccgtcgtact gcaaagccaa tctgcgctat caggtacctt ccggactcta gtaatggcac aatgttgtgt tcttcccccc tggtggtgga tggaggtgca tggtcagcgt aggtctccaa agccccgaga aggtcagcct agagcaatgg gctccttctt tcttctcatg ccctgtctcc acgccacaaa tctcctcttc cgcgtcctct cgaaattaga gacatacatg ttccggaaat tatttgtaaa tcagatctac cgagtgccca aaaacccaag cgtgagccac taatgccaag cctcaccgtt caaaggcctc accacaggtg gacctgcctg gcagccggag cctctacagc ctccgtgatg gggtaaataa gctcaactca ataccggttt agaggtatcg gtcacagtgc aagggagatg 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tctcctcttc cgcgtcctct cgaaattaga gacatacatg ttccggaaat tatttgtaaa tcagatctac cgagtgccca aaaacccaag cgtgagccac taatgccaag cctcaccgtt caaaggcctc accacaggtg gacctgcctg gcagccggag cctctacagc ctccgtgatg gggtaaataa列表atctcgctac tttgtaaagc cttccttcgt tccgccaagc aactaacctt ttactattca tgtacccccc ccgaaccctg caccacctgt tgatctcccg aggtccagtt gggaggagca actggctgaa tcgagaaaac ccccatcccg tctaccccag agaccacacc tggacaagag tgcacaacca ccgaacatgg catgcacgtc gtgtgaatat cgatagtcaa ccttgacgat aggacttcga cccttactac ccctgattct ggcaggaccg gacccctgag caactggtac gttcaacagc cggcaaggag catctccaaa ggaggagatg cgacatcgcc tcccatgctg caggtggcag ctacacgcag95/171 页atggcttgtc ccttgtactc gctcaaccag gagtcacccg gttacagaag cccagctgca gccgcggata ttgggtattg gatgagcgca tcagtcttcc gtcacgtgcg gtggacggcg acgttccgtg tacaagtgca accaaagggc accaagaacc gtggagtggg gactccgacg caggggaacg aagagcctctgctcaactca ataccggttt agaggtatcg gtcacagtgc aagggagatg caagttaatc gtcgaactca gtcatcgatc ccgtgcccag gacaccctca gaagaccccg acaaagccac gtgcaccagg 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ccggactcta gtaatggcac aatgttgtgt tcttcccccc tggtggtgga tggaggtgca tggtcagcgt aggtctccaa agccccgaga aggtcagcct agagcaatgg acgccacaaa tctcctcttc cgcgtcctct tgaagttaga aacatatatg ctccggaaat tatttgtaaa tcagatctac cgagtgccca aaaacccaag cgtgagccac taatgccaag cctcaccgtt caaaggcctc accacaggtg gacctgcctg gcagccggag gctcaactca ataccggttt agaggtatcg gtcacagtcc atgggcaacg caagttaatc gtcgaactca gtcatcgatc ccgtgcccag gacaccctca gaagaccccg acaaagccac gtgcaccagg ccagccccca tacaccctgc gtcaaaggct aacaactaca324atctcgctac tttgtaaagc cttccttcgt tccgccaggc aactcacctt ttactattca tgtacccccc ccgaaccctg caccacctgt tgatctcccg aggtccagtt gggaggagca actggctgaa tcgagaaaac ccccatcccg tctaccccag agaccacaccccgaacatgg catgcacgtc ttgtgaatat tgattcacaa cctcgacgac aggacttcga cccttactac ccctgattct ggcaggaccg gacccctgag caactggtac gttcaacagc cggcaaggag catctccaaa ggaggagatg cgacatcgcc tcccatgctg60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020101998965 A CN 101998971序列表104/171 页gactccgacg gctccttctt 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页<211>726 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 野生型人类 CD80 信号肽以及野生型人类 CD80ECD 的编码序列 <400>173 atgggccaca cagctcttgg gaagtgaaag caaactcgca atgaatatat atcgtgatcc tatgaaaaag gacttcccta atttgctcaa gaattaaatg agcagcaaac ggacatttaa gataac <210>174 <211>208 <212>PRT <213> 智人 <220> <223> 野生型人类 CD80 ECD <400>174 Val Ile His Val Thr Lys Glu Val 1 5 Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu 20 Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu 35 40 Lys Glu Val Ala Thr 10 Leu Ala Gln Thr Arg 25 Thr Met Met Ser Gly 45336cacggaggca tgctggctgg aagtggcaac tctactggca ggcccgagta tggctctgcg acgctttcaa cacctagtat cctctggagg ccatcaacac tggatttcaa gagtgaatcagggaacatca tctttctcac gctgtcctgt aaaggagaag caagaaccgg cccatctgac gcgggaacac atctgacttt ttttcctgag aacagtttcc tatgacaacc gaccttcaacccatccaagt ttctgttcag ggtcacaatg aaaatggtgc accatctttg gagggcacat ctggctgaag gaaattccaa cctcacctct caagatcctg aaccacagct tggaatacaagtccatacct gtgttatcca tttctgttga tgactatgat atatcactaa acgagtgtgt tgacgttatc cttctaatat cctggctgga aaactgagct tcatgtgtct cgaagcaagacaatttcttt cgtgaccaag agagctggca gtctggggac taacctctcc tgttctgaag agtcaaagct tagaaggata aaatggagaa ctatgctgtt catcaagtat gcattttcct60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 726Leu Ser Cys 15 Ile Tyr Trp 30 Asp Met Asn101998965 A CN 101998971序列表Phe Asp Ile Thr Asn 60 Ser Asp Glu Gly Thr 75 Ala Phe Lys Arg Glu 95 Asp Phe Pro Thr Pro 110 Ile Arg Arg Ile Ile 125 Leu Ser Trp Leu Glu 140 Val Ser Gln Asp Pro 155 Asp Phe Asn Met Thr 175 Gly His Leu Arg Val 190 Glu His Phe Pro Asp 205 Asn Tyr 80 His Ser Cys Asn Glu 160 Thr Asn Asn116/171 页Ile Trp Pro Glu Tyr 50 Leu Ser Ile Val Ile 65 Glu Cys Val Val Leu 85 Leu Ala Glu Val Thr 100 Ile Ser Asp Phe Glu 115 Ser Thr Ser Gly Gly 130 Gly Glu Glu Leu Asn 145 Thr Glu Leu Tyr Ala 165 Asn His Ser Phe Met 180 Gln Thr Phe Asn Trp 195 <210>175 <211>329 <212>PRT <213> 智人Lys Asn Arg Thr Ile 55 Leu Ala Leu Arg Pro 70 Lys Tyr Glu Lys Asp 90 Leu Ser Val Lys Ala 105 Ile Pro Thr Ser Asn 120 Phe Pro Glu Pro His 135 Ala Ile Asn Thr Thr 150 Val Ser Ser 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agtgcactat ctcctctgaa actctcaaaa ttctgaatga gccgcacaag acaagggctt accagatgaa tttctaatat cagaacctaa gtattatgca ctgtttcatt agacgcggct accacattcc gtctaattct ccaacacaat ctgaaagatc aaagtgatac gggactgagt gattcaagct ccaaagcctg ggtatactta ttttgattcg gtatcaatgt ttctgaactg aacagaaaat gaagatgagt gaaatctcaa ccctgatgtt tttatcttca ttggattaca atggaaatgg ggagagggaa tgatgaagcc atgtttt aacattctct tatttcaatg agtgagctag ggcaaagaga gacagttgga atcatccatc tcagtgcttg gtgtacataa gttttgctaa gataatgtca acgagcaata cctttctcta gctgtacttc aagaagaaga gagagtgaac cagcgtgttt ttgtgatggc agactgcaga tagtattttg aatttgacag ccctgagact acaaaaagcc ctaacttcag atttgacctg gaaccaagaa cagaactgta tgaccatctt tagagcttga caacagttat agcggcctcg agaccaagaa ttaaaagttc cttcctgctc cctgccatgc gcaggaccag tgttcattcc tcacaatctt cacaggaatg tcaacctgaa ctcatctata ttcaactatc cgacgtttcc ctgtattctg ggaccctcag tatatgtgtg caactcttat aagagaaaaa gaagacatct 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 987<210>177 <211>477 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 预测的野生型人类 CD86- 人类 IgG1 融合蛋白 <400>177 Met Asp Pro Gln Cys Thr Met Gly 1 5 Ala Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala 20 Asn Glu Thr Ala Asp Leu Pro Cys Leu Ser Asn Ile Leu 10 Pro Leu Lys Ile Gln 25 Gln Phe Ala Asn Ser339Phe Val Met 15 Ala Tyr Phe 30 Gln Asn Gln101998965 A CN 101998971序列表45 Gln Glu Asn Leu Val 60 Asp Ser Val His Ser 80 Ser Trp Thr Leu Arg 95 Tyr Gln Cys Ile Ile 110 His Gln Met Asn Ser 125 Glu Ile Val Pro Ile 140 Thr Cys Ser Ser Ile 160 Leu Leu Arg Thr Lys 175 Lys Ser Gln Asp Asn 190 Ser Val Ser Phe Pro 205 Leu Glu Thr Asp Lys 220 Leu Glu Asp Pro Gln 240 Lys Thr His Thr Cys 255 Pro Ser Val Phe Leu 270 Ser Arg Thr Pro Glu 285 Asp Pro Glu Val Lys 300 Asn Ala Lys Thr Lys 320 Val Val Ser Val Leu 335 Glu Tyr Lys Cys Lys 350119/171 页35 Ser Leu Ser Glu Leu Val 50 Leu Asn Glu Val Tyr Leu 65 70 Lys Tyr Met Gly Arg Thr 85 Leu His Asn Leu Gln Ile 100 His His Lys Lys Pro Thr 115 Glu Leu Ser Val Leu Ala 130 Ser Asn Ile Thr Glu Asn 145 150 His Gly Tyr Pro Glu Pro 165 Asn Ser Thr 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cccatcgaga ctgcccccat ggcttctatc agtgcactat ctcctctgaa actctcaaaa ttctgaatga gccgcacaag acaagggctt accagatgaa tttctaatat cagaacctaa gtattatgca ctgtttcatt agacgcggct gggtgacccc tcctgggggg cccggacccc agttcaactg agcagtacaa tgaatggcaa aaaccatctc cccgggatga ccagcgacat gggactgagt gattcaagct ccaaagcctg ggtatactta ttttgattcg gtatcaatgt ttctgaactg aacagaaaat gaagatgagt gaaatctcaa ccctgatgtt tttatcttca aaagagctgc accgtcagtc tgaggtcaca gtacgtggac cagcacgtac ggagtacaag caaagccaaa gctgaccaag cgccgtggag aacattctct tatttcaatg agtgagctag ggcaaagaga gacagttgga atcatccatc tcagtgcttg gtgtacataa gttttgctaa gataatgtca acgagcaata cctttctcta gacaaaactc ttcctcttcc tgcgtggtgg ggcgtggagg cgtgtggtca tgcaaggtct gggcagcccc aaccaggtca tgggagagca343ttgtgatggc agactgcaga tagtattttg aatttgacag ccctgagact acaaaaagcc ctaacttcag atttgacctg gaaccaagaa cagaactgta tgaccatctt tagagcttga acacatgccc ccccaaaacc tggacgtgag tgcataatgc gcgtcctcac ccaacaaagc gagaaccaca gcctgacctg atgggcagcccttcctgctc cctgccatgc gcaggaccag 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accctcatga gaccccgagg aagccacggg caccaggact gcccccatcg accctgcccc aaaggcttct aactacaaga ctcaccgtgg gaggctctgccacctgtggc tctcccggac tccagttcaa aggagcagtt ggctgaacgg agaaaaccat catcccggga accccagcga ccacacctcc acaagagcag acaaccactaaggaccgtca ccctgaggtc ctggtacgtg caacagcacg caaggagtac ctccaaaacc ggagatgacc catcgccgtg catgctggac gtggcagcag cacgcagaag60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 684Cys Pro Ala Pro Pro 15 Lys Pro Lys Asp Thr 30 Val Val Val Asp Val 45 Tyr Val Asp Gly Val 60 Glu Gln Phe Asn Ser 75 His Gln Asp Trp LeuVal Leu Ser Glu Thr 80 Asn101998965 A CN 101998971序列表95 Pro Ala Pro 110 Glu Pro Gln Asn Gln Val Ile Ala Val 160 Thr Thr Pro 175 Lys Leu Thr 190 Cys Ser Val Leu Ser Leu126/171 页Gly Ile Val Ser 145 Glu Pro Val Met Ser 22585 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 100 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 115 120 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 130 135 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 150 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 165 Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 180 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 195 200 His Glu Ala 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gcaaatgttg 60 tgtcgagtgc ccaccgt 77 <210>190 <211>42 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>190 cagaattcat tatttacccg gagacaggga gaggctcttc tg <210>191 <211>54 <212>DNA <213> 人工序列 <220>3503042101998965 A CN 101998971序列表130/171 页<223> 引物 <400>191 ggaataccgg ttttttgtaa agccatgcac gtcgctcaac cagccgtcgt actc <210>192 <211>30 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>192 ggcactcaga tctacgtcat cgatcccgaa <210>193 <211>372 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人类 CTLA-4ECD 编码序列 <400>193 atgcacgtgg tgtgagtatg gacagccagg ctagatgatt ggactgaggg ccatactacc ccagattctg <210>194 <211>672 <212>DNA3515430cccagcctgc catctccagg tgactgaagt ccatctgcac ccatggacac tgggcatagg actgtggtactg caaagccact ctgtgcggca gggcacctcc gggactctac caacggaaccgccagcagcc gaggtccggg acctacatga agtggaaatc atctgcaagg cagatttatggaggcatcgc tgacagtgct tggggaatga aagtgaacct tggagctcat taattgatcccagctttgtg tcggcaggct gttgaccttc cactatccaa gtacccaccg agaaccgtgc60 120 180 240 300 360 372101998965 A CN 101998971序列表131/171 页<213> 人工序列 <220> <223> 全长人类 CTLA-4 编码序列 <400>194 atggcttgcc ccctgcactc gcccagcctg gcatctccag gtgactgaag tccatctgca gccatggaca ctgggcatag gacttcctcc ctcacagctg tatgtgaaaa cccatcaatt <210>195 <211>288 <212>PRT <213> 智人 <220> <223> 预测的全长人类 CD80 <400>195 Met Gly His Thr Arg 1 5 Leu Asn Phe Phe Gln 20 Ser Gly Val Ile His 35 Ser Cys Gly His Asn 50 Tyr Trp Gln Lys Glu Arg Gln Gly Thr Ser 10 Leu Leu Val Leu Ala 25 Val Thr Lys Glu Val 40 Val Ser Val Glu Glu 55 Lys Lys Met Val Leu352ttggatttca tcctgttttt ctgtggtact gcaaagccac tctgtgcggc cgggcacctc cgggactcta gcaacggaac tctggatcct tttctttgag tgcccccaac gagcggcacaag tcttctcttc ggccagcagc tgaggtccgg aacctacatg cagtggaaat catctgcaag ccagatttat tgcagcagtt caaaatgcta agagccagaagctcagctga atccctgtct cgaggcatcg gtgacagtgc atggggaatg caagtgaacc gtggagctca gtaattgatc agttcggggt aagaaaagaa tgtgaaaagcacctggctac tctgcaaagc ccagctttgt ttcggcaggc agttgacctt tcactatcca tgtacccacc cagaaccgtg tgttttttta gccctcttac aatttcagcccaggacctgg aatgcacgtg gtgtgagtat tgacagccag cctagatgat aggactgagg gccatactac cccagattct tagctttctc aacaggggtc ttattttatt60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 672Pro Ser Lys Cys Pro 15 Gly Leu Ser His Phe 30 Lys Glu Val Ala Thr 45 Leu Ala Gln Thr Arg 60 Thr Met Met Ser GlyTyr Cys Leu Ile Asp101998965 A CN 101998971序列表75 Thr Ile Phe Asp Ile 95 Arg Pro Ser Asp Glu 110 Lys Asp Ala Phe Lys 125 Lys Ala Asp Phe Pro 140 Ser Asn Ile Arg Arg 155 Pro His Leu Ser Trp 175 Thr Thr Val Ser Gln 190 Lys Leu Asp Phe Asn 205 Lys Tyr Gly His Leu 220 Lys Gln Glu His Phe 235 Leu Ile Ser Val Asn 255 Phe Ala Pro Arg Cys 270 Glu Ser Val Arg Pro 285 80 Thr Gly Arg Thr Ile 160 Leu Asp Met Arg Pro 240 Gly Arg Val132/171 页65 Met Asn Ile Trp Pro 85 Asn Asn Leu Ser Ile 100 Thr Tyr Glu Cys Val 115 Glu His Leu Ala Glu 130 Pro Ser Ile Ser Asp 145 Ile Cys Ser Thr Ser 165 Glu Asn Gly Glu Glu 180 Pro Glu Thr Glu Leu 195 Thr Thr Asn His Ser 210 Val Asn Gln Thr Phe 225 Asp Asn Leu Leu Pro 245 Ile Phe Val Ile Cys 260 Glu Arg Arg Arg Asn 275 <210>196 <211>867 <212>DNA <213> 人工序列70 Glu Tyr Lys Asn Arg 90 Val Ile Leu Ala Leu 105 Val Leu Lys Tyr Glu 120 Val Thr Leu Ser Val 135 Phe Glu Ile Pro Thr 150 Gly Gly Phe Pro Glu 170 Leu Asn Ala Ile Asn 185 Tyr Ala Val Ser Ser 200 Phe Met Cys Leu Ile 215 Asn Trp Asn Thr Thr 230 Ser Trp Ala Ile Thr 250 Cys Leu Thr Tyr Cys 265 Glu Arg Leu Arg Arg 280<220> <223> 全长人类 CD80 编码序列 <400>196 atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60353101998965 A CN 101998971序tgctggctgg aagtggcaac tctactggca ggcccgagta tggctctgcg acgctttcaa cacctagtat cctctggagg ccatcaacac tggatttcaa gagtgaatca tcccatcctg cctactgctt gtgtacgccc tctttctcac gctgtcctgt aaaggagaag caagaaccgg cccatctgac gcgggaacac atctgacttt ttttccagag aacagtttcc tatgacaacc gaccttcaac ggccattacc tgccccaaga tgtataa列表gtgttatcca tttctgttga tgactatgat atatcactaa acgagtgtgt tgacgttatc cttctaatat cctggttgga aaactgagct tcatgtgtct ccaagcaaga taaatggaat gaaggaggaa cgtgaccaag agagctggca gtctggggac taacctctcc tgttctgaag agtcaaagct tagaaggata aaatggagaa ctatgctgtt catcaagtat gcattttcct ttttgtgata tgagagattg133/171 页cagctcttgg gaagtgaaag caaactcgca atgaatatat attgtgatcc tatgaaaaag gacttcccta atttgctcaa gaattaaatg agcagcaaac ggacatttaa gataacctgc tgctgcctga agaagggaaattctgttcag ggtcacaatg aaaatggtgc accatctttg gagggcacat ctggctgaag gaaattccaa cctcacctct caagatcctg aaccacagct tggaatacaa ttaatctcag tgcagagaga120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 867<210>197 <211>352 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223>D3-54-IgG2 融合蛋白 ( 具有 C- 端赖氨酸 ) <400>197 Met His Val Ala Gln 1 5 Ala Ser Phe Val Cys 20 Arg Val Thr Val Leu 35 Ala Met Thr Tyr Met 50 Ile Cys Thr Gly Thr 65 Gly Leu Arg Ala Met 85 Met Tyr Pro Pro Pro 100 Tyr Val Ile Asp Pro Pro Ala Val Val Leu 10 Glu Tyr Ala Ser Pro 25 Arg Gln Ala Asp Ser 40 Lys Glu Asn Glu Leu 55 Phe Ser Gly Asn Gln 70 Asp Thr Gly Leu Tyr 90 Tyr Tyr Leu Gly Ile 105 Glu Pro Cys Pro Asp354Ala Ser Ser Arg Gly 15 Gly Lys Ala Asn Glu 30 Gln Val Thr Glu Val 45 Thr Phe Leu Asp Asp 60 Val Asn Leu Thr Ile 75 Ile Cys Lys Val Glu 95 Gly 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caggtggcag ctacacgcag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1170<210>202 <211>1170 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223>D3-56-IgG2 融合蛋白编码序列360101998965 A CN 101998971序列表140/171 页<400>202 atggcttgtc ccttgtactc gctcaaccag gcgtcacccg gttacagaag cccagctgca gccatggata ttgggtattg gatgagcgca tcagtcttcc gtcacgtgcg gtggacggcg acgttccgtg tacaagtgca accaaagggc accaagaacc gtggagtggg gactccgacg caggggaacg aagagcctct ttggatttca ttctcttttt ccgtcgtact gcaaagccaa tctgcgctat caggtacctt ccggactcta gtaatggcac aatgttgtgt tcttcccccc tggtggtgga tggaggtgca tggtcagcgt aggtctccaa agccccgaga aggtcagcct agagcaatgg gctccttctt tcttctcatg ccctgtctcc acgccacaaa tctcctcttc cgcgtcctct cgaagttaga gacatacatg ttccggaaat tatttgtaaa tcagatctac cgagtgccca aaaacccaag cgtgagccac taatgccaag cctcaccgtt caaaggcctc accacaggtg gacctgcctg gcagccggag cctctacagc ctccgtgatg gggtaaataa gctcaactca ataccggttt agaggtatcg gtcacagtgc aaggaaaatg caagttaatc gtcgaactca gtcatcgatc ccgtgcccag gacaccctca gaagaccccg acaaagccac gtgcaccagg ccagccccca tacaccctgc gtcaaaggct aacaactaca aagctcaccg catgaggctc atctcgctac tttgtaaagc cttccttcgt tccgccaagc aactaacctt ttactattca tgtacccccc ccgaaccctg caccacctgt tgatctcccg aggtccagtt gggaggagca actggctgaa tcgagaaaac ccccatcccg tctaccccag agaccacacc tggacaagag tgcacaacca ccgaacatgg catgcacgtc gtgtgaatat cgatagtcaa ccttgacgat aggacttcga cccttactac ccctgattct ggcaggaccg gacccctgag caactggtac gttcaacagc cggcaaggag catctccaaa ggaggagatg cgacatcgcc tcccatgctg caggtggcag ctacacgcag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1170<210>203 <211>1170 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223>D3-69-IgG2 融合蛋白编码序列 <400>203 atggcttgtc ccttgtactc gctcaaccag gagtcacccg gttacagaag cccagctgca ttggatttca ttctcttttt ccgtcgtact gcaaagccaa tctgcgctat caggtacctt acgccacaaa tctcctcttc cgcgtcctct cgaaattaga gacatacatg ttccggaaat gctcaactca ataccggttt agaggtatcg gtcacagtgc aagggagatg caagttaatc361atctcgctac tttgtaaagc cttccttcgt tccgccaagc aactaacctt ttactattcaccgaacatgg catgcacgtc gtgtgaatat cgatagtcaa ccttgacgat aggacttcga60 120 180 240 300 360101998965 A CN 101998971序tatttgtaaa tcagatctac cgagtgccca aaaacccaag cgtgagccac taatgccaag cctcaccgtt caaaggcctc accacaggtg gacctgcctg gcagccggag cctctacagc ctccgtgatg gggtaaataa列表tgtacccccc ccgaaccctg caccacctgt tgatctcccg aggtccagtt gggaggagca actggctgaa tcgagaaaac ccccatcccg tctaccccag agaccacacc tggacaagag tgcacaacca cccttactac ccctgattct ggcaggaccg gacccctgag caactggtac gttcaacagc cggcaaggag catctccaaa ggaggagatg cgacatcgcc tcccatgctg caggtggcag ctacacgcag141/171 页gccatggata ccggactcta gagggtatag gtaatggcac gatgagcgca aatgttgtgt tcagtcttcc tcttcccccc gtcacgtgcg tggtggtgga gtggacggcg tggaggtgca acgttccgtg tggtcagcgt tacaagtgca aggtctccaa accaaagggc agccccgaga accaagaacc aggtcagcct gtggagtggg agagcaatgg gactccgacg gctccttctt caggggaacg tcttctcatg aagagcctct ccctgtctcc <210>204 <211>1170 <212>DNA <213> 人工序列gtcgaactca gtcatcgatc ccgtgcccag gacaccctca gaagaccccg acaaagccac gtgcaccagg ccagccccca tacaccctgc gtcaaaggct aacaactaca aagctcaccg catgaggctc420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1170<220> <223>D3-75-IgG2 融合蛋白编码序列 <400>204 atggcttgtc ccttgtactc gctcaaccag gagtcacccg gttacagaag cccagctgca gccatggata ttgggtattg gatgagcgca tcagtcttcc gtcacgtgcg gtggacggcg acgttccgtg tacaagtgca accaaagggc ttggatttca ttctcttttt ccgtcgtact gcaaagccaa tctgcgctat caggtacctt ccggactcta gtaatggcac aatgttgtgt tcttcccccc tggtggtgga tggaggtgca tggtcagcgt aggtctccaa agccccgaga acgccacaaa tctcctcttc cgcgtcctct cgaagttaga gacatacatg ttccggaaat tatttgtaaa tcagatctac cgagtgccca aaaacccaag cgtgagccac taatgccaag cctcaccgtt caaaggcctc accacaggtg gctcaactca ataccggttt agaggtatcg gtcacagtgc aaggaaaatg caagttaatc gtcgaactca gtcatcgatc ccgtgcccag gacaccctca gaagaccccg acaaagccac gtgcaccagg ccagccccca tacaccctgc362atctcgctac tttgtaaagc cttccttcgt tccgccaagc aactaacctt ttactattca tgtacccccc ccgaaccctg caccacctgt tgatctcccg aggtccagtt gggaggagca actggctgaa tcgagaaaac ccccatcccgccgaacatgg catgcacgtc gtgtgaatat cgatagtcaa ccttgacgat aggacttcga cccttactac ccctgattct ggcaggaccg gacccctgag caactggtac gttcaacagc cggcaaggag catctccaaa ggaggagatg60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900101998965 A CN 101998971序aggtcagcct agagcaatgg gctccttctt tcttctcatg ccctgtctcc gacctgcctg gcagccggag cctctacagc ctccgtgatg gggtaaataa列表tctaccccag agaccacacc tggacaagag tgcacaacca cgacatcgcc tcccatgctg caggtggcag ctacacgcag142/171 页accaagaacc gtggagtggg gactccgacg caggggaacg aagagcctctgtcaaaggct aacaactaca aagctcaccg catgaggctc960 1020 1080 1140 1170<210>205 <211>351 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223>D3-12-IgG2 融合蛋白 ( 不具有 C- 端赖氨酸 ) <400>205 Met His Val Ala Gln 1 5 Ala Ser Phe Val Cys 20 Arg Val Thr Val Leu 35 Ala Met Thr Tyr Met 50 Ser Cys Thr Gly Thr 65 Gly Leu Arg Ala Ala 85 Met Tyr Pro Pro Pro 100 Tyr Val Ile Asp Pro 115 Cys Val Glu Cys Pro 130 Val Phe Leu Phe Pro 145 Thr Pro Glu Val Thr 165 Glu Val Gln Phe Asn Pro Ala Val Val Leu 10 Glu Tyr Glu Ser Pro 25 Arg Gln Ala Gly Ser 40 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Pro373Ala Ser Ser Arg Gly 15 Gly Lys Ala Asn Glu 30 Gln Val Thr Glu Val 45 Thr Phe Leu Asp Asp 60 Val Asn Leu Thr Ile 75 Ile Cys Lys Val Glu 95 Gly Asn Gly Thr Gln 110 Ser Asp Glu Arg Lys 125 Pro Val Ala Gly Pro 140 Thr Leu Met Ile Ser 155 Val Ser His Glu Asp 175 Val Glu Val His Asn 190 Ser Thr Phe Arg Val 205 Leu Asn Gly Lys Glu 220 Ala Pro Ile Glu LysIle Val Cys Pro Gln 80 Leu Ile Cys Ser Arg 160 Pro Ala Val Tyr Thr101998965 A CN 101998971序列表235 Pro Gln Val Tyr Thr 255 Gln Val Ser Leu Thr 270 Ala Val Glu Trp Glu 285 Thr Pro Pro Met Leu 300 Leu Thr Val Asp Lys 315 Ser Val Met His Glu 335 Ser Leu Ser Pro Gly 350 240 Leu Cys Ser Asp Ser 320 Ala153/171 页225 Ile Ser Lys Thr Lys 245 Pro Pro Ser Arg Glu 260 Leu Val Lys Gly Phe 275 Asn Gly Gln Pro Glu 290 Ser Asp Gly Ser Phe 305 Arg Trp Gln Gln Gly 325 Leu His Asn His Tyr 340 <210>213 <211>351 <212>PRT <213> 人工序列230 Gly Gln Pro Arg Glu 250 Glu Met Thr Lys Asn 265 Tyr Pro Ser Asp Ile 280 Asn Asn Tyr Lys Thr 295 Phe Leu Tyr Ser Lys 310 Asn Val Phe Ser Cys 330 Thr Gln Lys Ser Leu 345<220> <223>D3-69-IgG2 融合蛋白 ( 不具有 C- 端赖氨酸 ) <400>213 Met His Val Ala Gln 1 5 Ala Ser Phe Val Cys 20 Arg Val Thr Val Leu 35 Ala Met Thr Tyr Met 50 Ser Cys Thr Gly Thr 65 Gly Leu Arg Ala Met Pro Ala Val Val Leu 10 Glu Tyr Glu Ser Pro 25 Arg Gln Ala Asp Ser 40 Lys Gly Asp Glu Leu 55 Phe Ser Gly Asn Gln 70 Asp Thr Gly Leu Tyr Ala Ser Ser Arg Gly 15 Gly Lys Ala Asn Glu 30 Gln Val Thr Glu Val 45 Thr Phe Leu Asp Asp 60 Val Asn Leu Thr Ile 75 Ile Ile Cys Pro Gln 80Ile Cys Lys Val Glu Leu 85 90 95 Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Ile Gly Asn Gly Thr Gln Ile374101998965 A CN 101998971序列表110 Glu Arg Lys Cys 125 Ala Gly Pro Ser Met Ile Ser Arg 160 His Glu Asp Pro 175 Val His Asn Ala 190 Phe Arg Val Val 205 Gly Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Thr 240 Val Tyr Thr Leu 255 Ser Leu Thr Cys 270 Glu Trp Glu Ser 285 Pro Met Leu Asp Val Asp Lys Ser 320 Met His Glu Ala 335 Ser Pro Gly 350154/171 页100 Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro 115 Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys 130 135 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 145 150 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 165 Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 180 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 195 Ser Val Leu Thr Val Val His 210 215 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 225 230 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 245 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 260 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 275 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 290 295 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 305 310 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 325 Leu His Asn His Tyr Thr Gln 340 <210>214 <211>351 <212>PRT <213> 人工序列105 Cys Pro Asp Ser Asp 120 Pro Ala Pro Pro Val 140 Pro Lys Asp Thr Leu 155 Val Val Asp Val Ser 170 Val Asp Gly Val Glu 185 Gln Phe Asn Ser Thr 200 Gln Asp Trp Leu Asn 220 Gly Leu Pro Ala Pro 235 Pro Arg Glu Pro Gln 250 Thr Lys Asn Gln Val 265 Ser Asp Ile Ala Val 280 Tyr Lys Thr Thr Pro 300 Tyr Ser Lys Leu Thr 315 Phe Ser Cys Ser Val 330 Lys Ser Leu Ser Leu 345<220> <223>D3-75-IgG2 融合蛋白 ( 不具有 C- 端赖氨酸 )375101998965 A CN 101998971序列表155/171 页<400>214 Met His Val Ala Gln 1 5 Ala Ser Phe Val Cys 20 Arg Val Thr Val Leu 35 Ala Met Thr Tyr Met 50 Ser Cys Thr Gly Thr 65 Gly Leu Arg Ala Met 85 Met Tyr Pro Pro Pro 100 Tyr Val Ile Asp Pro 115 Cys Val Glu Cys Pro 130 Val Phe Leu Phe Pro 145 Thr Pro Glu Val Thr 165 Glu Val Gln Phe Asn 180 Lys Thr Lys Pro Arg 195 Ser Val Leu Thr Val 210 Lys Cys Lys Val Ser 225 Ile Ser Lys Thr Lys 245 Pro Pro Ser Arg Glu 260 Leu Val Lys Gly Phe 275 Pro Ala Val Val Leu 10 Glu Tyr Glu Ser Pro 25 Arg Gln Ala Asp Ser 40 Lys Glu Asn Glu Leu 55 Phe Ser Gly Asn Gln 70 Asp Thr Gly Leu Tyr 90 Tyr Tyr Leu Gly Ile 105 Glu Pro Cys Pro Asp 120 Pro Cys Pro Ala Pro 135 Pro Lys Pro Lys Asp 150 Cys Val Val Val Asp 170 Trp Tyr Val Asp Gly 185 Glu Glu Gln Phe Asn 200 Val His Gln Asp Trp 215 Asn Lys Gly Leu Pro 230 Gly Gln Pro Arg Glu 250 Glu Met Thr Lys Asn 265 Tyr Pro Ser Asp Ile 280376Ala Ser Ser Arg Gly 15 Gly Lys Ala Asn Glu 30 Gln Val Thr Glu Val 45 Thr Phe Leu Asp Asp 60 Val Asn Leu Thr Ile 75 Ile Cys Lys Val Glu 95 Gly Asn Gly Thr Gln 110 Ser Asp Glu Arg Lys 125 Pro Val Ala Gly Pro 140 Thr Leu Met Ile Ser 155 Val Ser His Glu Asp 175 Val Glu Val His Asn 190 Ser Thr Phe Arg Val 205 Leu Asn Gly Lys Glu 220 Ala Pro Ile Glu Lys 235 Pro Gln Val Tyr Thr 255 Gln Val Ser Leu Thr 270 Ala Val Glu Trp Glu 285Ile Val Cys Pro Gln 80 Leu Ile Cys Ser Arg 160 Pro Ala Val Tyr Thr 240 Leu Cys Ser101998965 A CN 101998971序列表Thr Pro Pro Met Leu 300 Leu Thr Val Asp Lys 315 Ser Val Met His Glu 335 Ser Leu Ser Pro Gly 350 Asp Ser 320 Ala156/171 页Asn Gly Gln Pro Glu 290 Ser Asp Gly Ser Phe 305 Arg Trp Gln Gln Gly 325 Leu His Asn His Tyr 340 <210>215 <211>111 <212>DNA <213> 人工序列Asn Asn Tyr Lys Thr 295 Phe Leu Tyr Ser Lys 310 Asn Val Phe Ser Cys 330 Thr Gln Lys Ser Leu 345<220> <223> 野生型人类 CTLA-4 信号肽序列的编码序列， 该信号肽序列包含全长人类 CTLA-4 蛋白的 1-37 位氨基酸残基 <400>215 atggcttgtc ttggatttca acgccacaaa gctcaactca atctcgctac ccgaacatgg 60 ccttgtactc ttctcttttt tctcctcttc ataccggttt tttgtaaagc c 111 <210>216 <211>37 <212>PRT <213> 智人 <220> <223> 包含全长人类 CTLA-4 蛋白的 1-37 位氨基酸残基的野生型人类 CTLA-4 信号肽序 列 <400>216 Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala 1 5 10 15 Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro 20 25 30 Val Phe Cys Lys Ala377101998965 A CN 101998971序列表157/171 页35 <210>217 <211>684 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人类 IgG2Fc 多肽的编码序列 <400>217 gagcgcaaat gtcttcctct acgtgcgtgg gacggcgtgg ttccgtgtgg aagtgcaagg aaagggcagc aagaaccagg gagtgggaga tccgacggct gggaacgtct agcctctccc gttgtgtcga tccccccaaa tggtggacgt aggtgcataa tcagcgtcct tctccaacaa cccgagaacc tcagcctgac gcaatgggca ccttcttcct tctcatgctc tgtctccggg gtgcccaccg acccaaggac gagccacgaa tgccaagaca caccgttgtg aggcctccca acaggtgtac ctgcctggtc gccggagaac ctacagcaag cgtgatgcat taaa tgcccagcac accctcatga gaccccgagg aagccacggg caccaggact gcccccatcg accctgcccc aaaggcttct aactacaaga ctcaccgtgg gaggctctgc cacctgtggc tctcccggac tccagttcaa aggagcagtt ggctgaacgg agaaaaccat catcccggga accccagcga ccacacctcc acaagagcag acaaccacta aggaccgtca ccctgaggtc ctggtacgtg caacagcacg caaggagtac ctccaaaacc ggagatgacc catcgccgtg catgctggac gtggcagcag cacgcagaag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 684<210>218 <211>227 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人类 IgG2Fc 多肽 ( 不具有 C- 端赖氨酸 ) <400>218 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 1 5 10 15 Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser378101998965 A CN 101998971序列表45 Val Asp Gly Val Glu 60 Gln Phe Asn Ser Thr 80 Gln Asp Trp Leu Asn 95 Gly Leu Pro Ala Pro 110 Pro Arg Glu Pro Gln 125 Thr Lys Asn Gln Val 140 Ser Asp Ile Ala Val 160 Tyr Lys Thr Thr Pro 175 Tyr Ser Lys Leu Thr 190 Phe Ser Cys Ser Val 205 Lys Ser Leu Ser Leu 220158/171 页35 His Glu Asp Pro Glu Val 50 Val His Asn Ala Lys Thr 65 70 Phe Arg Val Val Ser Val 85 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 100 Ile Glu Lys Thr Ile Ser 115 Val Tyr Thr Leu Pro Pro 130 Ser Leu Thr Cys Leu Val 145 150 Glu Trp Glu Ser Asn Gly 165 Pro Met Leu Asp Ser Asp 180 Val Asp Lys Ser Arg Trp 195 Met His Glu Ala Leu His 210 Ser Pro Gly 225 <210>219 <211>351 <212>PRT <213> 人工序列40 Gln Phe Asn Trp Tyr 55 Lys Pro Arg Glu Glu 75 Leu Thr Val Val His 90 Lys Val Ser Asn Lys 105 Lys Thr Lys Gly Gln 120 Ser Arg Glu Glu Met 135 Lys Gly Phe Tyr Pro 155 Gln Pro Glu Asn Asn 170 Gly Ser Phe Phe Leu 185 Gln Gln Gly Asn Val 200 Asn His Tyr Thr Gln 215<220> <223>D3-71-IgG2 融合蛋白 ( 不具有 C- 端赖氨酸 ) <400>219 Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala Ser Ser Arg Gly Ile 1 5 10 15 Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly Lys Ala Asn Glu Ile379101998965 A CN 101998971序列表30 Thr Glu Val Cys 45 Leu Asp Asp Pro Leu Thr Ile Gln 80 Lys Val Glu Leu 95 Gly Thr Gln Ile 110 Glu Arg Lys Cys 125 Ala Gly Pro Ser Met Ile Ser Arg 160 His Glu Asp Pro 175 Val His Asn Ala 190 Phe Arg Val Val 205 Gly Lys Glu Tyr Ile Glu Lys Thr 240 Val Tyr Thr Leu 255 Ser Leu Thr Cys 270 Glu Trp Glu Ser 285 Pro Met Leu Asp Val Asp Lys Ser 320 Met His Glu Ala 335159/171 页20 Arg Val Thr Val Leu Arg Gln 35 Ala Met Thr Tyr Met Lys Gly 50 55 Ser Cys Thr Gly Thr Phe Ser 65 70 Gly Leu 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101998971序列表160/171 页Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 340 345 350 <210>220 <211>352 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223>D3-71-IgG2 融合蛋白 ( 具有 C- 端赖氨酸 ) <400>220 Met His Val Ala Gln 1 5 Ala Ser Phe Val Cys 20 Arg Val Thr Val Leu 35 Ala Met Thr Tyr Met 50 Ser Cys Thr Gly Thr 65 Gly Leu Arg Ala Met 85 Met Tyr Pro Pro Pro 100 Tyr Val Ile Asp Pro 115 Cys Val Glu Cys Pro 130 Val Phe Leu Phe Pro 145 Thr Pro Glu Val Thr 165 Glu Val Gln Phe Asn 180 Pro Ala Val Val Leu 10 Glu Tyr Ala Ser Pro 25 Arg Gln Ala Asp Ser 40 Lys Gly Asp Glu Leu 55 Phe Ser Gly Asn Gln 70 Asp Thr Gly Leu Tyr 90 Tyr Tyr Glu Gly Ile 105 Glu Pro Cys Pro Asp 120 Pro Cys Pro Ala Pro 135 Pro Lys Pro Lys Asp 150 Cys Val Val Val Asp 170 Trp Tyr Val Asp Gly Ala Ser Ser Arg Gly 15 Gly Lys Ala Asn Glu 30 Gln Val Thr Glu Val 45 Thr Phe Leu Asp Asp 60 Val Asn Leu Thr Ile 75 Ile Cys Lys Val Glu 95 Gly Asn Gly Thr Gln 110 Ser Asp Glu Arg Lys 125 Pro Val Ala Gly Pro 140 Thr Leu Met Ile Ser 155 Val Ser His Glu Asp 175 Val Glu Val His Asn Ile Ile Cys Pro Gln 80 Leu Ile Cys Ser Arg 160 Pro Ala185 190 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val 195 200 205381101998965 A CN 101998971序列表Leu Asn Gly Lys Glu 220 Ala Pro Ile Glu Lys 235 Pro Gln Val Tyr Thr 255 Gln Val Ser Leu Thr 270 Ala Val Glu Trp Glu 285 Thr Pro Pro Met Leu 300 Leu Thr Val Asp Lys 315 Ser Val Met His Glu 335 Ser Leu Ser Pro Gly 350 Tyr Thr 240 Leu Cys Ser Asp Ser 320 Ala Lys161/171 页Ser Val Leu Thr Val 210 Lys Cys Lys Val Ser 225 Ile Ser Lys Thr Lys 245 Pro Pro Ser Arg Glu 260 Leu Val Lys Gly Phe 275 Asn Gly Gln Pro Glu 290 Ser Asp Gly Ser Phe 305 Arg Trp Gln Gln Gly 325 Leu His Asn His Tyr 340 <210>221 <211>351 <212>PRT <213> 人工序列Val His Gln Asp Trp 215 Asn Lys Gly Leu Pro 230 Gly Gln Pro Arg Glu 250 Glu Met Thr Lys Asn 265 Tyr Pro Ser Asp Ile 280 Asn Asn Tyr Lys Thr 295 Phe Leu Tyr Ser Lys 310 Asn Val Phe Ser Cys 330 Thr Gln Lys Ser Leu 345<220> <223>D3-76-IgG2 融合蛋白 ( 不具有 C- 端赖氨酸 ) <400>221 Met His Val Ala Gln 1 5 Ala Ser Phe Val Cys 20 Arg Val Thr Val Leu 35 Ala Met Thr Tyr Met 50 Pro Ala Val Val Leu 10 Glu Tyr Ala Ser Pro 25 Arg Gln Ala Asp Ser 40 Lys Glu Asp Glu Leu Ala Ser Ser Arg Gly 15 Gly Lys Ala Asn Glu 30 Gln Val Thr Glu Val 45 Thr Phe Leu Asp Asp Ile Val Cys Pro55 60 Ile Cys Thr Gly Thr Phe Ser Gly Asn Gln Val Asn Leu Thr Ile Gln 65 70 75 80382101998965 A CN 101998971序列表Ile Cys Lys Val Glu 95 Gly Asn Gly Thr Gln 110 Ser Asp Glu Arg Lys 125 Pro Val Ala Gly Pro 140 Thr Leu Met Ile Ser 155 Val Ser His Glu Asp 175 Val Glu Val His Asn 190 Ser Thr Phe Arg Val 205 Leu Asn Gly Lys Glu 220 Ala Pro Ile Glu Lys 235 Pro Gln Val Tyr Thr 255 Gln Val Ser Leu Thr 270 Ala Val Glu Trp Glu 285 Thr Pro Pro Met Leu 300 Leu Thr Val Asp Lys 315 Ser Val Met His Glu 335 Ser Leu Ser Pro Gly 350 Leu Ile Cys Ser Arg 160 Pro Ala Val Tyr Thr 240 Leu Cys Ser Asp Ser 320 Ala162/171 页Gly Leu Arg Ala Met 85 Met Tyr Pro Pro Pro 100 Tyr Val Ile Asp Pro 115 Cys Val Glu Cys Pro 130 Val Phe Leu Phe Pro 145 Thr Pro Glu Val 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Glu Cys Pro 130 Val Phe Leu Phe Pro 145 Thr Pro Glu Val Thr 165 Glu Val Gln Phe Asn 180 Lys Thr Lys Pro Arg 195 Ser Val Leu Thr Val 210 Lys Cys Lys Val Ser 225 Ile Ser Lys Thr Lys 245 Pro Pro Ser Arg Glu 260 Pro Ala Val Val Leu 10 Glu Tyr Ala Ser Pro 25 Arg Gln Ala Asp Ser 40 Lys Glu Asp Glu Leu 55 Phe Ser Gly Asn Gln 70 Asp Thr Gly Leu Tyr 90 Tyr Tyr Leu Gly Ile 105 Glu Pro Cys Pro Asp 120 Pro Cys Pro Ala Pro 135 Pro Lys Pro Lys Asp 150 Cys Val Val Val Asp 170 Trp Tyr Val Asp Gly 185 Glu Glu Gln Phe Asn 200 Val His Gln Asp Trp 215 Asn Lys Gly Leu Pro 230 Gly Gln Pro Arg Glu 250 Glu Met Thr Lys Asn 265384Ala Ser Ser Arg Gly 15 Gly Lys Ala Asn Glu 30 Gln Val Thr Glu Val 45 Thr Phe Leu Asp Asp 60 Val Asn Leu Thr Ile 75 Ile Cys Lys Val Glu 95 Gly Asn Gly Thr Gln 110 Ser Asp Glu Arg Lys 125 Pro Val Ala Gly Pro 140 Thr Leu Met Ile Ser 155 Val Ser His Glu Asp 175 Val Glu Val His Asn 190 Ser Thr Phe Arg Val 205 Leu Asn Gly Lys Glu 220 Ala Pro Ile Glu Lys 235 Pro Gln Val Tyr Thr 255 Gln Val 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cctcaccgtt caaaggcctc accacaggtg gacctgcctg gcagccggag cctctacagcAsp Ile Ala Val Glu 285 Lys Thr Thr Pro Pro 300 Ser Lys Leu Thr Val 315 Ser Cys Ser Val Met 330 Ser Leu Ser Leu Ser 345gctcaactca ataccggttt agaggtatcg gtcacagtgc aagggagatg caagttaatc gtcgaactca gtcatcgatc ccgtgcccag gacaccctca gaagaccccg acaaagccac gtgcaccagg ccagccccca tacaccctgc gtcaaaggct aacaactaca aagctcaccg385atctcgctac tttgtaaagc cttccttcgt tccgccaagc aactaacctt ttactattca tgtacccccc ccgaaccctg caccacctgt tgatctcccg aggtccagtt gggaggagca actggctgaa tcgagaaaac ccccatcccg tctaccccag agaccacacc tggacaagagccgaacatgg catgcacgtc gtgtgaatat cgatagtcaa ccttgacgat aggacttcga cccttactac ccctgattct ggcaggaccg gacccctgag caactggtac gttcaacagc cggcaaggag catctccaaa ggaggagatg cgacatcgcc tcccatgctg caggtggcag60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080101998965 A CN 101998971序列表165/171 页caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1140 aagagcctct ccctgtctcc gggtaaataa 1170 <210>224 <211>1170 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223>D3-76IgG2 融合蛋白编码序列 <400>224 atggcttgtc ccttgtactc gctcaaccag gcgtcacccg gttacagaag cccatctgca gccatggata ttgggtattg gatgagcgca tcagtcttcc gtcacgtgcg gtggacggcg acgttccgtg tacaagtgca accaaagggc accaagaacc gtggagtggg gactccgacg caggggaacg aagagcctct ttggatttca ttctcttttt ccgtcgtact gcaaagccaa tctgcgctat caggtacctt ccggactcta gtaatggcac aatgttgtgt tcttcccccc tggtggtgga tggaggtgca tggtcagcgt aggtctccaa agccccgaga aggtcagcct agagcaatgg gctccttctt tcttctcatg ccctgtctcc acgccacaaa tctcctcttc cgcgtcctct cgaagttaga gacatacatg ttccggaaat tatttgtaaa tcagatctac cgagtgccca aaaacccaag cgtgagccac taatgccaag cctcaccgtt caaaggcctc accacaggtg gacctgcctg gcagccggag cctctacagc ctccgtgatg gggtaaataa gctcaactca ataccggttt agaggtatcg gtcacagtgc aaggaagatg caagttaatc gtcgaactca gtcatcgatc ccgtgcccag gacaccctca gaagaccccg acaaagccac gtgcaccagg ccagccccca tacaccctgc gtcaaaggct aacaactaca aagctcaccg catgaggctc atctcgctac tttgtaaagc cttccttcgt tccgccaagc aactaacctt ttactattca tgtacccccc ccgaaccctg caccacctgt tgatctcccg aggtccagtt gggaggagca actggctgaa tcgagaaaac ccccatcccg tctaccccag agaccacacc tggacaagag tgcacaacca ccgaacatgg catgcacgtc gtgtgaatat cgatagtcaa ccttgacgat aggacttcga cccttactac ccctgattct ggcaggaccg gacccctgag caactggtac gttcaacagc cggcaaggag catctccaaa ggaggagatg cgacatcgcc tcccatgctg caggtggcag ctacacgcag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1170<210>225 <211>485 <212>PRT <213> 人工序列386101998965 A CN 101998971序列表166/171 页<220> <223> 人类 CD86- 鼠 Ig 融合蛋白 <400>225 Met Asp Pro Gln Cys 1 5 Ala Phe Leu Leu Ser 20 Asn Glu Thr Ala Asp 35 Ser Leu Ser Glu Leu 50 Leu Asn Glu Val Tyr 65 Lys Tyr Met Gly Arg 85 Leu His Asn Leu Gln 100 His His Lys Lys Pro 115 Glu Leu Ser Val Leu 130 Ser Asn Ile Thr Glu 145 His Gly Tyr Pro Glu 165 Asn Ser Thr Ile Glu 180 Val Thr Glu Leu Tyr 195 Asp Val Thr Ser Asn 210 Thr Arg Leu Leu Ser 225 Pro Pro Pro Gly Val 245 Pro Pro Leu Lys Glu 260 Thr Met Gly Leu Ser 10 Gly Ala Ala Pro Leu 25 Leu Pro Cys Gln Phe 40 Val Val Phe Trp Gln 55 Leu Gly Lys Glu Lys 70 Thr Ser Phe Asp Ser 90 Ile Lys Asp Lys Gly 105 Thr Gly Met Ile Arg 120 Ala Asn Phe Ser Gln 135 Asn Val Tyr Ile Asn 150 Pro Lys Lys Met Ser 170 Tyr Asp Gly Ile Met 185 Asp Val Ser Ile Ser 200 Met Thr Ile Phe Cys 215 Ser Pro Phe Ser Ile 230 Thr Pro Arg Val Pro 250 Cys Pro Pro Cys Ala 265387Asn Ile Leu Phe Val 15 Lys Ile Gln Ala Tyr 30 Ala Asn Ser Gln Asn 45 Asp Gln Glu Asn Leu 60 Phe Asp Ser Val His 75 Asp Ser Trp Thr Leu 95 Leu Tyr Gln Cys Ile 110 Ile His Gln Met Asn 125 Pro Glu Ile Val Pro 140 Leu Thr Cys Ser Ser 155 Val Leu Leu Arg Thr 175 Gln Lys Ser Gln Asp 190 Leu Ser Val Ser Phe 205 Ile Leu Glu Thr Asp 220 Glu Leu Glu Asp Pro 235 Ile Thr Gln Asn Pro 255 Ala Pro Asp Leu Leu 270Met Phe Gln Val Ser 80 Arg Ile Ser Ile Ile 160 Lys Asn Pro Lys Gln 240 Cys Gly101998965 A CN 101998971序Val Phe Ile Phe Pro 280 Ser Pro Met Val Thr 295 Asp Val Gln Ile Ser 310 Gln Thr Gln Thr His 325 Ser Ala Leu Pro Ile 340 Lys Cys Lys Val Asn 360 Ile Ser Lys Pro Arg 375 Pro Pro Pro Ala Glu 390 Met Ile Thr Gly Phe 405 Asn Gly Arg Thr Glu 420 Ser Asp Gly Ser Tyr 440 Thr Trp Glu Arg Gly 455 Leu His Asn His Leu 470 Ser Gly 485列表Val Leu Met Val Ser Glu Val Glu Val 320 Ser Thr Leu 335 Met Ser Gly 350 Ser Pro Ile Pro Gln Val Glu Phe Ser 400 Ala Val Asp 415 Thr Ala Thr 430 Leu Arg Val Ser Val Val Ser Arg Ser 480167/171 页Gly Pro Ser 275 Ile Ser Leu 290 Asp Asp Pro 305 His Thr Ala Arg Val Val Lys Glu Phe 355 Glu Lys Thr 370 Tyr Val Leu 385 Leu Thr Cys Trp Thr Ser Val Leu Asp 435 Gln Lys Ser 450 His Glu Gly 465 Leu Gly LysPro Lys Ile Lys Asp 285 Cys Val Val Val Asp 300 Trp Phe Val Asn Asn 315 Arg Glu Asp Tyr Asn 330 Gln His Gln Asp Trp 345 Asn Arg Ala Leu Pro 365 Gly Pro Val Arg Ala 380 Glu Met Thr Lys Lys 395 Leu Pro Ala Glu Ile 410 Gln Asn Tyr Lys Asn 425 Phe Met Tyr Ser Lys 445 Ser Leu Phe Ala Cys 460 Thr Thr Lys Thr Ile 475<210>226 <211>484 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人类 CD80- 鼠 Ig 融合蛋白 <400>226388101998965 A CN 101998971序列表Pro Ser Lys Cys Pro 15 Gly Leu Ser His Phe 30 Lys Glu Val Ala Thr 45 Leu Ala Gln Thr Arg 60 Thr Met Met Ser Gly 75 Thr Ile Phe Asp Ile 95 Arg Pro Ser Asp Glu 110 Lys Asp Ala Phe Lys 125 Lys Ala Asp Phe Pro 140 Ser Asn Ile Arg Arg 155 Pro His Leu Ser Trp 175 Thr Thr Val Ser Gln 190 Lys Leu Asp Phe Asn 205 Lys Tyr Gly His Leu 220 Lys Gln Glu His Phe 235 Thr Gln Asn Pro Cys 255 Pro Asp Leu Leu Gly 270 Lys Asp Val Leu Met 285 Val Asp Val Ser Glu 300 Asn Asn Val Glu Val Tyr Cys Leu Ile Asp 80 Thr Gly Arg Thr Ile 160 Leu Asp Met Arg Pro 240 Pro Gly Ile Asp His168/171 页Met Gly His Thr Arg 1 5 Leu Asn Phe Phe Gln 20 Ser Gly Val Ile His 35 Ser Cys Gly His Asn 50 Tyr Trp Gln Lys Glu 65 Met Asn Ile Trp Pro 85 Asn Asn Leu Ser Ile 100 Thr Tyr Glu Cys Val 115 Glu His Leu Ala Glu 130 Pro Ser Ile Ser Asp 145 Ile Cys Ser Thr Ser 165 Glu Asn Gly Glu Glu 180 Pro Glu Thr Glu Leu 195 Thr Thr Asn His Ser 210 Val Asn Gln Thr Phe 225 Asp Asn Gly Val Thr 245 Pro Leu Lys Glu Cys 260 Pro Ser Val Phe Ile 275 Ser Leu Ser Pro Met 290 Asp Pro Asp Val GlnArg Gln Gly Thr Ser 10 Leu Leu Val Leu Ala 25 Val Thr Lys Glu Val 40 Val Ser Val Glu Glu 55 Lys Lys Met Val Leu 70 Glu Tyr Lys Asn Arg 90 Val Ile Leu Ala Leu 105 Val Leu Lys Tyr Glu 120 Val Thr Leu Ser Val 135 Phe Glu Ile Pro Thr 150 Gly Gly Phe Pro Glu 170 Leu Asn Ala Ile Asn 185 Tyr Ala Val Ser Ser 200 Phe Met Cys Leu Ile 215 Asn Trp Asn Thr Thr 230 Pro Arg Val Pro Ile 250 Pro Pro Cys Ala Ala 265 Phe Pro Pro Lys Ile 280 Val Thr Cys Val Val 295 Ile Ser Trp Phe Val389101998965 A CN 101998971序列表315 Tyr Asn Ser Thr Leu 335 Asp Trp Met Ser Gly 350 Leu Pro Ser Pro Ile 365 Arg Ala Pro Gln Val 380 Lys Lys Glu Phe Ser 395 Glu Ile Ala Val Asp 415 Lys Asn Thr Ala Thr 430 Ser Lys Leu Arg Val 445 Ala Cys Ser Val Val 460 Thr Ile Ser Arg Ser 475 320 Arg Lys Glu Tyr Leu 400 Trp Val Gln His Leu 480169/171 页305 Thr Ala Gln Thr Gln 325 Val Val Ser Ala Leu 340 Glu Phe Lys Cys Lys 355 Lys Thr Ile Ser Lys 370 Val Leu Pro Pro Pro 385 Thr Cys Met Ile Thr 405 Thr Ser Asn Gly Arg 420 Leu Asp Ser Asp Gly 435 Lys Ser Thr Trp Glu 450 Glu Gly Leu His Asn 465 Gly Lys Ser Gly <210>227 <211>1458 <212>DNA <213> 人工序列310 Thr His Arg Glu Asp 330 Pro Ile Gln His Gln 345 Val Asn Asn Arg Ala 360 Pro Arg Gly Pro Val 375 Ala Glu Glu Met Thr 390 Gly Phe Leu Pro Ala 410 Thr Glu Gln Asn Tyr 425 Ser Tyr Phe Met Tyr 440 Arg Gly Ser Leu Phe 455 His Leu Thr Thr Lys 470<220> <223> 人类 CD86- 鼠 Ig 融合蛋白编码序列 <400>227 atggatcccc tctggtgctg caatttgcaa gaaaacttgg agtgcactat ctcctctgaa actctcaaaa ttctgaatga gggactgagt gattcaagct ccaaagcctg ggtatactta aacattctct tatttcaatg agtgagctag ggcaaagaga ttgtgatggc cttcctgctc 60 agactgcaga cctgccatgc 120 tagtattttg gcaggaccag 180aatttgacag tgttcattcc 240 aagtatatgg gccgcacaag ttttgattcg gacagttgga ccctgagact tcacaatctt 300 cagatcaagg acaagggctt gtatcaatgt atcatccatc acaaaaagcc cacaggaatg 360390101998965 A CN 101998971序accagatgaa tttctaatat cagaacctaa gtattatgca ctgtttcatt agacgcggct gggtgacccc catgcgcagc aggatgtact aggatgaccc agacacaaac tccagcacca tcccatcccc tatatgtctt tgatcacagg agcaaaacta gcaagctcag tccacgaggg ccggataa ttctgaactg aacagaaaat gaagatgagt gaaatctcaa ccctgatgtt tttatcttca cagagtgccc tccagacctc catgatctcc agacgtccag ccatagagag ggactggatg catcgagaaa gcctccacca cttcttacct caagaacacc agtacaaaag tctgcacaat列表ctaacttcag atttgacctg gaaccaagaa cagaactgta tgaccatctt tagagcttga acccctgtcc catccgtctt tggtcacatg ttgtgaacaa gtactctccg agttcaaatg aacccagagg tgactaagaa ctgtggactg tggactctga aaagaggaag ctaagaccat tcaacctgaa ctcatctata ttcaactatc cgacgtttcc ctgtattctg ggaccctcag tccactcaaa catcttccct tgtggtggtg cgtggaagta ggtggtcagt caaggtcaac gccagtaaga agagttcagt gaccagcaat tggttcttac tcttttcgcc ctcccggtct170/171 页attcgcatcc atagtaccaa cacggctacc gagtatgatg atcagcttgt gaaactgaca cctcccccag gagtgtcccc ccaaagatca gatgtgagcg cacacagctc gccctcccca aacagagccc gctccacagg ctgacctgca gggcgtacag ttcatgtaca tgctcagtgg ctgggtaaattcagtgcttg gtgtacataa gttttgctaa gataatgtca acgagcaata cctttctcta ataacacaga ttgggtggac ctgagcccca atcagctggt gattacaaca agtggcaagg accatctcaa gcagaagaga gccgaaattg gcaacagtcc agcacttggg caccttacga420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1458<210>228 <211>1455 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 人类 CD80- 鼠 Ig 融合蛋白编码序列 <400>228 atgggccaca cagctcttgg gaagtgaaag caaactcgca atgaatatat atcgtgatcc tatgaaaaag gacttcccta atttgctcaa cacggaggca tgctggctgg aagtggcaac tctactggca ggcccgagta tggctctgcg acgctttcaa cacctagtat cctctggagg gggaacatca tctttctcac gctgtcctgt aaaggagaag caagaaccgg cccatctgac gcgggaacac atctgacttt ttttcctgag ccatccaagt ttctgttcag ggtcacaatg aaaatggtgc accatctttg gagggcacat ctggctgaag gaaattccaa cctcacctct391gtccatacct gtgttatcca tttctgttga tgactatgat atatcactaa acgagtgtgt tgacgttatc cttctaatat cctggctggacaatttcttt cgtgaccaag agagctggca gtctggggac taacctctcc tgttctgaag agtcaaagct tagaaggata aaatggagaa60 120 180 240 300 360 420 480 540101998965 A CN 101998971序ccatcaacac tggatttcaa gagtgaatca tgacccccag gcgcagctcc atgtactcat atgacccaga cacaaaccca agcaccagga catcccccat atgtcttgcc tcacaggctt aaaactacaa agctcagagt acgagggtct gataa aacagtttcc tatgacaacc gaccttcaac agtgcccata agacctcttg gatctccctg cgtccagatc tagagaggat ctggatgagt cgagaaaacc tccaccagca cttacctgcc gaacaccgca acaaaagagc gcacaatcac列表aaactgagct tcatgtgtct ccaagcaaga cctgtcctcc ccgtcttcat tcacatgtgt tgaacaacgt ctctccgggt tcaaatgcaa ccagagggcc ctaagaaaga tggactggac actctgatgg gaggaagtct agaccatctc ctatgctgtt catcaagtat gcattttcct actcaaagag cttccctcca ggtggtggat ggaagtacac ggtcagtgcc ggtcaacaac agtaagagct gttcagtctg cagcaatggg ttcttacttc tttcgcctgc ccggtctctg171/171 页gaattaaatg agcagcaaac ggacatttaa gataacgggg tgtcccccat aagatcaagg gtgagcgagg acagctcaga ctccccatcc agagccctcc ccacaggtat acctgcatga cgtacagagc atgtacagca tcagtggtcc ggtaaatccgcaagatcctg aaccacagct tggaatacaa acacagaacc ggtggaccat agccccatgg agctggtttg tacaacagta ggcaaggagt atctcaaaac gaagagatga gaaattgctg acagtcctgg acttgggaaa cttacgacta600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1455

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1、10申请公布号CN101998965A43申请公布日20110330CN101998965ACN101998965A21申请号200880114532022申请日2008101560/984,63120071101US61/051,21520080507USC07K14/725200601C07K19/00200601C12N15/12200601C12N15/63200601A61K38/17200601A61P37/00200601C12N15/62200601C12N15/79200601C12N15/85200601C12N5/10200601A61K35/12200601C12P21。

2、/0220060171申请人珀西德治疗有限责任公司地址美国加利福尼亚州72发明人埃里克E卡勒马登M佩邓加特史蒂文H巴斯玛格丽特奈格伯斯约哈庞诺南史蒂文J查平斯里达维斯瓦纳撒恩布伦特R拉森74专利代理机构北京市柳沈律师事务所11105代理人岑晓东54发明名称免疫抑制性多肽与核酸57摘要本发明提供了免疫抑制性多肽以及对此类多肽进行编码的核酸。在一个方面，本发明提供了突变CTLA4多肽以及对突变CTLA4多肽进行编码的核酸。还提供了组合物以及使用此类多肽连同核酸的方法。30优先权数据85PCT申请进入国家阶段日2010050486PCT申请的申请数据PCT/US2008/07998120081015。

3、87PCT申请的公布数据WO2009/058564EN2009050751INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书32页说明书188页序列表171页附图21页CN101998971A1/32页21一种分离或重组的CTLA4多肽，该多肽包括与在SEQIDNO159中所示的人类CTLA4细胞外结构域的多肽序列具有达到15个氨基酸残基差异的一个多肽序列，其中该分离或重组的CTLA4多肽具有结合CD80或CD86或二者之一的一个细胞外结构域的能力，和/或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。2根据权利要求1所述的一种分离或重组的多肽，该多肽具有与SEQIDNO36的多肽序列至少。

4、90的序列一致性。3根据权利要求2所述的一种分离或重组的多肽，该多肽具有与SEQIDNO36的多肽序列至少95的序列一致性。4根据权利要求3所述的一种分离或重组的多肽，该多肽包括SEQIDNO36的多肽序列。5根据权利要求1所述的一种分离或重组的多肽，该多肽具有与SEQIDNO50的多肽序列至少90的序列一致性。6根据权利要求5所述的一种分离或重组的多肽，该多肽具有与SEQIDNO50的多肽序列至少95的序列一致性。7根据权利要求6所述的一种分离或重组的多肽，该多肽包括SEQIDNO50的多肽序列。8如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中CD80是人类CD80并且CD86是人类CD86。9如以。

5、上权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽包括长度为124个氨基酸残基的一个多肽序列。10如以上权利要求中任一项所述的多肽，该多肽包括一个氨基酸取代，该取代在选自下组的一个氨基酸位置上，该组的构成为对应于相对SEQIDNO159的位置50、54、55、56、64、65、70、或85的多个氨基酸位置。11如以上权利要求中任一项所述的多肽，该多肽包括两个氨基酸取代，这些取代在选自下组的多个氨基酸位置上，该组的构成为对应于相对SEQIDNO159的位置50、54、55、56、64、65、70、或85的多个氨基酸位置。12如以上权利要求中任一项所述的多肽，该多肽包括三个氨基酸取代，这些取代在选自下组的多。

6、个氨基酸位置上，该组的构成为对应于相对SEQIDNO159的位置50、54、55、56、64、65、70、或85的多个氨基酸位置。13如以上权利要求中任一项所述的多肽，该多肽包括四个氨基酸取代，这些取代在选自下组的多个氨基酸位置上，该组的构成为对应于相对SEQIDNO159的位置50、54、55、56、64、65、70、或85的多个氨基酸位置。14如权利要求10至13中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置70上的氨基酸取代。15根据如权利要求14所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置70上的氨基酸取代是S70F。16如权利要求10至15中任一项所述的多肽。

7、，该多肽进一步包括一个在相对SEQIDNO159的位置104上的氨基酸取代。17如权利要求16所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置104上的氨基酸权利要求书CN101998965ACN101998971A2/32页3取代是L104E。18如权利要求10至17中任一项所述的多肽，该多肽进一步包括一个在相对SEQIDNO159的位置30上的氨基酸取代。19如权利要求18所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置30上的取代是T30N/D/A。20如权利要求19所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置30上的取代是T30N。21如权利要求10至20中任一项所述的多肽，。

8、该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置64上的氨基酸取代。22如权利要求21所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置64上的氨基酸取代是S64P。23如权利要求10至22中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置50上的氨基酸取代。24如权利要求23所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置50上的氨基酸取代是A50M。25如权利要求10至24中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置54上的氨基酸取代。26根据如权利要求25所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置54上的氨基酸取代是M54K/V。27如权利要。

9、求26所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置54上的氨基酸取代是M54K。28如权利要求10至17中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置65上的氨基酸取代。29如权利要求28所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置65上的氨基酸取代是I65S。30如权利要求10至17中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置56上的氨基酸取代。31如权利要求30所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置56上的氨基酸取代是N56D。32如权利要求10至17中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置55上的。

10、氨基酸取代。33如权利要求32所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置55上的氨基酸取代是G55E。34如权利要求10至17中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置85上的氨基酸取代。35如权利要求34所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置55上的氨基酸取代是M85A。36如权利要求10至17中任一项所述的多肽，该多肽进一步包括一个在相对SEQIDNO159的位置24上的氨基酸取代。权利要求书CN101998965ACN101998971A3/32页437如权利要求36所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置24上的氨基酸取代是A24E。

11、/S。38如权利要求37所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置24上的氨基酸取代是A24E。39如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽具有对于CD86或它的一个细胞外结构域的一种结合亲和力，该结合亲和力是大约等于或大于一种单体人类CTLA4细胞外结构域对于CD86或CD86细胞外结构域的结合亲和力。40如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽具有对于CD80或它的一个细胞外结构域的一种结合亲和力，该结合亲和力大于一种单体人类CTLA4细胞外结构域对于CD80或CD80细胞外结构域的结合亲和力。41如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽具有阻抑一种免疫应答的能力。42。

12、如以上权利要求中任一项所述的多肽，其中该多肽具有抑制T细胞活化或T细胞增殖的能力。43一种分离或重组的多肽多聚体，该多肽多聚体包括至少两个如以上权利要求中任一项所述的多肽。44一种分离或重组的融合蛋白，该融合蛋白包括A如权利要求1至42中任一项所述的一种多肽，以及B一种第二多肽，其中该第二多肽是一种IGFC多肽，并且其中该融合蛋白具有结合CD80和/或CD86、或二者之一的或两者的一个细胞外结构域的能力，和/或调整或调节一种免疫应答的能力。45一种分离或重组的二聚体融合蛋白，该二聚体融合蛋白包括两个根据权利要求44所述的单体融合蛋白。46一种分离或重组的核酸，该核酸包括一个核苷酸序列，该核苷酸。

13、序列编码了如权利要求1至42中任一项所述的一种多肽、权利要求43所述的一种多聚体、权利要求44所述的一种融合蛋白、或权利要求45所述的一种二聚体融合蛋白。47一种载体，该载体包括如权利要求46所述的一种核酸。48一种分离或重组的宿主细胞，该宿主细胞包括A如权利要求1至42中任一项所述的一种多肽；B如权利要求43所述的一种多聚体；C如权利要求44所述的一种融合蛋白；D如权利要求45所述的一种二聚体融合蛋白；E如权利要求46所述的一种核酸；和/或。F如权利要求47所述的一种载体。49一种药物组合物，该药物组合物包括一种药学上可接受的赋形剂或药学上可接受的载体、以及以下的一项或多项A如权利要求1至4。

14、2中任一项所述的一种多肽；B如权利要求43所述的一种多聚体；C如权利要求44所述的一种融合蛋白；D如权利要求45所述的一种二聚体融合蛋白；E如权利要求46所述的一种核酸；权利要求书CN101998965ACN101998971A4/32页5F如权利要求47所述的一种载体；和/或。G如权利要求48所述的一种宿主细胞。50用于阻抑一种免疫应答的一种方法，所述方法包括将一种B7阳性细胞与一个有效量的以下的至少一项进行接触A如权利要求1至42中任一项所述的一种多肽；B如权利要求43所述的一种多聚体；C如权利要求44所述的一种融合蛋白；D如权利要求45所述的一种二聚体融合蛋白；E如权利要求46所述的一种。

15、核酸；F如权利要求47所述的一种载体；和/或。G如权利要求48所述的一种宿主细胞以阻抑一种免疫应答，其中一种免疫应答由此受到阻抑。51如权利要求1至42中任一项所述的一种多肽、权利要求43所述的一种多聚体、权利要求44所述的一种融合蛋白、权利要求45所述的一种二聚体融合蛋白、权利要求46所述的一种核酸、权利要求47所述的一种载体、和/或权利要求48所述的一种宿主细胞，用于阻抑一种免疫应答。52如权利要求1至42中任一项所述的一种多肽、权利要求43所述的一种多聚体、权利要求44所述的一种融合蛋白、权利要求45所述的一种二聚体融合蛋白、权利要求46所述的一种核酸、权利要求47所述的一种载体、和/或。

16、权利要求48所述的一种宿主细胞，在制造用于阻抑一种免疫应答的药物中的用途。53一种分离或重组的多肽，该多肽包括一个多肽序列，该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少95的序列一致性，该组的构成为SEQIDNOS1至73，其中该多肽结合CD80或CD86或二者之一的一个细胞外结构域，和/或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。54如权利要求53所述的多肽，其中CD80是人类CD80并且CD86是人类CD86。55如权利要求53至54中任一项所述的多肽，其中该多肽具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。56如权利要求53至55中任一项所述的多肽，其中该多肽具有抑制T细胞活化的能力。57如权利要求53至。

17、55中任一项所述的多肽，其中该多肽具有抑制T细胞增殖的能力。58如权利要求53至57中任一项所述的多肽，其中该多肽与CTLA4相比具有阻抑或抑制一种免疫应答的更大的能力。59如权利要求53所述的多肽，其中该多肽具有抑制T细胞活化或T细胞增殖的一种能力，该能力大于人类CTLA4抑制T细胞活化或T细胞增殖的能力。60如权利要求53所述的多肽，其中该多肽具有抑制T细胞活化或T细胞增殖的能力，该能力大于人类CTLA4的一种细胞外结构域对T细胞活化或T细胞增殖进行抑制的能力。61如权利要求53至57中任一项所述的多肽，其中该多肽具有抑制一种免疫应答的一种能力，该能力大于包括了在SEQIDNO168中所示。

18、的多肽序列的一种LEA29Y多肽抑制一权利要求书CN101998965ACN101998971A5/32页6种免疫应答的能力。62如权利要求53至61中任一项所述的多肽，其中该多肽包括一个多肽序列，该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少96、97、98、或99的序列一致性，该组的构成为SEQIDNOS1至73。63如权利要求53至62中任一项所述的多肽，其中该多肽包括选自下组的一个多肽序列，该组的构成为SEQIDNOS1至73。64一种分离或重组的多肽，该多肽包括一个多肽序列，该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少95的序列一致性，该组的构成为SEQIDNOS1至73，其中该多。

19、肽结合一个单体人类CD80或单体人类CD86或二者之一的一个细胞外结构域。65如权利要求64所述的多肽，其中该多肽具有对于单体人类CD86的一种结合亲和力，该结合亲和力是大约等于或大于单体人类CTLA4对于单体人类CD86的结合亲和力。66如权利要求64所述的多肽，其中该多肽具有对于单体人类CD86的一种结合亲和力，该结合亲和力是大约等于或大于单体人类CTLA4对于单体人类CD86的结合亲和力。67如权利要求65所述的多肽，其中该多肽具有对于单体人类CD86的一种结合亲和力，该结合亲和力是大约等于或大于单体人类CTLA4对于单体人类CD86的结合亲和力。68如权利要求64至67中任一项所述的多。

20、肽，其中该多肽与单体人类CTLA4相比具有阻抑一种免疫应答的更大的能力、抑制T细胞活化的更大的能力、和/或抑制T细胞增殖的更大的能力。69一种分离或重组的多肽，该多肽包括一个多肽序列，该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少95的序列一致性，该组的构成为SEQIDNOS1至73，其中该多肽具有对于一个人类CD86细胞外结构域或人类CD80细胞外结构域的一种结合亲和力，该结合亲和力对应地是大约等于或大于一种人类CTLA4细胞外结构域对于该人类CD86细胞外结构域或人类CD80细胞外结构域的结合亲和力，并且其中该多肽可任选地具有阻抑一种免疫应答的能力。70如权利要求69所述的多肽，其中该多肽。

21、具有对于该人类CD86细胞外结构域的一种结合亲和力，该结合亲和力大于该人类CTLA4细胞外结构域对于该人类CD86细胞外结构域的结合亲和力。71如权利要求70所述的多肽，其中该多肽具有对于该人类CD80细胞外结构域的一种结合亲和力，该结合亲和力大于该人类CTLA4细胞外结构域对于该人类CD80细胞外结构域的结合亲和力。72如权利要求69至71中任一项所述的多肽，其中该多肽与该人类CTLA4细胞外结构域相比具有阻抑一种免疫应答的更大的能力、抑制T细胞活化的更大的能力、和/或抑制T细胞增殖的更大的能力。73如权利要求53所述的多肽，其中该突变多肽包括长度为124个氨基酸残基的一个多肽序列。74一种。

22、分离或重组的突变CTLA4多肽，该多肽包括一个多肽序列，该多肽序列A与在SEQIDNO159中所示的人类CTLA4细胞外结构域的多肽序列具有不超过11个、不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、或不超过6个氨基酸残基的差异，并且权利要求书CN101998965ACN101998971A6/32页7B包括至少一个氨基酸取代，该取代是在对应于相对SEQIDNO159的位置24、30、32、50、54、55、56、64、65、70、或85的一个氨基酸残基位置上，其中该突变CTLA4多肽具有结合CD80或CD86或二者之一的一个细胞外结构域的能力，和/或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。75。

23、如权利要求74所述的多肽，其中CD80是人类CD80并且CD86是人类CD86。76如权利要求74所述的多肽，其中该突变多肽包括长度为124个氨基酸残基的一个多肽序列。77如权利要求74所述的多肽，该多肽包括两个氨基酸取代，这些取代是在选自下组的多个氨基酸位置上，该组的构成为对应于相对SEQIDNO159的位置24、30、32、50、54、55、56、64、65、70、85、或104的多个氨基酸位置。78如权利要求74所述的多肽，该多肽包括三个氨基酸取代，这些取代是在选自下组的多个氨基酸位置上，该组的构成为对应于相对SEQIDNO159的位置24、30、32、50、54、55、56、64、65。

24、、70、85、或104的多个氨基酸位置。79如权利要求74所述的多肽，该多肽包括四个氨基酸取代，这些取代是在选自下组的多个氨基酸位置上，该组的构成为对应于相对SEQIDNO159的位置24、30、32、50、54、55、56、64、65、70、85、或104的多个氨基酸位置。80如权利要求74所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置70上的氨基酸取代。81如权利要求80所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置70上的氨基酸取代是S70F。82如权利要求74至81中任一项所述的多肽，该多肽进一步包括一个在相对SEQIDNO159的位置104上的氨基酸取代。83如权利要。

25、求82所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置104上的氨基酸取代是L104E。84如权利要求74至83中任一项所述的多肽，该多肽进一步包括一个在相对SEQIDNO159的位置30上的氨基酸取代。85如权利要求84所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置30上的取代是T30N/D/A。86如权利要求85所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置30上的取代是T30N。87如权利要求74至86中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置64上的氨基酸取代。88如权利要求87所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置64上的氨基酸取代是S6。

26、4P。89如权利要求74至88中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置50上的氨基酸取代。90如权利要求89所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置50上的氨基酸取代是A50M。91如权利要求74至83中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159权利要求书CN101998965ACN101998971A7/32页8的位置54上的氨基酸取代。92如权利要求91所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置54上的氨基酸取代是M54K/V。93如权利要求92所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置54上的氨基酸取代是M54K。94如。

27、权利要求74至83中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置65上的氨基酸取代。95如权利要求94所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置65上的氨基酸取代是I65S。96如权利要求74至83中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置56上的氨基酸取代。97如权利要求96所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置56上的氨基酸取代是N56D。98如权利要求74至83中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置55上的氨基酸取代。99如权利要求98所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置55上的氨基。

28、酸取代是G55E。100如权利要求74至83中任一项所述的多肽，该多肽包括一个在相对SEQIDNO159的位置85上的氨基酸取代。101如权利要求100所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置55上的氨基酸取代是M85A。102如权利要求74至83中任一项所述的多肽，该多肽进一步包括一个在相对SEQIDNO159的位置24上的氨基酸取代。103如权利要求102所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置24上的氨基酸取代是A24E/S。104如权利要求103所述的多肽，其中该在相对SEQIDNO159的位置24上的氨基酸取代是A24E。105如权利要求74至104中任一项所述的。

29、多肽，其中该多肽具有对于CD86或它的一个细胞外结构域的一种结合亲和力，该结合亲和力是大约等于或大于一种单体人类CTLA4细胞外结构域对于CD86或CD86细胞外结构域的结合亲和力。106如权利要求74至105中任一项所述的多肽，其中该多肽具有对于CD80或它的一个细胞外结构域的一种结合亲和力，该结合亲和力大于一种单体人类CTLA4细胞外结构域对于CD80或CD80细胞外结构域的结合亲和力。107如权利要求74至106中任一项所述的多肽，其中该多肽具有阻抑一种免疫应答的能力。108如权利要求74至107中任一项所述的多肽，其中该多肽具有抑制T细胞活化或T细胞增殖的能力。109一种分离或重组的多。

30、肽，该多肽包括一个多肽序列，该多肽序列包括I与由SEQIDNOS1至73所构成的组中选出的一个多肽序列至少95的序列一致性，以及II权利要求书CN101998965ACN101998971A8/32页9一个苯丙胺酸残基，该苯丙胺酸残基在对应于由SEQIDNOS1至73所构成的组中选出的所述多肽序列的位置70的氨基酸位置上，其中该多肽具有结合CD80和/或CD86、或二者之一的或两者的一个细胞外结构域的能力，和/或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。110如权利要求109所述的多肽，其中该多肽包括以下的一项或多项在对应于位置24的一个氨基酸位置上的一个谷氨酸残基；在对应于对应位置30的一个氨基酸位。

31、置上的一个天冬酰胺残基；在对应于位置32的一个氨基酸位置上的一个异亮氨酸残基；在对应于位置50的一个氨基酸位置上的一个甲硫氨酸残基；在对应于位置54的一个氨基酸位置上的一个赖氨酸残基；在对应于位置55的一个氨基酸位置上的一个谷氨酸残基；在对应于位置56的一个氨基酸位置上的一个天冬氨酸残基；在对应于位置64的一个氨基酸位置上的一个脯氨酸残基；在对应于位置65的一个氨基酸位置上的一个丝氨酸残基；以及在对应于位置104的一个氨基酸位置上的一个谷氨酸残基；111一种分离或重组的突变CTLA4多肽，该多肽结合CD80和/或CD86、和/或二者之一的或两者的一个细胞外结构域，和/或可阻抑一种免疫应答，所述。

32、多肽包括一个多肽序列，该多肽序列A与在SEQIDNO159中所示的人类CTLA4细胞外结构域多肽的多肽序列具有不超过6个氨基酸残基的差异，并且B包括至少一个氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代包括S70F，其中根据SEQIDNO159对多个氨基酸残基位置进行编号。112如权利要求111所述的多肽，该多肽进一步包括至少一个氨基酸取代，该氨基酸取代选自下组，其构成为A24E、T30N、V32I、D41G、A50M、M54K、G55E、N56D、S64P、I65S、M85A、L104E、以及I106F。113一种分离或重组的多肽，该多肽包括选自下组的一个多肽序列，该组的构成为SEQIDNOS1至7。

33、9，或任何所述多肽序列的一个片段，其中所述片段结合CD80和/或CD86、和/或二者之一的或两者的一个细胞外结构域，和/或具有阻抑或抑制一种免疫应答的能力。114如权利要求113所述的多肽，其中该片段结合人类CD80以及人类CD86和/或它们对应的细胞外结构域。115如权利要求53至114中任一项所述的多肽，其中该多肽是一种可溶性多肽。116一种分离或重组的蛋白，该蛋白包括A如权利要求53至115中任一项所述的一种多肽，以及B协助该多肽的分泌的一种肽。117如权利要求116所述的蛋白，其中该肽是一种信号肽。118如权利要求117所述的蛋白，其中该信号肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列具有与SE。

34、QIDNO182或SEQIDNO216的氨基酸序列至少95的序列一致性。119如权利要求118所述的蛋白，其中该信号肽包括SEQIDNO182或SEQIDNO权利要求书CN101998965ACN101998971A9/32页10216的氨基酸序列。120一种分离或重组的蛋白，该蛋白包括如权利要求53至115中任一项所述的一种多肽，以及一个跨膜结构域。121如权利要求120所述的蛋白，其中该跨膜结构域包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列与包括SEQIDNO160的氨基酸残基162至182的一个氨基酸序列具有至少95的一致性。122如权利要求121所述的蛋白，其中该跨膜结构域包括SEQIDNO160。

35、的氨基酸残基162至182。123如权利要求120所述的蛋白，该蛋白进一步包括一个胞质域。124如权利要求122所述的蛋白，其中该胞质域包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列与包括SEQIDNO160的氨基酸残基183至223的一个氨基酸序列具有至少95的一致性。125如权利要求124所述的蛋白，其中该胞质域包括一个氨基酸序列，该氨基酸序列包括SEQIDNO160的氨基酸残基183至223。126如权利要求120至125中任一项所述的蛋白，该蛋白进一步包括一种信号肽。127如权利要求53至115中任一项所述的多肽或如权利要求116至126中任一项所述的蛋白，其中该多肽的氨基酸残基中的一个或多个被糖基。

36、化。128如权利要求53至115或127中任一项所述的多肽或如权利要求116至127中任一项所述的蛋白，其中该多肽的氨基酸残基中的一个或多个被聚乙二醇化。129一种分离或重组的多肽多聚体，该多肽多聚体包括至少两个如权利要求53至115中任一项所述的多肽或至少两个权利要求116至128中任一项所述的蛋白。130如权利要求129所述的多聚体，其中该至少两个多肽中的所有都是相同的。131如权利要求129所述的多聚体，其中该多聚体是可阻抑或抑制一种免疫应答的。132如权利要求129所述的多聚体，其中该多聚体是可抑制T细胞活化或T细胞增殖的。133如权利要求129所述的多聚体，其中该多聚体包括四个多肽。。

37、134一种分离或重组的多肽二聚体，该二聚体包括两个如权利要求53至115中任一项所述的多肽。135如权利要求134所述的二聚体，其中该二聚体是一种同型二聚体。136如权利要求134所述的二聚体，其中该二聚体是一种异型二聚体。137如权利要求134所述的二聚体，其中该二聚体是可阻抑或抑制一种免疫应答的。138如权利要求134所述的二聚体，其中该二聚体是可抑制T细胞活化或T细胞增殖的。139一种分离或重组的多肽二聚体，该多肽二聚体包括两个如权利要求53至115中任一项所述的多肽，其中该二聚体具有对于人类CD86或它的一个细胞外结构域的一种结合亲合力，该结合亲合力对应地是大约等于或大于包括两个人类C。

38、TLA4细胞外结构域的一个二聚体对于人类CD86或它的一个细胞外结构域的结合亲合力。140一种分离或重组的多肽二聚体，该多肽二聚体包括两个如权利要求53至115中任一项所述的多肽，其中该二聚体具有对于人类CD80或它的一个细胞外结构域的一种结合权利要求书CN101998965ACN101998971A10/32页11亲合力，该结合亲合力对应地是大约等于或大于包括两个人类CTLA4细胞外结构域的一个二聚体对于人类CD80或它的一个细胞外结构域的结合亲合力。141如权利要求139所述的二聚体，其中该二聚体具有对于人类CD80或它的一个细胞外结构域的一种结合亲合力，该结合亲合力对应地是大约等于或大于。

39、包括两个人类CTLA4细胞外结构域的一个二聚体对于人类CD80或它的一个细胞外结构域的结合亲合力。142如权利要求140所述的二聚体，其中该二聚体具有对于人类CD86或它的一个细胞外结构域的一种结合亲合力，该结合亲合力对应地是大于包括两个LEA29Y多肽的一个二聚体对于人类CD86或它的一个细胞外结构域的结合亲合力，其中每个LEA29Y多肽包括在SEQIDNO168中所示的多肽序列。143如权利要求140所述的二聚体，其中该二聚体以一个速率从结合的人类CD86或它的一个细胞外结构域中解离，该速率对应地是小于包括两个人类CTLA4细胞外结构域的一个二聚体从结合的人类CD86或它的一个细胞外结构域。

40、中解离的速率。144如权利要求140所述的二聚体，其中该二聚体以一个速率从结合的人类CD86或它的一个细胞外结构域中解离，该速率对应地是小于包括两个LEA29Y多肽的一个二聚体从结合的人类CD86或它的一个细胞外结构域中解离的速率，其中每个LEA29Y多肽包括在SEQIDNO168中所示的多肽序列。145如权利要求140所述的二聚体，其中该二聚体以一个速率与人类CD86或它的一个细胞外结构域相结合，该速率对应地是大于包括两个人类CTLA4细胞外结构域的一个二聚体与人类CD86或它的一个细胞外结构域相结合的速率。146如权利要求140所述的二聚体，其中该二聚体以一个速率与人类CD86或它的一个细。

41、胞外结构域相结合，该速率对应地是大于包括两个LEA29Y多肽的一个二聚体与人类CD86或它的一个细胞外结构域相结合的速率，其中每个LEA29Y多肽包括在SEQIDNO168中所示的多肽序列。147一种分离或重组的多肽二聚体，该多肽二聚体包括两个如权利要求53至115中任一项所述的多肽，其中包括两个人类CTLA4细胞外结构域或两个LEA29Y多肽的一个二聚体相比该二聚体具有阻抑一种免疫应答的更大的能力。148如权利要求147所述的二聚体，其中该二聚体与包括两个人类CTLA4细胞外结构域的一个二聚体相比具有抑制T细胞活化或T细胞增殖的更大的能力。149一种分离或重组的多肽二聚体，该二聚体包括两个如。

42、权利要求53至115中任一项所述的多肽，其中该二聚体具有一个CD86平衡解离常数KD，该CD86平衡解离常数小于包括了两个人类CTLA4细胞外结构域或两个LEA29Y多肽的一种二聚体的CD86平衡解离常数KD。150一种分离或合成的偶联物，该偶联物包括A如权利要求1至115中任一项所述的一种多肽，以及B共价地附连至该多肽上的一个非多肽部分。151如权利要求150所述的偶联物，其中该偶联物结合了CD80或CD86或二者之一的一个细胞外结构域。152如权利要求151所述的偶联物，其中CD80是人类CD80并且CD86是人类CD86。153如权利要求150所述的偶联物，该偶联物包括至少两个非多肽部分。

43、。权利要求书CN101998965ACN101998971A11/32页12154如权利要求153所述的偶联物，其中该非多肽部分是一个糖分子。155如权利要求154所述的偶联物，其中该糖分子是附连于一个N糖基化位点上的。156如权利要求150所述的偶联物，其中该非多肽部分是一种聚合物。157如权利要求156所述的偶联物，其中该聚合物是一个聚乙二醇部分。158如权利要求157所述的偶联物，其中该聚乙二醇部分是共价地附连于该多肽的一个半胱氨酸残基上的。159如权利要求157所述的偶联物，该偶联物包括共价地附连于该多肽的一个赖氨酸残基上的一个聚乙二醇部分。160如权利要求159所述的偶联物，该偶联物。

44、包括共价地附连于该多肽的N端氨基基团上的一个聚乙二醇部分。161一种分离或重组的融合蛋白，该融合蛋白包括A一个第一多肽，该多肽包括一个多肽序列，该多肽序列具有与选自下组的至少一种多肽序列至少95的一致性，该组的构成为SEQIDNOS1至73，以及B一个第二多肽，其中该第二多肽是一个IGFC多肽，其中该融合蛋白具有结合CD80和/或CD86、或二者之一的或两者的一个细胞外结构域的一种能力，和/或调整或调节一种免疫应答的能力。162如权利要求161所述的融合蛋白，其中该融合蛋白调整或调节了T细胞的活化或增殖或细胞因子的产生。163如权利要求161或162所述的融合蛋白，其中该第二多肽是直接地与该第。

45、一多肽进行融合的。164如权利要求161或162所述的融合蛋白，其中该第二多肽是与一个连接物氨基酸序列进行融合的，该氨基酸序列是与该第一多肽进行融合的。165如权利要求161所述的融合蛋白，其中该第二多肽是与该第一多肽的C端进行融合的。166如权利要求161所述的融合蛋白，其中该第二多肽包括一个IG重链恒定区的一个或多个结构域。167如权利要求161所述的融合蛋白，其中该第二多肽包括一种IG多肽的一个铰链区、CH2结构域、以及CH3结构域。168如权利要求161所述的融合蛋白，其中该IGFC多肽是一种野生型人类IGFC多肽或一种突变IGFC多肽。169如权利要求161所述的融合蛋白，其中该第二。

46、多肽包括一种人类IG多肽的一个铰链区、CH2结构域、以及CH3结构域。170如权利要求169所述的融合蛋白，其中该人类IG多肽是一种人类IGG多肽，该人类IGG2多肽可任选地是人类IGG2FC多肽。171一种分离或重组的融合蛋白二聚体，该融合蛋白二聚体包括经由至少一个二硫键连接的两个单体融合蛋白，该二硫键在每个单体突变融合蛋白中存在的两个半胱氨酸残基之间形成，其中每个单体融合蛋白包括A一个多肽，该多肽包括一个多肽序列，该多肽序列具有与选自下组的至少一个多肽序列至少95的一致性，该组的构成为SEQIDNOS1至73，以及B一个IGFC多肽，其中该融合蛋白二聚体具有结合CD80和/或CD86、和/。

47、或CD80IG和/或CD86IG的能力，和/或具有抑制或阻抑一种免疫应答的能力。权利要求书CN101998965ACN101998971A12/32页13172一种分离或重组的融合蛋白二聚体，该融合蛋白二聚体包括两个单体融合蛋白，其中每个这种单体融合蛋白包括1一个多肽，该多肽包括一个多肽序列，该多肽序列与选自下组的一种多肽序列具有不超过10、9、8、7或6个氨基酸残基的差异，该组的构成为SEQIDNOS1至73，并且其中在该多肽序列中在位置24、30、32、41、50、54、55、56、64、65、70、或85上的氨基酸残基是与在所述所选择的多肽序列的对应位置上的氨基酸残基相同的，以及2一个I。

48、GFC多肽，其中该融合蛋白二聚体结合CD80和/或CD86，和/或抑制一种免疫应答。173一种分离或重组的融合蛋白二聚体，该融合蛋白二聚体包括两个单体融合蛋白，其中每个单体融合蛋白包括1一个突变CTLA4细胞外结构域多肽，该多肽包括一个多肽序列，该多肽序列I与在SEQIDNO159中所示的人类CTLA4细胞外结构域的多肽序列具有不超过10、9、8、7、或6个氨基酸残基的差异，并且II包括至少一个氨基酸取代，该取代是在对应于相对SEQIDNO159的位置24、30、32、50、54、55、56、64、65、70、或85的一个氨基酸位置上；以及2一个IGFC多肽，其中该融合蛋白二聚体结合CD80和。

49、/或CD86、和/或阻抑或抑制一种免疫应答。174一种分离或重组的突变CTLA4IG融合蛋白二聚体，该融合蛋白二聚体包括两个突变CTLA4IG融合蛋白单体，其中每个突变CTLA4IG融合单体包括1一个突变CTLA4ECD多肽，该多肽包括一个多肽序列，该多肽序列A与在SEQIDNO159中所示的人类CTLA4细胞外结构域的多肽序列具有不超过10、9、8、7、或6个氨基酸残基的差异，并且B包括在相对于SEQIDNO159的多个氨基酸位置上的一个或多个取代，这种或这些取代选自下组，其构成为A50M、M54K、G55E、N56D、S64P、I65S、以及S70F；以及2一个IGFC多肽，该IGFC多肽可任选地是IGG2FC多肽，其中该突变CTLA4IG二聚体结合了HCD80或HCD86，和/或阻抑或抑制一种免疫应答。175一种分离或重组的融合蛋白二聚体，该融合蛋白二聚体包括两个如权利要求161至171以及314至316中任一项所述的单体融合蛋白，其中这两个单体融合蛋白是经由以下各项连接的I在两个半胱氨酸残基之间形成的至少一个二硫键，其中每个半胱氨酸残基是存在于这两个第一多肽之一中的，和/或II在两个半胱氨酸残基之间形成的至少一个二硫键，其中每个半胱氨酸残基是存在于这两个第二多肽之一中的。176如权利要求171、172、173、或174所述的融合蛋白二聚体，。

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