用于养殖淡水鱼二联口服疫苗及制备和使用方法.pdf

本发明涉及一种用于养殖淡水鱼二联口服疫苗，包含按质量分数构成的如下组份，药用淀粉：2.5-3.5份、麦芽糊精：0.8-1.2份、浓度为6×1010cfu/mL的嗜水气单胞菌菌液：0.5-0.8份及浓度为6×1010cfu/mL的豚鼠气单胞菌菌液：0.5-0.8份；该二联口服疫苗的制备包括方法步骤为：⑴灭活、⑵微丸制备、⑶肠溶层包衣制备及⑷诱食剂的喷涂；该二联口服疫苗的使用方法包括步骤为，⑴第一次投喂和⑵加强投喂。本发明制备了嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌二联口服疫苗，并采用投喂接种的方法，免疫效果理想，工作量小，适合大规模接种，同时，疫苗在肠道中迅速释放，获得高效免疫效果。

权利要求书
1.  一种用于养殖淡水鱼二联口服疫苗，其特征在于：包含按质量分数构成的如下组份：


2.  根据权利要求1所述的用于养殖淡水鱼二联口服疫苗，其特征在于：所述嗜水气单胞 菌菌液和豚鼠气单胞菌菌液为经过了0.5％的甲醛灭活。

3.  一种用于养殖淡水鱼类二联口服疫苗的制备，其特征在于方法如下：
⑴灭活：使用0.5％的甲醛对浓度为6×1010cfu/mL的嗜水气单胞菌菌液和浓度为6× 1010cfu/mL的豚鼠气单胞菌菌液进行灭活；
⑵微丸制备：
①将上述二联口服疫苗所包含的按质量分数构成的如下组份：

混合均匀成微湿的软材；
②制微丸：对上述软材使用微丸机制微丸，微丸机采用200-400转/分钟的转速，制备 成10～20目的微丸；
⑶肠溶层包衣制备：
①将主要成分为肠溶型丙烯酸树脂包衣材料溶于80％的乙醇中，制备成10％～15％的悬浊 液；
②使用包衣机将上述悬浊液均匀喷涂于疫苗微丸的表面；
⑷诱食剂的喷涂：
①将诱食剂二甲基-β-丙酸噻亭溶于水中，制成10％～30％的水溶液；
②使用包衣机将上述水溶液均匀喷涂于上述制备的肠溶层包衣表面。

4.  根据权利要求3所述的用于养殖淡水鱼二联口服疫苗的制备，其特征在于：所述步 骤⑵中制备成的微丸的有效疫苗含量为1.8×1010cfu/g量级水平。

5.  根据权利要求3所述的用于养殖淡水鱼二联口服疫苗的制备，其特征在于：所述步 骤⑶的①的步骤中肠溶型丙烯酸树脂的具体标号为EOBS68，pH6.8。

6.  根据权利要求3所述的用于养殖淡水鱼二联口服疫苗的制备，其特征在于：所述步 骤⑷的①的步骤中诱食剂二甲基-β-丙酸噻亭，以牛磺酸代替。

7.  一种用于养殖淡水鱼类二联口服疫苗的使用方法，其特征在于包括方法步骤如下：
⑴第一次投喂：在当天正常饵料投喂间隔，将二联口服疫苗微丸投喂鱼，投喂量为正常 饵料量的50％，当天2次，同时，当天正常饵料投喂量减半，第一次投喂连续2天；
⑵加强投喂；在第一次投喂疫苗微丸后的第14－28天中的任一天开始，进行与第一次 投喂方法及投喂量相同的加强投喂。

说明书用于养殖淡水鱼二联口服疫苗及制备和使用方法
技术领域
本发明属于养殖淡水鱼疫苗及使用的技术领域，特别是一种用于养殖淡水鱼二联口服疫 苗及制备和使用方法。
背景技术
目前我国淡水鱼的疾病呈逐年增加趋势，尤其是嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌的流行， 造成了巨大的经济损失，严重阻碍了我国淡水鱼产业的发展。目前鱼类细菌性疾病主要是通 过采用抗菌药物结合优化养殖技术的方法进行疾病的预防和治疗。然而，长期使用抗生素及 化学药品，使大部分细菌产生了较强且广泛的耐药性，并且还造成环境污染以及药物残留超 标等食品安全问题。由于药残问题，多次造成我国的水产品出口受限。为了达到环境安全、 食品安全及无公害水产养殖的目的，国家已经命令禁止生产和使用危害严重的药物，尽量少 用或不用药物。随着免疫学技术的发展，近年来诸多学者研究表明疫苗免疫接种是防治鱼类 细菌性疾病的有效方法，为鱼类细菌病的防治寻找到了另一有效安全的防治途径，是我国科 学研究重点支持的领域之一。
随着高密度、设施集约化养殖模式的普及，鱼类细菌性疾病呈现出多重感染、混合感染、 交叉感染的新趋势，同时感染多种细菌的情况非常普遍，因此一些学者开展了二联疫苗、三 联疫苗和多联疫苗研究。如近些年已经开展了嗜水气单胞菌和温和气单胞菌二联疫苗对黄鳝 的免疫效果研究、开展了嗜水气单胞菌和河弧菌二联疫苗对鲫的免疫效果研究、开展了嗜水 气单胞菌与迟缓爱德华氏菌亚单位二联疫苗对小鼠的免疫效果、开展了三联疫苗预防斑点叉 尾鮰细菌性疾病研究。以上研究大部分采用注射和浸泡免疫方法，由于浸泡具有免疫效果差、 疫苗用量大等缺点，注射接种疫苗操作过程繁琐、工作量大、伤口容易感染等，均不适宜在 生产实践中应用。口服接种具有免疫效果好、操作方便、刺激较小以及工作强度小等特点， 适宜在生产中大规模应用，成为当前的研究热点。
另外，近年来也有科研人员采用2％海藻酸钠、6％PVP-K30制备了银鲫口服嗜水气单胞菌 微胶囊疫苗，相对免疫保护率为61.1％，高于全细胞疫苗组的50％；用聚乳酸—乙醇酸共聚物 PLG和聚乙烯醇采用复乳挥发法制备嗜水气单胞菌口服疫苗，产品相对免疫保护率为42.9％， 高于全细胞疫苗组的32.1％。以上研究均是希望递送疫苗到后肠，刺激肠道粘膜免疫相关淋巴 组织发挥免疫作用。但是，以上技术没有对相关鱼类的胃肠道消化生理特性研究，也没有对 其进行耐酸性研究，因此疫苗有效成分不能实现肠道释放的目的，由于鱼用疫苗易受温度、 酸碱度、胃蛋白酶影响，直接口服接种会损坏疫苗，降低疫苗免疫效果，如果疫苗过早释放， 将被胃酸、消化酶分解，不能起到免疫保护作用，限制了其在生产中的应用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，而提出一种用于养殖淡水鱼二联口服疫苗及制备 和使用方法。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一种用于养殖淡水鱼二联口服疫苗，包含按质量分数构成的如下组份：

而且，所述嗜水气单胞菌菌液和豚鼠气单胞菌菌液为经过了0.5％的甲醛灭活。
一种用于养殖淡水鱼类二联口服疫苗的制备，方法如下：
⑴灭活：使用0.5％的甲醛对浓度为6×1010cfu/mL的嗜水气单胞菌菌液和浓度为6× 1010cfu/mL的豚鼠气单胞菌菌液进行灭活；
⑵微丸制备：
①将上述二联口服疫苗所包含的按质量分数构成的如下组份：

混合均匀成微湿的软材；
②制微丸：对上述软材使用微丸机制微丸，微丸机采用200-400转/分钟的转速，制备 成10～20目的微丸；
⑶肠溶层包衣制备：
①将主要成分为肠溶型丙烯酸树脂包衣材料溶于80％的乙醇中，制备成10％～15％的悬浊 液；
②使用包衣机将上述悬浊液均匀喷涂于疫苗微丸的表面；
⑷诱食剂的喷涂：
①将诱食剂二甲基-β-丙酸噻亭溶于水中，制成10％～30％的水溶液；
②使用包衣机将上述水溶液均匀喷涂于上述制备的肠溶层包衣表面。
而且，所述步骤⑵中制备成的微丸的有效疫苗含量为1.8×1010cfu/g量级水平。
而且，所述步骤⑶的①的步骤中肠溶型丙烯酸树脂的具体标号为EOBS68，pH6.8。
而且，所述步骤⑷的①的步骤中诱食剂二甲基-β-丙酸噻亭，以牛磺酸代替。
一种用于养殖淡水鱼类二联口服疫苗的使用方法，包括方法步骤如下：
⑴第一次投喂：在当天正常饵料投喂间隔，将二联口服疫苗微丸投喂鱼，投喂量为正常 饵料量的50％，当天2次，同时，当天正常饵料投喂量减半，第一次投喂连续2天；
⑵加强投喂；在第一次投喂疫苗微丸后的第14－28天中的任一天开始，进行与第一次 投喂方法及投喂量相同的加强投喂。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明与现有疫苗制备方法相比，本发明首次制备了嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌二 联口服疫苗，并采用投喂接种的方法，免疫效果理想，工作量小，适合大规模接种。
2、本发明采用功能性包衣材料，既保护疫苗在胃液中不被消化，又使疫苗在肠道中迅速 释放，与后肠黏膜充分接触，产生免疫反应，获得高效免疫效果，解决了直接口服给药免疫 效果差的问题。
3、本发明充分考虑淡水鱼的生活环境、身体机能、捕食习惯等特点，在配方比例上反复 进行实验，科学取值，针对性很强，使用方便，效果非常显著，有很高的市场应用价值。
具体实施方式
以下对本发明实施做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此 限定本发明的保护范围。
一种用于养殖淡水鱼二联口服疫苗，包含按质量分数构成的如下组分：

在本发明的具体实施中，所述嗜水气单胞菌菌液和豚鼠气单胞菌菌液经过了0.5％的甲醛 灭活。
一种用于养殖淡水鱼类二联口服疫苗的制备，该制备方法如下：
⑴灭活：使用0.5％的甲醛对浓度为6×1010cfu/mL的嗜水气单胞菌菌液和浓度为6× 1010cfu/mL的豚鼠气单胞菌菌液进行灭活；
⑵微丸制备：
①将上述二联口服疫苗所包含的按质量分数构成的如下组分：

混合均匀成微湿的软材；
②制微丸：对上述软材使用微丸机制微丸，微丸机采用200-400转/分钟的转速，制备 成10～20目的微丸，所述制备成的微丸的有效疫苗含量为1010cfu/g量级水平；
⑶肠溶层包衣制备：
①将主要成分为肠溶型丙烯酸树脂包衣材料溶于80％的乙醇中，制备成10％～15％的悬浊 液；在本发明的具体实施中，肠溶型丙烯酸树脂的具体型号为EOBS68，pH6.8；
②使用包衣机将上述悬浊液均匀喷涂于疫苗微丸的表面；
⑷诱食剂的喷涂：
①将二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成10％～30％的水溶液；在本发明的具体实 施中，所述诱食剂二甲基-β-丙酸噻亭(DMPT)，可以根据不同的鱼种喷涂不同种类，不同浓 度的诱食剂，如采用牛磺酸作为诱食剂，其水溶液浓度为20％；
②使用包衣机将上述水溶液均匀喷涂于上述制备的肠溶层包衣表面。
一种用于养殖淡水鱼类二联口服疫苗的使用方法，该方法的步骤如下：
⑴第一次投喂：在当天正常饵料投喂间隔，将二联口服疫苗微丸投喂鱼，投喂量为正常 饵料量的50％，当天2次，同时，当天正常饵料投喂量减半，第一次投喂，连续投喂2天；
⑵加强投喂；在第一次投喂疫苗微丸后的第14－28天中的任一天开始，进行与第一次 投喂方法及投喂量相同的加强投喂。
二联口服疫苗及其制备实例1
一种用于养殖淡鱼类二联口服疫苗及制备，该二联口服疫苗制剂的配方如下：150g药用 淀粉、50g麦芽糊精、60mL经过0.5％的甲醛灭活的嗜水气单胞菌菌液和豚鼠气单胞菌菌液的 混合液(浓度为6×1010cfu/mL,比例为1:1)，通过微丸机制备出10～16目的微丸，自然晾干， 疫苗有效含量为1010cfu/g。将肠溶型包衣材料(主要成分为丙烯酸树脂)溶于80％的乙醇中， 制备成13％的悬浊液，使用包衣机均匀喷涂于疫苗微丸的表面，最后将二甲基-β-丙酸噻亭 (DMPT)溶于水中，制成15％的溶液，使用包衣机均匀喷涂于肠溶层表面。
三联口服疫苗及其制备实例2
一种用于养殖淡水鱼类二联口服疫苗的制备，该二联口服疫苗制剂的配方如下：125g 药用淀粉、40g麦芽糊精、50mL经过0.5％的甲醛灭活的嗜水气单胞菌菌液和豚鼠气单胞菌菌 液的混合液(浓度均为6×1010cfu/mL,比例为1:1)，通过微丸机制备出16～20目的微丸，自 然晾干,疫苗有效含量为1010cfu/g。将肠溶型包衣材料(主要成分为丙烯酸树脂)溶于80％ 的乙醇中，制备成10％的悬浊液，使用包衣机均匀喷涂于疫苗微丸的表面，最后将二甲基-β -丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成10％的溶液，使用包衣机均匀喷涂于肠溶层表面。
三联口服疫苗及其制备实例3
一种用于养殖淡水鱼类二联口服疫苗的制备，该二联口服疫苗制剂的配方如下：175g 药用淀粉、60g麦芽糊精、80mL经过0.5％的甲醛灭活的嗜水气单胞菌菌液和豚鼠气单胞菌菌 液的混合液(浓度均为6×1010cfu/mL,比例为1:1)，通过微丸机制备出16～20目的微丸，自 然晾干,疫苗有效含量为1010cfu/g。将肠溶型包衣材料(主要成分为丙烯酸树脂)溶于80％ 的乙醇中，制备成15％的悬浊液，使用包衣机均匀喷涂于疫苗微丸的表面，最后将二甲基-β -丙酸噻亭(DMPT)溶于水中，制成20％的溶液，使用包衣机均匀喷涂于肠溶层表面。
二联口服疫苗的使用方法实例
将上述制备的疫苗微丸投喂血鹦鹉鱼，投喂量为正常饵料投喂量的50％，其余50％投喂 正常饵料，每天2次，连续投喂2天，间隔14天加强投喂2天。
应用效果对比：
水族箱小水体口服疫苗免疫血鹦鹉实验，设计三个组，对照组、口服免疫组1和口服免 疫组2。口服免疫组1每天投喂制备的口服疫苗2次，连续投喂2天，然后投喂正常饵料； 口服免疫组2每天投喂制备的口服疫苗2次，连续投喂2天，然后投喂正常饵料，14天后加 强免疫2天；对照组投喂正常颗粒饵料。间隔7天采血一次，每组采4尾鱼，测定血清抗体 平均水平。28天后，分别对试验鱼和对照鱼进行嗜水气单胞菌菌液和豚鼠气单胞菌菌液(浓 度为1×109cfu/mL,比例为1:1)进行人工感染，7天后统计两组鱼的死亡率，并计算免疫保 护率。结果见表1。
表1 口服免疫后血鹦鹉血清中抗体效价均值

口服免疫组1和口服免疫组2血清的嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌的抗体效价在21天时 达到最大值，抗体水平都显著高于对照组。14天时嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌的抗体效价 口服免疫组1和口服免疫组2无显著差异，21天和28天时嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌的 抗体效价口服免疫组1明显高于口服免疫组2。
嗜水气单胞菌人工感染试验，口服免疫组1死亡率为40％，口服免疫组2死亡率为50％， 豚鼠气单胞菌人工感染试验，口服免疫组1死亡率为30％，口服免疫组2死亡率为50％，均低 于对照组100％。嗜水气单胞菌感染试验，口服免疫组1相对免疫保护率达到60％，口服免疫 组2达到50％，豚鼠气单胞菌感染试验，口服免疫组1相对免疫保护率达到70％，口服免疫组 2达到50％。结果证明投喂本发明的养殖淡水鱼类二联口服疫苗可以明显提高血鹦鹉鱼对嗜水 气单胞菌和豚鼠气单胞菌的抵抗力。
池塘养殖对比试验结果：
试验时间：2014年8月至10月；试验地点：某农场，养殖模式：池塘养殖；养殖鱼类： 淡水白鲨；实验池投喂本发明口服二联疫苗，每天投喂2次，连续投喂2天，28天后加强免 疫一次；对照池投喂普通饵料，其它养殖及管理方法相同。2个月后采集8尾鱼血清用凝集 法测定抗体效价，并取10尾鱼进行嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌(比例为1:1，菌液浓度为 1×109cfu/mL)人工感染实验，测定免疫保护率。试验结果见表2。
表2 池塘养殖淡水白鲨的血清抗体效价及免疫保护率

实验池嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌效价均值分别为208和192，高于对照池的4和6； 攻毒试验免疫保护率达到50％。实验池效果明显优于对照池。结果证明，池塘养殖投喂本发 明的二联口服疫苗可有效地预防淡水白鲨由嗜水气单胞菌和豚鼠气单胞菌引起的疾病，提高 免疫保护率。