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1、10申请公布号CN102001921A43申请公布日20110406CN102001921ACN102001921A21申请号201010119062622申请日20100308CCTCCNOM201004420100205C07C43/23200601C12P7/22200601A61K31/085200601A61P31/16200601C12R1/64520060171申请人中国海洋大学地址266100山东省青岛崂山区松岭路238号72发明人李德海顾谦群张国建朱天骄54发明名称倍半萜混对苯二酚类化合物及其制备方法和用途57摘要本发明涉及两种倍半萜混苯二酚类化合物的制备方法和用途。本发明用。
2、采自南海海绵样品中的链格孢菌SP32ALTERNARIASP生产出结构新颖的倍半萜混苯二酚类化合物。经实验证实，该类化合物具有抗甲型H1N1流感病毒作用，有开发成为抗甲流药物制剂的潜力。83生物保藏信息51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页CN102001931A1/1页21化合物I结构其中R1R4为羟基、R5为甲氧基。2权利要求1所述化合物的制备方法，其特征是发酵培养链格孢菌SP32ALTERNARIASP获取含有上述化合物的发酵物，然后从发酵物中分离纯化出所示化合物。3权利要求2所述的制备方法，其中将所述发酵物经硅胶柱层析，以石油醚、石油醚丙。
3、酮，氯仿，氯仿甲醇为溶剂进行梯度洗脱，氯仿甲醇973洗脱部分，再经SEPHADEXLH20凝胶柱层析及制备HPLC分离纯化得所示化合物。4权利要求1所述的化合物在制备研发抗甲型H1N1流感病毒药物中的用途。权利要求书CN102001921ACN102001931A1/4页3倍半萜混对苯二酚类化合物及其制备方法和用途技术领域0001本发明涉及用链格孢菌SP32ALTERNARIASP保藏编号是CCTCCM2010044生产倍半萜混苯二酚类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备抗甲型H1N1流感药物中的用途。背景技术0002倍半萜混苯酚类化合物是多产生于海绵、海鞘等无脊椎动物的一种活性混源萜类。
4、化合物，但链格孢菌作为其来源未见报道。本发明人研究得知，链格孢菌SP32ALTERNARIASP保藏编号CCTCCM2010044，保藏日期2010年2月5日，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址武汉市武汉大学液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的抗甲型H1N1流感病毒增殖作用，遂对其活性成分进行了研究。研究发现所示倍半萜混苯二酚类化合物具有较强的抗甲型H1N1流感病毒活性，目前尚未见该化合物的化学结构及抗甲型H1N1流感病毒的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。发明内容0003本发明旨在提供一个结构独特的具有抗甲型H1N1流感病毒作用的新化合物。其结构式为0004式I化合物00050。
5、006其结构特征是此结构是新颖的倍半萜混苯酚类化合物，其中R1R5为氢、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。0007本发明优选的结构中R1R4为羟基、R5为甲氧基。0008本发明所涉及的化合物可通过微生物发酵培养来获取含有倍半萜混苯酚类化合物的发酵物，然后从发酵物中采用硅胶柱层析、SEPHADEXLH20凝胶柱层析制备HPLC等方法分离纯化得到。0009本发明的下述实施例中列举了利用链格孢菌SP32ALTERNARIASP保藏编号是CCTCCM2010044制备本发明所示化合物的实例。具体实施方式0010在如下的实施例中所指的化合物的化学结构结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位为001。
6、1说明书CN102001921ACN102001931A2/4页40012实施例1化合物的发酵生产及分离精制00131发酵生产0014生产菌的发酵培养按培养微生物的常规方法，取链格孢菌SP32ALTERNARIASP保藏编号是CCTCCM2010044适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。0015取斜面培养4天的链格孢菌SP32ALTERNARIASP适量，接种到装有200ML培养液培养基组成克/升麦芽糖200，甘露醇200，味精100，KH2PO405，MGSO403，酵母膏30，PH自然的500ML锥型瓶中，在28、160转/分钟条件下摇床培养8天，获得菌丝体和。
7、发酵液。00162浸膏的获得0017用棉布将菌丝体和发酵液分离。将发酵液等体积乙酸乙酯萃取三次，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏。00183化合物的分离精制0019浸膏用氯仿甲醇混合溶剂溶解后，加200300目硅胶青岛海洋化工集团公司产品拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚、石油醚丙酮，氯仿，氯仿甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为5个流份。将FR4氯仿甲醇973洗脱物以氯仿甲醇11为溶剂进行LH20柱层析，再经加压硅胶柱层析以石油醚丙酮9155为溶剂，最后经半制备反相高效液相色谱甲醇水6535得所示化合物。0020化合物I无色油状，正离子ESIMSM/Z4152MNA，44C01，MEOH。
8、，分子式C22H34O5，IRKBRCM11693，1620，1509，1441，1308，1222，1017，990。1H和13CNMR数据见表1。0021表1化合物I的1H和13CNMR数据600和150MHZ，INDMSOD6A0022说明书CN102001921ACN102001931A3/4页50023A本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用S单重峰、D二重峰、T三重峰和Q四重峰表示。0024B此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的13C核。0025C此栏中的数字和代号分别代表在1H1H。
9、COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。0026实施例2体外抗H1N1病毒活性的测试00271实验样品及实验方法0028被测样品溶液的配制测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物I纯品。精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供测活性。0029病毒株及受感染细胞系的培养采用甲型流感病毒株A/PR/8/34H1N1感染狗肾上皮细胞MDCK，于感染同时将待测样品加入细胞维持液不含血清中，在37摄氏度下通入5二氧化碳的培养箱中继代培养，而后采用倒置显微镜观察感染细胞的CPE细说明书CN102001921ACN102001931A4/4页6胞病变情况。0030四氮唑盐MTT法取。
10、对数生长期的狗肾上皮细胞MDCK细胞，将细胞密度调至每毫升2105个细胞，按每孔50微升接种于96孔细胞培养板中，于37通入5CO2的培养箱中培养24小时。每孔接种50L的1000TCID50的甲型流感病毒液，于37吸附60MIN，弃病毒上清。每孔加入200L细胞维持液无血清，含有5G/ML胰蛋白酶，然后在相应的孔分别加入样品液或阳性对照药各2L，并设阳性对照组利巴韦林，正常细胞对照组不感染病毒和病毒对照组不加药。将培养板置37继续培养，每日观察CPE情况，在病毒对照组有75100的CPE出现时，弃培养液上清，每孔加入含5MG/MLMTT的不含血清的培养液50微升，继续培养23小时，小心吸去上清。每孔加入DMSO各100L，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶完全溶解后，利用MD公司产SPECTRAMAXPLUS型酶标仪测定每孔在570NM处的吸光值OD值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔。取三孔平均OD值，按病毒抑制率IROD样品组OD病毒组/OD正常组OD病毒组100计算每个浓度下的病毒增殖抑制率IR。00312实验结果0032在MTT法测试中，化合物I对H1N1病毒增殖抑制结果见表20033表2化合物I对H1N1病毒增殖的抑制率003400353结论0036该类化合物具有抗甲型H1N1流感病毒作用，有开发成为抗甲流药物制剂的潜力。说明书CN102001921A。